本發(fā)明涉及通式I代表的4種肽AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-Tyr-Val的4種肽，涉及它們的制備方法、涉及它們的鎮(zhèn)痛活性，涉及它們的抗炎活性，涉及它們的抗腫瘤活性，涉及它們的抗血栓活性及涉及它們的溶血栓活性，因而本發(fā)明涉及它們在制備鎮(zhèn)痛藥、抗炎藥、抗腫瘤藥物、抗血栓藥物和溶血栓藥物的應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

發(fā)明抗腫瘤、抗血栓、溶血栓、抗凝血和鎮(zhèn)痛作用寡肽是發(fā)明人長期關(guān)注的領(lǐng)域。雖然發(fā)明人發(fā)明公開過一系列具有這些活性的寡肽，但是集這些活性為一體的寡肽一直沒有得到。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通式AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-Tyr-Val的4種肽是集鎮(zhèn)痛作用、抗炎作用、抗腫瘤作用、抗血栓作用和溶血栓作用為一體的寡肽。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個內(nèi)容是提供AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-Tyr-Val的4種肽(當(dāng)AA₁＝Asn，AA₂＝Pro，AA₃＝Pro，AA₄＝Asp，AA₅＝Asp時(shí)AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-Tyr-Val為Asn-Pro-Pro-Asp-Asp-Tyr-Val；當(dāng)AA₁＝Leu，AA₂＝Arg，AA₃＝Ala，AA₄＝Pro，AA₅＝Leu時(shí)AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-Tyr-Val為Leu-Arg-Ala-Pro-Leu-Tyr-Val；當(dāng)AA₁不存在，AA₂＝Glu，AA₃＝Thr，AA₄＝Ala，AA₅＝Pro時(shí)AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-Tyr-Val為Glu-Thr-Ala-Pro-Tyr-Val；當(dāng)AA₁和AA₂都不存在，AA₃＝Glu，AA₄＝Leu，AA₅＝Phe時(shí)AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-Tyr-Val為Glu-Leu-Phe-Tyr-Val)。

本發(fā)明的第二個內(nèi)容是提供AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-Tyr-Val的4種肽(當(dāng)AA₁＝Asn，AA₂＝Pro，AA₃＝Pro，AA₄＝Asp，AA₅＝Asp時(shí)AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-Tyr-Val為Asn-Pro-Pro-Asp-Asp-Tyr-Val；當(dāng)AA₁＝Leu，AA₂＝Arg，AA₃＝Ala，AA₄＝Pro，AA₅＝Leu時(shí)AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-Tyr-Val為Leu-Arg-Ala-Pro-Leu-Tyr-Val；當(dāng)AA₁不存在，AA₂＝Glu，AA₃＝Thr，AA₄＝Ala，AA₅＝Pro時(shí)AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-Tyr-Val為Glu-Thr-Ala-Pro-Tyr-Val；當(dāng)AA₁和AA₂都不存在，AA₃＝Glu，AA₄＝Leu，AA₅＝Phe時(shí)AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-Tyr-Val為Glu-Leu-Phe-Tyr-Val)的合成方法，該方法包括：

(1)Glu-Leu-Phe-Tyr-Val的制備方法

(1-1)在DCC和HOBt的催化下按照標(biāo)準(zhǔn)方法制備Boc-Tyr-Val-OBzl；

(1-2)Boc-Tyr-Val-OBzl在濃度為4N的氯化氫-乙酸乙酯溶液中，0℃脫Boc，轉(zhuǎn)化成Tyr-Val-OBzl；

(1-3)在DCC和HOBt的催化下制備Boc-Leu-Phe-OBzl；

(1-4)Boc-Leu-Phe-OBzl在H₂，Pd/C催化下，轉(zhuǎn)化成Boc-Leu-Phe；

(1-5)在DCC和HOBt的催化下制備Boc-Leu-Phe-Tyr-Val-OBzl；

(1-6)Boc-Leu-Phe-Tyr-Val-OBzl在濃度為4N的氯化氫-乙酸乙酯溶液中，0℃脫Boc，轉(zhuǎn)化成Leu-Phe-Tyr-Val-OBzl；

(1-7)在DCC和HOBt的催化下制備Boc-Glu(OBzl)-Leu-Phe-Tyr-Val-OBzl；

(1-8)Boc-Glu(OBzl)-Leu-Phe-Tyr-Val-OBzl在Pd/C催化下氫解Boc-Glu-Leu-Phe-Tyr-Val；

(1-9)Boc-Glu-Leu-Phe-Tyr-Val在濃度為4N氯化氫-乙酸乙酯溶液中，0℃脫Boc轉(zhuǎn)化成Glu-Leu-Phe-Tyr-Val；

(2)Leu-Arg-Ala-Pro-Leu-Tyr-Val的制備方法：

(2-1)在DCC和HOBt的催化下按照標(biāo)準(zhǔn)方法制備Boc-Tyr-Val-OBzl；

(2-2)Boc-Tyr-Val-OBzl在濃度為4N的氯化氫-乙酸乙酯溶液中0℃脫Boc，轉(zhuǎn)化成Tyr-Val-OBzl；

(2-3)在DCC和HOBt的催化下制備Boc-Ala-Pro-OBzl；

(2-4)Boc-Ala-Pro-OBzl在Pd/C催化下氫解轉(zhuǎn)化成Boc-Ala-Pro；

(2-5)在DCC和HOBt的催化下制備Boc-Leu-Tyr-Val-OBzl；

(2-6)Boc-Leu-Tyr-Val-OBzl在濃度為4N的氯化氫-乙酸乙酯溶液中0℃脫Boc，轉(zhuǎn)化成Leu-Tyr-Val-OBzl；

(2-7)在DCC和HOBt的催化下制備Boc-Ala-Pro-Leu-Tyr-Val-OBzl；

(2-8)Boc-Ala-Pro-Leu-Tyr-Val-OBzl在濃度為4N的氯化氫-乙酸乙酯溶液中0℃脫Boc，轉(zhuǎn)化成Ala-Pro-Leu-Tyr-Val-OBzl；

(2-9)在DCC和HOBt的催化下制備Boc-Leu-Arg(NO₂)-OBzl；

(2-10)Boc-Leu-Arg(NO₂)-OBzl在濃度為2N的NaOH水溶液中0℃轉(zhuǎn)化成Boc-Leu-Arg(NO₂)；

(2-11)在DCC和HOBt的催化下制備Boc-Leu-Arg(NO₂)-Ala-Pro-Leu-Tyr-Val-OBzl；

(2-12)Boc-Leu-Arg(NO₂)-Ala-Pro-Leu-Tyr-Val-OBzl在三氟醋酸和三氟甲磺酸中0℃脫保護(hù)轉(zhuǎn)化成Leu-Arg-Ala-Pro-Leu-Tyr-Val；

(3)Asn-Pro-Pro-Asp-Asp-Tyr-Val的合成方法：

(3-1)在DCC和HOBt的催化下按照標(biāo)準(zhǔn)方法制備Boc-Tyr-Val-OBzl；

(3-2)Boc-Tyr-Val-OBzl在濃度為4N的氯化氫-乙酸乙酯溶液中0℃脫Boc，轉(zhuǎn)化成Tyr-Val-OBzl；

(3-3)在DCC和HOBt的催化下制備Boc-Asp(OBzl)-Tyr-Val-OBzl；

(3-4)Boc-Asp(OBzl)-Tyr-Val-OBzl在濃度為4N的氯化氫-乙酸乙酯溶液中0℃脫Boc，轉(zhuǎn)化成Asp(OBzl)-Tyr-Val-OBzl；

(3-5)在DCC和HOBt的催化下制備Boc-Asp(OBzl)-Asp(OBzl)-Tyr-Val-OBzl；

(3-6)Boc-Asp(OBzl)-Asp(OBzl)-Tyr-Val-OBzl在濃度為4N的氯化氫-乙酸乙酯溶液中0℃脫Boc，轉(zhuǎn)化成Asp(OBzl)-Asp(OBzl)-Tyr-Val-OBzl；

(3-7)在DCC和HOBt的催化下制備Boc-Pro-Pro-OBzl；

(3-8)Boc-Pro-Pro-OBzl在濃度為4N的氯化氫-乙酸乙酯溶液中0℃脫Boc，轉(zhuǎn)化成Pro-Pro-OBzl；

(3-9)在DCC和HOBt的催化下制備Boc-Asn-Pro-Pro-OBzl；

(3-10)Boc-Asn-Pro-Pro-OBzl在Pd/C催化下氫解轉(zhuǎn)化成Boc-Asn-Pro-Pro；

(3-11)在DCC和HOBt的催化下制備Boc-Asn-Pro-Pro-Asp(OBzl)-Asp(OBzl)-Tyr-Val-OBzl；

(3-12)Boc-Asn-Pro-Pro-Asp(OBzl)-Asp(OBzl)-Tyr-Val-OBzl在三氟醋酸和三氟甲磺酸中0℃脫保護(hù)轉(zhuǎn)化成Asn-Pro-Pro-Asp-Asp-Tyr-Val；

(4)Glu-Thr-Ala-Pro-Tyr-Val的制備方法：

(4-1)在DCC和HOBt的催化下按照標(biāo)準(zhǔn)方法制備Boc-Tyr-Val-OBzl；

(4-2)Boc-Tyr-Val-OBzl在濃度為4N的氯化氫-乙酸乙酯溶液中0℃脫Boc，轉(zhuǎn)化成Tyr-Val-OBzl；

(4-3)在DCC和HOBt的催化下制備Boc-Ala-Pro-OBzl；

(4-4)Boc-Ala-Pro-OBzl在Pd/C催化下氫解轉(zhuǎn)化成Boc-Ala-Pro；

(4-5)在DCC和HOBt的催化下制備Boc-Ala-Pro-Tyr-Val-OBzl；

(4-6)Boc-Ala-Pro-Tyr-Val-OBzl在濃度為4N的氯化氫-乙酸乙酯溶液中0℃脫Boc，轉(zhuǎn)化成Ala-Pro-Tyr-Val-OBzl；

(4-7)在DCC和HOBt的催化下制備Boc-Thr-Ala-Pro-Tyr-Val-OBzl；

(4-8)Boc-Thr-Ala-Pro-Tyr-Val-OBzl在濃度為4N的氯化氫-乙酸乙酯溶液中0℃脫Boc，轉(zhuǎn)化成Thr-Ala-Pro-Tyr-Val-OBzl；

(4-9)在DCC和HOBt的催化下制備Boc-Glu(OBzl)-Thr-Ala-Pro-Tyr-Val-OBzl；

(4-10)Boc-Glu(OBzl)-Thr-Ala-Pro-Tyr-Val-OBzl在三氟醋酸和三氟甲磺酸中0℃脫保護(hù)轉(zhuǎn)化成Glu-Thr-Ala-Pro-Tyr-Val。

本發(fā)明的第三個內(nèi)容是評價(jià)AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-Tyr-Val的鎮(zhèn)痛作用。

本發(fā)明的第四個內(nèi)容是評價(jià)AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-Tyr-Val的抗炎作用。

本發(fā)明的第五個內(nèi)容是評價(jià)AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-Tyr-Val的抗腫瘤作用。

本發(fā)明的第六個內(nèi)容是評價(jià)AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-Tyr-Val的抗血栓作用。

本發(fā)明的第七個內(nèi)容是評價(jià)AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-Tyr-Val的溶血栓作用。

附圖說明

圖1 Glu-Leu-Phe-Tyr-Val(GQ-E)的合成路線.i)二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，1-羥基苯并三唑(HOBt)，N-甲基嗎啉(NMM)，四氫呋喃(THF)；ii)H₂，Pd/C iii)4N HCl/EA，0℃。

圖2 Glu-Thr-Ala-Pro-Tyr-Val(GQ-Q)的合成路線i)二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，1-羥基苯并三唑(HOBt)，N-甲基嗎啉(NMM)，四氫呋喃(THF)；ii)H₂，Pd/C；iii)4N HCl/EA，0℃；iv)2N NaOH，0℃；v)三氟醋酸(TFA)，三幅甲磺酸(TFMSA)。

圖3 leu-Arg-Ala-Pro-Leu-Tyr-Val(GQ-L)的合成路線.i)二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，1-羥基苯并三唑(HOBt)，N-甲基嗎啉(NMM)，四氫呋喃(THF)；ii)H₂，Pd/C；iii)4N HCl/EA，0℃；iv)2N NaOH，0℃；v)三氟醋酸(TFA)，三幅甲磺酸(TFMSA)。

圖4 Asn-Pro-Pro-Asp-Asp-Tyr-Val(GQ-N)的合成路線.i)二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，1-羥基苯并三唑(HOBt)，N-甲基嗎啉(NMM)，四氫呋喃(THF)；ii)H₂，Pd/C；iii)4N HCl/EA，0℃；iv)2N NaOH，0℃；v)三氟醋酸(TFA)，三幅甲磺酸(TFMSA)。

具體實(shí)施方式

為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1制備Boc-Tyr-Val-OBzl

冰浴下，2.81g(10mmol)Boc-Tyr溶解于少量無水四氫呋喃(THF)中，加入1.36g(10mmol)HOBt，加入2.47g(12mmol)DCC與少量無水THF的溶液，活化30分鐘，加入2.07g(10mmol)Val-OBzl，用NMM調(diào)節(jié)pH＝9，反應(yīng)結(jié)束后過濾除去二環(huán)己基脲(DCU)。濾液減壓濃縮，殘留物用乙酸乙酯溶解，再次過濾DCU，濾液用NaHCO₃飽和 溶液洗3遍，用NaCl飽和溶液洗3遍，5％的KHSO₄溶液洗3遍，NaCl飽和溶液洗3遍，5％的NaHCO₃溶液萃洗3遍，NaCl飽和溶液萃洗3遍，乙酸乙酯層用無水Na₂SO₄干燥12小時(shí)，濾除Na₂SO₄，濾液減壓濃縮，得到4.02g(85.5％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：472[M+H]⁺。

實(shí)施例2制備Tyr-Val-OBzl

冰浴下將4.7g(10mmol)Boc-Tyr-Val-OBzl用盡少量干燥過的乙酸乙酯溶解，攪拌10min，加入50mL氯化氫-乙酸乙酯溶液(4N)反應(yīng)4h，原料點(diǎn)消失。反應(yīng)混合物減壓濃縮至干，殘留物加40mL干燥過的乙酸乙酯溶解，得到的溶液減壓濃縮至干。殘留物按該操作重復(fù)3次。殘留物加無水乙醚，用塑料鏟研磨，減壓濃縮除去乙醚。殘留物按該操作重復(fù)3次。得到3.97g(99％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：372[M+H]⁺。

實(shí)施例3制備Boc-Leu-Phe-OBzl

按照實(shí)施例1的方法，2.31g(10mmol)Boc-Leu和2.55g(10mmol)Phe-OBzl得到3.98g(81.6％)標(biāo)題化合物，為無色油狀物。ESI⁺-MS(m/e)：470[M+H]⁺。

實(shí)施例4制備Boc-Leu-Phe

將4.88g(10mmol)Boc-Leu-Phe-OBzl用甲醇溶解，加入488mg的10％的Pd/C。連接三通，減壓抽除茄瓶中的空氣后，反應(yīng)瓶中充滿H₂，按該操作重復(fù)3次。反應(yīng)20h后原料點(diǎn)消失。濾除Pd/C，旋干甲醇。得到3.67g(97％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：380[M+H]⁺。

實(shí)施例5制備Boc-Leu-Phe-Tyr-Val-OBzl

按照實(shí)施例1的方法，3.78g(10mmol)Boc-Leu-Phe和3.7g(10mmol)Tyr-Val-OBzl得到4.23g(57.9％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：732[M+H]⁺。

實(shí)施例6制備Leu-Phe-Tyr-Val-OBzl

按照實(shí)施例2的方法，從7.3g(10mmol)Boc-Leu-Phe-Tyr-Val-OBzl得到6.1g(98％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：632[M+H]⁺。

實(shí)施例7制備Boc-Glu(OBzl)-Leu-Phe-Tyr-Val-OBzl

按照實(shí)施例1的方法，3.37g(10mmol)Boc-Glu(OBzl)和6.3g(10mmol)Leu-Phe-Tyr-Val-OBzl得到3.35g(35.3％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：951[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝9.14(s，1H)，8.23(d，1H)，7.95(m，2H)，7.71(d，1H)，7.34(m，10H)，7.16(m，5H)，7.12(m，3H)，6.63(d，2H)，5.13(s，2H)，5.08(s，2H)，4.60(m，1H)，4.40(m，1H)，4.25(m，2H)，3.92(m，1H)，2.90(m，2H)，2.51(m，2H)， 2.33(m，2H)，2.10(m，1H)，1.80(m，2H)，1.54(m，1H)，1.30(s，11H)，0.81(s，12H)。

實(shí)施例8制備Boc-Glu-Leu-Phe-Tyr-Val

按照實(shí)施例4的方法，從950mg(1mmol)的Boc-Glu-Leu-Phe-Tyr-Val-OBzl得到750mg(95.2％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：771[M+H]⁺。

實(shí)施例9制備Glu-Leu-Phe-Tyr-Val(GQ-E)

按照實(shí)施例2的方法，從769mg(1mmol)Boc-Glu-Leu-Phe-Tyr-Val-OBzl得到650mg(95.1％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：671[M+H]⁺；Mp 166.2～167.8℃.(c＝0.07，甲醇).IR：3273，3063，2961，2930，1710，1640，1515，1469，1443，1390，1369，1218，1030，916，828，802，746，698，610，598，554.¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝12.35(s，2H)，9.19(s，1H)，8.45(s，J＝8.1Hz 1H)，8.23(d，J＝8.1Hz，3H)，8.04(m，2H)，7.15(s，5H)，7.05(d，J＝8.4Hz，2H)，6.63(d，J＝8.4Hz，2H)，4.54(m，2H)，4.33(m，1H)，4.17(m，1H)，3.77(m，1H)，2.90(m，2H)，2.70(m，2H)，2.26(m，2H)，2.06(m，1H)，1.81(m，2H)，1.39(m，3H)，0.83(m，12H)。

實(shí)施例10制備Boc-Ala-Pro-OBzl

按照實(shí)施例1的方法，1.89g(10mmol)Boc-Ala和2.03g(10mmol)Pro-OBzl得到2.04g(54.3％)標(biāo)題化合物，為無色油狀物。ESI⁺-MS(m/e)：377[M+H]⁺。

實(shí)施例11制備Boc-Ala-Pro-OH

按照實(shí)施例4的方法，從3.76g(10mmol)Boc-Ala-Pro-OBzl得到2.83g(99％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：287[M+H]⁺。

實(shí)施例12制備Boc-Leu-Tyr-Val-OBzl

按照實(shí)施例1的方法，2.31g(10mmol)Boc-Leu和3.7g(10mmol)Tyr-Val-OBzl得到3.67g(63.0％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：491[M+H]⁺。

實(shí)施例13制備Leu-Tyr-Val-OBzl

按照實(shí)施例2的方法，從5.83g(10mmol)Boc-Leu-Tyr-Val-OBzl得到4.95g(99.9％)標(biāo)題化合物，為黃色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：391[M+H]⁺。

實(shí)施例14制備Boc-Ala-Pro-Leu-Tyr-Val-OBzl

按照實(shí)施例1的方法，從2.86g(10mmol)Boc-Ala-Pro和4.83g(10mmol)Leu-Tyr-Val-OBzl，得到3.32g(44.5％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：659[M+H]⁺。

實(shí)施例15制備Ala-Pro-Leu-Tyr-Val-OBzl

按照實(shí)施例2的方法，從7.51g(10mmol)Boc-Ala-Pro-Leu-Tyr-Val-OBzl得到 6.05g(92.5％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：559[M+H]⁺。

實(shí)施例16制備Boc-Leu-Arg(NO₂)-OBzl

按照實(shí)施例1的方法，2.31g(10mmol)Boc-Leu和3.09g(10mmol)Arg(NO₂)-OBzl得到白色油狀物3.64g(69.7％)。ESI⁺-MS(m/e)：524[M+H]⁺。

實(shí)施例17制備Boc-Leu-Arg(NO₂)-OH

冰浴下將5.22g(10mmol)Boc-Leu-Arg(NO₂)-OBzl溶解于甲醇，攪拌10min，逐滴加入2N NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH到13-14。保持冰浴反應(yīng)4個小時(shí)，反應(yīng)完全。冰浴下反應(yīng)液用飽和KHSO₄溶液調(diào)節(jié)pH到中性，先減壓濃縮除甲醇，再用飽和KHSO₄溶液調(diào)節(jié)pH到2。反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取3遍。得到的溶液用飽和NaCl溶液洗至中性，用無水Na₂SO₄干燥12小時(shí)，過濾，濾液減壓濃縮，得到4.89g(100％)標(biāo)題化合物，為無色油狀物。ESI⁺-MS(m/e)：433[M+H]⁺。

實(shí)施例18制備Boc-Leu-Arg(NO₂)-Ala-Pro-Leu-Tyr-Val-OBzl

按照實(shí)施例1的方法，4.31g(10mmol)Boc-Leu-Arg(NO₂)和6.51g(10mmol)Ala-Pro-Leu-Tyr-Val-OBzl，得到3.24g(31.6％)標(biāo)題化合物，為無色果凍狀化合物。ESI⁺-MS(m/e)：973[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝9.14(s，1H)，8.51(s，1H)，8.20(m，2H)，7.78(m，4H)，7.36(m，5H)，6.93(d，J＝8.4Hz，3H)，6.59(d，J＝8.4Hz，2H)，5.13(s，2H)，4.50(m，2H)，4.31.89(m，2H)，4.18(m，2H)，3.94(m，1H)，3.52(s，2H)，3.13(m，2H)，2.89(m，1H)，2.63(m，1H)，2.05(m，2H)，1.89(m，2H)，1.72(m，1H)，1.50(m，6H)，1.37(m，13H)，1.16(d，J＝7.5Hz，3H)，0.835(m，18H)。

實(shí)施例19制備Leu-Arg-Ala-Pro-Leu-Tyr-Val(GQ-L)

冰浴下將106mg(0.1mmol)Boc-Leu-Arg(NO₂)-Ala-Pro-Leu-Tyr-Val-OBzl用4mLTFA(三氟醋酸)溶解，攪拌10min，加入1mL TFMSA(三氟甲磺酸)，反應(yīng)30min后，反應(yīng)基本完成，原料點(diǎn)消失。將無水乙醚加入茄瓶中，用塑料鏟磨洗，傾倒乙醚；重復(fù)操作三次。最終獲得棕黃色粉末，用三蒸水溶解，用氨水調(diào)pH至7，走Sephdex G10，收集得到78mg(72.9％)標(biāo)題化合物，為白色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：804[M+H]⁺；Mp 159.5～16.2℃.(c＝0.09，甲醇).IR：3297，2965，1656，1518，1469，1346，1239，1224，1167，1027，831，762，636，578.¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.58(d，J＝7.5Hz，1H)，8.22(s，2H)，8.06(s，3H)，7.87(m，1H)，7.40(m，3H)，6.97(d，J＝8.4Hz，2H)，6.60(d，J＝8.4Hz，2H)，4.61(m，2H)，4.32(m，2H)，4.15(m，3H)，3.81(m，3H)，3.39(m，1H)，3.09(d，J＝4.5Hz，2H)，2.06(m，1H)，1.40-1.95(m，10H)，1.02-1.49(m，9H)，0.85(m，18H)。

實(shí)施例20制備Boc-Asp(OBzl)-Tyr-Val-OBzl

按照實(shí)施例1的方法，3.23g(10mmol)Boc-Asp(OBzl)和3.7g(10mmol)Tyr-Val-OBzl得到4.87g(72％)標(biāo)題化合物，為無色油狀物。ESI⁺-MS(m/e)：677[M+H]⁺。

實(shí)施例21制備Asp(OBzl)-Tyr-Val-OBzl的制備

按照實(shí)施例2的方法，從6.75g(10mmol)Boc-Asp(OBzl)Tyr-Val-OBzl得到5.43g(94.4％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：577[M+H]⁺。

實(shí)施例22制備Boe-Asp(OBzl)-Asp(OBzl)-Tyr-Val-OBzl

按照實(shí)施例1的方法，3.23g(10mmol)Boc-Asp(OBzl)和5.75g(10mmol)Asp(OBzl)-Tyr-Val-OBzl得到4.92g(44.9％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：882[M+H]⁺。

實(shí)施例23制備Asp(OBzl)-Asp(OBzl)-Leu-Tyr-Val-OBzl

按照實(shí)施例2的方法，從7.51g(10mmol)Boc-Asp(OBzl)-Asp(OBzl)-Leu-Tyr-Val-OBzl得到7.7g(98.2％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：782[M+H]⁺。

實(shí)施例24制備Boc-Pro-Pro-OBzl

按照實(shí)施例1的方法，2.15g(10mmol)Boc-Pro和2.05g(10mmol)Pro-OBzl得到2.34g(77.5％)標(biāo)題化合物，為無色油狀物。ESI⁺-MS(m/e)：403[M+H]⁺。

實(shí)施例25制備Pro-Pro-OBzl

按照實(shí)施例2的方法，從4.02g(10mmol)Boc-Pro-Pro-OBzl得到2.99g(99％)標(biāo)題化合物，為無色粉末.ESI⁺-MS(m/e)：303[M+H]⁺。

實(shí)施例26制備Boc-Asn-Pro-Pro-OBzl

按照實(shí)施例1的方法，2.46g(10mmol)Boc-Asn和3.02g(10mmol)Pro-Pro-OBzl得到2.58g(48.7％)標(biāo)題化合物，為無色油狀物。ESI⁺-MS(m/e)：518[M+H]⁺。

實(shí)施例27制備Boc-Asn-Pro-Pro

按照實(shí)施例4的方法，從5.30g(10mmol)的Boc-Asn-Pro-Pro-OBzl得到4.30g(97.7％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：427[M+H]⁺。

實(shí)施例28制備Boc-Asn-Pro-Pro-Asp-Asp-Tyr-Val-OBzl

按照實(shí)施例1的方法，4.4g(10mmol)Boc-Asn-Pro-Pro和7.8g(10mmol)Asp(OBzl)-Asp(OBzl)-Tyr-Val-OBzl得到2.95g(24.5％)標(biāo)題化合物，為無色果凍 狀。ESI⁺-MS(m/e)：1190[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝9.16(s，1H)，8.11(m，3H)，7.78(s，1H)，7.33(m，15H)，7.18(s，1H)，6.98(d，J＝8.4Hz，2H)，6.87(d，J＝8.4Hz，1H)，6.62(d，J＝8.4Hz，2H)，5.11(s，2H)，5.08(s，2H)，5.04(s，2H)，4.55(m，5H)，4.25(m，1H)，4.18(m，1H)，3.60(m，2H)，3.48(m，2H)，3.35(m，1H)，2.97-2.52(m，6H)，2.30(m，2H)，2.00(m，3H)，1.82(m，6H)，1.35(s，9H)，0.85(d，J＝6.6Hz，3H)，0.83(d，J＝6.6Hz，3H)。

實(shí)施例29制備Asn-Pro-Pro-Asp-Asp-Tyr-Val(GQ-N)

按照實(shí)施例19的方法，從120mg(0.1mmol)Boc-Asn-Pro-Pro-Asp-Asp-Tyr-Val-OBzl得到69mg(83.1％)的標(biāo)題化合物，為白色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：820[M+H]⁺；Mp 164.8～165.9℃.(c＝0.08，甲醇).IR：2966，1721，1651，1515，1448，1223，1167，1027，909，828，761，728，697，636.¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.12(s，1H)，8.03(m，4H)，7.09(m，1H)，7.68(m，1H)，7.30(m，1H)，7.00(d，J＝8.4Hz，3H)，6.63(d，J＝8.4Hz，2H)，4.60(m，1H)，4.42(m，4H)，4.25(m，1H)，4.10(m，3H)，3.67(m，4H)，3.47(m，1H)，3.06(m，2H)，2.69(m，4H)，2.45(m，2H)，2.23(m，1H)，1.88(m，8H)，0.88(t，6H)。

實(shí)施例30制備Boc-Ala-Pro-OBzl

按照實(shí)施例1的方法，1.89g(10mmol)Boc-Ala和2.03g(10mmol)Pro-OBzl得到2.04g(54.3％)標(biāo)題化合物，為無色油狀物。ESI⁺-MS(m/e)：377[M+H]⁺。

實(shí)施例31制備Boc-Ala-Pro

按照實(shí)施例4的方法，從3.76g(10mmol)Boc-Ala-Pro-OBzl得到2.83g(99％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：287[M+H]⁺。

實(shí)施例32制備Boc-Ala-Pro-Tyr-Val-OBzl

按照實(shí)施例1的方法，2.86g(10mmol)Boc-Ala-Pro和3.7g(10mmol)Tyr-Val-OBzl得到4.01g(63.3％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：540[M+H]⁺。

實(shí)施例33制備Ala-Pro-Tyr-Val-OBzl

按照實(shí)施例2的方法，從6.38g(10mmol)Boc-Ala-Pro-Tyr-Val-OBzl得到5.29g(98.6％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：640[M+H]⁺。

實(shí)施例34Boc-Thr-Ala-Pro-Tyr-Val-OBzl的制備

按照實(shí)施例1的方法，2.46g(10mmol)Boc-Thr和5.38g(10mmol)Ala-Pro-Tyr-Val-OBzl得到3.39g(44.6％)標(biāo)題化合物，為無色油狀物。ESI⁺-MS(m/e)：741[M+H]⁺。

實(shí)施例35制備Thr-Ala-Pro-Tyr-Val-OBzl

按照實(shí)施例2的方法，從3.7g(5mmol)Boc-Ala-Pro-Tyr-Val-OBzl得到6.03g(94.2％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：641[M+H]⁺。

實(shí)施例36制備Boc-Glu(OBzl)-Thr-Ala-Pro-Tyr-Val-OBzl

按照實(shí)施例1的方法，337mg(1mmol)Boc-Glu(OBzl)和640mg(1mmol)Thr-Ala-Pro-Tyr-Val-OBzl得到530mg(55.3％)標(biāo)題化合物，為無色油狀物。ESI⁺-MS(m/e)：960[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝9.17(s，1H)，8.15(d，J＝7.5Hz，1H)，8.05(d，J＝8.1Hz，1H)，7.80(d，J＝8.7Hz，1H)，7.67(d，J＝8.1Hz，1H)，7.31(m，10H)，7.02(d，J＝9.6Hz，1H)，6.97(d，J＝8.4Hz，2H)，6.77(s，1H)，6.62(d，J＝8.4Hz，2H)，5.12(m，4H)，4.49(m，2H)，4.41(m，1H)，4.33(m，1H)，4.18(m，2H)，4.01(m，1H)，3.51(m，2H)，2.80(m，2H)，2.11(m，2H)，1.90(m，2H)，1.78(m，1H)，1.59(m，2H)，1.38(s，9H)，1.12(d，J＝6.9Hz，3H)，1.06(d，J＝6.3Hz，3H)，0.85(m，6H)。

實(shí)施例37制備Glu-Thr-Ala-Pro-Tyr-Val(GQ-Q)

按照實(shí)施例19的方法，從433mg(0.5mmol)Boc-Glu(OBzl)-Thr-Ala-Pro-Tyr-Val-OBzl得到304mg(89.5％)標(biāo)題化合物，為微黃色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：680[M+H]⁺；Mp 129.1-130.6℃.(c＝0.09，甲醇).IR：3210，3060，2973，2935，1716，1650，1614，1543，1515，1443，1374，1349，1301，1224，1148，1114，1044，1011，918，875，830，801，665，601，558.¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.67(d，J＝8.1Hz，1H)，8.28(s，2H)，8.14(d，J＝7.5Hz，1H)，7.82(d，J＝8.4Hz，1H)，7.66(d，J＝8.1Hz，1H)，7.45(s，1H)，6.95(m，2H)，6.65(d，2H)，4.43(m，2H)，4.32(m，1H)，4.22(m，2H)，4.16(m，1H)，3.96(m，2H)，3.56(m，1H)，2.6-3.0(m，2H)，2.28(m，2H)，2.05(m，3H)，1.63(m，2H)，1.20-0.78(m，12H)。

實(shí)施例38評價(jià)GQ-E、GQ-L、GQ-N、GQ-Q的鎮(zhèn)痛活性

雄性ICR小鼠(20±2g)裝到小鼠固定器中，鼠尾暴露于固定器外，于鼠尾距離尾尖三分之一處標(biāo)記，作為光感感受器的感應(yīng)點(diǎn)，照射鼠尾距離尾尖三分之二的位置。測痛儀預(yù)熱30min，記時(shí)，將小鼠鼠尾遮住光感儀。燈閃爍時(shí)開始記時(shí)，鼠尾離開光感儀時(shí)停止記時(shí)，測得的時(shí)間即為小鼠產(chǎn)生痛感的時(shí)間，連續(xù)測定3次，每次測量間隔為5min，取平均值。未服藥小鼠產(chǎn)生痛感的時(shí)間為基礎(chǔ)痛感時(shí)間。服藥引起的小鼠產(chǎn)生痛感時(shí)間變化反映了藥物的鎮(zhèn)痛活性。小鼠，隨機(jī)分組，每組14只，測定基礎(chǔ)痛感時(shí)間后，小鼠或口服0.2mLGQ-E、GQ-L、GQ-N、GQ-Q的生理鹽水溶液，劑量為1μmol/kg或口服0.2mL生理鹽水或口服阿司匹林的生理鹽水溶液，劑量為1200μmol/kg。測量給藥后30，60，90，120，150和180min小鼠產(chǎn)生痛感的時(shí)間。數(shù)據(jù)用均值±SD秒表示， 列如表1，用方差分析并進(jìn)行t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)表明，口服生理鹽水30，60，90，120，150和180min之后小鼠產(chǎn)生痛感的時(shí)間與口服生理鹽水之前的基礎(chǔ)痛感時(shí)間沒有顯著差異；口服1200μmol/kg阿司匹林60，90，120，150和180min之后小鼠產(chǎn)生痛感的時(shí)間顯著長于口服阿司匹林之前的基礎(chǔ)痛感時(shí)間；口服GQ-L、GQ-N1μmol/kg 30，60，90，120，150和180min之后小鼠產(chǎn)生痛感的時(shí)間顯著長于口服GQ-L、GQ-N之前的基礎(chǔ)痛感時(shí)間?？诜?μmol/kgGQ-L在120，150和180min之后的鎮(zhèn)痛活性與口服1200μmol/kg阿司匹林相當(dāng)。而30，60和90min之后的鎮(zhèn)痛活性比口服1200μmol/kg阿司匹林還強(qiáng)。口服1μmol/kgGQ-N在30min之后的鎮(zhèn)痛活性比口服1200μmol/kg阿司匹林還強(qiáng)。

表1 GQ-L、GQ-E、GQ-N、GQ-Q的鎮(zhèn)痛活性

n＝14；a)與基礎(chǔ)痛感時(shí)間比p＞0.05；b)與基礎(chǔ)痛感時(shí)間比p＜0.05；c)與基礎(chǔ)痛感時(shí)間比p＜0.01。

實(shí)施例39評價(jià)GQ-L、GQ-E、GQ-N、GQ-Q的抗炎活性

體重20±雄性小鼠口服1μmol/kgGQ-L、GQ-E、GQ-N、GQ-Q或1200μmol/kg阿司匹林或0.2mL/20g生理鹽水30分鐘后，往小白鼠的左耳外廓涂二甲苯(0.04mL)，2小時(shí)后將小白鼠頸椎脫臼處死。將小鼠的左，右耳剪下，用直徑7mm的打孔器在兩耳的相同位置，取圓形耳片，分別稱重，求出兩圓耳片的重量差作為腫脹度。(腫脹度＝左耳原片重量-右耳原片重量)以腫脹度表示化合物的活性。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均采用t檢驗(yàn)和方差分析，腫脹度以表示。結(jié)果表明，GQ-E治療的鼠耳腫脹度與生理鹽水組相比具有顯著性差異，表明化合物具有確切的抗炎活性。

表2 GQ-L、GQ-E、GQ-N、GQ-Q的抗炎活性

n＝14；a)與生理鹽水組比較，p＜0.01。

實(shí)施例40評價(jià)GQ-L、GQ-E、GQ-N、GQ-Q的抗腫瘤活性

無菌條件下取接種于ICR小鼠7-10天的S180肉瘤，加入適量生理鹽水配制成瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為2×10⁷/mL，接種于健康雄性ICR小鼠前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2mL。腫瘤接種24h后，小鼠每日腹腔注射0.2mLGQ-L、GQ-E、GQ-N、GQ-Q的生理鹽水溶液，連續(xù)給藥10天，劑量為1μmol/kg；或小鼠每日腹腔注射0.2mL阿霉素的生理鹽水溶液，連續(xù)給藥10天，劑量為2μmol/kg；或小鼠每日腹腔注射0.2mL生理鹽水，連續(xù)給藥10天。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第11天，稱小鼠體重，乙醚麻醉剖取各組小鼠的腫瘤，稱重并以瘤重表示化合物的活性，數(shù)據(jù)列入表3。結(jié)果表明1μmol/kgGQ-L、GQ-N、GQ-E治療小鼠的瘤重明顯小于生理鹽水治療小鼠的瘤重，顯示確切的抗腫瘤活性。

表3 GQ-L、GQ-E、GQ-N、GQ-Q對S180荷瘤小鼠的瘤重的影響

n＝15；a)與生理鹽水比p＜0.01。

實(shí)施例41評價(jià)GQ-L、GQ-E、GQ-N、GQ-Q的抗血栓活性

1)將聚乙烯管拉成一端為斜口的細(xì)管，定長為10.0cm，分別為右經(jīng)靜脈(管徑較粗)及左頸動脈(管徑較細(xì))插管；中段聚乙烯管定長為8.0cm，血栓線壓在頸動脈插管方向，插管前需在管中充滿肝素。

2)體重250±雄性大鼠口服1μmol/kgGQ-L、GQ-E、GQ-N、GQ-Q或167μmol/kg阿司匹林或0.3mL/100g生理鹽水30分鐘后，腹腔注射20％的烏拉坦進(jìn)行麻醉。仰臥位將大鼠固定于鼠板上，剪開頸部皮膚，分離右頸總動脈及左頸靜脈，血管下壓線，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，靜脈靠遠(yuǎn)心端處剪一小口，進(jìn)行靜脈端插管，注射肝素，系線固定，再用動脈夾夾住動脈近心端，靠近遠(yuǎn)心端方向剪一小口，進(jìn)行動脈端結(jié)扎，系線固定后松開動脈夾，建立體外循環(huán)旁路。循環(huán)15分鐘后先剪斷靜脈端觀察血液循環(huán)是否正常，若正常從動脈端取出血栓線，在紙上沾干浮血后稱重，以栓重表示化合物的活性，數(shù)據(jù) 列入表4。結(jié)果表明，GQ-N、GQ-L治療大鼠的血栓重明顯小于生理鹽水治療大鼠的血栓重，顯示確切的抗血栓活性。

表4化合物GQ-L、GQ-E、GQ-N、GQ-Q對SD大鼠栓重的影響

n＝12；a)與生理鹽水比p＜0.05；b)與生理鹽水比p＜0.01。

實(shí)施例41評價(jià)GQ-L、GQ-N、GQ-E、GQ-Q的溶栓活性

將大鼠靜息飼養(yǎng)一天，隨機(jī)分組，每組10只，禁食不禁水。

1)將體重250±雄性SD大鼠用20％烏拉坦溶液進(jìn)行麻醉(6mL/kg腹腔)。麻醉后的大鼠固定于鼠板上，分離右側(cè)頸總動脈，于近心端夾動脈夾，近心端和遠(yuǎn)心端分別傳入手術(shù)線，在遠(yuǎn)心端插取血管，松開動脈夾取約1mL動脈血。迅速將動脈血注射入垂直的造栓管(長16mm，內(nèi)徑2.5mm，外徑5mm，管底用1mL EP管底座)中，(注意不可有氣泡)每個造栓管中注入0.1mL大鼠動脈血液，往管內(nèi)迅速插入血栓固定螺栓(長20mm，)，血液凝固40min，用針灸針取出血栓，稱取血栓重量。

2)旁路插管由三部分組成，其中中段為聚乙烯膠管，長60mm，內(nèi)徑3.5mm，兩端為相同的聚乙烯管，長100mm，內(nèi)徑1mm，外景2mm，該管的一段拉成尖管，另一端的外部套一段長7mm，外徑3.5mm的聚乙烯管。三段管的內(nèi)壁均為硅烷化。

3)將血栓包裹的血栓固定螺栓置于中段的聚乙烯膠管內(nèi)，膠管的兩端分別與兩根聚乙烯的加粗端相套，用注射器通過尖管端注滿肝素生理鹽水溶液。將充滿肝素鈉的生理鹽水溶液一端插入左側(cè)靜脈，另一端用注射器加入準(zhǔn)確量的肝素鈉抗凝后，拔掉肝素鈉的注射器，插入動脈端。用頭皮針將生理鹽水(3mL/kg)或者尿激酶的生理鹽水溶液(20000IU/kg)或GQ-L、GQ-N、GQ-E、GQ-Q的生理鹽水溶液(1μmol/kg)通過旁路管的中段，刺入遠(yuǎn)離血栓固定螺栓的近靜脈處，打開動脈夾，使血流通過旁路管道從動脈流入靜脈的時(shí)刻為循環(huán)起始時(shí)間，緩慢的將注射器中的液體注入到血液中(約6min)，使生理鹽水，尿激酶，Arg-Leu-Val-Cys-Val通過血液循環(huán)，按靜脈-心臟-動脈的順序作用到 血栓上。60min后取出附有血栓的螺栓，蘸去浮血，記錄重量。以血栓減重代表溶栓活性。數(shù)據(jù)列入表5。結(jié)果表明，GQ-L、GQ-N、GQ-E、治療大鼠的血栓減重明顯大于生理鹽水治療大鼠的血栓減重，顯示確切的溶血栓活性。

表5 GQ-L、GQ-N、GQ-E、GQ-Q的溶栓活性

n＝10；a)與生理鹽水比p＜0.01。