可用于治療診斷學的聚合納米顆粒的制作方法
【專利摘要】描述了用于受控藥物遞送的基于淀粉的pH-響應性納米顆粒的合成和表征。通過新的一鍋法合成了具有不同的淀粉與MAA摩爾比的聚甲基丙烯酸接枝的淀粉(PMAA-g-St)納米顆粒，所述一鍋法能夠同時在水性介質(zhì)中實現(xiàn)PMAA的接枝和納米顆粒形成。NMR數(shù)據(jù)表明，聚山梨醇酯80聚合成接枝聚合物。納米顆粒是相對球形的，具有狹窄的尺寸分布和多孔的表面形態(tài)，且在生理pH范圍表現(xiàn)出pH依賴性膨脹。顆粒尺寸和體積相變的量級依賴于PMAA含量和制劑參數(shù)，諸如表面活性劑水平、交聯(lián)劑量和總單體濃度。結(jié)果表明，新的pH-響應性納米顆粒具有對受控藥物遞送有用的性能。
【專利說明】可用于治療診斷學的聚合納米顆粒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及可用于遞送治療劑和/或診斷劑的聚合納米顆粒。

【背景技術(shù)】
[0002] 許多天然的多糖（諸如淀粉和海藻酸鹽）存在于食品中或被用作食品成分。淀 粉是在自然界中存在的最豐富的多糖之一。該生物聚合物具有（C 6HltlO5)J]分子式，其中 η的范圍為300-1000[1]。淀粉由2種被稱作直鏈淀粉和支鏈淀粉的聚合物的混合物組成 [1，2]。直鏈淀粉分子由通過α-1，4縮醛鍵連接的a-D-吡喃葡萄糖單元組成。支鏈淀粉 分子大得多且高度支化。所述分子含有α -1，4直鏈鍵，且通過α -1，6鍵支化[1，2]。大多 數(shù)在工業(yè)中使用的淀粉經(jīng)常含有20-30%直鏈淀粉，余量為支鏈淀粉（70-80% )和諸如脂 質(zhì)和蛋白的次要組分（小于1 % ) [3]。
[0003] 淀粉會提供獨特的優(yōu)勢。淀粉是相對安全的，具有十分適用于體內(nèi)應用的生物相 容性和生物可降解譜。在膠體系統(tǒng)的情形下，淀粉具有穩(wěn)定性能，從而使它成為生物分子開 發(fā)的有用候選物。淀粉含有許多羥基，所述羥基能夠發(fā)生醇特有的各種化學反應。這可以 將多種藥物、靶向部分、金屬螯合劑、熒光探針等與基于淀粉的材料結(jié)合。基于淀粉的材料 還可以是非常有成本效益的。盡管具有這些優(yōu)勢，但淀粉作為生物材料和在藥物遞送應用 中具有有限的應用。天然淀粉由于它的較差機械和化學性能而具有有限的應用；但是，可以 做出各種修飾來改善淀粉的性能和拓寬它的應用。最常見的化學修飾是接枝、氧化、酯化、 醚化和水解。由于淀粉的可生物降解性能和穩(wěn)定性能與丙烯酸聚合物的PH響應特性的組 合，用基于丙烯酸的單體接枝淀粉可以產(chǎn)生具有潛在藥物遞送和生物醫(yī)學應用的材料。
[0004] 已經(jīng)合成淀粉-黃原膠水凝膠用于通過由三偏磷酸鈉交聯(lián)淀粉和黃原膠進行受 控藥物遞送[4]。已經(jīng)使用輻射、光解或催化劑和引發(fā)劑如金屬離子、過氧化物或過硫酸鹽 [5-12]通過不同乙烯基單體的接枝聚合來修飾淀粉[5]。乙烯基單體在淀粉上的接枝通常 通過自由基引發(fā)來實現(xiàn)。已經(jīng)將淀粉接枝共聚物用作水凝膠、絮凝劑、離子交換劑、超級吸 收劑等[13-18]。
[0005] 親水丙烯酸單體可以形成具有可調(diào)節(jié)的膨脹動力學的水凝膠，且已經(jīng)用于藥物遞 送和其它生物醫(yī)學應用，諸如改善成骨細胞粘附[19-21]。淀粉的可生物降解性能與基于 丙烯酸的聚合物的PH響應特性的組合可以導致在生物醫(yī)學和藥物遞送中具有潛力的受關(guān) 注的水凝膠。以前公開的工作已經(jīng)證實，過硫酸鉀能夠引發(fā)甲基丙烯酸向淀粉上的接枝；但 是，形成大量的同聚物[22]。通過使用過硫酸鉀/硫代硫酸鈉氧化還原引發(fā)系統(tǒng),Hebeish 等人能夠有效地將聚甲基丙烯酸接枝到淀粉上，同時使同聚物形成最小化[6, 7]。
[0006] 在許多應用中，響應于環(huán)境刺激（諸如pH)的快速相變是受期望的。但是，大尺寸 的大塊水凝膠通常經(jīng)歷緩慢的尺寸變化，因為聚合網(wǎng)絡中的構(gòu)象變化以及溶質(zhì)和水穿過所 述網(wǎng)絡的擴散需要時間。由于響應時間與擴散距離的平方成比例，通過調(diào)節(jié)水凝膠尺寸可 以控制相變速率[23]。通常，納米尺寸的聚合物會經(jīng)歷膨脹平衡和微秒級的相變。因此，刺 激響應性納米顆?？梢詽撛诘赜迷诖碳ろ憫运幬镞f送中，且可以因為它們對刺激的極快 響應而充當傳感器或微開關(guān)。
[0007] 盡管存在關(guān)于乙烯基單體的接枝聚合的眾多出版物，但關(guān)于基于納米尺寸淀粉 的PH敏感顆粒的開發(fā)和表征的公開數(shù)據(jù)非常有限。Saboktakin等人最近已經(jīng)描述了聚 甲基丙烯酸向羧甲基淀粉上的接枝以產(chǎn)生本體聚合物[24]。該作者隨后使用冷凍干燥法 來生產(chǎn)納米粉末；但是，他們的方法沒有產(chǎn)生納米顆粒在水性介質(zhì)中的穩(wěn)定膠體分散體。 Saboktakin等人還已經(jīng)描述了聚甲基丙烯酸向作為紫杉醇的遞送系統(tǒng)的殼聚糖納米顆粒 上的接枝[24(a)]。Hirosue等人已經(jīng)在國際專利公開WO 2010/084060中描述了具有淀粉 骨架的聚合物，在所述淀粉骨架上，在用連接物（諸如2-溴異丁?；澹┬揎椆羌芤院笸?過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ATRP)來接枝甲基丙烯酸酯單體。通過乳劑擴散法用所述淀粉聚 合物配制納米顆粒。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本文描述的發(fā)明包括用于合成納米顆粒的方法。
[0009] 本發(fā)明的納米顆粒包括聚合物骨架，其具有接枝在其上的含有羧基或氨基的聚合 鏈。在納米顆粒外表面上存在的聚乙氧基化物部分共價連接以作為納米顆粒的一部分。 [0010] 本發(fā)明的納米顆粒特別可用作例如治療劑和/或信號分子的載體。
[0011] 優(yōu)選地，在"一鍋"合成過程中在水溶液中形成本發(fā)明的納米顆粒，其中單體接枝 聚合在骨架聚合物上，并且聚乙氧基化物部分參與所述聚合以共價地合并為納米顆粒的一 部分。
[0012] 在公開的實施方案中，所述聚合物骨架由淀粉提供，所述單體是甲基丙烯酸 (MAA)、甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯（DEAEM)，且所述聚乙氧基化部分由聚山梨醇酯80(吐 溫? 80)提供。
[0013] 本發(fā)明的納米顆粒特別可用作載體納米顆粒。所述載體的貨物（cargo)或凈荷 (playload)可以是治療劑，諸如藥物、信號分子如熒光團（例如熒光素胺）、釓等。
[0014] 可以在納米顆粒形成之后，向納米顆粒加載治療劑?？商鎿Q地，且特別是在顆粒貨 物包括當在患者中存在時不希望從載體顆粒逐出的信號分子或其它分子的情況下，可以在 納米顆粒產(chǎn)生之前通過與聚合物共價連接而用所述分子將所述聚合物官能化。在公開的實 例中，將有機螯合劑二亞乙基三胺五乙酸二酸酐（DTPA二酸酐）與納米顆粒共價連接。在 一個實例中，在納米顆粒產(chǎn)生之前，將DTPA與多糖聚合物骨架共價連接；在另一個實例中， 將DTPA與已經(jīng)形成的納米顆粒連接。將Gd+ 3加載入作為納米顆粒的一部分預安裝的螯合 劑中。
[0015] 在另一個實例中，將已知為水溶性的藥物鹽酸多柔比星加載入本發(fā)明的納米顆粒 中，并表征體內(nèi)行為。
[0016] 可能得到具有相對低的多分散性指數(shù)（PDI)的本發(fā)明的納米顆粒。提供了單分散 體的一個實例，即其中納米顆粒具有小于〇. 12的TOI的組合物。
[0017] 本發(fā)明的納米顆粒（其中存在多個羧基或氨基）是pH敏感的，并且提供了解釋毫 秒級相變的實例。在一個方面，已經(jīng)檢查了例示的顆粒的尺寸，其依賴于各種加工參數(shù)和 pH。在本文中例示了其中平均直徑從IOOnm變化至超過300nm的納米顆粒組合物。
[0018] 在抗癌藥物多柔比星的情況下，一個實例示出加載藥物的納米顆粒，其提供在藥 物抗性細胞系中的IC50下降，觀察到多達19倍的下降。因此，載體納米顆粒的潛在應用是 用于治療藥物抗性乳腺癌的多柔比星受控遞送。
[0019] 加載Gd+3的納米顆?？梢杂迷诖殴舱癯上瘢∕RI)造影劑中，并且在本文中例示了 該用途。
[0020] 還通過熒光素胺異構(gòu)體I例示了具有與所述顆粒共價連接的有機熒光探針的納 米顆粒的用途。
[0021] 本發(fā)明的納米顆粒具有體外和體內(nèi)應用。例如，本文描述的體外研究指示癌細胞 對所述顆粒的細胞攝取和針對肝細胞的微小細胞毒性，從而表明可用于藥物遞送和診斷應 用。
[0022] 例示的顆粒的NMR研究指示，聚山梨醇酯80 (PS80)被聚合入聚甲基丙烯酸接枝的 淀粉納米顆粒且存在于顆粒表面上。使聚乙氧基化的聚山梨醇酯（已知其表現(xiàn)出表面活性 劑性能）與納米顆粒共價結(jié)合，會向所述載體提供在生物系統(tǒng)中的穩(wěn)定性。此外，已知PS80 會結(jié)合血液中的低密度脂蛋白（LDL)，從而經(jīng)由LDL受體介導的胞吞轉(zhuǎn)運作用促進納米顆 粒穿過血腦屏障。共價結(jié)合的PS80可以給這樣的顆粒賦予有利的腦靶向潛力。除了本文 描述的我們的離體研究以外，成像數(shù)據(jù)會提供納米顆粒穿過血腦屏障之能力的證據(jù)。
[0023] 因此，本發(fā)明的一個實施方案是生產(chǎn)納米顆粒的方法，所述方法包括下述步驟：
[0024] (a)將聚合物溶解在液體溶液中；
[0025] (b)提供包含羧酸側(cè)基的可聚合單體；
[0026] (C)將所述單體接枝聚合以在溶解的聚合物上形成聚合鏈，
[0027] ⑷提供乙氧基化分子，其具有可與形成的鏈反應的官能團，其中：
[0028] 步驟（C)在乙氧基化分子的存在下進行，以使所述乙氧基化分子與所述聚合鏈共 價連接。
[0029] 所述液體溶液可以包括羥基溶劑諸如水，一種或多種醇，特別是乙醇，或水和醇的 混合物，特別是水和乙醇的混合物。
[0030] 所述聚合物可以是具有0.05-3 (或0. 5-3、或1-3、或2-3)取代度/聚合物單元的 多羥基聚合物，所述單體可以包括烯基，且所述接枝聚合步驟可以在有交聯(lián)劑的存在下進 行。
[0031] 根據(jù)一個實施方案，步驟（C)的單體以交聯(lián)劑的量的1-20倍（mol/mol)的量存 在。
[0032] 所述聚合步驟可以是在自由基引發(fā)劑的存在下進行的自由基接枝聚合過程。所述 引發(fā)劑可以基本上不含過渡金屬。特定的引發(fā)劑是過硫酸鹽或其功能等效物。
[0033] 乙氧基化分子的乙氧基化物基團可以用游離羥基封端。所述乙氧基化分子可以包 括烯基，所述烯基發(fā)生化學反應以將表面活性劑分子與聚合鏈共價連接。在一個特定實施 方案中，乙氧基化分子是具有R(C9-C31)_C(0)0-基團的聚乙氧基化脫水山梨糖醇，其中所 述脫水山梨糖醇在所述聚合步驟中通過R(C9-C31)-C(0)0-基團的C-C共價鍵與第二種聚 合物連接。所述R (C9-C31) -C (0) 0-基團可以含有至少一個C-C不飽和性，其在所述聚合步 驟中反應以形成C-C共價鍵。
[0034] 可以選擇聚合物的量和步驟（C)的單體的量，以產(chǎn)生這樣的納米顆粒：其中聚合 鏈中的單體單元與所述聚合物的單體單元的摩爾比是〇. 1-10。
[0035] 所述聚合步驟可以在表面活性劑（通常是陰離子表面活性劑）的存在下進行。
[0036] 實施方案包括：產(chǎn)生用于遞送生物試劑的納米顆粒，其中所述試劑與步驟（a)的 聚合物共價連接。所述聚合物可以是多羥基化聚合物，其中所述試劑通過其羥基氫原子的 置換而與所述聚合物共價連接。所述試劑可以是能夠絡合金屬的有機部分，且所述方法可 以包括形成金屬-有機部分絡合物?？梢赃x擇金屬，以提供在磁共振成像中的信號，例如， 可以是Gd+ 3。
[0037] 可以將步驟（c)的單體的量選擇為足夠高的，以使在pH 7. 4和IOmM的離子強度 測量的所產(chǎn)生的納米顆粒的水溶液的ζ電位的絕對值為至少15mV。
[0038] 通過將所述試劑和從本發(fā)明的方法得到的納米顆粒分散在液體介質(zhì)中以將所述 試劑并入所述納米顆粒，可以產(chǎn)生用于遞送生物試劑的納米顆粒。
[0039] 通過共價連接至從本發(fā)明的方法產(chǎn)生的納米顆粒和將所述試劑共價連接至所述 納米顆粒的聚合鏈的羧酸基團，可以產(chǎn)生用于遞送生物試劑的納米顆粒。
[0040] 根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明是產(chǎn)生載體納米顆粒的方法，所述方法包括下述步 驟：
[0041] (i)將聚合物溶解在水溶液中；
[0042] (ii)提供包含羧酸側(cè)基的可聚合單體；
[0043] (iii)將所述單體接枝聚合以在溶解的聚合物上形成聚合鏈，
[0044] (iv)提供聚乙氧基化分子，其具有可與形成的鏈反應的官能團，其中：
[0045] 聚合步驟（iii)在聚乙氧基化分子的存在下進行，以將所述聚乙氧基化分子與形 成的鏈共價連接，且聚合的產(chǎn)物形成所述納米顆粒，其中聚乙氧基化部分在所述納米顆粒 的外部上。
[0046] 本發(fā)明包括納米顆粒，其包含：(a)第一聚合物；(b)與所述第一聚合物接枝的第 二聚合物；和（C)與所述第二聚合物共價結(jié)合的聚乙氧基化部分。
[0047] 在一個實施方案中，所述納米顆粒的第二聚合物可以包括聚合的乙烯基，所述第 二聚合物的骨架的每2個碳具有約1個羧基。所述第二聚合物可以是聚烯基聚合物。所述 聚烯基聚合物可以是聚丙烯酸。根據(jù)一個特定實施方案，所述聚丙烯酸是聚甲基丙烯酸。
[0048] 所述聚乙氧基化部分可以是具有R(C9-C31)_C(0)0-基團的脫水山梨糖醇，其中 所述脫水山梨糖醇通過R-基團的C-C共價鍵與第二聚合物連接。
[0049] 所述納米顆粒的第一聚合物可以包括多羥基聚合物。
[0050] 所述第二聚合物可以是交聯(lián)的。
[0051] 實施方案包括含有多個納米顆粒的組合物，組合物可以包括藥學活性劑。這樣的 試劑可以例如吸附至納米顆粒。
[0052] 組合物可以包括納米顆粒和信號分子。所述信號分子可以是被有機部分螯合的金 屬，其中所述部分與納米顆粒共價結(jié)合。有機部分可以與所述第一聚合物共價結(jié)合。
[0053] 所述信號分子可以與所述納米顆粒共價結(jié)合，優(yōu)選地與羧酸側(cè)基共價連接。信號 分子的一個實例是熒光團。
[0054] 含有納米顆粒的組合物可以進一步包括藥學活性劑。
[0055] -個實施方案包括這樣的納米顆粒，其含有：（I)第一聚合物，其包含多糖；（II) 第二交聯(lián)聚合物，其包含與所述第一聚合物接枝的聚甲基丙烯酸；和（III)聚山梨醇酯，其 包含與所述第二聚合物共價結(jié)合的（C9-C31) R-C (O) O-基團，所述共價結(jié)合通過所述第二 聚合物的碳骨架與所述R基團之間的C-C鍵實現(xiàn)。
[0056] 納米顆粒的（C9-C31)R-C(O)O-基團可以是_(C17)R-C(O)O-,其中R是直鏈烷 基。所述聚山梨醇酯可以包括基團-O(CH 2CH2O)w-C(O) (C17)R、HO (CH2CH2O) x-、-HO (CH2CH2O) y-和-HO (CH2CH2O) z-，其中w+x+y+z = 20。所述多糖的分子量可以是約2, 600至約4, 500Da。
[0057] 所述多糖的單體單元與所述聚甲基丙烯酸的單體甲基丙烯酸酯單元的摩爾比可 以是在0.2-8. 0之間。
[0058] 所述聚山梨醇酯與所述聚甲基丙烯酸的單體甲基丙烯酸酯單元的摩爾比可以是 在 0.002-0. 03 之間。
[0059] 本發(fā)明的一個實施方案是生產(chǎn)納米顆粒的方法，其包括以下步驟：
[0060] (a)將聚合物溶解在液體溶液中；
[0061] (b)提供包含燒基氣基燒基醋側(cè)基的可聚合單體；
[0062] (C)提供交聯(lián)劑；和
[0063] (d)將所述單體接枝聚合以在溶解的聚合物上形成聚合鏈，以形成所述納米顆粒。
[0064] 所述聚合物可以是具有0. 05-3取代度/聚合物單元的多羥基聚合物，所述單體可 以包括烯基，且所述接枝聚合步驟可以在交聯(lián)劑的存在下進行。所述多羥基聚合物可以具 有1-3取代度/聚合物單元。
[0065] 所述可聚合單體可以是甲基丙烯酸的烷基氨基烷基酯，例如，甲基丙烯酸二乙基 氨基乙酯。
[0066] 所述交聯(lián)劑可以是乙二醇二甲基丙烯酸酯。
[0067] 步驟（d)的單體可以以交聯(lián)劑的量的1-200倍（mol/mol)的量存在。
[0068] 可以選擇聚合物的量和步驟（C)的單體的量，以產(chǎn)生這樣的納米顆粒：其中聚合 鏈中的單體單元與所述聚合物的單體單元的摩爾比是〇. 05-20,例如，2-4。
[0069] 聚山梨醇酯可以存在于步驟（d)中。
[0070] 所述可聚合單體可以以所述聚山梨醇酯的量的5-50倍（mol/mol)、或約10-40、或 約15-35、或約20-30 (mol/mol)的量存在。
[0071] 非離子穩(wěn)定劑（例如，聚乙烯吡咯烷酮）可以存在于步驟（d)中。
[0072] 本發(fā)明包括納米顆粒，其含有：⑴第一聚合物，其包含多糖；和（ii)第二交聯(lián)聚 合物，其包含與所述第一聚合物接枝的甲基丙烯酸的烷基氨基烷基酯，其中所述第二聚合 物是交聯(lián)的。
[0073] 所述第二聚合物可以是聚合的甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯。
[0074] 所述第二聚合物可以包括聚合的乙烯基，所述第二聚合物的骨架的每2個碳具有 約1個羧基。所述多糖可以是淀粉?？梢援a(chǎn)生這樣的納米顆粒：當將它們的環(huán)境溶液的PH 從約4變?yōu)榧s7. 4時，其表現(xiàn)出500-1500倍的增加的體積變化，或當將它們的環(huán)境溶液的 pH從約4變?yōu)榧s7. 4時，則呈現(xiàn)約600至1400倍，或約700至約1300倍，或約500至約 1300倍，或約400至1100倍，或約700至1100倍，或約800倍，或約900倍，或約1000倍， 或約1100倍。
[0075] 附圖和表格簡述
[0076] 圖1顯示了最大化學計量為1的多柔比星和納米顆粒的羧酸基團之間的相互作用 的圖解數(shù)據(jù)。（A)在不同pH的緩沖液中滴定8. 5mM多柔比星的空白示差焓曲線。（B)在不 同pH的緩沖液中將8. 5mM多柔比星滴定進0. lmg/ml PMAA-g-St-PS80納米顆粒中的示差 焓曲線。通過加入NaCl，將離子強度保持恒定在0. 15M。
[0077] 圖 2 顯示了（A)淀粉、（B)PMAA-PS 80 和（C)PMAA-PS 80-g-St 的 FTIR 光譜。指 定主峰,并在文本中解釋。
[0078] 圖 3 顯示了在 0· 05M NaOD 中的 A)PS 80、B)淀粉、C)PMAA-PS80、D) PMAA-PS80-g-St-2、E)PS80、F)淀粉、G)DTPA、H)St-DTPA、DPMAA-PS 80-g-St 和 J) PMAA-PS 80-g-St-DTPA的1H NMR譜。如在分子路線圖上所示的那樣指定主峰。
[0079] 圖4顯示了穿過血腦屏障的來自毛細血管腔的PMAA-g-St-PS80-FITC外滲。 PMA-PS 80-g-St納米顆粒的腦分布和積累的定性和定量結(jié)果。全腦的離體近紅外熒光圖 像。（A)與未注射納米顆粒的正常腦相比，靜脈內(nèi)（iv)注射納米顆粒以后隨時間變化的腦 中相對熒光強度的比率。將數(shù)據(jù)表示為平均值土標準差（η = 4)。（B)靜脈內(nèi)施用鹽水 (左）、PMAA-PS 80-g-St (中）和PMAA-PS 80-g-St (右）以后45分鐘，灌注小鼠腦的熒光 顯微術(shù)圖像。對于用PMAA-PS 80-g-St納米顆粒處理的樣品而言，可以在腦毛細血管的血 管周圍區(qū)域中檢測到顆粒。
[0080] 圖5的示意圖解釋了三元共聚物合成的反應路線圖中的不同步驟。
[0081] 圖 6 顯示了 ：⑷在 0· 15M PBS(pH = 7. 4)中的 PMAA-g-St-2 的 TEM 圖像。將納 米顆粒用鑰酸銨染色，并在碳包被的網(wǎng)格上干燥。（B)在0. 15M pH 7. 4PBS中的納米顆粒的 強度加權(quán)流體動力學直徑。所述顆粒表現(xiàn)出高斯分布，且是相對單分散的。
[0082] 圖7顯示了 PDEAEM-g-St-2納米顆粒的TEM圖像。
[0083] 圖8顯示了 ：⑷對于0. 15M PBS中MAA/St的不同進料摩爾比，納米顆粒的相對 直徑相對于pH的圖。D7.4和D 4分別是在pH 7. 4和4的顆粒直徑。（B)對于不同MAA/St摩 爾比的顆粒，pH對表面電荷的影響。使用NaCl將離子強度保持恒定在10mM。數(shù)據(jù)點代表 3個獨立測量結(jié)果的平均值土標準差。
[0084] 圖9顯示了 ： (A)電位測定滴定曲線。空三角形代表PMAA-g-St-2膠乳分散體的未 校正的電位測定滴定曲線。固體含量=〇· 104重量％，Cs= 0· 05N NaCl，[NaOH] = 0· 1N， [HC1] =0. IN。實心圓圈代表校正后的滴定曲線。空心圓圈顯示了空白滴定曲線。箭頭代 表當量點。使用當量點來計算不同納米顆粒批次中的MA含量。（B)表觀解離常數(shù)（pK a) 作為不同淀粉納米顆粒的電離程度（α)和MAA含量的函數(shù)的變化。
[0085] 圖10顯示了在注射之間使用30s的穩(wěn)定時間的正向和反向電位測定滴定。（A) PMAA，（B)PMAA-g-St-2,（C)PMAA-g-St-4。僅在具有高淀粉含量的納米顆粒的情況下，觀察 正向和反向滴定之間的延遲時間。
[0086] 圖11顯示了表觀解離常數(shù)（PKa)作為不同淀粉納米顆粒的電離程度（α)和MA 含量的函數(shù)的變化。
[0087] 圖12顯示了（A) SDS、（B)PS 80、（C)總單體濃度和⑶交聯(lián)劑摩爾比對顆粒尺寸 和pH敏感性的影響。實心正方形代表顆粒尺寸，實心三角形代表相對顆粒直徑。數(shù)據(jù)點代 表3個獨立測量結(jié)果的平均值土標準差。
[0088] 圖13顯示了（A)在0· 15M磷酸鹽緩沖液（pH 7. 4)中加載有多柔比星（LC = 33% ) 的PMA-PS 80-g-St納米顆粒的數(shù)目加權(quán)高斯分布，和（B)加載多柔比星的納米顆粒（LC =33% )的透射電子顯微照片（TEM)。
[0089] 圖14顯示了以下物質(zhì)的XRD譜：(A)天然形式的多柔比星，（B)PMAA-PS 80-g-St 納米顆粒，（C)加載多柔比星的納米顆粒（LC = 50% )，和（D)在室溫貯存6個月以后的加 載多柔比星的納米顆粒（LC = 50% )。對于多柔比星，在衍射圖中看到指示結(jié)晶相在天然 形式中存在的明顯峰，而納米顆粒顯示典型的無定形模式。加載多柔比星的納米顆粒的衍 射圖中的峰的缺失指示出結(jié)晶的多柔比星向無定形多柔比星的相轉(zhuǎn)化。
[0090] 圖15顯示了最大化學計量為1的多柔比星和納米顆粒的羧酸基團之間的相互作 用的圖解數(shù)據(jù)。（A)在具有不同NaCl含量的DDIW中滴定8. 5mM多柔比星的空白示差焓 曲線。（B)在不同pH的具有不同NaCl含量的DDIW中將8. 5mM多柔比星滴定進0. lmg/ml PMAAg-St-PS80納米顆粒中的示差焓曲線。
[0091] 圖16顯示了來自納米顆粒的pH依賴性的多柔比星釋放。指示了在37°C時pH對 多柔比星釋放動力學的影響，所述多柔比星釋放自具有50%的藥物加載含量的納米顆粒。 使用游離多柔比星從透析袋的釋放作為對照。對于每個緩沖系統(tǒng)，通過加入NaCl將離子強 度保持恒定在〇. 15M。
[0092] 圖17顯示了㈧在有和沒有（對照）用熒光納米顆粒（NP)孵育4小時的情況下， MDA-MB435/LCC6細胞（野生型（WT)和多藥抗性型（MDRl))的熒光顯微術(shù)圖像。將細胞核 用Hoescht 33342染色，并用DAPI濾光片顯影，將細胞膜用Vybrant?DiI染色，并用Cy3濾 光片顯影，并將納米顆粒用熒光素胺異構(gòu)體I標記，并用FITC濾光片顯影。每2 μ m從細胞 的最上面和最下面區(qū)域做光學切片，從而允許選擇大約在細胞核的中點處的圖像。（B)用 0. 25mg/ml PMAA-PS 80-g-St納米顆粒處理4小時的MDA-MB435/LCC6細胞的TEM顯微照 片。給納米顆粒加載釓離子（金屬），并且表現(xiàn)為電子致密沉積物。在左側(cè)圖像中用虛線指 示的區(qū)域是右側(cè)圖像的放大圖。
[0093] 圖18顯示了野生型和藥物抗性的人乳腺癌細胞有效地內(nèi)吞納米顆粒。 MDA-MB435/LCC6細胞的流式細胞計量術(shù)直方圖指示孵育時間和溫度對顆粒攝取的影響。 以0. 25mg/ml的最終納米顆粒濃度，將細胞與熒光標記的納米顆粒一起在37°C孵育。（A) 1?八-]\^435/^(1)背景，（2)1小時孵育，（3)4小時孵育，（4)24小時孵育。（8)]\0^-]\^435/ 評?。?)背景，（2)4°〇，（3)241：。（〇]\0^-]\^ 435/]\?1?1(1)背景，（2)1小時孵育，（3)4小時孵 育，（4)24 小時孵育。（D)MDA-MB435/MDR1(1)背景，（2)4°C，（3)24°C。使用 488nm 氬離子 激光激發(fā)，并在530nm監(jiān)測發(fā)射。
[0094] 圖19解釋了加載多柔比星的納米顆粒在表達MDRl的人乳腺癌細胞中表現(xiàn)出顯著 更低的IC50值。通過MTT測定確定了 MDA-MB435/LCC6細胞類型對游離多柔比星和加載 多柔比星的納米顆粒的響應。（A-B)暴露于遞增濃度的游離多柔比星和加載多柔比星的納 米顆粒24小時（A)和48小時（B)以后，MDA-MB435/LCC6/WT(n = 3)細胞的細胞生存力。 (C-D)暴露于遞增濃度的游離多柔比星和加載藥物的納米顆粒24小時（C)和48小時（D) 以后，MDA435/LCC6/MDRl(n = 3)細胞的細胞活性。使用沒有處理和與空白納米顆粒一起 孵育的細胞分別作為游離藥物和加載藥物的納米顆粒的對照。將細胞活性表達為每個治療 組相對于對照的百分比。數(shù)據(jù)點代表為每個實驗指定的試驗數(shù)目的平均值土標準差。
[0095] 圖20顯示了（A) SA-NP和PF-NP的TEM圖像。（B)染料結(jié)合的納米顆粒顯示NIR 熒光特征。（C) SA-NP和PF-NP的物理化學性能的總結(jié)。顆粒直徑是指在5分鐘內(nèi)平均的讀 出的數(shù)目加權(quán)直徑。加載效率（LE% )是并入納米顆粒中的最初加入的藥物的比例，而藥物 加載含量（LC% )是藥物重量相對于納米顆?？傊亓康陌俜直取⑺兄得枋鰹?個獨立 試驗的平均值土標準差。加載溶液中的Dox的總量是I. 25mg。
[0096] 圖21顯示了 Balb/c小鼠的冠狀T1-加權(quán)的（3D-FLASH，TE/TR 3/25毫秒，翻轉(zhuǎn) 角 20° )全身圖像，所述 Balb/c 小鼠注射有⑷ Omniscan? (〇· lmmol/kg Gd3+)、（B) PolyGd(0.025mmol/kg Gd3+)和（C)PolyGd_Dox(0.025mmol/Kg Gd3+)。在幻燈片 A 中描繪 了心臟、肝、膀胱?；脽羝珺顯示了腎和腔靜脈。在1/4劑量的Omniscan?、PolyGd和 PolyGd-Dox在延長的時段內(nèi)產(chǎn)生了高得多的對比。
[0097] 圖22顯示了腦（左）和血液（右）的熒光強度（相對于基線歸一化）的比率；數(shù) 據(jù)提供了 PMAA-g-St-PS80在腦中的沉積的證據(jù)。
[0098] 圖23顯示了⑷SA-NP和PF-NP的TEM圖像。（B) SA-NP和PF-NP的物理化學性 能的總結(jié)。顆粒直徑表示在5分鐘內(nèi)平均的讀出的數(shù)目加權(quán)直徑。加載效率（LE%)是并 入納米顆粒中的最初加入的藥物的比例，而藥物加載含量（LC% )是藥物重量相對于納米 顆?？傊亓康陌俜直取⑺兄得枋鰹?個獨立試驗的平均值土標準差。加載溶液中的 Dox的總量是I. 25mg。
[0099] 圖24顯示了㈧使用錐蟲藍排除測定，空白直鏈聚合物和納米顆粒、加載Gd3+的 聚合物和納米顆粒、以及游離Gd 3+在大鼠肝細胞中的體外細胞毒性。將Gd3+加載入直鏈聚合 物和納米顆粒中會顯著降低在細胞中的Gd 3+毒性（*與對照相比統(tǒng)計上顯著的（p〈0. 05))。 (B)暴露30min、60min、120min或240min的鹽水（黑色）、空白聚合物（深灰色）、PolyGd(淺 灰色）和游離Gd 3+(白色）對培養(yǎng)物中的大鼠肝細胞的毒性。"％活"表示排除錐蟲藍的肝 細胞的百分比。顯示了 3個試驗的平均值和標準差。星號（*)表示存活值相對于對照的顯 著差異（P〈〇. 05)。
[0100] 圖25顯示了暴露30min、60min、120min或240min的鹽水（黑色）、空白聚合物（深 灰色）、P〇lyGd(淺灰色）和游離GcT(白色）對培養(yǎng)物中的大鼠肝細胞的毒性。" ％活"表 示排除錐蟲藍的肝細胞的百分比。顯示了 3個試驗的平均值和標準差。星號（*)表示存活 值相對于對照的顯著差異（P〈〇. 05)。
[0101] 圖26顯示了（A)攜帶正位乳腺腫瘤模型的小鼠中SA-NP和PF-NP的整個動物實 時生物分布和腫瘤靶向。在靜脈內(nèi)注射之前（基線），然后在納米顆粒注射以后的不同小時 直到14天，確定納米顆粒相關(guān)的熒光。用箭頭指示腫瘤。（B) SA-NP和PF-NP從全身（左） 和腫瘤（右）的時間依賴性的排泄譜。將目標區(qū)域的熒光強度記錄為平均輻射效率。將數(shù) 據(jù)表示為平均值土標準差（η = 2X3)。C)
[0102] 圖27顯示了全身分布的定量MRI : (A)用加載Gd3+的PMAA-g-St聚合物 (0· 025mm〇l/kg Gd+3)注射的 Balb/c 小鼠的 R1 圖譜。（B)與基線相比，Omniscan? (0.1mmol/Kg Gd3+)、PolyGd (0.025mmol/Kg Gd3+)和 PolyGd-Dox (0.025mmol/Kg Gd3+)隨 時間在左心室血液、肝、膀胱和腎中的弛豫率的變化AR1。與Omniscan?相比，PolyGd和 PolyGd-Dox造成血液弛豫率在延長的時間段中的高得多的增加。將數(shù)據(jù)表示為3個獨立運 行的平均值土標準差。（C) SA-NP和PF-NP的組織分布和腫瘤積累的定量結(jié)果。與正常主 要器官和未注射NIR染料結(jié)合的納米顆粒的腫瘤相比，在靜脈內(nèi)注射納米顆粒以后，主要 器官、腫瘤和血液的相對熒光強度的比率隨時間變化。將數(shù)據(jù)表示為平均值土標準差（η =2X3)。
[0103] 圖28顯示了 SA-NP和PF-NP的組織分布和腫瘤積累的定量結(jié)果。與正常主要器官 和未注射NIR染料結(jié)合的納米顆粒的腫瘤相比，在靜脈內(nèi)注射納米顆粒以后，主要器官、腫 瘤和血液的相對熒光強度的比率隨時間變化。將數(shù)據(jù)表示為平均值土標準差（η = 2X3)。
[0104] 圖29顯示了 PolyGcKO. 025mmol/kg Gd3+)在荷瘤Balb/c小鼠中的生物分布、消除 和腫瘤積累。使用ICP-AES確定Gd3+含量。將數(shù)據(jù)表示為3個獨立運行的平均值土標準 差。
[0105] 圖30是并入納米顆粒的聚山梨醇酯80(PS80)的示意圖。PS80能夠結(jié)合Apo-E， 所述Apo-E轉(zhuǎn)而結(jié)合腦微血管中的LDL受體，從而實現(xiàn)納米顆粒的胞吞轉(zhuǎn)運作用。NMR數(shù)據(jù) 指示PS80聚合成St-g-PMAA納米顆粒和直鏈聚合物。共價結(jié)合PS80確保體內(nèi)穩(wěn)定性。
[0106] 圖31顯示的TOF-SMS數(shù)據(jù)指示顆粒表面上的聚山梨醇酯80表達。TOF-SMS以 陽離子模式通過在255、265、267、281和283處的特征峰清楚地顯示了 PS80的存在，表明作 為脫水山梨糖醇分子的側(cè)鏈的油酸和硬脂酸脂肪酸系列。
[0107] 圖32顯示了給予加載Gd3+的納米顆粒以后小鼠腦的MR成像。（A)在基線和給予 PMAA-g-St-P80以后20分鐘，小鼠冠狀腦切片的R1圖譜。（B)在不同時間點的腦R1值。（C) 腦分布的定量MRI :注射有加載Gd3+的PMAA-PS 80-g-St納米顆粒（0.05mmol/kg Gd+3)的 Balb/c小鼠 （n = 3)的札圖譜。（D)加載Gd3+的PMA-PS 80-g-St-DTPA聚合物在矢狀竇、 腦室、皮質(zhì)和亞皮質(zhì)中隨時間的縱向弛豫率（Ri)。星號（*)表示與基線相比R 1值的顯著差 異（ρ〈0· 05)。（E)在不同時間點的腦R1值。
[0108] 圖33顯示了（A)通過用近紅外染料（Hilyte Fluor 750,熒光素胺異構(gòu)體I) 標記的PMA-PS 80-g-St納米顆粒的生物發(fā)光成像（左）和分布（右）獲取的腦腫瘤的 代表性圖像。結(jié)果強烈地提示納米顆粒在腦腫瘤中的積累。通過細胞的顱內(nèi)注射，建立 MDA-MB-231-1UC-D3H2LN的腦轉(zhuǎn)移。1周后，在腹膜內(nèi)注射螢光素溶液以后3-5min，將腦腫 瘤成像。在尾靜脈注射納米顆粒以后6小時，獲取熒光圖像。（B)使用DAPI和RFP濾光片獲 取的腦腫瘤切片的熒光顯微圖像，所述濾光片設置成使Hoescht 33342染色的細胞核（藍 色）和NIR HF 750-標記的納米顆粒顯影。圖像清楚地顯示了納米顆粒（紅色）和Dox(綠 色）共局部化，從而提示Dox由納米顆粒遞送至腫瘤組織并且從納米顆粒釋放進入腦腫瘤 中。
[0109] 圖34顯示了加載Gd(III)的直鏈聚合物在小鼠腫瘤模型中實現(xiàn)顯著的MR對比。 (A)PolyGd(上）和 PolyGd-Dox(下）（0.025mmol/kg Gd3+)的腫瘤分布：1\-加權(quán)的圖像（1) 和對應的R1圖譜（2)。箭頭指示在右后脅腹皮下植入的腫瘤。（B)腫瘤周圍和腫瘤核心中 的AR1的時程，從而顯示甚至在造影劑注射以后48小時升高的腫瘤1^。將數(shù)據(jù)表示為3個 獨立運行的平均值土標準差。
[0110] 圖35顯示了基于淀粉的納米顆粒在EMT6/WT荷瘤小鼠中的抗腫瘤活性。在第 0天在正位植入腫瘤細胞。在第8和15天，以等于Dox的2X10mg/kg劑量，用（A) 5%右 旋糖（n = 2 X 4)、（B)游離 Dox (n = 8)、PF-NP (n = 2 X 4)、（C) PF-NP 和（D) SA-NP (η = 2X3)治療小鼠。測量腫瘤體積直到第62天。每條曲線代表1只動物。（Ε)5%右旋糖、游 離Dox、PF-NP和SA-NP的Kaplan Meier存活曲線。存活曲線的趨勢是顯著不同的（ρ = 0.0033, Mantel Cox)。在第8天和第15天，通過靜脈內(nèi)注射不同制劑來治療小鼠。（F)以 等于 Dox 的 2X lOmg/kg 劑量，用 5%右旋糖（η = 2X4)、游離 Dox(n = 2X4)、PF-NP(n = 2X4)和SA-NP(η = 2X3)治療的荷瘤小鼠的體重的時間譜。給Balb/c小鼠在乳房脂肪墊 中接種EMT6/WT腫瘤，并在接種后第8天和第15天接受治療。每條曲線代表1只動物。（G) 以等于 Dox 的 2X 10mg/kg 劑量，用 5%右旋糖（η = 2X4)、游離 Dox(n = 2X4)、PF-NP(n =2 X 4)和SA-NP (η = 2 X 3)治療的荷瘤小鼠的體重的時間譜。給Balb/c小鼠在乳房脂肪 墊中接種EMT6/WT腫瘤，并在接種后第8天和第15天接受治療。每條曲線代表1只動物。
[0111] 圖36顯不了（A)MIP血管造影照片，其顯不在以0· 03mmol Gd/kg注射加載Gd3+ 的PMAA-g-St-DTPA之前（基線）和之后15分鐘得到的（1)全身和（2)頭頸區(qū)域的對比增 強。（B)在全身血管造影照片中從下腔靜脈測量的血管信號與噪音（S/N)比率和對比與噪 音（C/N)比率的動力學。*表示相對于基線的顯著差異（p〈0. 05)。將數(shù)據(jù)表示為3個獨立 運行的平均值和標準差。
[0112] 圖37顯示了⑷純淀粉、⑶PDEAEM和（C)PDEAEM-g-St的FTIR光譜。
[0113] 圖 38 顯示了（A)淀粉、（B)PDEAEM 和（C)PDEAEM-g-St 的 HNMR 譜。
[0114] 圖39顯示了 0· 15M PBS(pH = 4)中的TOEAEM-g-St-l納米顆粒的強度-重量分 布。
[0115] 圖 40 顯示了（λ 15M PBS(pH = 7. 4)中的 PDEAEM-g-St-Ι 的強度-重量分布。
[0116] 圖41顯示了不同淀粉組合物的H)EAEM-g-St顆粒的直徑在25°C隨介質(zhì)的pH的變 化。
[0117] 圖42顯示了 Gd-結(jié)合的TOEAEM-g-St-DTPA納米顆粒在不同pH的直徑。
[0118] 圖43顯示了納米顆粒中的近紅外染料結(jié)合。A)結(jié)合反應的示意圖。（B)與空白 相比用NIR染料標記的PMAA-g-St-PS80。C)納米顆粒顯示對于4. 3 μ mol/g的染料含量在 820nm的熒光發(fā)射。
[0119] 圖44顯示了⑷PMAA-g-St_P80聚合物在鼠乳腺癌腫瘤模型中的腫瘤積累。在尾 靜脈注射0. 2ml PMAA-g-St-PS80(4. 5mg/ml)以后，在不同時間點對動物成像。用箭頭指示 腫瘤。
[0120] 表1顯示了納米顆粒制備配方和聚合物組成。將反應收率定義為純化的三元共聚 物與進料中MAA、PS 80和淀粉的總重量的比率。
[0121] 表2顯示了加載藥物的納米顆粒的表征。顯示了藥物加載對顆粒尺寸和表面電荷 的影響。顆粒直徑表示在5分鐘內(nèi)平均的讀出的數(shù)目加權(quán)直徑。加載效率是并入納米顆 粒中的最初加入的藥物的比例，而藥物加載含量是藥物重量相對于納米顆?？傊亓康陌俜?t匕。將所有值報告為3個獨立試驗的平均值土標準差。
[0122] 表3顯示了在不同pH的0. 15M PBS中，具有不同MAA/St進料摩爾比的納米顆粒 的強度加權(quán)流體動力學直徑。使用NaCl將離子強度保持恒定。將所有值描述為3個獨立 試驗的平均值土標準差。
[0123] 表4顯示了從滴定數(shù)據(jù)計算的進料和產(chǎn)物MA含量以及在pH 4和pH 7. 4及IOmM 離子強度的緩沖液中的ξ電位值。將所有值描述為3個獨立試驗的平均值土標準差。
[0124] 表5Α顯示了 St-DTPA-g-PMAA-P80的Gd+3含量和體外弛豫率；在3Τ和7Τ在0. 9% NaCl中測量弛豫率。已經(jīng)包括Omniscan用于比較。
[0125] 表 5B 顯示了 Omniscan?、PolyGd 和 PolyGd-Dox 的 Gd3+含量、Dox 含量、分子量、 顆粒尺寸和A。在3和7T下于鹽水中測量巧。顯示了 3個獨立實驗的平均值和標準差。 基于它的分子式，計算Omniscan?的分子量。
[0126] 表 6 顯示了 Omniscan?、PolyGd 和 PolyGd-Dox 的 Gd3+含量、Dox 含量、分子量、 顆粒尺寸和A。在3和7T下于鹽水中測量巧。顯示了 3個獨立實驗的平均值和標準差。 基于它的分子式，計算Omn i scan?的分子量。
[0127] 表7顯示了不同H)EAEM-g-St批次的進料組合物。 實施例
[0128] 化學品和試劑
[0129] 可溶性淀粉（MW 2, 600-4, 500Da)、甲基丙烯酸（MAA)、N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺 (MBA)、硫代硫酸鈉（STS)、過硫酸鉀（KPS)、聚山梨醇酯80 (PS 80)和十二烷基硫酸鈉（SDS) 購自Sigma-Aldrich Canada (Oakville, ON,加拿大）。在使用之前，通過真空蒸饋除去MAA 抑制劑。所有其它化學物質(zhì)是試劑級，并且原樣使用。
[0130] 細胞系和維持
[0131] 鼠乳腺癌細胞系 EMT6/WT 最初由 Ian Tannock 博士（Ontario Cancer 1]181:;[1：1^6，1'01'0111:0，(^，加拿大）提供，現(xiàn)在維持在我們的實驗室中。在371€在5% C02/95%空氣保濕培養(yǎng)箱中，在75cm2聚苯乙烯組織培養(yǎng)瓶上培養(yǎng)細胞單層。將癌細胞維持 在補充了 10%胎牛血清（Cansera Inc.，Etobicoke，ON,加拿大）的α-最低必需培養(yǎng)基 (Ontario Cancer Institute Media Laboratory, Toronto, 0Ν,加拿大）中。將生長至匯合 的細胞用0· 05%胰蛋白酶_EDTA(Invitrogen Inc. , Burlington, ON,加拿大）進行胰蛋白 酶處理，在新鮮生長培養(yǎng)基中稀釋（1/10)，并重新接種。
[0132] 實驗動物和正位乳腺腫瘤的誘導
[0133] 所有動物工作得到大學健康網(wǎng)絡（University Health Network)動物護理委員會 批準，并根據(jù)加拿大動物護理委員會（Canadian Council on Animal Care)頒布的所有指 南和規(guī)定進行所有實驗。使用8周齡雌性Balb/c小鼠 （Jackson laboratory, Maine, USA)。 在整個研究中，允許動物自由獲取食物和水。對于腫瘤研究，將100萬個鼠 EMT6乳腺癌細 胞皮下注射進左脅腹。監(jiān)測腫瘤的生長，并在5mm的腫瘤平均直徑開始MRI研究。
[0134] 納米顆粒的制備和表征
[0135] 實施例1.聚甲基丙烯酸接枝的淀粉（PMAA-g-St)納米顆粒的合成
[0136] PMAA-PS-80-g-St納米顆粒的合成
[0137] 使用過硫酸鉀/硫代硫酸鈉引發(fā)（KPS/STS)系統(tǒng)，使用自由基分散聚合法在一鍋 中制備PMAA-g-St納米顆粒。進行一系列初步研究，以鑒別合適的表面活性劑類型和濃度 以及得到穩(wěn)定顆粒所需的單體濃度。
[0138] 在浸在水浴中的配有氮氣入口、冷凝器、溫度計和磁力攪拌器的500ml三頸燒瓶 中進行聚合。通過在95°C加熱30分鐘，將期望量的淀粉溶解在蒸餾水中，冷卻至70°C，并 用N 2凈化30分鐘以除去任何溶解的氧。隨后，在攪拌的同時將期望量的SDS、PS 80、KPS 和STS加入淀粉溶液中。15分鐘以后，通過向溶液中加入所需量的氮凈化的MA和MBA，開 始反應。在5分鐘以后出現(xiàn)乳光，繼續(xù)在70°C進行反應8小時以確保完全轉(zhuǎn)化。將產(chǎn)物用 溫水充分洗滌2次，并用甲醇萃取，隨后超速離心以除去任何未反應的物質(zhì)和同聚物。將純 化的顆粒冷凍干燥，并儲存在干燥器中用于將來使用。
[0139] 使用方程式1計算接枝收率百分比（GY% ):

【權(quán)利要求】
1. 生產(chǎn)納米顆粒的方法，所述方法包括下述步驟： (a)將聚合物溶解在液體溶液中； 化）提供包含駿酸側(cè)基的可聚合單體； (C)將所述單體接枝聚合W在溶解的聚合物上形成聚合鏈， (d)提供己氧基化分子，其具有可與形成的鏈反應的官能團，其中： 步驟（C)在所述己氧基化分子的存在下進行，W使所述己氧基化分子與所述聚合鏈共 價連接。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述液體溶液包含輕基溶劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述輕基溶劑包含水。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其中所述聚合物是具有0. 05-3取代度/聚合物 單元的多輕基聚合物，所述單體包含帰基，且所述接枝聚合步驟在交聯(lián)劑的存在下進行。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述多輕基聚合物具有0. 5-3的取代度。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述多輕基聚合物具有2-3的取代度。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述多輕基聚合物包括取代度為0. 5-3的多糖。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述多輕基聚合物包括葡萄糖。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述多糖包括淀粉。
10. 根據(jù)權(quán)利要求4、5或6所述的方法，其中所述步驟（C)的單體W所述交聯(lián)劑的量的 1-20倍（mol/mol)的量存在。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述步驟（C)的單體W所述交聯(lián)劑的量的3-6 倍的量存在。
12. 根據(jù)權(quán)利要求4-11中任一項所述的方法，其中所述聚合步驟是在自由基引發(fā)劑的 存在下進行的自由基接枝聚合。
13. 根據(jù)權(quán)利要求4-12中任一項所述的方法，其中所述引發(fā)劑基本上不含有過渡金 屬。
14. 根據(jù)權(quán)利要求4-12中任一項所述的方法，其中所述引發(fā)劑是過硫酸鹽或其功能等 效物。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項所述的方法，其中所述己氧基化分子的己氧基化物基 團由游離輕基封端。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項所述的方法，其中所述己氧基化分子包括帰基，所述 帰基進行化學反應W將表面活性劑分子共價連接至所述聚合鏈。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述己氧基化分子是具有R(C9-C31)-C(0) 0-基團的聚己氧基化脫水山梨糖醇，其中在所述聚合步驟中，將脫水山梨糖醇通過 R(C9-C31)-C(0)0-基團的C-C共價鍵與第二聚合物連接。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述脫水山梨糖醇是聚山梨醇醋，其中氧基亞 己基單元的總數(shù)是至少10。
19. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述氧基亞己基單元的總數(shù)是10、12、14、16、 18、20、22、24、26、28、30 或 32。
20. 根據(jù)權(quán)利要求17、18或19所述的方法，其中所述R (C9-C31) -C做0-基團含有至少 一個C-C不飽和性，所述C-C不飽和性在所述聚合步驟中反應W形成C-C共價鍵。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述聚己氧基化分子是聚山梨醇醋80。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項所述的方法，其中選擇所述聚合物的量和所述步驟 (C)的單體的量W產(chǎn)生納米顆粒，其中所述聚合鏈中的單體單元與所述聚合物的單體單元 的摩爾比是0. 1-10。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中選擇所述聚合物的量和所述步驟（C)的單體 的量W產(chǎn)生納米顆粒，其中所述聚合鏈中的單體單元與所述聚合物的單體單元的摩爾比是 0? 3_7. 0。
24. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中選擇所述聚合物的量和所述步驟（C)的單體 的量W產(chǎn)生納米顆粒，其中所述聚合鏈中的單體單元與所述聚合物的單體單元的摩爾比是 1-5. 0。
25. 根據(jù)權(quán)利要求1-24中任一項所述的方法，其中選擇所述己氧基化物分子的量 和步驟（C)中的單體的量W產(chǎn)生納米顆粒，其中己氧基化物分子與單體單元的摩爾比是 0.0005-1。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中選擇所述己氧基化物分子的量和步驟（C)中的 單體的量W產(chǎn)生納米顆粒，其中己氧基化物分子與單體單元的摩爾比是0. 003-0. 01。
27. 根據(jù)權(quán)利要求1-26中任一項所述的方法，其中所述聚合步驟在表面活性劑的存在 下進行。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述表面活性劑是陰離子表面活性劑。
29. 生產(chǎn)用于遞送生物試劑的納米顆粒的方法，所述方法包括：權(quán)利要求1-28中任一 項所述的方法，其中將所述試劑共價連接至步驟（a)的聚合物。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述聚合物是多輕基化聚合物，并將所述試劑 通過所述聚合物的輕基氨原子的取代而共價連接至所述聚合物。
31. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述試劑包含能夠絡合金屬的有機部分。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其還包括形成金屬-有機部分絡合物。
33. 根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的方法，其中選擇所述金屬W在磁共振成像中提供信 號。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述金屬是Gd "。
35. 根據(jù)權(quán)利要求1-34中任一項所述的方法，其中所述步驟（C)的單體的量足夠高，W 使在抑7.4和lOmM的離子強度測量的所產(chǎn)生的納米顆粒的水溶液的^電位的絕對值是 至少15mV。
36. 生產(chǎn)用于遞送生物試劑的納米顆粒的方法，所述方法包括；將所述試劑和通過權(quán) 利要求1-35中任一項所述的方法獲得的納米顆粒分散在液體介質(zhì)中，W將所述試劑并入 所述納米顆粒中。
37. 生產(chǎn)用于遞送生物試劑的納米顆粒的方法，所述方法包括；共價連接至通過權(quán)利 要求1-35中任一項所述的方法生產(chǎn)的納米顆粒和將所述試劑共價連接至所述納米顆粒的 聚合鏈的駿酸基團。
38. 生產(chǎn)載體納米顆粒的方法，所述方法包括下述步驟： (i) 將聚合物溶解在水溶液中； (ii) 提供包含駿酸側(cè)基的可聚合單體； (iii) 將所述單體接枝聚合w在溶解的聚合物上形成聚合鏈， (iv) 提供聚己氧基化分子，其具有可與形成的鏈反應的官能團，其中： 聚合步驟（ii)在聚己氧基化分子的存在下進行，W將所述聚己氧基化分子與形成的 鏈共價連接，且聚合的產(chǎn)物形成所述納米顆粒，其中聚己氧基化部分在所述納米顆粒的外 部上。
39. 納米顆粒，其包含： -第一聚合物； -與所述第一聚合物接枝的第二聚合物；和 -與所述第二聚合物共價結(jié)合的聚己氧基化部分。
40. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的納米顆粒，其中所述第二聚合物包含聚合的己帰基，所述 第二聚合物的骨架的每2個碳具有約1個駿基。
41. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的納米顆粒，其中所述第二聚合物是聚帰基聚合物。
42. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的納米顆粒，其中所述聚帰基聚合物是聚丙帰酸。
43. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的納米顆粒，其中所述聚丙帰酸是聚甲基丙帰酸。
44. 根據(jù)權(quán)利要求39-43中任一項所述的納米顆粒，其中所述聚己氧基化部分是具有 R(C9-C31)-C(0)0-基團的脫水山梨糖醇，其中所述脫水山梨糖醇通過R-基團的C-C共價鍵 與所述第二聚合物連接。
45. 根據(jù)權(quán)利要求39-44中任一項所述的納米顆粒，其中所述第一聚合物包括多輕基 聚合物。
46. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的納米顆粒，其中所述多輕基聚合物包括取代度為0. 05-3的 多糖。
47. 根據(jù)權(quán)利要求46所述的納米顆粒，其中所述多糖包括淀粉。
48. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的納米顆粒，其中所述第二聚合物是交聯(lián)的。
49. 組合物，其包含多個權(quán)利要求39-48中任一項所述的納米顆粒，還包含藥學活性 劑。
50. 根據(jù)權(quán)利要求49所述的組合物，其中將所述試劑吸附至所述納米顆粒。
51. 組合物，其包含多個權(quán)利要求39-48中任一項所述的納米顆粒，還包含信號分子。
52. 根據(jù)權(quán)利要求51所述的組合物，其中所述信號分子是通過有機部分馨合的金屬， 其中所述部分與所述納米顆粒共價結(jié)合。
53. 根據(jù)權(quán)利要求52所述的組合物，其中所述有機部分與所述第一聚合物共價結(jié)合。
54. 根據(jù)權(quán)利要求51所述的組合物，其中所述信號分子與所述納米顆粒共價結(jié)合，優(yōu) 選地與駿酸側(cè)基共價連接。
55. 根據(jù)權(quán)利要求51或54所述的組合物，其中所述信號分子是英光團。
56. 根據(jù)權(quán)利要求51-54中任一項所述的組合物，其還包含藥學活性劑。
57. 納米顆粒，其包含： -第一聚合物，其包含多糖； -第二交聯(lián)聚合物，其包含與所述第一聚合物接枝的聚甲基丙帰酸；和 -聚山梨醇醋，其包含與所述第二聚合物共價結(jié)合的（C9-C31) R-C (0) 0-基團，所述共 價結(jié)合通過所述第二聚合物的碳主鏈和所述R基團之間的C-C鍵實現(xiàn)。
58. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的納米顆粒，其中所述（C9-C31)R-C(0)0-基團是-(C17) R-C (0)0-，其中R是直鏈焼基。
59. 根據(jù)權(quán)利要求58所述的納米顆粒，其中所述聚山梨醇醋包含基團-〇(邸2邸2〇) ,-C (0) (C17) R、冊(邸2邸2〇) X-、-冊(邸2邸2〇) y-、-冊(邸2邸2〇) Z-，其中 w+x+y+z = 20。
60. 根據(jù)權(quán)利要求57、58或59所述的納米顆粒，其中所述多糖的分子量是 2,600-4, 500Da〇
61. 根據(jù)權(quán)利要求57、58或59所述的納米顆粒，其中所述第一聚合物包含淀粉。
62. 根據(jù)權(quán)利要求57-61中任一項所述的納米顆粒，其中所述多糖的單體單元與所述 聚甲基丙帰酸的單體甲基丙帰酸醋單元的摩爾比是0. 2-8. 0。
63. 根據(jù)權(quán)利要求57-62中任一項所述的納米顆粒，其中所述聚山梨醇醋與所述聚甲 基丙帰酸的單體甲基丙帰酸醋單元的摩爾比是0. 002-0. 03。
64. 生產(chǎn)納米顆粒的方法，所述方法包括下述步驟： (a)將聚合物溶解在液體溶液中； 化）提供包含焼基氨基焼基醋側(cè)基的可聚合單體； (C)提供交聯(lián)劑；和 (d)將所述單體接枝聚合W在溶解的聚合物上形成聚合鏈，從而形成所述納米顆粒。
65. 根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述聚合物是具有0. 05-3取代度/聚合物單元 的多輕基聚合物，所述單體包括帰基，且所述接枝聚合步驟在交聯(lián)劑的存在下進行。
66. 根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其中所述多輕基聚合物具有1-3取代度/聚合物單 JL〇
67. 根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其中所述多輕基聚合物包含取代度為0.5-3的多糖。
68. 根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其中所述多輕基聚合物包括葡萄糖。
69. 根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其中所述多糖包括淀粉。
70. 根據(jù)權(quán)利要求64-69中任一項所述的方法，其中所述液體溶液包含輕基溶劑。
71. 根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中所述輕基溶劑包含水和/或醇。
72. 根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其中所述輕基溶劑包含水和己醇。
73. 根據(jù)權(quán)利要求64-72中任一項所述的方法，其中所述可聚合單體是甲基丙帰酸的 焼基氨基焼基酉旨。
74. 根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中所述單體是甲基丙帰酸二己基氨基己醋。
75. 根據(jù)權(quán)利要求64-74中任一項所述的方法，其中所述聚合步驟是在自由基引發(fā)劑 的存在下進行的自由基接枝聚合。
76. 根據(jù)權(quán)利要求75所述的方法，其中所述引發(fā)劑基本上不含有過渡金屬。
77. 根據(jù)權(quán)利要求75或76所述的方法，其中所述引發(fā)劑是過硫酸鹽或其功能等效物。
78. 根據(jù)權(quán)利要求64-77中任一項所述的方法，其中所述交聯(lián)劑是己二醇二甲基丙帰 酸醋。
79. 根據(jù)權(quán)利要求64-78中任一項所述的方法，其中所述步驟（d)的單體W所述交聯(lián)劑 的量的1-200倍（mol/mol)的量存在。
80. 根據(jù)權(quán)利要求79所述的方法，其中所述步驟（d)的單體W所述交聯(lián)劑的量的3-50 倍（mol/mol)的量存在。
81. 根據(jù)權(quán)利要求64-80中任一項所述的方法，其中選擇所述聚合物的量和所述步驟 (C)的單體的量W產(chǎn)生納米顆粒，其中所述聚合鏈中的單體單元與所述聚合物的單體單元 的摩爾比是0.05-20。
82. 根據(jù)權(quán)利要求81所述的方法，其中選擇所述聚合物的量和所述步驟（C)的單體 的量W產(chǎn)生納米顆粒，其中所述聚合鏈中的單體單元與所述聚合物的單體單元的摩爾比是 2-4。
83. 根據(jù)權(quán)利要求64-82中任一項所述的方法，其中聚山梨醇醋存在于步驟（d)中。
84. 根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中所述聚山梨醇醋的R-基團是含有不飽和性的姪 基。
85. 根據(jù)權(quán)利要求84所述的方法，其中所述聚山梨醇醋是聚山梨醇醋80。
86. 根據(jù)權(quán)利要求83、84或85所述的方法，其中所述可聚合單體W所述聚山梨醇醋的 量的5-50倍（mol/mol)的量存在。
87. 根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中所述可聚合單體W所述聚山梨醇醋的量的 20-30倍（mol/mol)的量存在。
88. 根據(jù)權(quán)利要求64-87中任一項所述的方法，其中非離子穩(wěn)定劑存在于步驟（d)中。
89. 根據(jù)權(quán)利要求88所述的方法，其中所述穩(wěn)定劑是聚己帰化咯焼麗。
90. 生產(chǎn)用于遞送生物試劑的納米顆粒的方法，所述方法包括：權(quán)利要求64-89中任一 項所述的方法，其中將所述試劑共價連接至所述步驟（a)的聚合物。
91. 根據(jù)權(quán)利要求90所述的方法，其中所述試劑包含能夠絡合金屬的有機部分。
92. 根據(jù)權(quán)利要求91所述的方法，其還包括形成金屬-有機部分絡合物。
93. 根據(jù)權(quán)利要求92所述的方法，其中所述有機部分是DTPA。
94. 根據(jù)權(quán)利要求92或93所述的方法，其中選擇所述金屬W在磁共振成像中提供信 號。
95. 根據(jù)權(quán)利要求94所述的方法，其中所述金屬是Gd "。
96. 生產(chǎn)用于遞送生物試劑的納米顆粒的方法，所述方法包括；將所述試劑和權(quán)利要 求64-95中任一項所述的方法獲得的納米顆粒分散在液體介質(zhì)中，W將所述試劑并入所述 納米顆粒中。
97. 納米顆粒，其包含： -第一聚合物，其包含多糖；和 -第二交聯(lián)聚合物，其包含與所述第一聚合物接枝的甲基丙帰酸的焼基氨基焼基醋，其 中所述第二聚合物是交聯(lián)的。
98. 根據(jù)權(quán)利要求97所述的納米顆粒，其中所述第二聚合物是聚合的甲基丙帰酸二己 基氨基己醋。
99. 根據(jù)權(quán)利要求97所述的納米顆粒，其中第二聚合物包含聚合的己帰基，所述第二 聚合物的骨架的每2個碳具有約1個駿基。
100. 根據(jù)權(quán)利要求97、98或99所述的納米顆粒，其中所述多糖是淀粉。
101. 組合物，其包含權(quán)利要求97-100中任一項所述的納米顆粒的溶液，其中當所述納 米顆粒的環(huán)境溶液的抑從約4變至約7. 4時，所述納米顆粒表現(xiàn)出增加的500-1500倍的 體積變化。
102. 根據(jù)權(quán)利要求101所述的組合物，其中當所述納米顆粒的環(huán)境溶液的抑從約4變 至約7. 4時，所述納米顆粒表現(xiàn)出增加的700-1100倍的體積變化。
103. 組合物，其包含多個權(quán)利要求97-100中任一項所述的納米顆粒，還包含信號分 子。
104. 根據(jù)權(quán)利要求101或102所述的組合物，其還包含信號分子。
105. 根據(jù)權(quán)利要求103或104所述的組合物，其中所述信號分子是通過有機部分馨合 的金屬，其中所述部分與所述納米顆粒共價結(jié)合。
106. 根據(jù)權(quán)利要求105所述的組合物，其中所述有機部分與所述第一聚合物共價結(jié) 合。
107. 根據(jù)權(quán)利要求106所述的組合物，其中選擇所述金屬W在磁共振成像中提供信 號，并且所述甲基丙帰酸的焼基氨基焼基醋與所述多糖的單體單元的摩爾比是0. 5-5。
108. 根據(jù)權(quán)利要求107所述的組合物，其中所述甲基丙帰酸的焼基氨基焼基醋與所述 多糖的單體單元的摩爾比是0. 5-2。
109. 組合物，其包含多個權(quán)利要求97-100中任一項所述的納米顆粒，還包含藥學活性 劑。
110. 根據(jù)權(quán)利要求109所述的組合物，其中將所述試劑吸附至所述納米顆粒。
【文檔編號】C08F251/00GK104470975SQ201380023187
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年3月4日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月2日
【發(fā)明者】吳曉漁, 艾利萊扎·莎爾維利, 蔡平 申請人:多倫多大學董事局