本發(fā)明屬于化學(xué)醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及芐基-1H-吡唑、芐基-1H-吡咯衍生物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞程序性死亡是近年研究發(fā)現(xiàn)的一種新型細(xì)胞死亡方式，是具有傳統(tǒng)壞死樣細(xì)胞死亡形態(tài)但細(xì)胞呈現(xiàn)程序性死亡的特殊細(xì)胞死亡方式。通常在凋亡通路被抑制的情況下發(fā)生，程序性死亡的細(xì)胞內(nèi)兼具凋亡和壞死混合型特征。受體相互作用蛋白1(RIP1)是決定細(xì)胞生死的交叉點(diǎn)，在細(xì)胞的存活與凋亡或程序性壞死等過程中發(fā)揮重要的作用。RIP1與另一受體相互作用蛋白3(RIP3)形成的復(fù)合物是細(xì)胞發(fā)生程序性壞死的關(guān)鍵，而RIP1是程序性壞死過程中關(guān)鍵的調(diào)控因子。RIP1的第一個(gè)小分子抑制劑Nec-1在多種人類疾病動(dòng)物模型中均顯示了明顯的作用，如缺血性損傷、神經(jīng)退行性疾病、免疫相關(guān)疾病及惡性腫瘤等。選擇性的抑制RIP1激酶活性也成為了治療相關(guān)疾病的主要策略之一。以下為已報(bào)到的壞死抑制劑：上述已報(bào)到的壞死抑制劑大部分都活性較差，且藥代性質(zhì)不佳，這限制了其進(jìn)一步的研究。因此，對(duì)RIP1激酶更佳深入的研究以期能為臨床應(yīng)用提供新的可行性靶點(diǎn)成為目前的研究難點(diǎn)和熱點(diǎn)。研發(fā)更多的RIP1激酶抑制劑從中找到活性更佳體內(nèi)效果更好的具有臨床應(yīng)用價(jià)值的小分子抑制劑具有廣闊的應(yīng)用前景。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種芐基-1H-吡唑、芐基-1H-吡咯衍生物，其結(jié)構(gòu)如式Ⅰ所示：其中，X為C、N或O；R1、R2、R5～R7獨(dú)立地為-H、-NO2、-COOH、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、或-CF3；R3、R4獨(dú)立地為-H、-NO2、-COOH、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、-CF3；或R3和R4環(huán)合為飽和的六元環(huán)、不飽和的六元環(huán)或飽和的六元雜環(huán)；所述的六元雜環(huán)含有1～3個(gè)N、O或S原子。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，X為C或N；R1、R2、R5～R7獨(dú)立地為-H、-NO2、-COOH、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、或-CF3；R3、R4獨(dú)立地為-H、-NO2、-COOH、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、-CF3；或R3和R4環(huán)合為飽和的六元環(huán)、不飽和的六元環(huán)或飽和的六元雜環(huán)；所述的六元雜環(huán)含有1～3個(gè)N、O或S原子。優(yōu)選的，X為C或N；R1、R2獨(dú)立地為-H、-NO2、-COOH、-NH2或鹵素；R3、R4獨(dú)立地為-H、-NO2、-COOH、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、-CF3；或R3和R4環(huán)合為飽和的六元環(huán)、不飽和的六元環(huán)或飽和的六元雜環(huán)；所述的六元雜環(huán)含有1～3個(gè)N、O或S原子；R5～R7獨(dú)立地為-H、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、或-CF3。進(jìn)一步優(yōu)選的，X為C或N；R1、R2獨(dú)立地為-H、-NO2、-COOH、-NH2或鹵素；R3、R4獨(dú)立地為-H、-NO2、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、-CF3；或R3和R4環(huán)合為飽和的六元環(huán)、不飽和的六元環(huán)或飽和的六元雜環(huán)；所述的六元雜環(huán)含有1～3個(gè)N或O原子；R5～R7獨(dú)立地為-H、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、或-CF3。更進(jìn)一步優(yōu)選的，X為C或N；R1、R2獨(dú)立地為-H、-NO2、-COOH、-NH2或鹵素；R3、R4獨(dú)立地為-H、-NO2、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、-CF3；或R3和R4環(huán)合為不飽和的六元環(huán)或飽和的六元雜環(huán)；所述的六元雜環(huán)含有1～3個(gè)O原子；R5～R7獨(dú)立地為-H、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、或-CF3。最優(yōu)的，X為C或N；R1、R2獨(dú)立地為-H、-NO2、-COOH、-NH2或鹵素；R3、R4獨(dú)立地為-H、-NO2、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、-CF3；或R3和R4環(huán)合為不飽和的六元環(huán)或飽和的六元雜環(huán)；所述的六元雜環(huán)含有2個(gè)O原子；R5～R7獨(dú)立地為-H、-NH2、鹵素、甲基、-CN、甲氧基、或-CF3。上述的芐基-1H-吡唑、芐基-1H-吡咯衍生物，當(dāng)X為N，R1為-NO2時(shí)，其結(jié)構(gòu)如式Ⅱ所示：其中，R2、R5～R7獨(dú)立地為-H、-NO2、-COOH、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、或-CF3；R3、R4獨(dú)立地為-H、-NO2、-COOH、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、-CF3；或R3和R4環(huán)合為飽和的六元環(huán)、不飽和的六元環(huán)或飽和的六元雜環(huán)；所述的六元雜環(huán)含有1～3個(gè)N、O或S原子。優(yōu)選的，R2為-H、-NO2、-COOH、-NH2或鹵素；R3、R4獨(dú)立地為-H、-NO2、-COOH、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、-CF3；或R3和R4環(huán)合為飽和的六元環(huán)、不飽和的六元環(huán)或飽和的六元雜環(huán)；所述的六元雜環(huán)含有1～3個(gè)N、O或S原子；R5～R7獨(dú)立地為-H、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、或-CF3。優(yōu)選的，R2為-H或鹵素；R3、R4獨(dú)立地為-H、-NO2、-COOH、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、-CF3；或R3和R4環(huán)合為飽和的六元環(huán)、不飽和的六元環(huán)或飽和的六元雜環(huán)；所述的六元雜環(huán)含有1～3個(gè)N、O或S原子；R5～R7獨(dú)立地為-H、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、或-CF3。進(jìn)一步優(yōu)選的，R2為-H；R3、R4獨(dú)立地為-H、-NO2、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、-CF3；或R3和R4環(huán)合為飽和的六元環(huán)、不飽和的六元環(huán)或飽和的六元雜環(huán)；所述的六元雜環(huán)含有1～3個(gè)N或O原子；R5～R7獨(dú)立地為-H、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、或-CF3。更進(jìn)一步優(yōu)選的，R2為-H；R3、R4獨(dú)立地為-H、-NO2、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、-CF3；或R3和R4環(huán)合為不飽和的六元環(huán)或飽和的六元雜環(huán)；所述的六元雜環(huán)含有1～3個(gè)O原子；R5～R7獨(dú)立地為-H、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、或-CF3。最優(yōu)的，R2為-H；R3、R4獨(dú)立地為-H、-NO2、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、-CF3；或R3和R4環(huán)合為不飽和的六元環(huán)或飽和的六元雜環(huán)；所述的六元雜環(huán)含有2個(gè)O原子；R5～R7獨(dú)立地為-H、-NH2、鹵素、甲基、-CN、甲氧基、或-CF3。上述的芐基-1H-吡唑、芐基-1H-吡咯衍生物，當(dāng)R3和R6為-F時(shí)，其結(jié)構(gòu)如式Ⅲ所示：其中，X為C或N；R1、R2、R5、R7獨(dú)立地為-H、-NO2、-COOH、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基或-CF3；R4為-H、-NO2、-COOH、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、-CF3。優(yōu)選的，X為C或N；R1、R2獨(dú)立地為-H、-NO2、-COOH、-NH2或鹵素；R4為-H、-NO2、-COOH、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、-CF3；R5、R7獨(dú)立地為-H、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基或-CF3。進(jìn)一步優(yōu)選的，X為C或N；R1、R2獨(dú)立地為-H、-NO2、-COOH、-NH2或鹵素；R4為-H；R5、R7獨(dú)立地為-H、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基或-CF3。更進(jìn)一步優(yōu)選的，X為C或N；R1、R2獨(dú)立地為-H、-NO2、-COOH、-NH2或鹵素；R4為-H；R5、R7獨(dú)立地為-H或C1～C4烷基。最優(yōu)的，X為C或N；R1、R2獨(dú)立地為-H、-NO2、-COOH、-NH2或鹵素；R4為-H；R5、R7獨(dú)立地為-H。上述的芐基-1H-吡唑、芐基-1H-吡咯衍生物，其結(jié)構(gòu)式如下所示：本發(fā)明還提供了上述芐基-1H-吡唑、芐基-1H-吡咯衍生物的制備方法。合成路線為：其中，X為C、N或O；Y為鹵素；R1、R2、R5～R7獨(dú)立地為-H、-NO2、-COOH、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基或-CF3；R3、R4獨(dú)立地為-H、-NO2、-COOH、-NH2、鹵素、C1～C4烷基、-CN、C1～C4烷氧基、-CF3；或R3和R4環(huán)合為飽和的六元環(huán)、不飽和的六元環(huán)或飽和的六元雜環(huán)；所述的六元雜環(huán)含有1～3個(gè)N、O或S原子。上述芐基-1H-吡唑、芐基-1H-吡咯衍生物的制備方法，包括以下操作步驟：(1)首先在有機(jī)溶劑中，將3-R1吡唑/吡咯與鹵代試劑反應(yīng)，得到3-R1-4-Br吡唑/；(2)再與反應(yīng)得到式Ⅰ化合物；其中，步驟(1)中所述的有機(jī)溶劑為丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、氯仿惰性溶劑等。所述 的鹵代試劑為NBS、NIS、NCS或鹵素，其用量為1～2個(gè)當(dāng)量。所述反應(yīng)的溫度為0～90℃，反應(yīng)的時(shí)間為3～12h。其中，步驟(2)中所述反應(yīng)的溶劑選用丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、氯仿等。所述反應(yīng)的溫度為0～100℃，反應(yīng)的時(shí)間為0.5～3h。同時(shí)，所述反應(yīng)中要加入1～2個(gè)當(dāng)量的K2CO3和催化量的四丁基溴化銨。上述芐基-1H-吡唑、芐基-1H-吡咯衍生物包括了它們的同位素化合物、外消旋體、旋光活性異構(gòu)體、多晶型形式或其混合物。本發(fā)明還提供了式Ⅰ～Ⅲ所示的芐基-1H-吡唑、芐基-1H-吡咯衍生物藥學(xué)上可接受的鹽或水合物。本發(fā)明還提供了上述芐基-1H-吡唑、芐基-1H-吡咯衍生物的前藥，依據(jù)本發(fā)明，前藥是上述化合物的衍生物，它們自身可能具有較弱的活性或甚至沒有活性，但是在給藥后，在生理?xiàng)l件下(例如通過代謝、溶劑分解或另外的方式)被轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的生物活性形式。一種藥物組合物，是由式Ⅰ～Ⅲ所示的芐基-1H-吡唑、芐基-1H-吡咯衍生物、及其鹽或水合物添加藥學(xué)上可以接受的輔助性成分制備而成的。式Ⅰ～Ⅲ所示的芐基-1H-吡唑、芐基-1H-吡咯衍生物、及其鹽或水合物在制備RIP1激酶抑制劑中的用途。式Ⅰ～Ⅲ所示的芐基-1H-吡唑、芐基-1H-吡咯衍生物、及其鹽或水合物在制備治療缺血性損傷、神經(jīng)退行性疾病、免疫相關(guān)疾病或惡性腫瘤藥物中的用途。本發(fā)明提供的芐基-1H-吡唑、芐基-1H-吡咯衍生物，對(duì)RIP1激酶抑制活性顯著，體內(nèi)治療缺血性心肌細(xì)胞壞死效果明顯。該系列衍生物的溶解性較好，較Nec系列化合物在療效和藥代性質(zhì)上均有較大改善。同時(shí)，本發(fā)明提供的芐基-1H-吡唑、芐基-1H-吡咯衍生物，其合成方法簡(jiǎn)單，適合大規(guī)模生產(chǎn)。附圖說明圖1化合物3p及Nec-1的細(xì)胞活性測(cè)試曲線圖。圖2化合物3p及Nec-1的免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)。圖3化合物3p及Nec-1的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。圖4化合物3p治療后心肌細(xì)胞HE染色結(jié)果圖。其中，a為假手術(shù)組，b為空白組，c為實(shí)驗(yàn)組。圖5化合物4f及Nec-1的細(xì)胞活性測(cè)試曲線圖。圖6化合物4f的免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)。圖7化合物4f的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。圖8化合物4f治療后胰腺組織HE染色結(jié)果圖。其中，a為假手術(shù)組，b為空白組，c為實(shí)驗(yàn)組。具體實(shí)施方式實(shí)施例14-氯-3-硝基-1H-吡唑(中間體2a)的制備向反應(yīng)瓶中加入3-硝基-1H-吡唑(5mmol)、NBS(5.5mmol)，加入20mLDMF(N,N-二甲基甲酰胺)，然后加熱至90℃，氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)過夜。反應(yīng)完全后，減壓蒸餾除去大部分DMF，加水后析出大量固體，過濾，20mL水洗，固體干燥后得目標(biāo)產(chǎn)品，淡黃色固體。(收率87％)1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:14.32(s,1H),8.37(s,1H)；MS(ESI),m/z:148.1[M+H]+。中間體2b，2c用上述相同方法制備得到。實(shí)施例24-溴-3-硝基-1H-吡唑(中間體2b)的制備采用與制備中間體2a相同方法，制備得到中間體2b，產(chǎn)率55％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:14.38(s,1H),8.45(s,1H)；m/z:192.2[M+H]+。實(shí)施例34-碘-3-硝基-1H-吡唑(中間體2c)的制備采用與制備中間體2a相同方法，制備得到中間體2c，產(chǎn)率20％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:14.31(s,1H),8.27(s,1H)；MS(ESI),m/z:148.1[M+H]+。實(shí)施例44-溴-1-(2,5-二氟芐基)-3-硝基-1H-吡唑(化合物4f)的制備向50mL反應(yīng)瓶中加入3-硝基-4-溴-1H-吡唑(8.9mmol)、2,5-二氟溴芐(9.7mmol)、碳酸鉀(26.7mmol)和催化量四丁基溴化銨，加入20mLN,N-二甲基甲酰胺，常溫下攪拌1h。反應(yīng)完全后將反應(yīng)液10mL水中，析出大量白色固體，過濾，將固體干燥后得到黃色固體即 為產(chǎn)品。(收率92％)1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.50(s,1H),7.33(dd,J＝12.4,8.0Hz,3H),5.52(s,2H)；MS(ESI),m/z:274.2[M+H]+。實(shí)施例51-(萘-1-基甲基)-3-硝基-1H-吡唑(化合物3a)的制備以1-溴甲基萘和3-硝基-1H-吡唑?yàn)樵?，采用與實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物3a，產(chǎn)率85％，白色固體。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ:8.18(s,1H)，8.17(d,J＝4.4Hz,1H)，7.98(t,J＝9.6Hz,2H)，7.63-7.52(m,3H)，7.43(d,J＝7.2Hz,1H)，7.08(d,J＝2.4Hz,1H)，5.99(s,2H)；MS(ESI),m/z:254.1[M+H]+。實(shí)施例61-((2,3-二氫苯并[b][1,4]二氧六環(huán)-6-基)甲基)-3-硝基-1H-吡唑(化合物3b)的制備以1-溴甲基苯并二氧六環(huán)和3-硝基-1H-吡唑?yàn)樵?，采用與實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物3b，產(chǎn)率：75％，白色固體。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.12(d,J＝2.5Hz,1H),7.05(d,J＝2.5Hz,1H),6.89(d,J＝1.4Hz,1H),6.88–6.78(m,2H),5.32(s,2H),4.23(s,4H)；MS(ESI),m/z:261.9[M+H]+。實(shí)施例74'-((3-硝基-1H-吡唑-1-基)甲基)-[1,1聯(lián)苯]-2-氰基(化合物3c)的制備以4'-溴甲基-[1,1聯(lián)苯]-2-氰基和3-硝基-1H-吡唑?yàn)樵?，采用與實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物3c，產(chǎn)率：97％，白色固體。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.25(d,J＝2.8Hz,1H),7.96(d,J＝7.2Hz,1H),7.80(t,J＝7.6Hz,1H),7.63(d,J＝6.8Hz,2H),7.59(d,J＝8.4Hz,2H),7.49(d,J＝8.4Hz,2H),7.12(d,J＝2.4z,1H),5.58(s,2H)；MS(ESI),m/z:305.4[M+H]+。實(shí)施例81-芐基-3-硝基-1H-吡唑(化合物3d)的制備以芐基和3-硝基-1H-吡唑?yàn)樵?，采用與實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物3d，產(chǎn)率：90％，白色固體。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.17(d,J＝2.8Hz,1H),7.41-7.33(m,5H),7.08(d, J＝2.8Hz,1H),5.48(s,2H)；MS(ESI),m/z:204.2[M+H]+。實(shí)施例91-(2-氯芐基)-3-硝基-1H-吡唑(化合物3e)的制備以2-氯氯芐和3-硝基-1H-吡唑?yàn)樵希捎门c實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物3e，產(chǎn)率：87％,白色固體。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.15(d,J＝2.4Hz,1H),7.53(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),7.40(qd,J＝7.2,2.0Hz,2H),7.26(dd,J＝7.2,2.0Hz,1H),7.10(d,J＝2.8Hz,1H),5.60(s,2H)；MS(ESI),m/z:238.1[M+H]+。實(shí)施例101-(3-氯芐基)-3-硝基-1H-吡唑(化合物3f)的制備以3-氯氯芐和3-硝基-1H-吡唑?yàn)樵?，采用與實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物3f，產(chǎn)率：85％,白色固體。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.19(s,1H),7.43(d,J＝4.0Hz,3H),7.29(s,1H),7.09(s,1H),5.50(s,2H)；MS(ESI),m/z:238.3[M+H]+。實(shí)施例111-(4-氯芐基)-3-硝基-1H-吡唑(化合物3g)的制備以4-氯氯芐和3-硝基-1H-吡唑?yàn)樵?，采用與實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物3g，產(chǎn)率：86％,白色固體。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.18(d,J＝2.8Hz,1H),7.46(d,J＝8.4Hz,2H),7.36(d,J＝8.4Hz,2H),7.09(d,J＝2.4Hz,1H),5.48(s,2H)；MS(ESI),m/z:238.3[M+H]+。實(shí)施例121-(4-甲氧基芐基)-3-硝基-1H-吡唑(化合物3h)的制備以4-甲氧基溴芐和3-硝基-1H-吡唑?yàn)樵希捎门c實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物3h，產(chǎn)率：89％,白色固體。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.12(d,J＝2.4Hz,1H),7.32(d,J＝8.8Hz,2H),7.05(d,J＝2.8Hz,1H),6.94(d,J＝8.8Hz,2H),5.38(s,2H),3.75(s,3H)；MS(ESI),m/z:234.2[M+H]+。實(shí)施例134-((3-硝基-1H-吡唑-1-基)甲基)苯胺(化合物3i)的制備以4-氨基溴芐和3-硝基-1H-吡唑?yàn)樵希捎门c實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物3i，產(chǎn)率：45％,黃色固體。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.03(d,J＝2.4Hz,1H),7.05(d,J＝8.0Hz,2H),7.03(d,J＝2.4Hz,1H),6.54(d,J＝8.4Hz,2H),5.22(s,2H),3.18(s,2H)；MS(ESI),m/z:219.1[M+H]+。實(shí)施例143-硝基-1-(4-(三氟甲基)芐基)-1H-吡唑(化合物3j)的制備以4-三氟甲基溴芐和3-硝基-1H-吡唑?yàn)樵?，采用與實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物3j，產(chǎn)率：92％,白色固體。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.22(d,J＝2.4Hz,1H),7.77(d,J＝8.0Hz,2H),7.53(d,J＝8.0Hz,2H),7.12(d,J＝2.4Hz,1H),5.61(s,2H)；MS(ESI),m/z:272.1[M+H]+。實(shí)施例151-(4-溴芐基)-3-硝基-1H-吡唑(化合物3k)的制備以4-溴溴芐和3-硝基-1H-吡唑?yàn)樵希捎门c實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物3k，產(chǎn)率：93％，白色固體。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.17(d,J＝2.4Hz,1H),7.60(d,J＝8.4Hz,2H),7.30(d,J＝8.4Hz,2H),7.09(d,J＝2.4Hz,1H),5.47(s,2H)；MS(ESI),m/z:281.9[M+H]+。實(shí)施例161-(2-甲基芐基)-3-硝基-1H-吡唑(化合物3l)的制備以2-甲基溴芐和3-硝基-1H-吡唑?yàn)樵?，采用與實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物3l，產(chǎn)率：96％，白色固體。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.08(d,J＝2.4Hz,1H),7.26-7.18(m,3H),7.11(s,1H),7.08(d,J＝2.4Hz,1H),5.50(s,2H),2.31(s,3H)；MS(ESI),m/z:218.1[M+H]+。實(shí)施例171-(2-溴芐基)-3-硝基-1H-吡唑(化合物3m)的制備以2-溴溴芐和3-硝基-1H-吡唑?yàn)樵?，采用與實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物3m，產(chǎn)率：92％，白色固體。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.14(d,J＝2.4Hz,1H),7.70(d,J＝7.6Hz,1H),7.42(t,J＝7.6Hz,1H),7.33(t,J＝7.6Hz,1H),7.19(d,J＝7.6Hz,1H),7.11(d,J＝2.8Hz,1H),5.57(s,2H)；MS(ESI),m/z:282.1[M+H]+。實(shí)施例181-(3,4-二氟芐基)-3-硝基-1H-吡唑(化合物3n)的制備以3,4-二氟溴芐和3-硝基-1H-吡唑?yàn)樵?，采用與實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物3n，產(chǎn)率：90％,白色固體。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.18(d,J＝2.8Hz,1H),7.50-7.43(m,2H),7.23-7.20(m,1H),7.09(d,J＝2.4Hz,1H),5.48(s,2H)；MS(ESI),m/z:240.5[M+H]+。實(shí)施例191-(2,4-二氟芐基)-3-硝基-1H-吡唑(化合物3o)的制備以2,4-二氟溴芐和3-硝基-1H-吡唑?yàn)樵希捎门c實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物3o，產(chǎn)率：91％,白色固體。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.15(d,J＝2.4Hz,1H),7.49(q,J＝8.4Hz,1H),7.33(td,J＝8.4,2.4Hz,1H),7.15(td,J＝8.4,2.4Hz,1H),7.08(d,J＝2.4Hz,1H),5.52(s,2H)；MS(ESI),m/z:240.6[M+H]+。實(shí)施例201-(2,5-二氟芐基)-3-硝基-1H-吡唑(化合物3p)的制備以2,5-二氟溴芐和3-硝基-1H-吡唑?yàn)樵?，采用與實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物3p，產(chǎn)率：98％,白色固體。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.17(d,J＝2.4Hz,1H),7.34-7.24(m,3H),7.09(d,J＝2.4Hz,1H),5.54(s,2H)；MS(ESI),m/z:240.1[M+H]+。實(shí)施例211-(3,5-二氟芐基)-3-硝基-1H-吡唑(化合物3q)的制備以3,5-二氟溴芐和3-硝基-1H-吡唑?yàn)樵希捎门c實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物3q，產(chǎn)率：94％,白色固體。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.20(d,J＝2.4Hz,1H),7.24(t,J＝9.2Hz,1H),7.09(d,J＝8.4Hz,2H),7.07(d,J＝2.4Hz,1H),5.52(s,2H)；MS(ESI),m/z:240.2[M+H]+。實(shí)施例221-(2-氯-4-氟芐基)-3-硝基-1H-吡唑(化合物3r)的制備以2-氯-4-氟溴芐和3-硝基-1H-吡唑?yàn)樵希捎门c實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物3r，產(chǎn)率：95％,白色固體。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.15(d,J＝2.8Hz,1H),7.50(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),7.40(t,J＝7.2Hz,1H),7.10(td,J＝8.4,2.4Hz,1H),7.10(d,J＝2.8Hz,1H),5.57(s,2H)；MS(ESI),m/z:256.0[M+H]+。實(shí)施例231-(2,5-二氯芐基)-3-硝基-1H-吡唑(化合物3s)的制備以2,5-二氯氯芐和3-硝基-1H-吡唑?yàn)樵?，采用與實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物3s，產(chǎn)率：90％,白色固體。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.19(d,J＝2.4Hz,1H),7.57(d,J＝8.4Hz,1H),7.51(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),7.42(d,J＝2.0Hz,1H),7.11(d,J＝2.4Hz,1H),5.58(s,2H)；MS(ESI),m/z:272.1[M+H]+。實(shí)施例241-(5-氯-2-氟芐基)-3-硝基-1H-吡唑(化合物3t)的制備以5-氯-2-氟溴芐和3-硝基-1H-吡唑?yàn)樵希捎门c實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物3t，產(chǎn)率：97％,白色固體。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.18(d,J＝2.4Hz,1H),7.53-.7.49(m,2H),7.36-7.32(m,1H),7.09(d,J＝2.4Hz,1H),5.54(s,2H)；MS(ESI),m/z:256.2[M+H]+。實(shí)施例251-(3-氯-4-((3-硝基-1H-吡唑-1-基)甲基)苯基)-4-甲基哌啶(化合物3u)的制備將化合物3r(100mg,0.4mmol)置于100mL圓底燒瓶中，加入3mLN-甲基哌啶，滴 加三乙胺(155mg,1.2mmol)，常溫反應(yīng)過夜。反應(yīng)完全后，加入10mL水中，析出大量固體，過濾，減壓干燥得到化合物3u，黃色固體，產(chǎn)率75％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.03(d,J＝2.4Hz,1H),7.25(d,J＝8.8Hz,1H),7.05(d,J＝2.4Hz,1H),7.00(d,J＝2.4Hz,1H),6.94(d,J＝2.0Hz,1H),6.92(d,J＝2.4Hz,1H),5.43(s,2H),3.19(t,J＝4.4Hz,4H),2.42(d,J＝4.4Hz,4H),2.21(s,3H)；MS(ESI),m/z:336.1[M+H]+。實(shí)施例261-(2,5-二氟芐基)-1H-吡唑(化合物4a)的制備以2,5-二氟溴芐和吡唑?yàn)樵?，采用與實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物4a，產(chǎn)率：87％，藍(lán)色固體。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.88(d,J＝2.1Hz,1H),7.52(d,J＝1.4Hz,1H),7.28(dt,J＝9.2,4.6Hz,1H),7.21(dd,J＝8.0,3.8Hz,1H),6.94(ddd,J＝8.9,5.7,3.2Hz,1H),6.31(t,J＝1.8Hz,1H),5.42(s,2H)；MS(ESI),m/z:195.2[M+H]+。實(shí)施例271-(2,5-二氟芐基)-1H-吡唑-3-羧酸(化合物4b)的制備以2,5-二氟溴芐和3-羧基吡唑?yàn)樵?，采用與實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物4b，產(chǎn)率：75％,白色固體。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:12.75(s,1H),7.95(d,J＝2.0Hz,1H),7.35–7.14(m,3H),7.08(d,J＝8.4Hz,1H),5.51(s,2H)；MS(ESI),m/z:237.1[M-H]+。實(shí)施例281-(2,5-二氟芐基)-1H-吡唑-3-胺(化合物4c)的制備以2,5-二氟溴芐和3-氨基吡唑?yàn)樵?，采用與實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物4c，產(chǎn)率：75％,白色固體。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.12(t,J＝5.3Hz,1H),7.03–6.93(m,1H),6.90–6.79(m,1H),6.79–6.67(m,1H),5.46(d,J＝1.2Hz,1H),5.45(s,2H),4.24(s,2H)；MS(ESI),m/z:210.1[M+H]+。實(shí)施例291-(2,5-二氟芐基)-4-硝基-1H-吡唑(化合物4d)的制備以2,5-二氟溴芐和4-硝基吡唑?yàn)樵?，采用與實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物4d，產(chǎn)率：75％,白色固體。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.05(s,1H),8.30(s,1H),7.30(dtd,J＝16.2,8.6,5.1Hz,3H),5.47(s,2H)；MS(ESI),m/z:240.2[M+H]+。實(shí)施例304-氯-1-(2,5-二氟芐基)-3-硝基-1H-吡唑(化合物4e)的制備以2,5-二氟溴芐和3-硝基-4-氯-1H-吡唑?yàn)樵希捎门c實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物4e，產(chǎn)率：92％,黃色固體。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.50(s,1H),7.33(dd,J＝12.4,8.0Hz,3H),5.52(s,2H)；MS(ESI),m/z:274.2[M+H]+。實(shí)施例314-溴-1-(2,5-二氟芐基)-3-硝基-1H-吡唑(4f)的制備以2,5-二氟溴芐和3-硝基-4-溴-1H-吡唑?yàn)樵希捎门c實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物4f，產(chǎn)率：89％，棕色固體。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.49(s,1H)，7.48–7.20(m,3H)，5.53(s,2H)；MS(ESI)，m/z:318.2[M+H]+。實(shí)施例321-(2,5-二氟芐基)-4-碘-3-硝基-1H-吡唑(化合物4g)的制備以2,5-二氟溴芐和3-硝基-4-碘-1H-吡唑?yàn)樵?，采用與實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物4g，產(chǎn)率：90％，黃色固體。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.37(s,1H),7.54–7.11(m,3H),5.52(s,2H)；MS(ESI),m/z:365.9[M+H]+。實(shí)施例331-(2,5-二氟芐基)-4-碘-3-硝基-1H-吡咯(化合物4h)的制備以2,5-二氟溴芐和3-硝基-1H-吡咯為原料，采用與實(shí)施例4相同的操作步驟，制備得到化合物4h。1HNMR(400MHz,DMSO)δ8.15(t,J＝1.9Hz,1H),7.23(tt,J＝9.4,2.2Hz,1H),7.17–7.09(m,2H),7.07(t,J＝2.7Hz,1H),6.71(dd,J＝2.9,1.9Hz,1H),5.22(s,2H)；MS(ESI),m/z:239.1[M+H]+。實(shí)施例34細(xì)胞程序性壞死抑制活性實(shí)驗(yàn)1、細(xì)胞株：HT-29細(xì)胞購(gòu)置于美國(guó)ATCC(美國(guó)菌種保藏中心)，并保種于四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。2、細(xì)胞水平測(cè)試試驗(yàn)方法：選用HT-29細(xì)胞株，按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)。采用四氮唑鹽MTT還原法，將藥物與細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)，貼壁細(xì)胞需先貼壁24小時(shí)后再給藥。給藥同時(shí)加腫瘤壞死因子TNFα(購(gòu)于Peprotech公司)，凋亡抑制蛋白cIAP的抑制劑Smacmimetic(購(gòu)于Selleck公司)，含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶caspase的抑制劑Z-VAD-FMK(購(gòu)于APExBIO公司)以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生壞死。同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和誘導(dǎo)組和空白組，考察化合物3p抑制細(xì)胞程序性壞死的作用。具體操作如下：a)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁HT-29細(xì)胞，用0.25％胰酶(購(gòu)于Hyclone公司，SH30042.01)消化后，用含10％胎牛血清(購(gòu)自蘭州民海生物公司)的相應(yīng)的DMEM完全培養(yǎng)基(購(gòu)于Gibco公司，11965-92)配成4000個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種200μL，37℃，5％CO2培養(yǎng)24h。實(shí)驗(yàn)組換新的含不同濃度被測(cè)樣品的培養(yǎng)基，對(duì)照組則換含等體積溶劑的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組同時(shí)加入TNFα，Smacmimetic，Z-VAD-FMK以誘導(dǎo)，空白組不加，每組設(shè)3～5個(gè)平行孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)1d。b)棄去上清液，每孔加入200μL新鮮配制的含0.2mg/mLMTT(購(gòu)于Thermoscientific公司)的無血清培養(yǎng)基.37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心棄上清，并加入200μLDMSO(二甲基亞砜)，用微型超聲振蕩器混勻后，在酶標(biāo)儀上以試驗(yàn)波長(zhǎng)為570nm，參比波長(zhǎng)為450nm測(cè)定光密度值。c)按下式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率：細(xì)胞程序性壞死抑制率％＝(OD實(shí)驗(yàn)-OD誘導(dǎo)/OD空白)×100％。以同一樣品的不同濃度對(duì)細(xì)胞程序性壞死抑制率作圖可得到劑量反應(yīng)曲線，從中求出樣品的半數(shù)有效濃度EC50。表1中的Nec-1購(gòu)于SELLECK公司，純度≥98％，其結(jié)構(gòu)式為：表1列舉了本發(fā)明化合物與Nec-1對(duì)細(xì)胞程序性壞死的半數(shù)有效濃度EC50。表1本發(fā)明化合物與Nec-1對(duì)細(xì)胞程序性壞死的半數(shù)有效濃度EC50化合物EC50(uM)化合物EC50(uM)3a>103p0.2923b>103q1.8723c>103r0.8273d2.4603s53e2.5393t33f33u>103g1.4464a>103h54b0.4183i54c>103j5-104d>103k1.9614e0.1833l1.1564f0.1573m0.554g0.4113n34h>103o0.876Nec-11.051從表1中可以看出，本發(fā)明提供的化合物大部分都表現(xiàn)出了良好的抗細(xì)胞程序性壞死活性，其中化合物3m、3o、3p、3r、4b、4e、4f和4g具有＜1uM的抑制活性。實(shí)施例35體外活性實(shí)驗(yàn)1、細(xì)胞株：HT-29細(xì)胞購(gòu)置于美國(guó)ATCC(美國(guó)菌種保藏中心)，并保種于四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。2、細(xì)胞水平測(cè)試試驗(yàn)方法：選用HT-29細(xì)胞株，按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)。采用四氮唑鹽MTT還原法，將藥物與細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)，貼壁細(xì)胞需先貼壁24小時(shí)后再給藥。給藥同時(shí)加腫瘤壞死因子TNFα (購(gòu)于Peprotech公司)，凋亡抑制蛋白cIAP的抑制劑Smacmimetic(購(gòu)于Selleck公司)，含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶caspase的抑制劑Z-VAD-FMK(購(gòu)于APExBIO公司)以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生壞死。同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和誘導(dǎo)組和空白組，考察化合物3p抑制細(xì)胞程序性壞死的作用。具體操作如下：a)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁HT-29細(xì)胞，用0.25％胰酶(購(gòu)于Hyclone公司，SH30042.01)消化后，用含10％胎牛血清(購(gòu)自蘭州民海生物公司)的相應(yīng)的DMEM完全培養(yǎng)基(購(gòu)于Gibco公司，11965-92)配成4000個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種200μL，37℃，5％CO2培養(yǎng)24h。實(shí)驗(yàn)組換新的含不同濃度被測(cè)樣品的培養(yǎng)基，對(duì)照組則換含等體積溶劑的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組同時(shí)加入TNFα，Smacmimetic，Z-VAD-FMK以誘導(dǎo)，空白組不加，每組設(shè)3～5個(gè)平行孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)1d。實(shí)驗(yàn)組即化合物3p，純度≥98％；對(duì)照組Nec-1購(gòu)于SELLECK公司，純度≥98％。b)棄去上清液，每孔加入200μL新鮮配制的含0.2mg/mLMTT(購(gòu)于Thermoscientific公司)的無血清培養(yǎng)基.37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心棄上清，并加入200μLDMSO(二甲基亞砜)，用微型超聲振蕩器混勻后，在酶標(biāo)儀上以試驗(yàn)波長(zhǎng)為570nm，參比波長(zhǎng)為450nm測(cè)定光密度值。c)按下式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率：細(xì)胞程序性壞死抑制率％＝(OD實(shí)驗(yàn)-OD誘導(dǎo)/OD空白)×100％。并按抑制率作圖。化合物3p和4f對(duì)TSZ(TNFα，Smacmimetic和Z-VAD-FMK處理后的壞死誘導(dǎo)組)誘導(dǎo)HT-29產(chǎn)生的程序性壞死過程造成的細(xì)胞死亡抑制曲線見圖1和圖5。從圖可以看出，化合物3p和4f對(duì)程序性壞死具有抑制作用，且抑制活性高于陽(yáng)性對(duì)照Nec-1。3、蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，具體操作如下：a)制備蛋白樣品：培養(yǎng)HT-29細(xì)胞，在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)鋪于六孔板，24h后按一定濃度梯度加藥，設(shè)立空白組，陰性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組(Nec-1)和實(shí)驗(yàn)組(化合物3p)。陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組以及實(shí)驗(yàn)組用TNFα，Smacmimetic和Z-VAD-FMK誘導(dǎo)necroptosis8h，后用加入苯甲基磺酰氟(PMSF，購(gòu)于Sigma-Aldrich公司)、蛋白酶抑制劑Cocktail(購(gòu)于Sigma-Aldrich公司)和強(qiáng)細(xì)胞裂解液RIPA(購(gòu)于碧云天公司)裂解細(xì)胞，并用細(xì)胞超聲破碎儀進(jìn)行破碎，13000rpm離心15min后收集上清，用BCA定量試劑盒(購(gòu)于碧云天公司)進(jìn)行定量。加5X上樣緩沖液(購(gòu)于碧云天公司)100℃煮樣10min后分裝。由于p-RIP1和p-RIP3抗體未能購(gòu)得，故采用免疫沉淀的方法，用磷酸化絲氨酸(Phosphoserine/ps)抗體(購(gòu)于Lifetechnologies公司)獲取磷酸化的相互作用蛋白激酶1即p-RIP1和磷酸化的相互作用蛋白激酶3即p-RIP3蛋白。Phosphoserine/ps抗體與定量后的蛋白進(jìn)行孵育過夜后，再用蛋白 A瓊脂糖珠(購(gòu)于Roche公司)捕獲抗原抗體復(fù)合物4h，4000rpm/2min/次離心3次收集復(fù)合物，加5Xloadingbuffer100℃煮樣10min后離心，取上清電泳。用RIP1抗體(購(gòu)于BDBiosciences)和RIP3抗體(購(gòu)于ABcam公司)來檢測(cè)p-RIP1和p-RIP3的水平。b)上樣電泳：將蛋白樣品加入上樣槽，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。通常濃縮膠使用80V，分離膠使用100～120V。其中一個(gè)泳道加入1～2uL預(yù)染的分子量指示劑，作為蛋白分子量的定量標(biāo)準(zhǔn)以及初步判斷轉(zhuǎn)膜是否成功的標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)指示劑溴酚藍(lán)到達(dá)電泳槽底部時(shí)停止電泳，根據(jù)蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)切割目標(biāo)條帶。c)轉(zhuǎn)膜：選用聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜，購(gòu)于Millipore公司)，使用之前用甲醇浸泡5～10s。大于20kD的蛋白用0.45um的膜，小于20kD的蛋白用0.2um的膜。依據(jù)膠的大小裁剪合適的大小的膜和濾紙。將PVDF膜用純甲醇浸泡5～10s后放入轉(zhuǎn)移緩沖液中，待用。裝配―三明治‖轉(zhuǎn)膜匣：即海綿→4層濾紙→膠→膜→4層濾紙→海綿，每層放好后要小心趕走氣泡。注意要將膠放于負(fù)極面即黑色面。然后將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入―三明治‖，倒入轉(zhuǎn)移緩沖液和小冰袋，插入電極，通常使用100V轉(zhuǎn)膜0.5～2h。d)免疫雜交與顯色：將膜置于封閉緩沖液(含5％伊利脫脂奶粉的TBS/T(三乙醇胺緩沖鹽/吐溫水)溶液)中封閉1～2h，室，緩慢搖動(dòng)。加入合適稀釋度的一抗(通常為1:1000，含5％脫脂奶粉的TBS/T稀釋)，雜交袋孵育4℃過夜。TBS/T洗3次，每次10min。加入合適稀釋度的二抗(通常為1:5000，含5％脫脂奶粉的TBS/T稀釋)，雜交袋孵育，37℃恒溫孵箱中緩慢搖動(dòng)孵育1—1.5h。TBS/T洗3次，每次20min。TBS洗1次，5min。泡在TBS中，待顯影。發(fā)光反應(yīng)時(shí)將顯影液兩種溶液按1︰1混合，先將PVDF膜在PE手套上稍微蘸干TBS溶液，然后迅速將顯影液均勻涂抹于膜正面，用塑料薄膜覆蓋膜，放入暗盒中，放入膠片曝光，洗片。根據(jù)不同條帶強(qiáng)弱可調(diào)整曝光時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。化合物3p和4f對(duì)TSZ誘導(dǎo)HT29后關(guān)鍵蛋白相互作用蛋白激酶1即RIP1，相互作用蛋白激酶3即RIP3，MLKL(混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白)的表達(dá)水平和磷酸化水平見圖2、圖3、圖6和圖7。可見化合物3p和4f明顯抑制了TSZ誘導(dǎo)后RIP1的磷酸化，進(jìn)一步影響了RIP1下游的RIP3和混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域MLKL的磷酸化。實(shí)施例36體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)1、動(dòng)物來源：小鼠(Balb/C)，8-10周齡，購(gòu)自四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；雄性，飼養(yǎng)地點(diǎn)：四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室SPF動(dòng)物房(1號(hào)房)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(川)2014-178)。2、心肌缺血模型構(gòu)建及藥物治療：將小鼠用4％水合氯醛(購(gòu)于百靈威公司)按10mL/kg的劑量麻醉后，仰臥位固定，在 氣管表面剪開一小切口后將小動(dòng)物呼吸機(jī)所連導(dǎo)管(留置針頭套)插入小鼠氣管，啟動(dòng)呼吸機(jī)，參數(shù)為呼吸頻率110，呼吸比3︰1，潮氣量1mL。觀察到小鼠胸廓頻率與呼吸機(jī)頻率一致后，開胸，鈍性分離，在體視鏡輔助下找到左心耳，并在左心耳下方2～3mm用7-0帶針尼龍線進(jìn)行結(jié)扎。假手術(shù)組只開胸但并不進(jìn)行左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎?？瞻捉M和實(shí)驗(yàn)組在左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎后，待小鼠恢復(fù)。手術(shù)2天后，實(shí)驗(yàn)組開始按10mg/kg/d的劑量給藥化合物3p，給藥10天后處死小鼠，并取心臟做HE染色。給藥方案：化合物3p按10mg/kg/d口服給藥10天，假手術(shù)組和空白組給對(duì)應(yīng)空白溶劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：化合物3p和對(duì)小鼠心肌缺血模型的保護(hù)作用見圖4?；衔?p在按10mg/kg/d的劑量給藥10天后對(duì)小鼠由于冠狀動(dòng)脈結(jié)扎而造成的心肌缺血模型具有保護(hù)作用，壞死區(qū)域減小。3.急性胰腺炎模型構(gòu)建及藥物治療：將小鼠禁食12小時(shí)過夜后，腹腔注射8％L-精氨酸(購(gòu)于百靈威公司)，注射劑量為50ul/g，注射兩次，中間間隔1小時(shí)。注射后實(shí)驗(yàn)組按10mg/kg/d的劑量給藥化合物4f，給藥5天后處死老鼠，取胰腺做HE染色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：化合物4f對(duì)小鼠胰腺炎模型的保護(hù)作用見圖8，化合物4f在10mg/kg/d的劑量給藥5天后對(duì)L-精氨酸造成的小鼠急性胰腺炎具有保護(hù)作用。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3