本發(fā)明涉及Gly-Phe-Pro，涉及它的制備方法，涉及它的鎮(zhèn)痛作用，涉及它的抗炎作用，涉及它的抗腫瘤活性，涉及它的抗血栓活性及涉及它的溶血栓活性，因而本發(fā)明涉及它作為鎮(zhèn)痛抗炎藥物，抗腫瘤藥物，抗血栓藥物和溶血栓藥物的應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
發(fā)明抗腫瘤、抗血栓、溶血栓、抗凝血、鎮(zhèn)痛、抗炎作用寡肽是發(fā)明人長(zhǎng)期關(guān)注的領(lǐng)域。雖然發(fā)明人發(fā)明公開(kāi)過(guò)一系列具有這些活性的寡肽，但是集這些活性為一體的寡肽一直沒(méi)有得到。經(jīng)過(guò)近10年的序列設(shè)計(jì)和近5年的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)Gly-Phe-Pro是集鎮(zhèn)痛作用，抗炎作用，抗腫瘤作用抗血栓作用和溶血栓作用為一體的寡肽。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一個(gè)內(nèi)容是提供Gly-Phe-Pro。
本發(fā)明的第二個(gè)內(nèi)容是提供Gly-Phe-Pro的合成方法，該方法包括：
(1)在DCC、HOBt的催化下按標(biāo)準(zhǔn)方法制備Boc-Gly-Phe-OBzl；
(2)Boc-Gly-Phe-OBzl在H2Pd/C催化下氫解轉(zhuǎn)化成Boc-Gly-Phe；
(3)在DCC、HOBt的催化下制備Boc-Gly-Phe-Pro-OBzl；
(4)Boc-Gly-Phe-Pro-OBzl在H2Pd/C催化下氫解轉(zhuǎn)化成Boc-Gly-Phe-Pro
(5)Boc-Gly-Phe-Pro在4N的氯化氫-乙酸乙酯溶液中，0℃脫Boc，中轉(zhuǎn)化成Gly-Phe-Pro
本發(fā)明的第三個(gè)內(nèi)容是評(píng)價(jià)Gly-Phe-Pro的鎮(zhèn)痛作用。
本發(fā)明的第四個(gè)內(nèi)容是評(píng)價(jià)Gly-Phe-Pro抗炎作用。
本發(fā)明的第五個(gè)內(nèi)容是評(píng)價(jià)Gly-Phe-Pro抗腫瘤作用。
本發(fā)明的第六個(gè)內(nèi)容是評(píng)價(jià)Gly-Phe-Pro抗血栓作用。
本發(fā)明的第七個(gè)內(nèi)容是評(píng)價(jià)Gly-Phe-Pro溶血栓作用。
附圖說(shuō)明
圖1.Gly-Phe-Pro的合成路線.i)二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，1-羥基苯并三唑(HOBt)，N-甲基嗎啉(NMM)，四氫呋喃(THF)；ii)H2，Pd/C；iii)4N氯化氫的乙酸乙酯溶液，0℃。
具體實(shí)施方式
為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1制備Boc-Gly-Phe-OBzl
冰浴下1.75g(10mmol)Boc-Gly溶解于少量無(wú)水四氫呋喃(THF)中，加入1.36g(10mmol)HOBt，加入2.47g(12mmol)DCC于少量的無(wú)水THF中，活化30分鐘，加入2.55g(10mmol)Phe-OBzl，用NMM調(diào)節(jié)pH＝9，反應(yīng)結(jié)束后濾除去二環(huán)己基脲(DCU)。濾液減壓濃縮，殘留物用乙酸乙酯溶解，再次過(guò)濾DCU，濾液用NaHCO3飽和溶液洗3遍，用NaCl飽和溶液洗3遍，5％的KHSO4溶液洗3遍，NaCl飽和溶液萃洗3遍，5％的NaHCO3溶液萃洗3遍，NaCl飽和溶液萃洗3遍，乙酸乙酯層用無(wú)水Na2SO4干燥2小時(shí)，濾除Na2SO4，濾液減壓濃縮，得到3.45g(83.7％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色油狀物。ESI+-MS(m/e)：413[M+H]+。
實(shí)施例2制備Boc-Gly-Phe
將4.12g(10mmol)Boc-Gly-Phe-OBzl用甲醇溶解，加入412mg的10％的Pd/C。連接三通，減壓抽除茄瓶中的空氣后，將反應(yīng)瓶中充滿H2.按該操作重復(fù)3次。反應(yīng)20h后原料點(diǎn)消失。濾除Pd/C，旋干甲醇。得到3.02g(93.7％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色粉末。ESI+-MS(m/e)：323[M+H]+。
實(shí)施例3制備Boc-Gly-Phe-Pro-OBzl
按照實(shí)施例1的方法，3.22g(10mmol)Boc-Gly和2.05g(10mmol)Pro-OBzl得到標(biāo)題化合物，為無(wú)色粉末。ESI+-MS(m/e)：511[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.15(m，1H)，7.30(d，9H)，6.88(s，1H)，5.09(s，2H)，4.69(m，1H)，4.39(m，1H)，3.67(m，2H)，3.47(s，2H)，2.90(m，2H)，1.98(m，4H)，1.36(s，9H)。
實(shí)施例4制備Boc-Gly-Phe-Pro
按照實(shí)施例2的方法，從4.19g(10mmol)Boc-Gly-Phe-Pro-OBzl得到3.95g(94.3％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色粉末.ESI+-MS(m/e)：420[M+H]+。
實(shí)施例5制備Gly-Phe-Pro
冰浴下，將4.19g(10mmol)Boc-Gly-Phe-Pro-OBzl用盡量少的乙酸乙酯溶解，攪 拌10min，加入40mL氯化氫-乙酸乙酯溶液(4N)反應(yīng)4h，原料點(diǎn)消失。反應(yīng)混合物減壓濃縮至干，殘留物加40mL干燥過(guò)的乙酸乙酯溶解，得到的溶液減壓濃縮至干。殘留物按該操作重復(fù)3次。殘留物加無(wú)水乙醚，用塑料鏟研磨，減壓濃縮除去乙醚。殘留物按該操作重復(fù)3次。得到最終得到2.97g(93.1％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色粉末。ESI-MS(m/e)：320[M+H]+；Mp 96～97℃.(c＝0.12，甲醇).1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝7.21(m，5H)，4.70(m，1H)，4.25(m，1H)，3.60(m，2H)，3.28(m，2H)，2.85(m，2H)，2.07-1.57(m，4H)。
實(shí)施例6評(píng)價(jià)Gly-Phe-Pro的鎮(zhèn)痛活性
雄性ICR小鼠(20±2g)裝到小鼠固定器中，鼠尾暴露于固定器外，于鼠尾距離尾尖三分之一處標(biāo)記，作為光感感受器的感應(yīng)點(diǎn)，照射鼠尾距離尾尖三分之二的位置。測(cè)痛儀預(yù)熱30min，記時(shí)，將小鼠鼠尾遮住光感儀。燈閃爍時(shí)開(kāi)始記時(shí)，鼠尾離開(kāi)光感儀時(shí)停止記時(shí)，測(cè)得的時(shí)間即為小鼠產(chǎn)生痛感的時(shí)間，連續(xù)測(cè)定3次，每次測(cè)量間隔為5min，取平均值。未服藥小鼠產(chǎn)生痛感的時(shí)間為基礎(chǔ)痛感時(shí)間。服藥引起的小鼠產(chǎn)生痛感時(shí)間變化反映了藥物的鎮(zhèn)痛活性。小鼠，隨機(jī)分組，每組14只，測(cè)定基礎(chǔ)痛感時(shí)間后，小鼠或口服0.2mL Gly-Phe-Pro(GFP)的生理鹽水溶液，劑量為1μmol/kg或口服0.2mL生理鹽水或口服阿司匹林的生理鹽水溶液，劑量為1200μmol/kg。測(cè)量給藥后30，60，90，120，150和180min小鼠產(chǎn)生痛感的時(shí)間。數(shù)據(jù)用均值±SD秒表示，列如表1，用方差分析并進(jìn)行t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)表明，口服生理鹽水30，60，90，120，150和180min之后小鼠產(chǎn)生痛感的時(shí)間與口服生理鹽水之前的基礎(chǔ)痛感時(shí)間沒(méi)有顯著差異；口服1200μmol/kg阿司匹林60，90，120，150和180min之后小鼠產(chǎn)生痛感的時(shí)間顯著長(zhǎng)于口服阿司匹林之前的基礎(chǔ)痛感時(shí)間；口服1μmol/kg Gly-Phe-Pro 30，60，90，120，150和180min之后小鼠產(chǎn)生痛感的時(shí)間顯著長(zhǎng)于口服Gly-Phe-Pro之前的基礎(chǔ)痛感時(shí)間。可見(jiàn)，口服1μmol/kgArg-Leu-Val-Cys-Val60，90，120，150和180min之后的鎮(zhèn)痛活性與口服1200μmol/kg阿司匹林相當(dāng)。而口服1μmol/kg Gly-Phe-Pro 30min之后的鎮(zhèn)痛活性比口服1200μmol/kg阿司匹林還強(qiáng)。
表1Gly-Phe-Pro(GFP)的鎮(zhèn)痛活性
n＝14；a)與基礎(chǔ)痛感時(shí)間比p＞0.05；b)與基礎(chǔ)痛感時(shí)間比p＜0.05；c)與基礎(chǔ)痛感時(shí)間比p＜0.05。
實(shí)施例7評(píng)價(jià)Gly-Phe-Pro的抗炎活性
體重20±雄性小鼠口服1μmol/kgGly-Phe-Pro或1200μmol/kg阿司匹林或0.2mL/20g生理鹽水30分鐘后，往小白鼠的左耳外廓涂二甲苯(0.04mL)，2小時(shí)后將小白鼠頸椎脫臼處死。將小鼠的左，右耳剪下，用直徑7mm的打孔器在兩耳的相同位置，取圓形耳片，分別稱重，求出兩圓耳片的重量差作為腫脹度。(腫脹度＝左耳原片重量-右耳原片重量)以腫脹度表示化合物的活性。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均采用t檢驗(yàn)和方差分析，腫脹度以()表示。結(jié)果表明，Gly-Phe-Pro治療的鼠耳腫脹度與生理鹽水組相比具有顯著性差異，表明化合物具有確切的抗炎活性。
表2Gly-Phe-Pro的抗炎活性
n＝14；a)與生理鹽水比p＜0.01。
實(shí)施例8化合物Gly-Phe-Pro的體內(nèi)抗腫瘤活性評(píng)價(jià)
無(wú)菌條件下取接種于ICR小鼠7-10天的S180肉瘤，加入適量生理鹽水配制成瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為2×107/mL，接種于健康雄性ICR小鼠前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2mL。腫瘤接種24h后，小鼠每日腹腔注射0.2mL Gly-Phe-Pro的生理鹽水溶液，連續(xù)給藥10天，劑量為1μmol/kg；或小鼠每日腹腔注射0.2mL阿霉素的生理鹽水溶液，連續(xù)給藥10天，劑量為2μmol/kg；或小鼠每日腹腔注射0.2mL生理鹽水，連續(xù)給藥10天。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第11天，稱小鼠體重，乙醚麻醉剖取各組小鼠的腫瘤，稱重并以瘤重表示化合物的活性，數(shù)據(jù)列入表3。結(jié)果表明1μmol/kgGly-Phe-Pro治療小鼠的瘤重明顯小于生理鹽水治療小鼠的瘤重，Gly-Phe-Pro顯示確切的抗腫瘤活性。
表3Gly-Phe-Pro對(duì)S180荷瘤小鼠的瘤重的影響
n＝12；a)與生理鹽水比p＜0.05。
實(shí)施例9評(píng)價(jià)Gly-Phe-Pro的抗栓活性
1)將聚乙烯管拉成一端為斜口的細(xì)管，定長(zhǎng)為10.0cm，分別為右經(jīng)靜脈(管徑較粗)及左頸動(dòng)脈(管徑較細(xì))插管；中段聚乙烯管定長(zhǎng)為8.0cm，血栓線壓在頸動(dòng)脈插管方向，插管前需在管中充滿肝素。
2)體重250±雄性大鼠口服1μmol/kg Gly-Phe-Pro或167μmol/kg阿司匹林或0.3mL/100g生理鹽水30分鐘后，腹腔注射20％的烏拉坦進(jìn)行麻醉。仰臥位將大鼠固定于鼠板上，剪開(kāi)頸部皮膚，分離右頸總動(dòng)脈及左頸靜脈，血管下壓線，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，靜脈靠遠(yuǎn)心端處剪一小口，進(jìn)行靜脈端插管，注射肝素，系線固定，再用動(dòng)脈夾夾住動(dòng)脈近心端，靠近遠(yuǎn)心端方向剪一小口，進(jìn)行動(dòng)脈端結(jié)扎，系線固定后松開(kāi)動(dòng)脈夾，建立體外循環(huán)旁路。循環(huán)15分鐘后先剪斷靜脈端觀察血液循環(huán)是否正常，若正常從動(dòng)脈端取出血栓線，在紙上沾干浮血后稱重，以栓重表示化合物的活性，數(shù)據(jù)列入表4。結(jié)果表明，Gly-Phe-Pro治療大鼠的血栓重明顯小于生理鹽水治療大鼠的血栓重，Gly-Phe-Pro顯示確切的抗血栓活性。
表4Gly-Phe-Pro的抗栓活性
n＝12；a)與生理鹽水比p＜0.05。
實(shí)施例10評(píng)價(jià)Gly-Phe-Pro的溶栓活性
將大鼠靜息飼養(yǎng)一天，隨機(jī)分組，每組10只，禁食不禁水。
1)將體重250±雄性SD大鼠用20％烏拉坦溶液進(jìn)行麻醉(6mL/kg腹腔)。麻醉后的大鼠固定于鼠板上，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，于近心端夾動(dòng)脈夾，近心端和遠(yuǎn)心端分別傳入手術(shù)線，在遠(yuǎn)心端插取血管，松開(kāi)動(dòng)脈夾取約1mL動(dòng)脈血。迅速將動(dòng)脈血注射入垂直的造栓管(長(zhǎng)16mm，內(nèi)徑2.5mm，外徑5mm，管底用1mL EP管底座)中，(注意不可有氣泡)每個(gè)造栓管中注入0.1mL大鼠動(dòng)脈血液，往管內(nèi)迅速插入血栓固定螺栓(長(zhǎng)20mm，)，血液凝固40min，用針灸針取出血栓，稱取血栓重量。
2)旁路插管由三部分組成，其中中段為聚乙烯膠管，長(zhǎng)60mm，內(nèi)徑3.5mm，兩端為相同的聚乙烯管，長(zhǎng)100mm，內(nèi)徑1mm，外景2mm，該管的一段拉成尖管，另一端的外部套一段長(zhǎng)7mm，外徑3.5mm的聚乙烯管。三段管的內(nèi)壁均為硅烷化。
3)將血栓包裹的血栓固定螺栓置于中段的聚乙烯膠管內(nèi)，膠管的兩端分別與兩根聚乙烯的加粗端相套，用注射器通過(guò)尖管端注滿肝素生理鹽水溶液。將充滿肝素鈉的生理鹽水溶液一端插入左側(cè)靜脈，另一端用注射器加入準(zhǔn)確量的肝素鈉抗凝后，拔掉肝素鈉的注射器，插入動(dòng)脈端。用頭皮針將生理鹽水(3mL/kg)或者尿激酶的生理鹽水溶液(20000IU/kg)或Gly-Phe-Pro的生理鹽水溶液(1μmol/kg)通過(guò)旁路管的中段，刺入遠(yuǎn)離血栓固定螺栓的近靜脈處，打開(kāi)動(dòng)脈夾，使血流通過(guò)旁路管道從動(dòng)脈流入靜脈的時(shí)刻為循環(huán)起始時(shí)間，緩慢的將注射器中的液體注入到血液中(約6min)，使生理鹽水，尿激酶，Gly-Phe-Pro通過(guò)血液循環(huán)，按靜脈-心臟-動(dòng)脈的順序作用到血栓上。60min后取出附有血栓的螺栓，蘸去浮血，記錄重量。以血栓減重代表溶栓活性。數(shù)據(jù)列入表4。結(jié)果表明，Gly-Phe-Pro治療大鼠的血栓減重明顯大于生理鹽水治療大鼠的血栓減重，Gly-Phe-Pro顯示確切的溶血栓活性。
表5Gly-Phe-Pro的溶栓活性
n＝10；a)與生理鹽水比p＜0.01。