本發(fā)明屬于生物工程技術領域，具體涉及猴源GII.17型諾如病毒P結構域及其變體的目的蛋白，以及純化方法和應用。

背景技術：

諾如病毒(Norovirus,NoV)是導致成人和兒童非細菌性急性胃腸炎的主要病原體，是近年來導致人類由腹瀉引起的發(fā)病率和死亡率增高的主要原因，諾如病毒可在所有年齡段、不同場所(幼兒園、學校、養(yǎng)老院、餐館等)引起暴發(fā)。諾如病毒感染的特征為突然發(fā)病，嘔吐、腹痛和水樣腹瀉，可伴有發(fā)燒和頭痛等，所有年齡人群對該病毒均敏感，一般潛伏期為24h～48h，病程為2d～3d，雖然常自愈，但不斷出現(xiàn)的新流行株仍對人類健康造成很大威脅。

諾如病毒根據(jù)其RNA多聚酶區(qū)和衣殼蛋白區(qū)序列同源性差異可分為6個基因組：GI、GII、GIII、GIV、GV和GVI。其中，GI、GII、GIV主要感染人，GIII感染牛，GV感染鼠，GVI感染狗。根據(jù)ORF2全基因序列相似性，GI至少可分為9個基因型，GII至少可分為22個基因型，九十年代中期一種特異性的諾如病毒GII.4株是造成世界范圍內(nèi)諾如病毒流行的主要基因型，目前國內(nèi)流行優(yōu)勢株正逐漸轉變?yōu)镚II.17型。

諾如病毒屬于杯狀病毒科諾瓦克病毒屬，直徑約為26～35nm，無包膜，球形，呈二十面體對稱，基因組為單股正鏈RNA，全長約為7.5kb，包含三個閱讀框，ORF1長約5kb，編碼非結構蛋白，經(jīng)翻譯后修飾成6個功能蛋白，包括：N末端蛋白(P48)、NTPase、3A樣蛋白、VPg(病毒基因組連接蛋白)、3C樣蛋白和RNA依賴性RNA聚合酶(Pol)。ORF2長約1.8kb，編碼530個左右氨基酸的衣殼蛋白(VP1)，VP1蛋白折疊成兩個區(qū)域：殼區(qū)(S區(qū))和突出區(qū)(P區(qū))，其中S區(qū)為VP1的內(nèi)殼，P區(qū)位于VP1結構的殼外，包含P1和P2兩個亞區(qū)，P2亞區(qū)位于衣殼蛋白的最外層，易發(fā)生變異。ORF3長約0.6kb，編碼一個微小結構蛋白(VP2)，VP2蛋白的具體功能未知，有研究認為它可能參與病毒衣殼的構建，并有助于整個衣殼蛋白的穩(wěn)定。

由于諾如病毒目前還無法在體外進行培養(yǎng)，因此基因工程方法是目前諾如病毒疫苗研發(fā)的唯一方法。諾如病毒編碼結構蛋白VP1可形成類病毒顆粒(vires-like particles，VLPs)，其在形態(tài)和抗原方面與天然的病毒相似，是宿主識別和發(fā)生免疫應答的主要位點，是諾如病毒的重要候選疫苗之一。然而，制備VLPs需要在真核系統(tǒng)中才能很好地形成顆粒，這種方法非常復雜且產(chǎn)量不是很高。研究表明，諾如病毒的P結構域在大腸桿菌中表達后，能自然形成P顆粒，具有很好地抗原性和免疫原性。原核表達系統(tǒng)是目前掌握最為成熟的表達系統(tǒng)，也是基因工程中應用最廣泛的表達系統(tǒng)，該項技術主要方法是將已克隆入目的基因DNA片段的載體(一般為質粒)轉化細菌，通過異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導并最終純化獲得所需目的蛋白，其優(yōu)點在于操作簡單，能夠在較短時間內(nèi)獲得基因表達產(chǎn)物，所需成本相對比較低廉，外源基因表達產(chǎn)物水平高，基因背景和表達特性清楚。

由于諾如病毒基因變異性大導致諾如病毒的暴發(fā)流行，有必要通過原核系統(tǒng)研發(fā)諾如病毒的疫苗，并開發(fā)病毒感染檢測試劑盒。

技術實現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術不能有效預防諾如病毒的暴發(fā)問題，本發(fā)明提供猴源GII.17型諾如病毒P結構域及其變體的目的蛋白，通過分別構建含中和位點和受體結合位點的諾如病毒P結構域P-RGD及變體蛋白P△R，只需1次免疫注射該蛋白即可誘導小鼠產(chǎn)生較高低度的抗體，可用于后續(xù)GII.17型諾如病毒感染的檢測及疫苗研發(fā)。

本發(fā)明通過下列技術方案實現(xiàn)：猴源GII.17型諾如病毒P結構域的目的蛋白，其核苷酸基因序列如SEQ ID No.1所示。

上述猴源GII.17型諾如病毒P結構域的目的蛋白，其氨基酸基因序列如SEQ ID No.2所示。

猴源GII.17型諾如病毒P結構域變體的目的蛋白，其核苷酸基因序列如SEQ ID No.3所示。

上述GII.17型諾如病毒P結構域變體的目的蛋白，其氨基酸基因序列如SEQ ID No.4所示。

本發(fā)明的另一目的還在于提供上述猴源GII.17型諾如病毒P結構域及其變體的目的蛋白在GII.17型諾如病毒感染檢測和疫苗制備上的應用。具體地，可以用目的蛋白包被ELSIA板，檢測疑似諾如病毒感染的病人血清。

上述猴源GII.17型諾如病毒P結構域及其變體的目的蛋白，是經(jīng)過下列步驟得到：

(1)將pGEX-4T-1質粒用BamH I和Not I進行雙酶切，1％瓊脂糖核酸膠酶切后進行基因回收，得到含GST標簽的線性pGEX-4T-1載體質粒；

(2)將腹瀉猴子的糞便制成懸液，通過RT-PCR技術及測序獲得猴源GII.17諾如病毒VP1基因序列，按照大腸桿菌密碼子使用的偏好性優(yōu)化VP1蛋白的核苷酸序列，人工合成VP1基因；以此基因為模板，通過如下P-RGD引物和PΔR引物進行PCR擴增，分別得到含RGD序列的P結構域基因(P-RGD)和不含精氨酸聚合區(qū)的P結構域變體(PΔR)基因，即帶酶切位點的兩個質粒P-RGD、P△R：

P-RGD引物F：tctggttccg cgtggatcct ctaaaaccaa acc

R：1、gcagaagcag tcaccacggc agtcgcactg cgcacgacgg

2、cagtcagtca cgatgcggcc gcttagcaga agcagtcacc ac

PΔR引物F：tctggttccg cgtggatcct ctaaaaccaa acc

R：cagtcagtca cgatgcggcc gcttacccat tcccggtgc

擴增后的基因片段純化后通過無縫拼接分別克隆進入步驟(1)的含GST標簽的線性pGEX-4T-1載體質粒，得到兩個原核表達質粒P-RGD-GST和PΔR-GST；

(3)將步驟(2)得到的兩個原核表達質粒P-RGD-GST和PΔR-GST分別轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，涂布含有氨芐西林的LB平板并篩選陽性克隆，將陽性克隆進行培養(yǎng)后提取質粒并送測序驗證；

(4)將步驟(3)測序驗證正確的質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞(市購)，經(jīng)過菌落PCR擴增(擴增所使用的引物同步驟2的引物，擴增是為了初步鑒定質粒構建是否成功)，鑒定質粒構建成功后，即得到P-RGD-GST、PΔR-GST表達克隆子；

(5)利用IPTG誘導步驟(4)得到的P-RGD-GST、PΔR-GST表達克隆子，得到高效表達的P-RGD-GST、PΔR-GST目的蛋白，用超聲方法對目的蛋白進行細胞壁破碎，經(jīng)離心，分別收集上清和沉淀，SDS-PAGE電泳鑒定各蛋白存在形式，用GST親和純化柱對P-RGD-GST、PΔR-GST重組蛋白進行純化，用Thrombin酶切掉GST標簽，純化后分別得到P-RGD和PΔR目的蛋白。

所述步驟(2)的猴源GII.17諾如病毒VP1基因序列的基因庫收錄號為：KX356908。

所述步驟(2)的人工合成VP1基因是5，端和3，端分別含有限制性內(nèi)切酶BamH I和Not I酶切位點序列。

所述步驟(2)的P-RGD引物有兩段下游引物，首先將上游和下游引物1進行PCR擴增，擴增后產(chǎn)物再用上游引物和下游引物2進行PCR擴增。

所述步驟(2)的無縫拼接是將帶酶切位點的兩個質粒P-RGD和P△R各取50納克，分別與100納克含GST標簽的線性pGEX-4T-1載體質粒和2微升5×Infusion HD Enzyme Premix混合，得到兩個混合樣，再分別用水補足至10微升混勻后在50℃下孵育15分鐘進行轉化，得到兩個原核表達質粒P-RGD-GST和PΔR-GST。

所述步驟(5)中高效表達和純化是經(jīng)下列具體步驟得到：

a、蛋白表達：將步驟(4)得到的P-RGD-GST、PΔR-GST表達克隆子20微升分別轉接到含0.01％氨芐西林的100mL LB培養(yǎng)基(即100mL LB培養(yǎng)基中含0.01克氨芐西林)，于37℃、220r/min的條件下培養(yǎng)至OD600為0.5時，加入IPTG至終濃度為0.5mM，于22℃、220r/min過夜誘導表達；將過夜誘導表達的菌液于12000g、4℃離心10min，棄上清；用10mL 4℃預冷的PBS(pH＝7.4)重懸菌體，于12000g、4℃離心10min，棄上清，菌體沉淀用于進一步的蛋白純化或保存于-80℃?zhèn)溆茫?/p>

b、蛋白純化：用10mL PBS(pH7.4)重懸步驟a的菌體沉淀，加入蛋白酶抑制劑PMSF至終濃度為1mM，超聲波破碎菌體后，于12000g、4℃離心10min，丟棄沉淀，收集上清10mL；將上清用0.22μm濾膜過濾后，用GST親和純化柱對P-RGD-GST、PΔR-GST重組蛋白進行純化。

用免疫印跡法分析純化得到的目的蛋白，發(fā)現(xiàn)表達純化的蛋白具有相應的抗原性，可用于GII.17型諾如病毒感染的檢測及GII.17諾如病毒亞單位疫苗的研發(fā)。

檢測所得目的蛋白的的免疫原性：免疫印跡顯示兩個蛋白免疫后均能誘導產(chǎn)生針對自身分子的抗體，ELISA法(酶聯(lián)免疫吸附法)以P/N值大于等于2判為陽性，兩個蛋白抗體滴度均可達到1:32000。

因此，所得P-RGD和PΔR目的蛋白通過免疫印跡法和ELISA驗證具有較好的抗原性，可用于GII.17型諾如病毒感染檢測試劑盒的研發(fā)。

本發(fā)明涉及從猴子糞便中分離得到的一株GII.17型諾如病毒P結構域及其變體蛋白的表達與純化，本發(fā)明主要包含：按照大腸桿菌密碼子使用的偏好性來設計VP1基因對應的核苷酸序列，通過人工方法合成相應的核苷酸序列，通過PCR得到其P結構域基因P-RGD及變體基因P△R，然后將得到的各雙鏈核苷酸基因片段通過無縫連接的方式插入到帶有GST標簽的原核表達載體pGEX-4T-1中，構建成重組質粒。將這些重組質粒轉化大腸桿菌BL21，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)進行誘導表達，通過GST親和柱純化誘導表達的蛋白，最終得到猴源GII.17型諾如病毒P結構域蛋白P-RGD及變體蛋白P△R，并通過免疫印跡法驗證了表達的蛋白具有抗原性。這2個蛋白免疫小鼠誘導產(chǎn)生的抗體效價為1:32000。本發(fā)明基于大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，將猴源GII.17的P結構域核苷酸依據(jù)大腸桿菌密碼子使用偏好性進行優(yōu)化后，實現(xiàn)了病毒蛋白的高效表達，且表達的蛋白具有很好的免疫原性，可以作為開發(fā)諾如病毒檢測試劑盒的原料。

為了便于后續(xù)的研究，設計P結構域引物時，加入了一段編碼RGD的核苷酸序列，稱之為P-RGD。設計引物時去掉P顆粒C端富含精氨酸的部分得到的就是P結構域變體，稱之為PΔR。通過原核系統(tǒng)表達并得到了純化的、具有很好抗原性的蛋白，能用于諾如病毒的疫苗研發(fā)和病毒感染檢測試劑盒的開發(fā)。

本發(fā)明的優(yōu)點和效果如下：

1)制備簡單：利用基因工程技術在原核系統(tǒng)即可實現(xiàn)高水平的重組蛋白表達，并容易得到純化的目的蛋白。

2)免疫原性強：只需要有限的免疫次數(shù)和較低劑量的抗原蛋白注射，即可以誘導高效價的特異性抗體。

3)安全：本方法構建得到的猴源GII.17型諾如病毒蛋白可用于亞單位疫苗研發(fā)，相比于滅活疫苗、減毒疫苗等，不僅不具有潛在的感染性，還去除了許多可能引起副反應的物質，只保留了能使機體產(chǎn)生中和抗體的抗原表位，安全性得到了提高，為可能暴發(fā)流行的GII.17型諾如病毒感染的檢測和疫苗研發(fā)奠定了基礎。

附圖說明

圖1為步驟(2)通過RT-PCR技術及測序獲得猴源GII.17諾如病毒VP1基因通過重組構建得到的未優(yōu)化組重組融合蛋白表達的SDS-PAGE分析；

圖2為步驟(2)的擴增產(chǎn)物的檢測圖；

圖3為步驟(2)的原核表達質粒構建示意圖；其中A為原核表達質粒P-RGD-GST的構建示意圖，B為原核表達質粒PΔR-GST的構建示意圖；

圖4為步驟(5)通過重組構建得到的優(yōu)化組重組融合蛋白表達的SDS-PAGE分析；

圖5為步驟(5)b純化后重組GST融合蛋白的SDS-PAGE分析；

圖6為步驟(5)b純化后重組GST融合蛋白的Western blot分析；

圖7為步驟(5)b所得無GST標簽目的蛋白的SDS-PAGE分析；

圖8為步驟(5)b所得無GST標簽目的蛋白的Western blot分析；

圖9為ELISA分析免疫小鼠后產(chǎn)生的特異性抗體效價；其中A為P-RGD目的蛋白的ELISA分析圖，B為PΔR目的蛋白的ELISA分析圖；

圖10為本發(fā)明所得猴源GII.17型諾如病毒P結構域及其變體的目的蛋白與genebank中最相似的序列(KX356908)的比對圖；

圖11為本發(fā)明所得猴源GII.17型諾如病毒P結構域及其變體的目的蛋白與genebank中其他最相似的序列(KT149172)的比對圖。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明做進一步說明。

(1)將pGEX-4T-1質粒(市購，其部分核苷酸基因序列如SEQ ID No.5所示)用BamH I和Not I進行雙酶切，1％瓊脂糖核酸膠酶切后進行基因回收，得到含GST標簽的線性pGEX-4T-1載體質粒；

(2)將腹瀉猴子的糞便制成懸液，用RNA提取試劑盒進行常規(guī)總RNA提取，并用逆轉錄試劑盒通過常規(guī)的逆轉錄得到總RNA逆轉錄為cDNA，經(jīng)測序比對后得到一株猴源GII.17諾如病毒VP1基因序列(其核苷酸基因序列如SEQ ID No.6所示，收錄號為：KX356908)；若將此VP1基因插入到pGEX-4T-1載體后按照本例中目的蛋白的構建及表達步驟進行未優(yōu)化組重組融合蛋白原核表達(如圖1)，發(fā)現(xiàn)未優(yōu)化組重組融合蛋白表達量較低，不足以用來做純化；

本例按照大腸桿菌密碼子使用的偏好性優(yōu)化VP1蛋白的核苷酸序列，5，端和3，端分別含有限制性內(nèi)切酶BamH I和Not I酶切位點序列，人工合成VP1基因(其核苷酸基因序列如SEQ ID No.7所示，氨基酸基因序列如SEQ ID No.8所示)，此VP1基因與從糞便中獲得的基因(收錄號為：KX356908)相似度為86％(見圖10)，與genebank中其他最相似的序列KT149172比對，相似度為85％(見圖11)；

以此基因為模板，通過如下P-RGD引物和PΔR引物進行PCR擴增，分別得到含RGD序列的P結構域基因(P-RGD)和不含精氨酸聚合區(qū)的P結構域變體(PΔR)基因(如圖2所示)，即帶酶切位點的兩個質粒P-RGD、P△R，是在genebank中找不到完全相同序列的兩個新序列；

所述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具體如下：

P-RGD引物F：tctggttccg cgtggatcct ctaaaaccaa acc

R：1、gcagaagcag tcaccacggc agtcgcactg cgcacgacgg

2、cagtcagtca cgatgcggcc gcttagcaga agcagtcacc ac

PΔR引物F：tctggttccg cgtggatcct ctaaaaccaa acc

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其中，P-RGD引物有兩段下游引物，首先將上游和下游引物1進行PCR擴增，擴增后產(chǎn)物再用上游引物和下游引物2進行PCR擴增；P-RGD引物的核苷酸基因序列如SEQ ID No.9、10和11所示；PΔR引物的核苷酸基因序列如SEQ ID No.12和13所示；

擴增后的基因片段純化后，將帶酶切位點的兩個質粒P-RGD和P△R各取50納克，分別與100納克含GST標簽的線性pGEX-4T-1載體質粒和2微升5×Infusion HD Enzyme Premix混合，得到兩個混合樣，再分別用水補足至10微升混勻后在50℃下孵育15分鐘進行轉化，即通過無縫拼接試劑盒(購自大連寶生物工程有限公司，目錄號：639636)分別克隆進入步驟(1)的含GST標簽的線性pGEX-4T-1載體質粒，得到兩個原核表達質粒P-RGD-GST和PΔR-GST(構建示意圖如圖3)；原核表達質粒P-RGD-GST的核苷酸基因序列如SEQ ID No.14所示，氨基酸基因序列如SEQ ID No.15所示；原核表達質粒PΔR-GST核苷酸基因序列如SEQ ID No.16所示，氨基酸基因序列如SEQ ID No.17所示)；

(3)將步驟(2)得到的兩個原核表達質粒P-RGD-GST和PΔR-GST分別轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞(市購)中，涂布含有氨芐西林的LB平板并篩選陽性克隆，將陽性克隆進行培養(yǎng)后提取質粒并送測序驗證；經(jīng)過測序驗證，兩個目的質粒基因均以正確的序列插入到了pGEX-4T-1載體基因序列的BamH I和Not I酶切位點之間；

(4)將步驟(3)測序驗證正確的質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞(市購)，經(jīng)過菌落PCR擴增(擴增所使用的引物同步驟2的引物，擴增是為了初步鑒定質粒構建是否成功)，鑒定質粒構建成功后，即得到P-RGD-GST、PΔR-GST表達克隆子；

(5)a、蛋白表達：將步驟(4)得到的P-RGD-GST、PΔR-GST表達克隆子20微升分別轉接到含0.01％氨芐西林的100mL LB培養(yǎng)基(即100mL LB培養(yǎng)基中含0.01克氨芐西林)，于37℃、220r/min的條件下培養(yǎng)至OD600為0.5時，加入IPTG至終濃度為0.5mM，于22℃、220r/min過夜誘導表達；將過夜誘導表達的菌液于12000g、4℃離心10min，棄上清；用10mL 4℃預冷的PBS(pH＝7.4)重懸菌體，于12000g、4℃離心10min，棄上清，菌體沉淀用于進一步的蛋白純化或保存于-80℃?zhèn)溆茫?/p>

b、蛋白純化：用10mL 4℃預冷PBS(pH7.4)重懸步驟a的菌體沉淀，加入蛋白酶抑制劑PMSF至終濃度為1mM，以30HZ功率和工作2秒停3秒的程序超聲波30分鐘破碎菌體后，于12000g、4℃離心10min，丟棄沉淀，收集上清10mL；通過SDS-PAGE分析蛋白表達情況(如圖4)，所構建的2個重組基因都得到了表達，且表達的蛋白主要在上清里；將上清用0.22μm濾膜過濾后，用GST親和純化柱(購自GE公司，目錄號：17-5131-02)對P-RGD-GST、PΔR-GST重組蛋白進行純化，并通過SDS-PAGE分析純化的蛋白，如圖5結果表明通過GST親和柱純化后，得到了較純的、預期分子量大小的蛋白；

用Thrombin酶切掉GST標簽，GST親和柱純化后分別得到P-RGD和PΔR目的蛋白，如圖7。

所得猴源GII.17型諾如病毒P結構域的目的蛋白，其核苷酸基因序列如SEQ ID No.1所示；其氨基酸基因序列如SEQ ID No.2所示。

猴源GII.17型諾如病毒P結構域變體的目的蛋白，其核苷酸基因序列如SEQ ID No.3所示；其氨基酸基因序列如SEQ ID No.4所示。

(6)重組蛋白免疫印跡檢測：

用10％SDS-PAGE凝膠對步驟(5)b純化后的重組蛋白P-RGD-GST、P△R-GST樣品進行電泳，先于80伏電泳30min，然后于150伏電泳1h(如圖5)。電泳完成后，將凝膠上的蛋白通過轉膜的形式轉移至硝酸纖維素(NC)膜上，轉膜參數(shù)為45V、1h。取出轉有蛋白的NC膜，用含5％脫脂奶粉的封閉液在常溫下封閉1hour。用PBST漂洗封閉完的NC膜一次。加一抗(1：5000)后于4℃過夜孵育，一抗為抗GST單克隆抗體(購自CAT，目錄號2625s)。次日，用PBST洗膜3次，10min/次，然后孵育辣根過氧化物酶標記的(HRP-labeled)抗鼠二抗(1：5000)(購自CST公司，目錄號：7076)，于室溫孵育2hour。用PBST洗膜3次，20min/次，最后用增強化學發(fā)光法(ECL)進行顯色，結果如圖6所示。發(fā)現(xiàn)表達純化的蛋白具有相應的抗原性，可用于GII.17型諾如病毒感染的檢測及GII.17諾如病毒亞單位疫苗的研發(fā)。

(7)檢測所得目的蛋白的的免疫原性

1)免疫原(100微升/劑)：P-RGD蛋白(20ug)+Quick Antibody新型免疫佐劑、P△R蛋白(20ug)+Quick Antibody新型免疫佐劑,佐劑(購自北京博奧龍免疫技術有限公司，目錄號：KX0210043)。

2)動物：8周齡清潔級Balb/c雄性小鼠，隨機分為2組，2只/組。

3)方法：

①免疫印跡法：分別在對應組的小鼠后腿大腿處肌肉注射兩種免疫原，左右腿各一劑，免疫后第14天眼部采血分離得到血清，用免疫印跡法分析抗體特異性和酶聯(lián)免疫吸附法測量抗體效價。免疫印跡法一抗為抗諾如病毒P-RGD、P△R小鼠血清(1:1000)，二抗為辣根過氧化物酶標記的(HRP-labeled)抗鼠IgG(1:5000)。

②ELISA法：以1微克/毫升、每孔100微升蛋白包被酶標板4℃過夜，以含5％牛血清白蛋白PBST(5％BSA-PBST)溶液于37℃封閉酶標板1hour，分別以1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:12800稀釋免疫后血清作為一抗，以HRP標記的鼠抗IgG(1:5000)為二抗，用TMB顯色液顯色30分鐘，2M H₂SO₄終止反應，于波長450納米處測定OD值，以樣品OD值與陰性對照OD值的比值(P/N)大于2，判定樣品為陽性，臨界值處對應的血清稀釋度即為抗體的最高效價。

4)檢測結果：

免疫印跡顯示兩個蛋白免疫后均能誘導產(chǎn)生針對自身分子的抗體，如圖8，ELISA法(酶聯(lián)免疫吸附法)以P/N值大于等于2判為陽性，兩個蛋白抗體滴度均可達到1:32000，如圖9。

因此，所得P-RGD和PΔR目的蛋白通過免疫印跡法和ELISA驗證具有較好的抗原性，可用于GII.17型諾如病毒感染檢測試劑盒的研發(fā)。