本發(fā)明涉及一種新型佐劑及其與抗原結(jié)合作為疫苗的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
佐劑被定義為當(dāng)用于與特異性抗原結(jié)合時(shí)起促進(jìn)并指導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答作用的物質(zhì)（Wack,A.,etal(2005)Curr.Opin.Immunol.17,411–418.）。通常，在與所有目前可用的商業(yè)疫苗一同使用時(shí)，與抗原結(jié)合的佐劑不會(huì)引起對(duì)自身的免疫應(yīng)答。由于大多數(shù)抗原較差的致免疫特性（immunogenicproperties），使用佐劑以提高、激活并指導(dǎo)對(duì)這些抗原的先天性及適應(yīng)性免疫應(yīng)答。佐劑的概念已經(jīng)延伸到了與免疫系統(tǒng)的特定細(xì)胞上的表面分子相互作用的載體，所述免疫系統(tǒng)作用于宿主的免疫系統(tǒng)和給藥的抗原之間的界面（interface）（SegalBH,etal,DrugDiscovToday.2006Jun;11(11-12):534-40.）。在這種情況下，佐劑幫助刺激免疫系統(tǒng)并提高對(duì)聯(lián)合給藥的抗原（co-administeredantigen）的應(yīng)答。因此，佐劑已被廣泛用于疫苗的開發(fā)中。可以根據(jù)佐劑的生化特性或作用機(jī)理對(duì)佐劑進(jìn)行分類。主要的兩類佐劑包括，直接作用于免疫系統(tǒng)的化合物，例如刺激免疫應(yīng)答的細(xì)菌毒素，以及能夠以受控的方式促進(jìn)抗原呈遞并表現(xiàn)為載體的分子。目前，大量佐劑被用于提高包括油、鉬鹽、蛋白和核酸的抗原的免疫學(xué)特性（StevenG.Reed,etal(2003)ExpertRev.Vaccines2,167–188.）。原則上，基于對(duì)抗原的應(yīng)答以及免疫應(yīng)答的質(zhì)量在很大程度上取決于佐劑的純度和性質(zhì)的事實(shí)，理想的佐劑應(yīng)該是用化學(xué)方法和物理方法明確定義的，這樣便于質(zhì)量控制。由于在大多數(shù)情況下抗原是明確定義的，因此，佐劑特異性的控制將確保最終特異性免疫應(yīng)答的抗原的可重復(fù)性開發(fā)。在上下文中，佐劑不僅可以引起對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，還可以指導(dǎo)抗原在宿主中引起的免疫應(yīng)答。如果免疫應(yīng)答向適當(dāng)?shù)姆较虬l(fā)展，佐劑的性質(zhì)將在本質(zhì)上影響作為治療產(chǎn)品的抗原的價(jià)值。除了有助于誘導(dǎo)對(duì)抗原的免疫（體液或細(xì)胞介導(dǎo)的）應(yīng)答外，佐劑的目的是引起導(dǎo)致特異性細(xì)胞因子產(chǎn)生的免疫效應(yīng)。另外，由于由抗原-佐劑構(gòu)建體引發(fā)的免疫應(yīng)答的特異性和量級(jí)可能主要依賴于宿主免疫細(xì)胞的性質(zhì)，因此，不結(jié)合宿主是難以分析佐劑的效力（potency）的。因此，由抗原誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答可能根據(jù)佐劑的性質(zhì)和宿主免疫系統(tǒng)的性質(zhì)而有所不同。隨著新型疫苗的開發(fā)，總有對(duì)新型佐劑的需求，并且通常需要佐劑以實(shí)現(xiàn)免疫應(yīng)答的有效誘導(dǎo)。新型佐劑也可以賦予疫苗新的引人注目的特性，例如，它們可以影響所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的類型和方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
我們意外的發(fā)現(xiàn)，將來源于利什曼原蟲（Leishmania）物種的特定蛋白片段和確定的抗原（definedantigen）進(jìn)行基因融合，當(dāng)用產(chǎn)生的嵌合蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行體內(nèi)給藥時(shí)，能夠顯著地提高融合的抗原的致免疫的潛力。我們還發(fā)現(xiàn)，存在于DNA質(zhì)粒中的嵌合基因體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生的蛋白也誘導(dǎo)了對(duì)基因融合抗原的強(qiáng)烈體液應(yīng)答，然而，用僅含有編碼所述抗原的基因的質(zhì)粒進(jìn)行給藥卻不會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液應(yīng)答。核酸分子第一方面，本發(fā)明提供了一種核酸分子，表示該核酸分子的核苷酸序列選自由以下核苷酸序列所組成的組中：i.編碼多肽或肽的核苷酸序列，該多肽或肽含有與SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性或相似性的氨基酸序列；ii.含有與SEQIDNO:2的核苷酸序列具有至少50%的序列同一性或相似性的核苷酸序列的核苷酸序列；iii.互補(bǔ)鏈與（i）或（ii）的序列的核酸分子雜交的核苷酸序列；以及iv.由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性而不同于（iii）的核酸分子的序列的核苷酸序列。當(dāng)所述核酸分子可操作地連接到編碼后文定義的抗原的核苷酸序列上時(shí)，優(yōu)選所述核酸分子被用作佐劑。本發(fā)明中描述的核酸分子由于其編碼的蛋白能夠用作佐劑而具有吸引力。本文中，佐劑被定義為能夠?qū)⒖乖蔬f到免疫系統(tǒng)的分子，這樣，當(dāng)抗原與佐劑結(jié)合給藥時(shí)，能夠引發(fā)對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答或增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。為了分析特異性抗原引發(fā)的免疫應(yīng)答，將所述免疫應(yīng)答與不具有佐劑的抗原誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答進(jìn)行了比較，在受試者或來自受試者的細(xì)胞中評(píng)價(jià)誘導(dǎo)率。上下文中，特異性抗原引發(fā)的免疫應(yīng)答與誘導(dǎo)的對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答或誘導(dǎo)增強(qiáng)的對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答或?qū)λ隹乖目蓹z測(cè)的免疫應(yīng)答是同義的。引發(fā)抗原特異性免疫應(yīng)答可以替換為誘導(dǎo)、增強(qiáng)或提高對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答可以為B和/或T細(xì)胞應(yīng)答。免疫應(yīng)答可以為B細(xì)胞應(yīng)答，即，專門針對(duì)所述抗原的抗體的產(chǎn)生?？贵w優(yōu)選為IgG抗體，更優(yōu)選IgG2a和/或IgG1抗體。免疫應(yīng)答可以為T細(xì)胞應(yīng)答，優(yōu)選為Th1應(yīng)答、Th2應(yīng)答或均衡的Th2/Th1應(yīng)答。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，根據(jù)疾病可能需要誘導(dǎo)B和/或T細(xì)胞應(yīng)答以控制疾病。可以通過ELISA評(píng)估所述抗體的產(chǎn)生，優(yōu)選按照實(shí)施例進(jìn)行。可選擇地，可以通過測(cè)定細(xì)胞因子（例如，IFNgamma、IL-6、TNFalpha或IL-10）的產(chǎn)生檢測(cè)所述免疫應(yīng)答?？梢酝ㄟ^ELISA評(píng)估這些細(xì)胞因子的產(chǎn)生，優(yōu)選按照實(shí)施例進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，特異性抗原引發(fā)的免疫應(yīng)答的檢測(cè)是指所述檢測(cè)發(fā)生在所述佐劑和抗原給藥后的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12小時(shí)以上，或至少1天，或至少2天，或至少3天，或至少4天以上。在受試者或來自受試者的細(xì)胞中進(jìn)行檢測(cè)的評(píng)估，優(yōu)選按照實(shí)施例進(jìn)行。在本發(fā)明的上下文中，特異性抗原引發(fā)的免疫應(yīng)答優(yōu)選指對(duì)所述抗原的可檢測(cè)的免疫應(yīng)答?？蓹z測(cè)的提高優(yōu)選為，進(jìn)行所述佐劑和抗原給藥后的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12小時(shí)以上，或至少1天，或至少2天，或至少3天，或至少4天以上，本文已限定的抗體和/或細(xì)胞因子的量提高至少5%，或10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、150%、200%以上。在受試者或來自受試者的細(xì)胞中進(jìn)行檢測(cè)的評(píng)估，優(yōu)選按照實(shí)施例進(jìn)行。優(yōu)選地，當(dāng)編碼的多肽作為佐劑時(shí)，與本文之前定義的具體限定的氨基酸和/或核苷酸序列（分別為SEQIDNO:1和SEQIDNO:2）具有至少50%、60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性或相似性的氨基酸序列和/或核苷酸序列是有功能的。當(dāng)由所述氨基酸序列所示的所述多肽與所述抗原一起使用時(shí)，至少在某種程度上能夠引發(fā)、誘導(dǎo)、增強(qiáng)或提高對(duì)抗原的免疫應(yīng)答?！爸辽僭谀撤N程度上”優(yōu)選指使用SEQIDNO:1檢測(cè)的抗原特異性免疫應(yīng)答的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或100%。本文之前已經(jīng)定義了引發(fā)、誘導(dǎo)、增強(qiáng)或提高對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。本文定義的核酸分子優(yōu)選為至少含有SEQIDNO:2的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42個(gè)以上的連續(xù)核苷酸的分子，并且當(dāng)其編碼的多肽與本文之前定義的抗原共同使用時(shí)，能夠引發(fā)、誘導(dǎo)、增強(qiáng)或提高對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本文定義的所述核酸分子優(yōu)選為至少含有SEQIDNO:2的762、765、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或1110個(gè)連續(xù)核苷酸的分子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本文定義的所述核酸分子優(yōu)選為至多含有SEQIDNO:2的1110、1000、990、980、970、960、950、940、930、920、910、900、890、880、870、860、850、840、830、820、810、800、790、780、770或765個(gè)連續(xù)核苷酸的分子。本文定義的多肽優(yōu)選至少含有SEQIDNO:1的6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42個(gè)以上的連續(xù)氨基酸的多肽，并且當(dāng)其與本文之前定義的抗原共同使用時(shí)，能夠引發(fā)、誘導(dǎo)、增強(qiáng)或提高對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本文定義的所述核酸分子優(yōu)選為至少含有SEQIDNO:1的254、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360或370個(gè)連續(xù)氨基酸的分子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本文定義的所述核酸分子優(yōu)選為至多含有SEQIDNO:1的370、360、350、340、330、320、310、300、290、280、270、260或254個(gè)連續(xù)氨基酸的分子。由SEQIDNO:1組成的多肽也被稱為APP（擴(kuò)增和激活蛋白，AugmentorandActivatorProtein）。本發(fā)明涵蓋的氨基酸或核苷酸序列可以來源于本文限定的分別通過替換、插入、缺失或添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)以上的核苷酸或氨基酸的序列中的一種。本發(fā)明涵蓋的氨基酸序列可以來源于本文限定的通過添加額外的N-或C-末端氨基酸或化學(xué)基團(tuán)以提高穩(wěn)定性、溶解性和致免疫性的序列中的一種。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋的氨基酸序列通過存在于SEQIDNO:1中的至少1個(gè)氨基酸的保守替換而來源于SEQIDNO:1。能夠替換的所述氨基酸可以為組氨酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的是，組氨酸可以被天冬酰胺或谷氨酰胺替換（即，后文定義的保守替換）。因此，在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋的氨基酸序列來源于SEQIDNO:1，并且至多含有1、2、3、4、5或6個(gè)組氨酸。相應(yīng)地，在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋的核酸序列來源于SEQIDNO:2，并且編碼至多含有1、2、3、4、5或6個(gè)組氨酸的氨基酸序列。在一種實(shí)施方式中，所述氨基酸序列不含有任何組氨酸和/或所述相應(yīng)的核酸序列編碼不含有組氨酸的氨基酸序列。因此，在一種實(shí)施方式中，表示核酸分子的核苷酸序列選自由以下核苷酸序列所組成的組中：i.編碼多肽或肽的核苷酸序列，該多肽或肽含有與SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性或相似性的氨基酸序列；ii.含有與SEQIDNO:2的核苷酸序列具有至少50%的序列同一性或相似性的核苷酸序列的核苷酸序列；iii.互補(bǔ)鏈與（i）或（ii）的序列的核酸分子雜交的核苷酸序列；以及iv.由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性而不同于（iii）的核酸分子的序列的核苷酸序列；并且，其中，所述核酸分子編碼至多含有1、2、3、4、5或6個(gè)組氨酸的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述核酸分子編碼不含有組氨酸的氨基酸序列。優(yōu)選地，在所述核酸分子中，編碼組氨酸的至少1個(gè)密碼子或編碼組氨酸的至少2、3、4、5、6個(gè)密碼子已經(jīng)被編碼天冬酰胺或谷氨酰胺的密碼子所替代。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，由本文之前定義的核苷酸序列所示的本發(fā)明的核酸分子進(jìn)一步含有編碼抗原的核苷酸序列。我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)相應(yīng)編碼抗原的核苷酸序列包括在、或融合到、或可操作地連接到編碼本文之前定義的佐劑的核酸分子中時(shí)，由本發(fā)明的佐劑引發(fā)的免疫應(yīng)答是最理想的。因此，本發(fā)明中的佐劑優(yōu)選以將其編碼核苷酸序列融合到或可操作地連接到編碼抗原的核苷酸序列中的方式使用。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述核酸分子沒有或不含有編碼多肽的序列，該多肽在它的全長(zhǎng)上與SEQIDNO:3相同或具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%的同源性。本文中的抗原定義為能夠被針對(duì)所述抗原的抗體識(shí)別的分子（當(dāng)所述分子存在于受試者中時(shí)）。當(dāng)存在于所述受試者中時(shí)，能夠誘導(dǎo)來自受試者的特異性免疫應(yīng)答的抗原被稱為具有致免疫性或?yàn)槊庖咴?。?yōu)選免疫應(yīng)答如本文之前所定義的?？乖瓋?yōu)選為多肽或肽。肽可以含有6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個(gè)氨基酸以上?？乖梢詾閬碓从诤笪亩x的生物體中的蛋白片段或全長(zhǎng)蛋白。也可以使用來自相同生物體的幾種抗原，以更有效地抵抗生物體。還可以參考由核酸序列所示的編碼核酸分子定義抗原?？乖膩碓纯梢詾榈鞍住⒌鞍椎南锖?或其片段，可以為純化的形式，或可以涵括在天然成分中，優(yōu)選為生物源，例如，細(xì)菌裂解物、寄生裂解物、酵母菌裂解物、病毒裂解物、真菌裂解物、超聲產(chǎn)物（sonicate）或固定產(chǎn)物（fixate）?？蛇x擇地，抗原可以為化學(xué)合成的或在體外酶解產(chǎn)生的。作為抗原的蛋白或其片段的來源也可以為來自RNA或DNA模板的編碼所述蛋白或其片段的核酸。所述RNA或DNA分子可以為“裸露的”DNA，優(yōu)選存在于囊泡或脂質(zhì)體中，或它們可以存在于核酸構(gòu)建體或載體中。所述載體可以為本領(lǐng)域公知的任何（重組體）DNA或RNA載體，優(yōu)選為質(zhì)粒；其中，編碼潛在抗原的基因被可操作地連接到賦予編碼信使表達(dá)和翻譯的調(diào)控序列上。所述載體也可以為DNA或RNA病毒，例如，但不限于腺病毒、腺相關(guān)的病毒（Adeno-AssociatedVirus，AAV）、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、改良的安卡拉痘苗病毒（modifiedVacciniaAnkaravirus，MVA）或雞痘病毒（FowlPoxvirus）、或任何其它能夠在所選受試者中使多肽表達(dá)的病毒載體。DNA載體可以為非整合的，例如，游離的復(fù)制載體（episomallyreplicatingvectors），或可以為通過隨機(jī)整合或同源重組整合到宿主基因組中的載體。根據(jù)本發(fā)明，隨意嵌入載體（例如，病毒或質(zhì)粒）中的含有編碼抗原蛋白或其片段的基因的DNA分子可以整合到受試者的基因組中。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，這種宿主可以為微生物。優(yōu)選這種重組體微生物為分支桿菌（Mycobacterium），例如肺結(jié)核分支桿菌（M.tuberculosis）、包皮垢分支桿菌（M.smegmatis）、牛結(jié)核分支桿菌（M.bovis），并且最優(yōu)選為能夠?qū)⒏鶕?jù)本發(fā)明的多肽或其片段傳遞到宿主中的牛結(jié)核分支桿菌卡介苗（BCG）或包皮垢分支桿菌（如Yue.Y.etal,(2007),J.Virol.Meth.,141:41-48,CayabiyabY.etal,(2006),J.Virol.,80:1645-1652中所述）。重組體BCG以及重組的方法為本領(lǐng)域所公知；例如，參見WO2004094469。這種重組體微生物可以制備成活的重組體和/或活的減毒疫苗，如Jacobsetal.1987,Nature,327(6122):532-5中公開的。所述載體也可以存在于細(xì)菌來源的宿主中，例如，但并不限于，活的減毒的和/或重組志賀氏桿菌（Shigella）或沙門氏菌（salmonella）細(xì)菌。在本發(fā)明的上下文中，受試者指人或動(dòng)物。涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)的動(dòng)物包括哺乳動(dòng)物，優(yōu)選犬?？乖梢詠碓从谌魏我阎呐c受試者的疾病或病癥有關(guān)的生物體。抗原可以來源于例如，細(xì)菌、酵母菌、真菌、寄生蟲的微生物。可選擇地，抗原可以來源于病毒。抗原也可以為自身或自體抗原，例如，與癌癥或腫瘤抗原有聯(lián)系或相關(guān)的抗原?？乖部梢耘c過敏性疾病有聯(lián)系或相關(guān)。疾病可以為寄生蟲病。在這種情況下，抗原可以來源于屬于頂復(fù)亞門（apicomplexa）（例如，瘧原蟲）和/或動(dòng)質(zhì)體門（kinetoplastidae）的原生動(dòng)物，特別是錐蟲科（trypanosomatid）家族成員，更特別是錐蟲科原生動(dòng)物利什曼原蟲的不同物種。存在20種以上已知的利什曼原蟲物種，包括利什曼原蟲亞屬的物種，包括復(fù)雜的碩大利什曼原蟲（L.major），包括碩大利什曼原蟲，復(fù)雜的杜氏利什曼原蟲（L.Donovani），包括恰氏利什曼原蟲（L.chagasi）、杜氏利什曼原蟲（L.donovani）和嬰兒利什曼原蟲（L.infantum），復(fù)雜的墨西哥利什曼原蟲（L.Mexicana），包括亞馬孫利什曼原蟲（L.amazonensis）和墨西哥利什曼原蟲（L.mexicana）以及維納尼亞亞種（subspeciesViannia），包括復(fù)雜的巴西利什曼原蟲（L.braziliensis），包括巴西利什曼原蟲和秘魯利什曼原蟲（L.peruviana）和復(fù)雜的圭亞利什曼原蟲（L.guyanensis），包括圭亞利什曼原蟲和巴拿馬利什曼原蟲（L.panamensis）的亞種。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗原來源于利什曼原蟲物種，優(yōu)選碩大利什曼原蟲和/或嬰兒利什曼原蟲。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗原來源于瘧原蟲物種，具體的目標(biāo)瘧原蟲物種為惡性瘧原蟲（Plasmodiumfalciparum）和間日瘧原蟲（Plasmodiumvivax）。例如，如果抗原來源于寄生蟲，優(yōu)選來源于引起利什曼病的利什曼原蟲物種，所述化合物可以選自由來自如Iborra,S.等的出版物中所公開的引起寄生蟲病的寄生蟲的其它蛋白源所組成的組中（Iborra,S.,etal2004.Vaccine22:3865-76）。本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選的抗原蛋白源為組蛋白，例如，H2A、H2B、H3、H4，或核糖體蛋白，例如，LiP0、L2、L7、L8、L16、S6、L3、L5和S4。優(yōu)選的H2A蛋白如SEQIDNO:3所示。優(yōu)選的編碼H2A的核酸如SEQIDNO:4所示。優(yōu)選的H2B蛋白如SEQIDNO:5所示。優(yōu)選的編碼H2B的核酸如SEQIDNO:6所示。優(yōu)選的H3蛋白如SEQIDNO:7所示。優(yōu)選的編碼H3的核酸如SEQIDNO:8所示。優(yōu)選的H4蛋白如SEQIDNO:9所示。優(yōu)選的編碼H4的核酸如SEQIDNO:10所示。優(yōu)選的LiP0蛋白如SEQIDNO:11所示。優(yōu)選的編碼LiP0的核酸如SEQIDNO:12所示。優(yōu)選的L2蛋白如SEQIDNO:13所示。優(yōu)選的編碼L2的核酸如SEQIDNO:14所示。優(yōu)選的L7蛋白如SEQIDNO:15所示。優(yōu)選的編碼L7的核酸如SEQIDNO:16所示。優(yōu)選的L8蛋白如SEQIDNO:17所示。優(yōu)選的編碼L8的核酸如SEQIDNO:18所示。優(yōu)選的L16蛋白如SEQIDNO:19所示。優(yōu)選的編碼L16的核酸如SEQIDNO:20所示。優(yōu)選的S4蛋白如SEQIDNO:21所示。優(yōu)選的編碼S4的核酸如SEQIDNO:22所示。優(yōu)選的S6蛋白如SEQIDNO:23所示。優(yōu)選的編碼S6的核酸如SEQIDNO:24所示。優(yōu)選的L3蛋白如SEQIDNO:25所示。優(yōu)選的編碼L3的核酸如SEQIDNO:26所示。優(yōu)選的L5蛋白如SEQIDNO:27所示。優(yōu)選的編碼L5的核酸如SEQIDNO:28所示。另一實(shí)例為含有幾種寄生蟲抗原的聚蛋白的應(yīng)用，參見Stober等和Aebischer等和Poot等（StoberC.B.U.G.,etal(2006),.Vaccine.,24:2602-2616;AebischerT.,etal,(2000)InfectionandImmunity.,68:1328-1336;andPootJetal,(2009),Vaccine,27:4439-4446）。在以下段落中，組蛋白也可以用作抗原的蛋白來源。優(yōu)選的化合物包括組蛋白或其片段，或編碼所述組蛋白或所述組蛋白片段的核酸分子。更優(yōu)選地，組蛋白為在EP1687023中限定的H2A、H2B、H3和/或H4。組蛋白H2A、H2B、H3和H4是非常保守的核蛋白，并且它們的序列為本領(lǐng)域所公知（Requena,J.M.,etal2000;ParasitolToday16:246-50）。優(yōu)選地，所述組蛋白從在進(jìn)化樹中與引起疾病的生物體接近的生物體中獲得。因此，在治療寄生蟲疾病，例如利什曼病中使用的具體目標(biāo)組蛋白來源為原生動(dòng)物，例如瘧原蟲。另外，目標(biāo)原生動(dòng)物為錐蟲科家族的成員，更特別地，為錐蟲科原生動(dòng)物利什曼原蟲的特定不同物種。其它優(yōu)選的化合物包括其它核糖體蛋白及其片段，或編碼所述蛋白或其片段的核酸分子。其它核糖體蛋白的實(shí)例包括L19和S4。其它優(yōu)選的化合物包括如WO2009/090175中限定的核糖體蛋白提取物。疾病可以包括，但并不限于，過敏癥或癌癥。本發(fā)明的上下文中，可以使用任何類型的已知與癌癥有聯(lián)系的或特異性的抗原。這種類型的抗原可以命名為腫瘤抗原。腫瘤抗原可以突變的致癌基因或突變的腫瘤抑制基因的蛋白產(chǎn)物，或已知在腫瘤或癌癥中表達(dá)的任何基因或突變基因的蛋白產(chǎn)物。腫瘤抗原可以為過表達(dá)的或異常表達(dá)的基因的蛋白產(chǎn)物。腫瘤抗原可以為致瘤病毒的蛋白產(chǎn)物。腫瘤抗原可以為腫瘤胚基因（oncofetalgene）的蛋白產(chǎn)物。腫瘤抗原的實(shí)例包括以下基因的蛋白產(chǎn)物：α-胎甲球蛋白（alphafetoprotein，AFP）、癌胚抗原（CEA）、上皮腫瘤抗原（ETA）、黑色素瘤相關(guān)的抗原（MAGE）、p53或CD20。本文定義的腫瘤抗原還可以為蛋白產(chǎn)物的一部分，即，來源于本文定義的基因的蛋白產(chǎn)物的多肽、肽。優(yōu)選的癌癥抗原包括CD20或其片段。CD20在一些B細(xì)胞惡性腫瘤中表達(dá)。CD20的優(yōu)選氨基酸序列如SEQIDNO:37所示。上下文中，優(yōu)選的抗原含有SEQIDNO:37的6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個(gè)以上的連續(xù)氨基酸，和/或與SEQIDNO:37至少具有50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%的同一性或相似性。癌癥可以為胃腺瘤（gastricademoma）和/或乳腺瘤。優(yōu)選的癌癥抗原包括S100A2蛋白或其片段。所述S100A2蛋白為上調(diào)與人胃腺癌（gastricadenocarcinoma）（1）或乳腺瘤（2）發(fā)展相關(guān)的鈣結(jié)合蛋白。S100A2的優(yōu)選氨基酸序列如SEQIDNO:42所示。編碼優(yōu)選的S100A2的優(yōu)選核酸序列如SEQIDNO:43所示。上下文中，優(yōu)選的抗原含有SEQIDNO:42的6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個(gè)以上的連續(xù)氨基酸，和/或與SEQIDNO:42至少具有50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%的同一性或相似性。疾病可以為過敏癥?？乖€可以與過敏性疾病有聯(lián)系或相關(guān)。優(yōu)選的過敏性抗原的實(shí)例包括來自柏木屬（Cupressus）物種的過敏原，優(yōu)選綠干柏（Cupressusarizonica，Cupa4或Cupa1）。編碼優(yōu)選的Cupa4的優(yōu)選的核酸序列如SEQIDNO:38所示。編碼優(yōu)選的Cupa1的優(yōu)選的核酸序列如SEQIDNO:39所示。優(yōu)選的Cupa4的優(yōu)選的氨基酸序列如SEQIDNO:40所示。優(yōu)選的Cupa1的優(yōu)選的氨基酸序列如SEQIDNO:41所示。上下文中，優(yōu)選的抗原含有由SEQIDNO:38或39編碼的氨基酸序列的6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個(gè)以上的連續(xù)氨基酸，和/或與SEQIDNO:38或39編碼的氨基酸序列至少具有50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%的同一性或相似性。上下文中，另一優(yōu)選的抗原含有SEQIDNO:40或41所示的氨基酸序列的6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個(gè)以上的連續(xù)氨基酸，和/或與SEQIDNO:40或41所示的氨基酸序列至少具有50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%的同一性或相似性。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是，本發(fā)明并不限于這些具體的抗原。本文限定的每種抗原（即，蛋白及其部分，多肽或肽）優(yōu)選與本文之前定義的作為佐劑的多肽一起或融合使用。這意味著，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，編碼抗原的核酸分子與本文之前定義的本發(fā)明的核酸分子可操作地連接，所述核酸分子編碼的多肽作為佐劑發(fā)揮作用。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，與本文之前定義的本發(fā)明的核酸分子（編碼作為佐劑起作用的多肽）可操作地連接的編碼抗原的核酸分子為一個(gè)單獨(dú)的核酸分子，編碼一個(gè)單獨(dú)的多肽。所述多肽可以被稱為嵌合多肽。這種嵌合多肽含有或由融合到本發(fā)明的佐劑中的抗原組成。這種嵌合多肽在5’端和/或3’端和/或抗原和佐劑之間可以含有一個(gè)或多個(gè)額外的氨基酸。因此，當(dāng)該核酸序列與編碼所述抗原的核苷酸序列可操作地連接時(shí)，本發(fā)明提供了一種本文之前定義的核酸分子，該核酸分子編碼對(duì)給定抗原能夠起佐劑作用的多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，這種核酸分子編碼能夠誘導(dǎo)受試者中抗原特異性免疫應(yīng)答的多肽。因此，本發(fā)明包括兩種類型的核酸分子：-一種含有編碼佐劑的核酸分子或由編碼佐劑的核酸分子組成；-一種含有融合到編碼抗原的核酸分子中的編碼佐劑的核酸分子或由融合到編碼抗原的核酸分子中的編碼佐劑的核酸分子組成。根據(jù)使用的來源的類型（基于蛋白的或基于核酸的），本領(lǐng)域技術(shù)人員知道何種類型的制劑是合適的?？乖梢砸月懵兜牡鞍谆蚝怂徇M(jìn)行給藥?？蛇x擇地，基于核酸來源的可以使用本文定義的核酸構(gòu)建體進(jìn)行給藥。優(yōu)選地，選擇基于蛋白的制劑。更優(yōu)選地，使用本文限定的嵌合多肽。在另一實(shí)施方式中，抗原可以來源于病毒。已知地來自在人中引起疾病的任何病毒的抗原均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在其它的實(shí)施方式中，抗原可以來源于酵母菌、真菌、過敏原或癌細(xì)胞或其它任何病變的細(xì)胞。已知地來自在人中引起疾病的任何酵母菌或真菌的抗原均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。相應(yīng)地，本發(fā)明的核酸分子編碼多肽，優(yōu)選地，當(dāng)所述核酸分子含有編碼抗原的核苷酸序列時(shí)，編碼本文之前限定的能夠誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答的嵌合多肽。多肽另一方面，本發(fā)明提供了一種多肽，該多肽由本文之前限定的核酸分子編碼。該多肽含有佐劑和優(yōu)選前文定義的抗原。本文所用的“多肽”是指任何肽、寡肽、多肽、基因產(chǎn)物、表達(dá)產(chǎn)物或蛋白。多肽由連續(xù)的氨基酸組成。術(shù)語(yǔ)“多肽”包括天然存在的或合成的分子。核酸構(gòu)建體另一方面，本發(fā)明提供一種核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體含有前文限定的核酸分子。該核酸構(gòu)建體可以含有編碼前文定義為佐劑的多肽的核酸分子。這種核酸構(gòu)建體可以含有編碼定義為佐劑的多肽的核酸分子和編碼前文定義為抗原的核酸分子。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的表達(dá)載體。優(yōu)選地，表達(dá)載體含有本發(fā)明的核苷酸序列，該核苷酸序列與一個(gè)或多個(gè)控制序列可操作地連接，控制序列在細(xì)胞、受試者或無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中指導(dǎo)編碼的多肽的產(chǎn)生或表達(dá)。表達(dá)載體可以被視為重組表達(dá)載體。相應(yīng)地，本文定義的編碼多肽（含有或由佐劑組成或構(gòu)成）的核酸分子優(yōu)選用作藥物，更優(yōu)選用作佐劑。相應(yīng)地，所述多肽優(yōu)選用作藥劑，更優(yōu)選用作佐劑。相應(yīng)地，本文定義的編碼多肽（含有或由佐劑和抗原組成或構(gòu)成）的核酸分子優(yōu)選用作藥物，更優(yōu)選用作針對(duì)所述抗原的疫苗。相應(yīng)地，所述多肽優(yōu)選用作藥劑，更優(yōu)選用作針對(duì)所述抗原的疫苗。本發(fā)明的疫苗可以起治療疫苗的作用。典型地，接觸抗原之間，即，與所述抗原相關(guān)的感染和初始癥狀的出現(xiàn)之間存在一段時(shí)間。在這種情況下，疫苗被用作藥理學(xué)的免疫產(chǎn)品，其通過在宿主中誘導(dǎo)阻礙疾病的病理學(xué)影響的免疫應(yīng)答，而預(yù)防和/或治療疾病和/或延緩疾病的發(fā)展。治療疫苗與預(yù)防疫苗的不同之處在于治療疫苗將在已經(jīng)感染或患有疾病的受試者中誘導(dǎo)保護(hù)。在其它實(shí)施方式中，疫苗為預(yù)防疫苗?？梢栽谑茉囌呓佑|所述抗原前，對(duì)受試者進(jìn)行預(yù)防疫苗的給藥。本文定義的藥物優(yōu)選腸道外給藥，例如，通過靜脈、皮下、腹腔、肌肉、動(dòng)脈或病灶內(nèi)（intralesional）途徑注射或灌注（infusion）。優(yōu)選的給藥模式為皮下注射?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)，將藥物與藥學(xué)上可接受的介質(zhì)或運(yùn)輸載體相結(jié)合。例如，可以將藥物溶于磷酸鹽緩沖液（PBS）中。用于制備腸道外給藥的組合物的方法為本領(lǐng)域所公知，并在多種資料中進(jìn)行了更詳細(xì)的描述，包括，例如，Remington'sPharmaceuticalSciences,Ed.ARGennaro,20thedition,2000,Williams&Wilkins,PA,USA。藥物優(yōu)選按治療有效劑量進(jìn)行給藥，即，提高人或動(dòng)物的免疫系統(tǒng)抵抗本文定義的疾病或病癥的能力的劑量。優(yōu)選地，治療有效劑量的本發(fā)明的藥物將阻止和/或延緩所述疾病或病癥的發(fā)展。根據(jù)疾病或病癥，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道選擇何種與所述疾病發(fā)展有關(guān)的參數(shù)或癥狀，以追蹤所述疾病或病癥的發(fā)展。本發(fā)明進(jìn)一步包括除本發(fā)明的核酸分子或多肽之外的另一種已知的佐劑的應(yīng)用。本發(fā)明中可以使用任何已知的佐劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知幾種合適的佐劑。最優(yōu)選佐劑選自下列佐劑：陽(yáng)離子（抗菌）肽、皂甙（saponine）和Toll樣受體（TLR）配體，例如，但并不限于，poly(I:C)、CpG基序、LPS、脂質(zhì)A、脂肽Pam3Cys和細(xì)菌鞭毛蛋白或其部分，以及具有化學(xué)修飾的它們的衍生物。根據(jù)本發(fā)明，在所述方法和組合物中使用的其它優(yōu)選的佐劑為：活的或死的BCG的混合物、含有潛在抗原及其部分的免疫球蛋白復(fù)合物、IC31（來自www.intercell.com；WO03047602）、QS21/MPL（US2003095974）、DDA/MPL（WO2005004911）、DA/TDB（WO2005004911；Holten-Andersenetal,2004InfectImmun.2004Mar;72(3):1608-17）和可溶性LAG3（CD223)（來自www.Immunotep.com；US2002192195)。另外，另一種優(yōu)選的佐劑包括短小棒狀桿菌（Corynebacteriumparyum）或痤瘡丙酸桿菌（Propionobacteriumacnes）（AebischerT.,etal,(2000)InfectionandImmunity.,68:1328-1336,PootJetal,(2009),Vaccine,27:4439-4446andFerreiraJ.H.etal,(2008),Vaccine,26:67-685）的使用。特別優(yōu)選的佐劑為已知通過Toll-樣受體作用的佐劑。能夠激活先天免疫系統(tǒng)的佐劑能通過Toll樣受體（TLR’s）（包括TLR’s1-10）和/或通過RIG-1（維甲酸誘導(dǎo)基因-1）蛋白和/或通過內(nèi)皮素受體（endothelinreceptor）很好地被激活。本領(lǐng)域很好地記載了能夠激活TLR受體的化合物及其變形和衍生物。TLR1可以被細(xì)菌脂蛋白及其乙?；问郊せ?，TLR2還可以被革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的糖脂、LPS、LPA、LTA、菌毛、外膜蛋白、來自細(xì)菌或來自宿主的熱休克蛋白（heatshockproteins）、以及分枝桿菌的脂阿拉伯甘露聚糖（Mycobacteriallipoarabinomannans）激活。TLR3可以被dsRNA，尤其為病毒源的dsRNA，或被化合物聚（I:C）激活。TLR4可以被革蘭氏陰性LPS、LTA、來自宿主或來自細(xì)菌源的熱休克蛋白、病毒衣殼或包膜蛋白、紫杉醇（taxol）或其衍生物、含有低聚糖和纖維連接蛋白的透明質(zhì)酸激活。TLR5可以被細(xì)菌的鞭毛或鞭毛蛋白激活。TLR6可以被分枝桿菌的脂蛋白和B族鏈球菌不耐熱的可溶性因子（GBS-F）或葡萄球菌調(diào)節(jié)蛋白（Staphylococcusmodulins）激活。TLR7可以被喹啉咪唑（imidazoquinolines）及衍生物激活。TLR9可以被未甲基化的CpGDNA或染色質(zhì)-IgG復(fù)合物激活。特別地，TLR3、TLR4、TLR7和TLR9在調(diào)節(jié)對(duì)病毒感染的先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，并將能夠激活這些受體的化合物特別優(yōu)選用于本發(fā)明。特別優(yōu)選的佐劑包括但不限于合成的化合物，包括dsRNA、聚(I:C)、觸發(fā)TLR3和TLR9受體的未甲基化的CpGDNA、IC31、TLR9激動(dòng)劑、IMSAVAC、TLR4激動(dòng)劑。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述佐劑物理地連接至前文定義的核酸分子上。佐劑和共刺激化合物（costimulatorycompounds）或官能團(tuán)與含有肽的HLAI類和HLAII類表位的物理連接通過同時(shí)發(fā)生的抗原呈遞細(xì)胞（特別是作用為吸收、消化并顯示抗原的樹突細(xì)胞）的刺激提供了增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。其他優(yōu)選的免疫修飾化合物為T細(xì)胞粘附抑制劑，更優(yōu)選為內(nèi)皮素受體如BQ-788(BuckanovichR.J.,etal,(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:4892.)的抑制劑。BQ-788為N-順-2,6-二甲基哌啶羰基-L-γ-甲基亮氨酰-D-1-甲氧基羰基色氨?；?D-正亮氨酸（N-cis-2,6-dimethylpiperidinocarbonyl-L-gamma-methylleucyl-D-1-methoxy-carbonyltryptophanyl-D-norleucine）。然而，任意BQ-788的衍生物或改性的BQ-788化合物也涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。其他佐劑包括MPL-SE（GlaxoSmithklineBiologicals，比利時(shí)）或EM005（IDRI，美國(guó)）。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，佐劑為Th1-促進(jìn)佐劑（如含有CpGODN基序的佐劑）。如文獻(xiàn)（LiuN.,etal(2003),NatureImmunology,687-693）所述，Th1-促進(jìn)佐劑是當(dāng)與抗原一起使用時(shí)，能夠促進(jìn)、或引發(fā)、或誘導(dǎo)、或誘導(dǎo)提高對(duì)給定抗原的Th1免疫反應(yīng)的佐劑，當(dāng)與抗原一起培養(yǎng)時(shí)，在治療受試者的脾細(xì)胞的上層清液中檢測(cè)到。作為對(duì)照，在同一受試的受試者的脾細(xì)胞中評(píng)測(cè)Th1免疫反應(yīng)的促進(jìn)或引起，所述受試的受試者未用抗原和佐劑處理，或者同一僅用抗原處理。優(yōu)選用通過與抗原一起培養(yǎng)治療的受試者的脾細(xì)胞和/或通過誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性IgG2a免疫球蛋白檢測(cè)到的IFNγ的誘導(dǎo)定義引起或促進(jìn)Th1免疫反應(yīng)。本文已經(jīng)定義了細(xì)胞因子和IgG2a的誘導(dǎo)的評(píng)估。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，Th-1促進(jìn)佐劑為，或含有寡脫氧核苷酸，或由寡脫氧核苷酸組成。更優(yōu)選地，寡脫氧核苷酸（ODN）含有，或由CpG組成，CpG中C為未甲基化的（CpGODN）：3’嘌呤-CpG-5’嘧啶。優(yōu)選的寡脫氧核苷酸為，或含有，或由硫代磷酸修飾的ODN序列組成。使用具有這種修飾的寡脫氧核苷酸是有利的，因?yàn)槭褂玫乃龉衙撗鹾塑账岜任葱揎椀墓衙撗鹾塑账岣臃€(wěn)定，因此，它們一旦在血流中就不會(huì)輕易被降解。優(yōu)選的Th-1促進(jìn)佐劑由，或含有至少一個(gè)CpG基序、至少兩個(gè)，或至少三個(gè)組成。優(yōu)選的免疫刺激ODN（immunostimulatoryODN）的序列（5’到3’）為TCAACGTTGA（SEQIDNO:29）和GCTAGCGTTAGCGT（SEQIDNO:30）。本領(lǐng)域技術(shù)人員并不受限于本文明確描述的序列。他/她可以設(shè)計(jì)具有本文之前定義的Th-1促進(jìn)特性的其它序列。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用本文定義的藥品（或藥品制劑或藥物組合物或藥物）以提高受試者免疫系統(tǒng)抵抗感染和/或疾病（更優(yōu)選為寄生蟲感染和/或寄生蟲疾?。┑哪芰?。具體地，可以使用所述藥品對(duì)人或動(dòng)物受試者進(jìn)行給藥。本文定義的藥品優(yōu)選腸道外給藥，例如，通過靜脈、皮下、腹腔、肌肉、動(dòng)脈或病灶內(nèi)途徑注射或灌注。優(yōu)選的給藥模式為皮下注射。本發(fā)明不限于本文定義的藥物或核酸分子或核酸構(gòu)建體或肽或多肽的特定給藥模式。優(yōu)選的給藥模式為使用膠囊或片劑的口服給藥?？蛇x擇地，本文定義的藥物或核酸分子或核酸構(gòu)建體或肽或多肽可以通過導(dǎo)管或泵或栓劑進(jìn)行局部給藥（locallyadministered）?？蛇x擇地，本文定義的藥物或核酸分子或核酸構(gòu)建體或肽或多肽可以進(jìn)行局部給藥（topicallyadministered）。本文定義的藥物或核酸分子或核酸構(gòu)建體或肽或多肽或含有所述化合物的組合物的劑型依賴于給藥的目標(biāo)模式和（治療的）用途。藥物載體可以為任何適合攜帶所述化合物到受試者中的可兼容的、無(wú)毒的物質(zhì)。例如，無(wú)菌水，或惰性固體或賦形劑可以用作載體，通常輔以藥學(xué)上可接受的佐劑、緩沖劑、分散劑等。組合物可以為液體的，例如，所述化合物的穩(wěn)定懸浮液，或者為含有所述化合物的組合物；或者為固體和/或干燥的形式：例如，粉末。對(duì)于口服和直腸給藥，所述化合物可以以固體劑型例如膠囊、片劑、栓劑和粉末的形式進(jìn)行給藥，或以液體劑型例如酏劑、糖漿劑、乳劑（cream）、軟膏、灌腸劑和懸浮液的形式進(jìn)行給藥。另一形式可以為半固體或半液體形式，其中，所述化合物以液體形式存在于固體支持物（solidsupport）（如塊）中或上?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的常規(guī)技術(shù)，將藥品與藥學(xué)上可接受的介質(zhì)或載體結(jié)合。例如，可以將本文定義的藥物或核酸分子或核酸構(gòu)建體或肽或多肽，以及可選擇的第二佐劑溶于磷酸鹽緩沖液（PBS）中。腸道外給藥組合物的制備方法為本領(lǐng)域所公知，并且在多種資料進(jìn)行了更詳細(xì)的描述，包括，例如，Remington'sPharmaceuticalSciences,Ed.ARGennaro,20thedition,2000,Williams&Wilkins,PA,USA。藥品優(yōu)選按治療有效劑量進(jìn)行給藥，即，提高人或動(dòng)物的免疫系統(tǒng)抵抗本文定義的疾病或病癥的能力的劑量。優(yōu)選地，本發(fā)明藥劑的治療有效劑量能夠引發(fā)本文定義的免疫應(yīng)答：在本文定義的治療的受試者中，當(dāng)所述藥劑能夠引發(fā)對(duì)特定抗原的適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答，或誘導(dǎo)或誘導(dǎo)增強(qiáng)對(duì)特定抗原的適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答時(shí)，這種劑量是在治療上有效的。更優(yōu)選地，引發(fā)的或誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答為保護(hù)性免疫應(yīng)答。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本文定義的藥品為疫苗。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，在疫苗中使用至少5、10、15或20微克本文定義的核酸分子或核酸構(gòu)建體或肽或多肽。所述疫苗可以進(jìn)行至少一次、二次、三次、四次以上的給藥。本文定義的疫苗可以為預(yù)防的或治療的疫苗。本文定義的核酸分子或核酸構(gòu)建體或肽或多肽可以溶于在100-500微升范圍內(nèi)變化的體積中。組合物另外，本發(fā)明提供了一種組合物，該組合物含有核酸分子或核酸構(gòu)建體或肽或多肽，以及可選擇的第二佐劑，優(yōu)選為Th1促進(jìn)佐劑。本文已經(jīng)定義了所述組合物的每種特性。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，這種組合物由本文定義的核酸分子或核酸構(gòu)建體或肽或多肽組成，優(yōu)選的Th1促進(jìn)佐劑為CpGODN。優(yōu)選的組合物含有，或由核酸分子或核酸構(gòu)建體或肽或多肽以及可選擇的第二佐劑（優(yōu)選為溶于PBS或合適的緩沖液中的Th1促進(jìn)佐劑）組成。如本文已經(jīng)定義的，由于抗原包括在所述肽或多肽中或由部分所述核酸分子編碼或由存在于所述核酸構(gòu)建體中的部分核酸分子編碼，故已經(jīng)存在抗原。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明還包括，將核酸分子或核酸構(gòu)建體或肽或多肽，以及可選擇的第二佐劑（優(yōu)選為Th1促進(jìn)佐劑）進(jìn)行順序給藥。因此，只要將每種組分都對(duì)受試者進(jìn)行給藥即可，它們不需要物理地存在于單一的組合物中。這種組合物還進(jìn)一步含有藥學(xué)上可接受的佐劑和/或載體。這種組合物優(yōu)選用作藥品或用作藥物。所述藥品優(yōu)選為疫苗。本文已經(jīng)擴(kuò)展定義了藥品、佐劑和疫苗。本文已經(jīng)定義了組合物可以為液體、固體或半液體或半固體的形式。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，為了改進(jìn)治療或預(yù)防性治療的特異性，將其它化合物和核酸分子或核酸構(gòu)建體或肽或多肽順序或同時(shí)使用。使用其它化合物是有利的，例如將進(jìn)一步提高治療受試者的免疫應(yīng)答。更優(yōu)選地，這種化合物不與核酸分子或核酸構(gòu)建體或肽或多肽共同存在于單一組合物中。應(yīng)用相應(yīng)地，本發(fā)明進(jìn)一步提供本文定義的編碼佐劑的核酸分子和編碼抗原、相應(yīng)肽、相應(yīng)多肽的核酸分子，相應(yīng)核酸構(gòu)建體和/或相應(yīng)組合物在制備用于治療與本文之前定義的抗原有關(guān)的疾病或病癥的藥物中的應(yīng)用。相應(yīng)地，本發(fā)明進(jìn)一步提供了之前定義的含有編碼佐劑的核酸分子（與編碼抗原的核酸分子可操作地連接）的核酸分子、相應(yīng)肽、相應(yīng)多肽、相應(yīng)核酸構(gòu)建體和/或相應(yīng)組合物在制備用于治療與抗原有關(guān)的疾病或病癥的作為疫苗的藥物中的應(yīng)用。本文已經(jīng)定義了這種應(yīng)用的各種特性。治療方法另一方面，提供了一種與抗原有關(guān)的疾病或病癥的治療方法，其中，所述治療包括編碼佐劑的核酸分子和編碼抗原的核酸分子、相應(yīng)肽、相應(yīng)多肽，相應(yīng)核酸構(gòu)建體和/或相應(yīng)組合物。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了一種與本文定義的抗原有關(guān)的疾病或病癥的治療方法，其中，所述治療包括疫苗，所述疫苗含有本文定義的核酸分子（含有與編碼抗原的核酸分子可操作地連接的編碼佐劑的核酸分子）、相應(yīng)肽、相應(yīng)多肽、相應(yīng)核酸構(gòu)建體和/或相應(yīng)組合物。本文已經(jīng)定義了這種方法的各種特性。定義序列同一性本文中的“序列同一性”被定義為兩個(gè)或多個(gè)氨基酸（肽、多肽或蛋白質(zhì)）序列或兩個(gè)或多個(gè)核酸（核苷酸、多核苷酸）序列之間的關(guān)系，這種關(guān)系是通過比較序列來確定的。本領(lǐng)域中，“同一性”也指的是氨基酸或核酸序列之間的序列相關(guān)性的程度，這種情況下可以通過匹配成串的序列來確定同一性。通過將氨基酸序列和一個(gè)肽或多肽的保守氨基酸取代與另一肽或多肽序列比對(duì)來確定兩個(gè)氨基酸序列之間的“相似性”。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在本文定義的整個(gè)SEQIDNO上計(jì)算同一性或相似性?！巴恍浴焙汀跋嗨菩浴焙苋菀淄ㄟ^已知的方法計(jì)算出來，包括但并不限于在ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.M.,ed.,牛津大學(xué)出版社，紐約,1988;Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.,ed.,學(xué)術(shù)出版社，紐約,1993;ComputerAnalysisofSequenceData,PartI,Griffin,A.M.,andGriffin,H.G.,eds.,胡馬納出版社，新澤西,1994;SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeine,G.,學(xué)術(shù)出版社，1987;andSequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.andDevereux,J.,eds.,MStockton出版社，紐約，1991;以及Carillo,H.,andLipman,D.,SIAMJ.AppliedMath.,48:1073(1988)中公開的方法。設(shè)計(jì)確定同一性的優(yōu)選方法以在測(cè)試的序列間產(chǎn)生最大的匹配。確定同一性和相似性的方法編纂在公開可用的計(jì)算機(jī)程序中。優(yōu)選的確定兩個(gè)序列同一性和相似性的計(jì)算機(jī)程序方法包括例如GCG程序包（Devereux、J.,etal.,NucleicAcidsResearch12(1):387(1984)）、BestFit、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul、S.F.etal.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。BLASTX程序是NCBI和其他來源（BLASTManual、Altschul,S.,etal.,NCBINLMNIHBethesda，MD20894;Altschul，S.,etal.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)）公開可獲得的。還可以使用眾所周知的SmithWaterman算法來確定同一性。優(yōu)選的多肽序列比對(duì)參數(shù)包括如下：規(guī)則系統(tǒng)（Algorithm）：NeedlemanandWunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)；比對(duì)矩陣（Comparisonmatrix）：BLOSSUM62來自HentikoffandHentikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:10915-10919(1992)；間隙罰分（GapPenalty）：12；和間隙長(zhǎng)度罰分（GapLengthPenalty）：4。就像來自位于麥迪遜，威斯康星州（Madison,WI）的遺傳學(xué)電腦集團(tuán)的“Ogap”程序一樣，帶有這些參數(shù)的有用的程序是公開可獲得的。前述的參數(shù)為氨基酸比對(duì)（閉口間隙（endgaps）不伴隨罰分（penalty））的默認(rèn)參數(shù)。優(yōu)選的核酸比對(duì)參數(shù)包括如下：規(guī)則系統(tǒng)：NeedlemanandWunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)；比對(duì)矩陣：匹配（matches）=+10，失配（mismatch）=0；間隙罰分：50；間隙長(zhǎng)度罰分：3。可獲得如來自麥迪遜，威斯康星州（Madison,Wis）的遺傳學(xué)電腦集團(tuán)的間隙程序。以上給出的是核酸比對(duì)的默認(rèn)參數(shù)。任選地，本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的是，在確定氨基酸相似性程度時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以考慮稱為“保守的”氨基酸取代。保守的氨基酸取代指的是具有相似的側(cè)鏈的殘基的可替換性。例如，一組具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；一組具有脂肪族-羥基的側(cè)鏈的氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；一組具有含酰胺側(cè)鏈的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一組具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一組具有堿性側(cè)鏈的氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；以及一組具有含硫側(cè)鏈的氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代組為：纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公開的氨基酸序列取代變體為公開的序列中至少一個(gè)殘基缺失且不同的殘基在其位置插入的氨基酸序列。優(yōu)選地，氨基酸的變化是保守的。優(yōu)選的各個(gè)自然發(fā)生的氨基酸的保守取代如下：Ala到Ser；Arg到Lys；Asn到Gln或His；Asp到Glu；Cys到Ser或Ala；Gln到Asn；Glu到Asp；Gly到Pro；His到Asn或Gln；Ile到Leu或Val；Leu到Ile或Val；Lys到Arg；Gln或Glu；Met到Leu或Ile；Phe到Met、Leu或Tyr；Ser到Thr；Thr到Ser；Trp到Tyr；Tyr到Trp或Phe；以及Val到Ile或Leu。雜交條件用于核酸分子雜交的條件可以具有低或中或高的嚴(yán)格性（DNA印跡過程）。低或中或高的嚴(yán)格性條件是指預(yù)雜交和雜交在42℃下、5XSSPE中、0.3%SDS、200pg/ml剪切了并變性的大馬哈魚精子DNA，以及25%或35%或50%的甲酰胺（分別對(duì)應(yīng)低或中或高嚴(yán)格性）的條件下進(jìn)行。隨后，使用2XSSC、0.2%SDS以及在55℃或65℃或75℃（分別對(duì)應(yīng)低或中或高嚴(yán)格性）下洗滌雜交反應(yīng)物3次，每次30min。核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體、可操作地連接、表達(dá)、控制序列定義核酸構(gòu)建體為從天然存在的基因中分離的核酸分子，或已經(jīng)被修飾為含有以否則不會(huì)天然存在的方式被結(jié)合或并列的核酸片段。核酸分子如核苷酸序列所示?？蛇x擇地，存在于核酸構(gòu)建體中的核苷酸序列可操作地連接到一個(gè)或多個(gè)在細(xì)胞或受試者中指導(dǎo)所述肽或多肽合成或表達(dá)的控制序列上。本文中的“可操作地連接”定義為控制序列位于相對(duì)本發(fā)明的編碼多肽的核苷酸序列的適當(dāng)位置處的結(jié)構(gòu)，使得控制序列在細(xì)胞和/或受試者中指導(dǎo)本發(fā)明的肽或多肽的產(chǎn)生/表達(dá)。“可操作地連接”也可以用于定義序列（即，定義為佐劑）位于相對(duì)編碼抗原的另一序列的適當(dāng)位置處的結(jié)構(gòu)，使得嵌合多肽（即，含有融合到抗原中的佐劑）在細(xì)胞和/或受試者中形成?！翱刹僮鞯剡B接”指編碼能夠起本文定義的佐劑作用的蛋白的序列基因融合到編碼本文定義的抗原的序列中，形成編碼嵌合蛋白的嵌合核酸序列。應(yīng)理解的是，表達(dá)包括涉及肽或多肽合成的任何步驟，包括但并不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾以及分泌。本文定義的控制序列包括對(duì)于多肽的表達(dá)是必須的或有利的所用組件。最低限度地，所述控制序列包括啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)?？蛇x擇地，存在于核酸構(gòu)建體中的表示為核苷酸序列的啟動(dòng)子可操作地連接到另一編碼本文定義的肽或多肽的核苷酸序列上。表達(dá)載體可以為能夠任意地經(jīng)受重組DNA過程并且能夠在細(xì)胞和/或受試者中引起編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列表達(dá)的任何載體。本文使用的術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”指起控制一個(gè)或多個(gè)核酸轉(zhuǎn)錄作用的核酸片段，位于相對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄方向的上游。啟動(dòng)子與由于依賴DNA的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)的存在而定義的結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以及任意的其它DNA序列（包括，但并不限于，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、抑制和激活蛋白結(jié)合位點(diǎn)以及任意的本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的直接或間接調(diào)控來自啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄量的核苷酸的其它序列）相關(guān)聯(lián)。在本發(fā)明的上下文中，啟動(dòng)子優(yōu)選在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）的-1核苷酸處終止。在本文和其權(quán)利要求中，動(dòng)詞“含有”及其詞形變化（conjugations）以其非限制性的意義使用，意指含有詞后的那些項(xiàng)，但是沒有排除未明確提到的項(xiàng)。另外，動(dòng)詞“組成”可以由“基本上由...組成”替換，意指除了明確鑒定的成分外，本文定義的產(chǎn)物或組合物或核酸分子或肽或多肽或核酸構(gòu)建體可以包括其他的成分，所述其他的成分不會(huì)改變本發(fā)明的獨(dú)特特征。另外，關(guān)于用不定冠詞“a”或“an”修飾的元件不排除存在一個(gè)以上的可能性，除非上下文中明確要求存在一個(gè)且僅一個(gè)元件。因此不定冠詞“a”或“an”通常指“至少一個(gè)”。將本說明書中引用參考的所有專利和文獻(xiàn)通過引用其全部?jī)?nèi)容的方式并入本文。提供的以下實(shí)施例僅為了說明目的，并不旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。附圖說明圖1.固相Kmp11。對(duì)Kmp11和對(duì)Q的體液應(yīng)答。A：Kmp11（20μg）的ip和sc給藥后對(duì)Kmp11的IgG應(yīng)答。B：KAAP（5μg）和Kmp11（1μg）的ip和sc給藥后對(duì)Kmp11的IgG應(yīng)答。C：KAAP（5μg）的ip和sc給藥后對(duì)Q的IgG應(yīng)答。D：Q（5μg）＋Kmp11（20μg）的ip和sc給藥后對(duì)Kmp11的IgG應(yīng)答。E：Q（5μg）＋Kmp11（20μg）的ip和sc給藥后對(duì)Q的IgG應(yīng)答。柱形圖顯示了組中動(dòng)物之間應(yīng)答的可變性。圖2.固相Kmp11。對(duì)Kmp11和對(duì)Q的體液應(yīng)答。A：通過ip和sc的KAAP（1μg）和Kmp11（0.25μg）給藥后對(duì)Kmp11的IgG體液應(yīng)答。B：通過ip和sc的KAAP（1μg）給藥后對(duì)Q的體液應(yīng)答。C：KAAP（1μg）的ip和sc給藥后對(duì)Kmp11的IgG1和IgG2a應(yīng)答。D：KAAP（1μg）的ip和sc給藥后對(duì)Q的IgG1和IgG2a應(yīng)答。柱形圖顯示了組中動(dòng)物之間應(yīng)答的可變性。圖3.固相Kmp11。對(duì)Kmp11和對(duì)Q的體液應(yīng)答。A：pRcKmp11（20μg）、KAAP（3μg）和pRcKAAP（20μg）的sc給藥后對(duì)Kmp11的IgG應(yīng)答。B：KAAP（3μg）和pRcKAAP（20μg）的sc給藥后對(duì)Q的IgG應(yīng)答。C：pRcKmp11（20μg）、KAAP（3μg）和pRcKAAP（20μg）的sc給藥后對(duì)Kmp11的IgG1和IgG2a應(yīng)答。D：KAAP（3μg）和pRcKAAP（20μg）的sc給藥后對(duì)Q的IgG1和IgG2a應(yīng)答。柱形圖顯示了組中動(dòng)物之間應(yīng)答的可變性。圖4.固相Kmp11。未刺激的以及來自注射PBS、KAAP和pRcKAAP的小鼠的KAAP刺激的脾細(xì)胞中的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。柱形圖顯示了三次平行測(cè)定之間的可變性。Y軸表示的單位為pg/ml，X軸中顯示的為疫苗接種組。圖5.固相Kmp11。未刺激的以及來自注射PBS、KAAP和pRcKAAP的小鼠的Kmp11刺激的脾細(xì)胞中的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。柱形圖顯示了三次平行測(cè)定之間的可變性。Y軸表示的單位為pg/ml，X軸中顯示的為疫苗接種組。圖6.固相Cupa4。通過3種劑量的PBS、5μg的CAAP；2μg的Cupa4以及2μg的Cupa4+3μg的AAP對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫。第三種劑量給藥1周后，收集血清并分析對(duì)Cupa4的反應(yīng)。1A-：IgG反應(yīng)。1B-：IgG1反應(yīng)。1C-：IgG2a反應(yīng)。用于IgG分析的血清的稀釋度為1/2000，用于分析IgG1和IgG2a的血清的稀釋度為1/1000。柱形圖顯示了統(tǒng)計(jì)誤差。圖7.固相Cupa4。通過2種劑量的PBS、5μg的CAAP；2μg的Cupa4以及2μg的Cupa4+3μgofAAP對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫。第二種劑量給藥1周后，收集血清并分析對(duì)Cupa4的反應(yīng)。2A-：IgG反應(yīng)。2B-：IgG1反應(yīng)。1C-：IgG2a反應(yīng)。用于IgG分析的血清的稀釋度為1/1600，用于分析IgG1和IgG2a的血清的稀釋度為1/400。柱形圖顯示了統(tǒng)計(jì)誤差。圖8.固相Cupa4。來自通過單一劑量的PBS、1.25μg的CAAP；0.5μg的Cupa4以及0.5μg的Cupa4+0.75μgofAAP進(jìn)行免疫的動(dòng)物的血清的IgG反應(yīng)。給藥1周后，收集血清并分析對(duì)Cupa4的反應(yīng)。測(cè)試的血清的稀釋度為1/100。柱形圖顯示了統(tǒng)計(jì)誤差。圖9.固相Cupa4。通過2種劑量的PBS、1.25μg的CAAP；0.5μg的Cupa4以及0.5μg的Cupa4+0.75μgofAAP對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫。第二種劑量給藥1周后，收集血清并分析對(duì)Cupa4的反應(yīng)。4A-：IgG；4B-：IgG1；4C-：IgG2a。用于IgG分析的血清的稀釋度為1/4000，用于分析IgG1和IgG2a的血清的稀釋度為1/100。柱形圖顯示了統(tǒng)計(jì)誤差。圖10.固相S100A2。對(duì)S100A2的反應(yīng)（以O(shè).D.單位計(jì)）。對(duì)4組動(dòng)物（N=5）進(jìn)行單一劑量的S100AAP（1.05μg）、S100A2（0.3μg）、AAP（0.75μg的AAP）和S100A2+AAP（0.3μg+0.75μg）免疫。對(duì)另一組作為對(duì)照的動(dòng)物進(jìn)行PBS緩沖液給藥。蛋白給藥后的15天獲取血清。以1/100的稀釋度分析血清。圖11.固相S100A2。對(duì)S100A2的反應(yīng)（以O(shè).D.單位計(jì)）。第一劑量給藥后的15天對(duì)與圖1中所示的相同的動(dòng)物組進(jìn)行S100AAP（1.05μg）、S100A2（0.3μg）、AAP（0.75μg的AAP）和S100A2+AAP（0.3μg+0.75μg）免疫。1周后獲取血清。（A）IgG反應(yīng)。（B）IgG1反應(yīng)。（C）IgG2反應(yīng)。以1/200的稀釋度分析血清。柱形圖顯示了統(tǒng)計(jì)誤差。圖12.Cupa4AAP表達(dá)載體。圖13.S100A2AAP表達(dá)載體。圖14.第三免疫后對(duì)S100A2的反應(yīng)（以O(shè).D.單位計(jì)）。第二劑量給藥后的15天對(duì)與圖1中所示的相同的動(dòng)物組進(jìn)行S100AAP（1.05μg）、S100A2（0.3μg）、AAP（0.75μg的AAP）和S100A2+AAP（0.3μg+0.75μg）免疫。1周后獲取血清。（A）IgG反應(yīng)。（B）IgG1反應(yīng)。（C）IgG2a反應(yīng)。以1/6400的稀釋度分析血清。柱形圖顯示了統(tǒng)計(jì)誤差（p<0.05）。具體實(shí)施方式實(shí)施例第1部分材料與方法動(dòng)物和免疫。雌性6-8周齡的BALB/c小鼠，購(gòu)自HarlanInterfaunaIbéricaS.A（巴塞羅納，西班牙）。通過按照結(jié)果部分中的圖表說明所示的腹腔注射（ip）或皮下注射（sb）途徑對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫。通過眼眶血管穿刺（orbitalplexuspuncture）對(duì)小鼠進(jìn)行取血。表達(dá)嵌合Kmp11AAP基因的DNA質(zhì)粒的構(gòu)建。通過BamHI消化，從嵌合的克隆pPQ中敲除了編碼H2A抗原決定簇的氨基和羧基末端的DNA序列（SotoM,etal.JClinMicrobiol.1998Jan;36(1):58-63）。PQ或Q的核酸序列如SEQIDNO:46所示。PQ或Q的氨基酸序列如SEQIDNO:47。生成的不含編碼H2A抗原決定簇的序列的克隆命名為pAAP（SEQIDNO:2）。使用如正向引物：5’CGGGATCCTTTAATGGCCACCACGTACGAGGAG3’（SEQIDNO:31）和反向引物5’CGGGATCCCCCCTTGGATGGGTACTGCGCAGC3’（SEQIDNO:32）的寡核苷酸所示的引物通過PCR擴(kuò)增存在于pBLs-KMP-11質(zhì)粒中的編碼所述蛋白（FuertesM.A.,etal,JBiolInorgChem6(2001)107-117）的DNA序列，從而獲得編碼Kmp11蛋白的DNA序列。然后，使用BamHI消化編碼Kmp11蛋白的PCR產(chǎn)物并將其插入到pAAP（BamHI消化的缺乏H2A決定簇的pPQ克?。⊿EQIDNO:33）中。將稱為pKmp11AAP的形成的克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（M15菌株）中。由pKmp11AAP克隆表達(dá)的嵌合的純化的蛋白稱為KAAP（SEQIDNO:34）。在10th-12th位置處含有TTA三聯(lián)體密碼子，從而避免了具有編碼Kmp11的序列的克隆反方向插入的傾向。在9th-11th位置處引入了編碼甘氨酸的三聯(lián)體密碼子，為Kmp11蛋白和由pAAP編碼的蛋白片段之間的交叉（intersection）提供靈活性。pRcKAAP質(zhì)粒的構(gòu)建為構(gòu)建含有編碼KAAP蛋白的DNA序列的DNA質(zhì)粒，使用如正向引物5’-CCCAAGCTTATGGCCACCACCTACGAGGAG-3’（SEQIDNO:35）和反向引物5’-CATTACTGGATCTATCAACAGG-3’（SEQIDNO:36）所示的引物PCR擴(kuò)增如上所述的Kmp11AAP質(zhì)粒。將DNA序列插入到pRc/CMVHindIII消化的質(zhì)粒中。質(zhì)粒pRC購(gòu)于vitrogen。通過不含內(nèi)毒素的Giga-制備試劑盒（Qiagen，希爾登，德國(guó)）純化DNA質(zhì)粒。蛋白純化根據(jù)供應(yīng)商提供的方法（Qiagen），在變性條件下，在氨基三乙酸樹脂柱（Ninitrilotriaceticacidresincolumns）中進(jìn)行由pKmp11AAP克隆表達(dá)的KAAP重組蛋白、以及重組Q和Kmp11蛋白的純化（SotoM,etal.JClinMicrobiol.(1998)Jan;36(1):58-63,andPlanellesL,etal,ImmunolCellBiol.(2002);80(3):241-7）。pRcKAAP的KAAP和Kmp11蛋白的表達(dá)根據(jù)制造商的方案，使用Reagent（Gibco,BRL），用20μg的pRcKmp11AAP或pRcKmp11質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞。簡(jiǎn)要地說，將3×106的感受態(tài)細(xì)胞接種在含有添加了5%FCS的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基的100毫米平板中，并當(dāng)細(xì)胞達(dá)到50-75%匯合（confluence）時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，收集細(xì)胞，使用冰冷的PBS洗滌兩遍，然后通過添加Laemmli緩沖液使細(xì)胞快速裂解。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）解析蛋白，并轉(zhuǎn)移至硝化纖維膜（Amersham,Aylesbury,UK）上。使用來自KAAP蛋白免疫的小鼠的血清檢測(cè)印記。在印記中可觀察到與抗KAAP反應(yīng)的預(yù)期大小的蛋白條帶。體液應(yīng)答的分析使用特異性抵抗Q或Kmp11的抗體分析血清樣品。簡(jiǎn)要地說，在室溫下，用100μL含有2μg/mL的Q或Kmp11的PBS將標(biāo)準(zhǔn)ELISA板的孔封閉過夜。采用偶聯(lián)辣根過氧化物酶的抗小鼠免疫球蛋白對(duì)IgG和特異性同種型進(jìn)行分析（NordicImmunologicalLabo-ratories蒂爾堡，荷蘭）：抗IgG和抗-IgG1的稀釋度為1:1000且抗-IgG2a的稀釋度為1:500。使用鄰苯二胺二鹽酸化物-OPD-（Ortophenylenediaminedihydrochloride-OPD-，Dako，A/S，格洛斯楚普，丹麥）作為底物。15分鐘后，通過添加100μl1M的H2SO4終止反應(yīng)。在450nm處讀取吸光值。細(xì)胞因子分析最后一次免疫一周后，于無(wú)菌條件下，在含有DMEM培養(yǎng)基的無(wú)菌盤上取小鼠的脾臟。通過使用蒸壓網(wǎng)（autoclavedmesh）研磨脾臟制備單細(xì)胞懸浮液。向其中加入5-10毫升的DMEM培養(yǎng)液，并將內(nèi)容物混合均勻。用移液器緩慢吸取上清液。在4℃下250g離心（SorvallRC-5離心機(jī)，HB-4轉(zhuǎn)子）10min使細(xì)胞成球團(tuán)（pelleted）。收集含有紅細(xì)胞和脾細(xì)胞的所述球團(tuán)。使用0.9%的氯化銨洗滌所述球團(tuán)一次以裂解紅細(xì)胞。合并同一組中的每只小鼠的脾細(xì)胞，并在含有10%的FCS和0.05mM的2-巰基乙醇的RPMI中將細(xì)胞重懸到107個(gè)細(xì)胞/ml的密度，然后在1.5ml的微量離心管中將其分成200ml的小份（5×105個(gè)細(xì)胞）。使用12μg/mlKAAP或Kmp11再刺激脾細(xì)胞。于37℃下，在含有5%CO2和95%濕度的環(huán)境下孵育細(xì)胞48小時(shí)。將來自每組（N=4）小鼠的上清合并。所有的測(cè)定均進(jìn)行三次。為了控制細(xì)胞增殖，測(cè)定ConA（3μg/ml）處理的細(xì)胞的上清中的IFN-γ和IL-2的量。相對(duì)于未經(jīng)處理的細(xì)胞，ConA處理的細(xì)胞中檢測(cè)到了高量的IFN-γ（1000倍）和IL-2（200倍）。細(xì)胞因子測(cè)定。使用CBD試劑盒（BD生物科學(xué)，新加坡），根據(jù)制造商的說明書，測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物上清中IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17和IL-10的濃度。使用FACSCALIBUR（BD生物科學(xué)，新加坡）獲取結(jié)果并使用FACS軟件進(jìn)行分析。結(jié)果為了獲知由SEQIDNO:1（AAP）氨基酸序列編碼的蛋白是否能夠提高或改變對(duì)例如Kmp11的共價(jià)連接的抗原的體液應(yīng)答，用AAP和Kmp11的DNAs基因融合形成的嵌合基因表達(dá)的KAAP蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行給藥。AAP序列源于之前描述的Q序列，編碼相應(yīng)于H2A抗原具有75%同一性的氨基和羧基末端的氨基酸片段的DNA除外。在嵌合KAAP蛋白中，Kmp11蛋白代表1/4的完全蛋白。設(shè)計(jì)了一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，其中，在第0天、第15天和第30天，對(duì)兩組小鼠（每組5只）中的每只注射3種劑量的20μg的Kmp11,5μg的KAAP以及20μg的Kmp11-5μg的Q。通過皮下注射（sc）或腹腔注射（ip）途徑對(duì)小鼠進(jìn)行蛋白的給藥。第3種劑量給藥后1周，通過ELISA測(cè)試測(cè)定對(duì)Q和Kmp11的IgG反應(yīng)。圖1A顯示了當(dāng)通過ip途徑給藥時(shí)Kmp11蛋白引發(fā)強(qiáng)烈的對(duì)Kmp11的反應(yīng)，但當(dāng)通過sc途徑給藥時(shí)并不能引起免疫應(yīng)答。觀察到，5μg的KAAPip給藥后，對(duì)Kmp11的應(yīng)答仍較高，與當(dāng)單獨(dú)進(jìn)行20μg的Kmp11給藥時(shí)觀察到的應(yīng)答相似，另外，與單獨(dú)通過相同途徑進(jìn)行20μg的Kmp11給藥時(shí)沒有應(yīng)答相比，sc給藥后引起了強(qiáng)烈的應(yīng)答（圖1B）。當(dāng)用KAAP蛋白進(jìn)行ip或sc給藥時(shí)，同樣觀察到了對(duì)Q的強(qiáng)烈應(yīng)答（圖1C）。由于當(dāng)進(jìn)行5μg的KAAP給藥時(shí)引發(fā)了強(qiáng)烈的應(yīng)答，并且在5μg的KAAP中的Kmp11的量約等于1μg的Kmp11，因此，我們測(cè)試了是否1μg的Kmp11也能誘導(dǎo)血清學(xué)的應(yīng)答。圖1B顯示了當(dāng)進(jìn)行ip給藥時(shí)蛋白能夠誘導(dǎo)輕微的對(duì)Kmp11的體液應(yīng)答（平均OD=0.3），但應(yīng)答明顯低于5μg的KAAP給藥后引發(fā)的應(yīng)答。另外，如預(yù)期的，可以觀察到，用1μg的Kmp11的sc給藥后沒有任何的對(duì)Kmp11的反應(yīng)，但與此相反的，當(dāng)用存在于5μg的KAAP中的相同量的Kmp11給藥后，應(yīng)答強(qiáng)烈。為了得知對(duì)Kmp11的反應(yīng)的提高是否是由于Kmp11與存在于Q蛋白中的蛋白片段的聯(lián)合給藥引起的，將Kmp11蛋白與Q混合給藥。觀察到，當(dāng)將混合物進(jìn)行ip給藥時(shí)對(duì)Kmp11的反應(yīng)降低了，并且當(dāng)將混合物進(jìn)行sc給藥時(shí)，沒有觀察到對(duì)Kmp11的應(yīng)答（圖1D），這表明，存在于Q蛋白中的蛋白片段不對(duì)Kmp11引發(fā)任何佐劑效應(yīng)。觀察到了對(duì)Q的強(qiáng)烈血清學(xué)反應(yīng)（圖1E）。由于5μg的KAAP給藥后觀查到了強(qiáng)烈的血清學(xué)應(yīng)答，我們分析了1μg的KAAP給藥后對(duì)Q和Kmp11的應(yīng)答。在第0天和第15天在5只小鼠的腳墊中進(jìn)行sc注射。第二劑量給藥后1周分析IgG和IgG1/IgG2a應(yīng)答。作為對(duì)照，對(duì)小鼠進(jìn)行0.25μg的Kmp11給藥（1μg的KAAP中存在的Kmp11的量）。圖2A顯示了通過ip給藥或sc給藥的1μg的KAAP給藥后獲得了對(duì)Kmp11的強(qiáng)烈應(yīng)答，但通過ip或sc的0.25μg的Kmp11給藥后沒有獲得應(yīng)答。當(dāng)通過ip或sc途徑的KAAP給藥后觀察到了對(duì)Q的體液應(yīng)答（圖2B）。應(yīng)答與3μg的KAAP和5μg的KAAP給藥后觀察到的應(yīng)答相似（數(shù)據(jù)未示出）。應(yīng)答的類型主要為對(duì)Kmp11或?qū)的IgG1型（圖2C和D），IgG1/IgG2a的比例約為0.5。在對(duì)小鼠進(jìn)行含有編碼KAAP基因的質(zhì)粒DNA給藥后，為了獲知KAAP蛋白是否能夠引發(fā)體液應(yīng)答，分析了對(duì)Q和Kmp11的IgG、IgG1和IgG2a體液應(yīng)答。在第0天、第15天和第30天，在7只組小鼠的腳墊中注射了20μg的pRcKQ1、20μg的pRcKmp11和3μg的KAAP，對(duì)照動(dòng)物進(jìn)行PBS給藥。圖2顯示了pRcKAAP給藥后檢測(cè)到了對(duì)Kmp11（圖3A）和Q（圖3B）的強(qiáng)烈IgG反應(yīng)，并且該反應(yīng)與KAAP蛋白給藥后檢測(cè)到的反應(yīng)相似。然而，用含有僅編碼Kmp11蛋白的基因的DNA質(zhì)粒進(jìn)行給藥后沒有獲得應(yīng)答。當(dāng)分析KAAP或pRcKmp11給藥后對(duì)Q的反應(yīng)（圖3D）時(shí)，檢測(cè)到了均衡的IgG1/IgG2a比例。當(dāng)檢測(cè)對(duì)Kmp11時(shí)，觀察到了稍微顯著的平均IgG1反應(yīng)（圖3C）。分析來自注射了KAAP和pRcKAAP的小鼠的未被刺激的、以及KAAP和Kmp11刺激的脾細(xì)胞的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在KAAP刺激的分離自pRcKAAP-免疫的動(dòng)物的細(xì)胞中觀察到了IFN-γ、IL-6、TNF-α和IL-10的特異性抗原的產(chǎn)量的增加。在KAAP刺激的來自PBS和KAAP-免疫的小鼠的細(xì)胞中檢測(cè)到細(xì)胞因子的產(chǎn)生沒有差別。因?yàn)樵贙AAP刺激的來自PBS和KAAP免疫的小鼠的細(xì)胞中檢測(cè)到了IL-6、TNF-α和IL-10的相似的增加，相對(duì)于未刺激的細(xì)胞，細(xì)胞因子產(chǎn)生的增加極為相似，這是由于脾細(xì)胞的非特異性刺激而不是KAAP特異性細(xì)胞的刺激。在來自KAAP刺激的PBS、KAAP和pRcKAAP-免疫的小鼠的脾細(xì)胞中觀察到了相似的IL-17產(chǎn)生（圖4）。在來自pRcKAAP-免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞經(jīng)Kmp11刺激后觀察到了產(chǎn)量增加的IFN-γ和IL-17。在來自KAAP-免疫的小鼠的細(xì)胞中也觀察到了IL-17產(chǎn)生的增加。另外，相對(duì)于未刺激的細(xì)胞，在使用Kmp11刺激的細(xì)胞培養(yǎng)物中觀察到了非特異性的TNF-α、IFN-γ和IL-6的產(chǎn)生（圖5）。結(jié)論當(dāng)將Kmp11和來自嬰兒利什曼原蟲的Lip2a、Lip2b和P0蛋白的片段進(jìn)行基因融合形成嵌合蛋白時(shí)，大大增強(qiáng)了Kmp11的致免疫性。含有Lip2a、Lip2b和P0片段的嵌合蛋白與Kmp11的混合物（但沒有融合）不會(huì)增強(qiáng)Kmp11的致免疫性。當(dāng)Kmp11蛋白作為融合到編碼來自嬰兒利什曼原蟲的Lip2a、Lip2b和P0蛋白的抗原決定簇的DNA片段上的DNA進(jìn)行給藥時(shí)，引發(fā)了強(qiáng)烈的體液應(yīng)答。當(dāng)Kmp11蛋白單獨(dú)作為DNA進(jìn)行給藥時(shí)，不引發(fā)可檢測(cè)的體液應(yīng)答。在KAAP刺激的分離自pRcKAAP-免疫的動(dòng)物的細(xì)胞中觀察到了抗原特異性的IFN-γ、IL-6、TNF-α和IL-10的產(chǎn)量的增加。使用Kmp11刺激后也觀察到了IFN-γ產(chǎn)量的增加。在KAAP刺激的分離自KAAP-免疫的動(dòng)物的細(xì)胞中沒有檢測(cè)到這種類型的產(chǎn)量增加。AAPDNA序列體外翻譯得到的蛋白可以用作促進(jìn)抵抗基因融合蛋白的抗體的產(chǎn)生的工具。當(dāng)作為DNA進(jìn)行給藥時(shí)，AAPDNA序列可以用作改善抗原致免疫潛力的載體。APP蛋白可以用作載體或佐劑以引發(fā)對(duì)基因融合抗原的免疫應(yīng)答。第II部分材料與方法CAAP表達(dá)載體的構(gòu)建（Cupa4-AAP）提前將Cupa4克隆到了pQE-30載體中，并作為重組蛋白進(jìn)行表達(dá)和純化（MolecularcloningandcharacterizationofCupa4,anewallergenfromCupressusarizonica,BiochemBiophysResCommun.2010Oct22;401(3):451-7.YagoPicodeNuriaParody,MiguelFuertes,JerónimoCarnés,DanielaRoncarolo,RenatoAriano,JoaquínSastre,GianniMistrello,CarlosAlonso）。然后，將蛋白插入到已經(jīng)BamHI消化的KAAP嵌合蛋白以釋放K（Kmp11）片段（本專利）后制備的AAP載體中。最終的表達(dá)載體含有AAP嵌合蛋白和Cupa4綠干柏（C.arizonica）過敏原（圖12）。蛋白被稱為CAAP。CAAP蛋白的表達(dá)和純化將編碼CAAP蛋白的載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)株M15（Qiagen）中。在在5小時(shí)向已經(jīng)用CAAP載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌培養(yǎng)物中添加1mM的IPTG后，在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行表達(dá)。按照之前描述的用于KAAP的純化方法進(jìn)行蛋白的純化。結(jié)果前一部分顯示了當(dāng)較差的致免疫性蛋白融合到AAP片段中時(shí)，免疫應(yīng)答大大增強(qiáng)。為了獲知AAP片段是否也能夠作為佐劑，從而即使在不存在佐劑的情況下也能提高具有強(qiáng)致免疫性的蛋白的致免疫潛力，構(gòu)建了CAAP載體。Cupa4為來自綠干柏的致敏性蛋白。已經(jīng)公開了10%的柏木屬過敏病人中，能夠引起對(duì)Cupa4的強(qiáng)烈IgGE應(yīng)答。為了測(cè)試融合到Cupa4的AAP是否增加了Cupa4的致免疫性，分別對(duì)小鼠組（N=5）中的每只小鼠注射5μg的重組CAAP蛋白，分別相當(dāng)于3和2μg的AAP和Cupa4。第二組小鼠（N=5）中的每只小鼠注射3μg的AAP和2μg的Cupa4形成的混合物。第三組小鼠（N=5）中的每只小鼠注射2μg的Cupa4蛋白。對(duì)于第四組，進(jìn)行3μg的AAP給藥。所有的蛋白均溶于PBS中，并在不用任何佐劑的條件下通過s.c.進(jìn)行給藥。在1/2000的稀釋度下測(cè)定對(duì)Cupa4的IgG反應(yīng)。如所預(yù)期的，第三劑量的PBS或AAP給藥后一周沒有觀察到對(duì)Cupa4的應(yīng)答（數(shù)據(jù)未示出）。第三劑量的Cupa4、CAAP、Cupa4+AAP和AAP給藥后1周的IgG應(yīng)答結(jié)果如圖6A所示?？梢杂^察到，Cupa4免疫的動(dòng)物引發(fā)了對(duì)Cupa4（作為所期望的高致免疫性蛋白）的IgG應(yīng)答。應(yīng)答從0.9到2.3之間變化，平均值為1.4OD。在Cupa4+AAP免疫的動(dòng)物中觀察到了稍微降低的對(duì)Cupa4的反應(yīng)。這表明AAP與Cupa4的混合給藥不會(huì)增加Cupa4的致免疫性，相反，AAP與Cupa4相競(jìng)爭(zhēng)。平均值為0.95OD。然而，當(dāng)Cupa4蛋白融合到AAP（CAAP）中進(jìn)行給藥，在大多數(shù)動(dòng)物中觀查到了應(yīng)答的增強(qiáng)。與在Cupa4免疫的動(dòng)物中檢測(cè)的1.4OD相比，應(yīng)答從1.1到2.9OD之間變化，平均值為2.2OD。第二劑量給藥1周后，在來自Cupa4、Cupa4+AAP和CAAP和AAP的動(dòng)物的血清中觀察到了相似的對(duì)Cupa4的IgG應(yīng)答的行為（圖7A），進(jìn)一步表明了Cupa4的強(qiáng)致免疫特性。為了獲知AAP在引發(fā)對(duì)Cupa4的IgG1和IgG2a應(yīng)答的調(diào)節(jié)中是否存在影響，第二劑量給藥后1周，在Cupa4、Cupa4+AAP和CAAP免疫的動(dòng)物中（稀釋度血清1/400）分析了IgG1和IgG2a的同種型應(yīng)答。圖7B顯示了第二劑量的Cupa4給藥后1周也在IgG1反應(yīng)中檢測(cè)到了從0.18到2.4OD之間變化的分散強(qiáng)度（dispersedintensity）（平均值為1.1）。在Cupa4+AAP免疫的動(dòng)物中對(duì)Cupa4的IgG1反應(yīng)較低并且較為均勻，在平均值0.7OD附近。與此相反，用CAAP免疫的動(dòng)物中對(duì)Cupa4的IgG1反應(yīng)的平均值比在Cupa4和Cupa4+AAP動(dòng)物中的高（平均值為2OD），進(jìn)一步表明了當(dāng)AAP融合到抗原中時(shí)，其發(fā)揮了佐劑的功能。第三劑量給藥后1周，當(dāng)分析對(duì)Cupa4的IgG1反應(yīng)時(shí)，也觀察到了相同的差異（圖6B），尤其是與Cupa4+AAP的混合物給藥進(jìn)行比較時(shí)。當(dāng)?shù)谌齽┝拷o藥1周后，在來自Cupa4、CAAP和Cupa4+AAP免疫的動(dòng)物的血清中分析對(duì)Cupa4的IgG2a反應(yīng)的強(qiáng)度時(shí)，觀察到，在Cupa4和Cupa4+AAP免疫的動(dòng)物的血清中（圖6C），反應(yīng)均勻，分別在平均值0.8和0.6OD附近。在CAAP組中觀察到的IgG2a應(yīng)答，數(shù)值從1.1到2.9OD之間變化，平均值為1.9OD，高于在Cupa4和Cupa4+AAP免疫的動(dòng)物中檢測(cè)到的數(shù)值。當(dāng)?shù)诙┝拷o藥1周后，分析來自Cupa4、Cupa4+AAP和CAAP免疫的動(dòng)物的血清時(shí)，檢測(cè)到了相似的觀察結(jié)果（圖7C）。為了得到進(jìn)一步的AAP早期佐劑功能的證據(jù)，使用上述實(shí)驗(yàn)所示的1/4Cupa4、CAAP和Cupa4+AAP的劑量免疫動(dòng)物組（分別相當(dāng)于0.5μg的Cupa4、1.5μg的CAAP和0.5μg的Cupa4+0.75μg的AAP）。第一劑量給藥后1周收集血清，在1/100的稀釋度下測(cè)定對(duì)Cupa4的IgG反應(yīng)。結(jié)果如圖8所示。觀察到，在Cupa4或Cupa4+AAP免疫的任何動(dòng)物中均不存在對(duì)Cupa4的應(yīng)答，在所有CAAP免疫的動(dòng)物中均觀察到了陽(yáng)性應(yīng)答。也觀察到了應(yīng)答在0.16到1.7OD之間變化。因此，除1只動(dòng)物外，后免疫的早期階段在大多數(shù)動(dòng)物中的應(yīng)答均較高。第二劑量給藥后，觀察到了較為令人感興趣的結(jié)果。在Cupa4+AAP組中，由AAP引發(fā)的應(yīng)答與由Cupa4引發(fā)的應(yīng)答產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)。事實(shí)上，沒有檢測(cè)到對(duì)Cupa4的反應(yīng)（圖9A）。令人感興趣地，當(dāng)抗原融合到AAP中時(shí)，不會(huì)發(fā)生這種競(jìng)爭(zhēng)。為了詳細(xì)地區(qū)別AAP的佐劑功能，在1/4000稀釋度下分析血清（圖9A）。CAAP免疫的動(dòng)物的血清的平均OD為0.45OD，而在來自Cupa4免疫的動(dòng)物的血清中為0.15OD。在該組中，兩只動(dòng)物對(duì)Cupa4的血清反應(yīng)接近于背景水平。所有來自CAAP的動(dòng)物組的血清均為陽(yáng)性。在兩組中對(duì)Cupa4的反應(yīng)之間的差異為統(tǒng)計(jì)學(xué)上的誤差（p<0.05）。當(dāng)分析IgG1和IgG2a應(yīng)答時(shí)（稀釋度1/100），驗(yàn)證了如上所示的數(shù)據(jù)（圖7B和7C）（圖9B和9C）。融合到抗原中的AAP指導(dǎo)對(duì)IgG2a的應(yīng)答。當(dāng)AAP與抗原融合時(shí)，指導(dǎo)了對(duì)IgG2a應(yīng)答。由于CAAP給藥，對(duì)Cupa4的應(yīng)答的反應(yīng)的p值相對(duì)于Cupa4給藥的為0.055，相對(duì)于Cupa4+AAP給藥的p<0.05）。因此，顯示的數(shù)據(jù)表明當(dāng)用融合到Cupa4的AAP蛋白片段進(jìn)行給藥時(shí)，其不僅能夠增強(qiáng)對(duì)強(qiáng)致免疫性蛋白（例如，Cupa4）的免疫應(yīng)答，還能調(diào)節(jié)引發(fā)的應(yīng)答的類型，尤其是對(duì)IgG2a應(yīng)答。當(dāng)AAP與Cupa4蛋白混合給藥時(shí)，觀察不到這種類型的佐劑活性。相反，AAP似乎與抗原的免疫活性相競(jìng)爭(zhēng)。第III部分S100AAP表達(dá)載體的制備使用5’-AAGGATCCATGTGCAGTTCTCTGGAG-3’（SEQIDNO:44）和5’-AACTTAAGCAGGGTCGGTCTGGGCAG-3’（SEQIDNO:45）引物，在體外PCR擴(kuò)增pDEST-17載體（實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存）中的S100A2DNA片段后，將其亞克隆到pSTBlue-1載體上（斜體顯示了BamHI和AflII限制性酶切位點(diǎn)）。然后，亞克隆到修飾的AAP載體（在PQE30載體中）中，該載體為合成的含有必要的限制性酶切位點(diǎn)的載體。所得表達(dá)載體含有AAP嵌合蛋白的3個(gè)片段和S100A2DNA片段（圖13）。將該載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)株M15（Qiagen）中。在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行表達(dá)：在5小時(shí)內(nèi)，用1mMIPTG誘導(dǎo)0.8O.D.450nm的培養(yǎng)物。最終的載體命名為S100AAP。S100A2蛋白在PQE30載體中表達(dá)。前一部分顯示了當(dāng)寄生蟲較差的致免疫性蛋白（Kmp11）融合到AAPDNA序列中時(shí)，對(duì)Kmp11的免疫應(yīng)答大大增強(qiáng)，并且當(dāng)植物強(qiáng)致免疫性蛋白（Cupa4）融合到AAPDNA序列中時(shí)，對(duì)Cupa4的免疫應(yīng)答也增強(qiáng)了。還顯示了，只有當(dāng)報(bào)告蛋白基因融合到AAP上時(shí)，AAP增加報(bào)告蛋白的致免疫性的能力才有效。為了獲知AAP片段是否也能作為佐劑，從而增強(qiáng)哺乳動(dòng)物蛋白的致免疫性潛力，構(gòu)建了S100AAP載體。S100AAP蛋白為鈣結(jié)合蛋白，上調(diào)有關(guān)人胃腺癌（1）和乳腺（2）瘤的進(jìn)展。為了測(cè)試融合到S100中的AAP是否會(huì)增強(qiáng)報(bào)告蛋白的致免疫性，用1.05μg的重組S100AAP蛋白（相當(dāng)于0.75μg和0.3μg的AAP和S100A2）分別注射小鼠組（N=5）的每只小鼠。第二組小鼠（N=5）中的每只注射0.75μg的AAP和0.3μg的S100A2。第三組小鼠（N=5）中的每只注射0.3μg的S100A2。對(duì)于第四組進(jìn)行0.75μg的AAP給藥。將所有蛋白溶于PBS中，并通過s.c.對(duì)小鼠進(jìn)行給藥。作為對(duì)照組小鼠（N=5）每只注射緩沖溶液（PBS）。圖10顯示了第一劑量給藥后1周在1/100稀釋度下對(duì)S100A2的總的IgG應(yīng)答。如所期望的，觀察到，來自AAP或PBS免疫的小鼠的血清均未顯示任何對(duì)S100A2的陽(yáng)性反應(yīng)。除1只小鼠外，當(dāng)?shù)鞍着c之前報(bào)道的用于Cupa4的AAP混合給藥時(shí)，對(duì)S100A2的反應(yīng)降低了，表明了混合給藥時(shí)兩種致免疫性蛋白間存在競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)（一只動(dòng)物的血清反應(yīng)為陰性）。來自單獨(dú)使用S100A2蛋白免疫的小鼠的數(shù)據(jù)顯示，在不存在佐劑的情況下，在小鼠中蛋白也是致免疫性的，因?yàn)榧词沟土康牡鞍捉o藥也能夠誘導(dǎo)較低的但為陽(yáng)性的應(yīng)答（平均OD=0.41）。盡管觀察到在S100AAP免疫的小鼠中AAP和S100A2之間沒有任何免疫競(jìng)爭(zhēng)，但另一方面，當(dāng)給藥蛋白融合到AAP中時(shí)，對(duì)S100A2的反應(yīng)增加了（30%）（平均OD=0.54）。如圖11所示，當(dāng)進(jìn)行S100AAP、S100A2、AAP+S100A2和AAP（1.05μg的deS100AAP；0.3μg的deS100A2；0.75μg的AAP＋0.3μg的S100A2和0.75μg的AAP）的第二劑量給藥后，明顯觀察到融合到報(bào)告蛋白中的AAP具有佐劑的功能。在S100AAP免疫的動(dòng)物的血清和單獨(dú)S100A2蛋白免疫的動(dòng)物的血清之間，檢測(cè)到了對(duì)S100A2反應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。與如上關(guān)于未融合到報(bào)告蛋白中的AAP給藥后對(duì)Kmp11和Cupa4的反應(yīng)的觀察結(jié)果一致，當(dāng)AAP未融合到報(bào)告S100A2中時(shí)，檢測(cè)到AAP不具有任何佐劑功能。另一方面，兩種蛋白之間的免疫競(jìng)爭(zhēng)也似乎存在。因此，由于AAP需要融合到報(bào)告蛋白中以行使佐劑功效，從設(shè)計(jì)的3種實(shí)驗(yàn)中可以推斷出免疫上的令人感興趣的特征。換句話說，這意味著，AAP的嵌合佐劑功能與AAP基因融合到報(bào)告蛋白中時(shí)是相關(guān)的。當(dāng)分析應(yīng)答的類型時(shí)，進(jìn)一步觀察到了佐劑效應(yīng)（圖11B）。檢測(cè)到的是，相對(duì)于S100A2或AAP+S100A2給藥后對(duì)S100A2的反應(yīng)，S100AAP給藥后不僅對(duì)S100A2的IgG反應(yīng)增強(qiáng)，并且當(dāng)分析IgG2a型時(shí)，也觀察到了這種反應(yīng)的增強(qiáng)。S100A2給藥后觀察到的IgG1/IgG2a反應(yīng)比值具有2.1的平均值，然而，當(dāng)使用S100AAP免疫動(dòng)物時(shí)，IgG1/IgG2a反應(yīng)比值為0.95，表明當(dāng)AAP融合到報(bào)告蛋白中時(shí)，AAP的佐劑功能引起了IgG1-IgG2a應(yīng)答轉(zhuǎn)為IgG2a。與如上關(guān)于IgG應(yīng)答顯示的觀察結(jié)果一致，當(dāng)使用蛋白混合物免疫動(dòng)物時(shí)，觀察到使用S100AAP免疫的動(dòng)物的血清的IgG1反應(yīng)明顯高于來自使用AAP+S100A2免疫的動(dòng)物的血清的IgG1反應(yīng)。在這兩種情況下，IgG2a應(yīng)答的平均值相似，進(jìn)一步證明了僅當(dāng)AAP融合到報(bào)告蛋白中時(shí)，AAP的功能才恢復(fù)針對(duì)IgG2a。1-Identificationofpotentialbiomarkersforearlyandadvancedgastricadenocarcinomadetection.EconomescuMC,NeculaLG,DraguD,BadeaL,DimaSO,TudorS,NastaseA,PopescuI,DiaconuCC.Hepatogastroenterology.2010Nov-Dec;57(104):1453-64。2-McKiernanE,McDermottEW,EvoyD,CrownJ,DuffyMJ.TheroleofS100genesinbreastcancerprogression.TumourBiol.2011Jun;32(3):441-50。第三劑量給藥后，進(jìn)一步甚至更清晰地觀察到了關(guān)于S100A2的AAP的佐劑功能的改變，如下所述：作為AAP的佐劑功能的進(jìn)一步證明，分析了抗原的第三劑量給藥后獲得的相同的動(dòng)物的血清。圖14顯示了對(duì)S100A2的應(yīng)答。在用于分析的血清的稀釋度的滴定曲線后，選擇1／6400的稀釋度，因?yàn)樵撓♂尪饶軌蜉^好的區(qū)別AAP的佐劑功能。明顯檢測(cè)到的是，S100AAP免疫的動(dòng)物的血清中對(duì)S100A2的反應(yīng)顯著強(qiáng)于S100A2蛋白的混合物免疫的動(dòng)物的血清中觀察到的反應(yīng)。為了獲知AAP是否會(huì)調(diào)節(jié)體液免疫，分析了IgGl和IgG2a應(yīng)答。在兩種類型的應(yīng)答中均觀察到了增強(qiáng)。當(dāng)?shù)鞍讍为?dú)給藥時(shí)，IgG2a／IgGl平均比值為0.45。然而，當(dāng)AAP融合到S100A2中時(shí)，IgG2a／IgGl之間的平均比值為1.6，表明AAP調(diào)節(jié)針對(duì)IgG2a的應(yīng)答。另外，需要注意的是，當(dāng)AAP與S100A2混合給藥時(shí)，AAP也調(diào)節(jié)針對(duì)IgG2a的應(yīng)答(IgG2a／IgGl平均比值等于1.1)。SEQDNO:2GGATCCTCTAGACCCATGTCCACCAAGTACCTCGCCGCGTACGCTCTGGCCTCCCTGAGCAAGGCGTCCCCGTCTCAGGCGGACGTGGAGGCTATCTGCAAGGCCGTCCACATCGACGTCGACCAGGCCACCCTCGCCTTTGTGATGGAGAGCGTTACGGGACGCGACGTGGCCACCCTGATCGCGGAGGGCGCCGCGAAGATGAGCGCGATGCCGGCGGCCAGCTCTGGTGCCGCTGCTGGCGTCACTGCTTCCGCTGCGGGTGATGCGGCTCCGGCTGCCGCCGCTGCTAAGAAGGACGAGCCGGAGGAGGAGGCCGACGACGACATGGGCCCCTCTAGAGTCGACCCCATGCAGTACCTCGCCGCGTACGCCCTCGTGGCGATGTCTGGCAAGACGCCGTCGAAGGCGGACGTTCAGGCTGTCCTGAAGGCCGCCGGCGTTGCCGTGGATGCCTCCCGCGTGGATGCC6TCTTCCAGGAGGTGGAGGGCAAGAGCTTCGATGCGCTGGTGGCCGAGGGCCGCACGAAGCTGGTGGGCTCTGGCTCTGCCGCTCCTGCTGGCGCTGTCTCCACTGCTGGTGCCGGCGCTGGCGCGGTGGCCGAGGCGAAGAAGGAGGAGCCCGAGGAGGAGGAGGCCGATGATGACATGGGCCCCGTCGACCTGCAGCCCGCCGCTGCCGCGCCGGCCGCCCCTAGCGCCGCTGCCAAGGAGGAGCCGGAGGAGAGCGACGAGGACGACTTCGGCATGGGCGGTCTCTTCTAASEQDNO:lGSSRPMSTKYLAAYALASLSKASPSQADVEAlCKAVHlDVDQATLAFVNlESVT6RDVATLlAEGAAKMSAMPAASSGAAAGVTASAAGDAAPAAAAAKKDEPEEEADDOMGPSRVDPMQYLAAYALVAMSGKTPSKADVQAVLKAAGVAVDASRVDAVFQEVE6KSFOALVAEGRTKLVGSGSAAPAGAVSTAGAGAGAVAEAKKEEPEEEEADDDMGPVDLQPAAAAPAAPSAAAKEEPEESDEDDFGMGGLF