包含tlr-5作為佐劑的用于經(jīng)皮膚免疫的疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于經(jīng)皮膚免疫的免疫原性組合物，其包含一種或多種抗原和佐劑，其中所述佐劑是TLR-5激動(dòng)劑。
【專利說明】包含TLR-5作為佐劑的用于經(jīng)皮膚免疫的疫苗
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供了用于經(jīng)皮膚免疫的免疫原性組合物，其包含抗原和佐劑，所述佐劑是TLR-5激動(dòng)劑。
[0002] 發(fā)明背景
[0003]無論初次或加強(qiáng)接種，一般均存在增加患者對(duì)接種的依從性以及提高疫苗生產(chǎn)和運(yùn)輸?shù)谋憷缘男枰?。?jīng)皮膚免疫能夠解決這些需求中的一些，并且能夠用于將抗原與佐劑組合施用，以誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答。
發(fā)明概要
[0004]本發(fā)明的一個(gè)目的是在對(duì)象體內(nèi)刺激對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答。疫苗包含一種包含抗原和佐劑兩者的免疫原性組合物，其并且經(jīng)皮膚施用。
[0005]免疫原性組合物內(nèi)的佐劑是TLR-5激動(dòng)劑。
[0006]附圖簡沭
[0007]圖1:小鼠免疫原性數(shù)據(jù)結(jié)果一第二次后14天的抗HBs IgG
[0008]詳細(xì)描沭
[0009]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于經(jīng)皮膚免疫的免疫原性組合物，其包含一種或多種抗原和佐劑，其中所述佐劑是TLR-5激動(dòng)劑。
[0010]在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含一種或多種抗原和佐劑的免疫原性組合物在生產(chǎn)用于經(jīng)皮膚免疫的藥物中的用途，其中所述佐劑是TLR-5激動(dòng)劑。
[0011]在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種經(jīng)皮膚免疫的方法，其包括對(duì)對(duì)象經(jīng)皮膚應(yīng)用包含一種或多種抗原和佐劑的免疫原性組合物的步驟，其中所述佐劑是TLR-5激動(dòng)劑。
[0012]本文中使用的術(shù)語經(jīng)皮膚意在是指將抗原應(yīng)用到人體皮膚的真皮和/或表皮中。盡管還涵蓋常規(guī)施用方法，本發(fā)明具體地利用用于經(jīng)皮膚免疫的遞送系統(tǒng)，該遞送系統(tǒng)誘導(dǎo)動(dòng)物或人體中的免疫應(yīng)答。
[0013]可以通過利用技術(shù)人員已知的任何經(jīng)皮膚方法進(jìn)行免疫原性組合物的經(jīng)皮膚應(yīng)用，所述方法包括但不限于利用短針裝置(包含長度為大約I至大約2mm之間的針的一種裝置)遞送或者利用皮膚貼劑遞送，所述免疫原性組合物包含至少一種抗原和佐劑，其中所述佐劑是TLR-5激動(dòng)劑。
[0014]對(duì)于本文中描述的經(jīng)皮膚疫苗，適于使用的裝置包括短針裝置，例如US4, 886，499、US5, 190，521、US5, 328，483、US5, 527，288、US4, 270，537、US5, 015，235、US5, 141,496、US5，417，662和EP1092444中描述的那些。還可以通過限制了針的有效穿透長度的裝置將經(jīng)皮膚疫苗施用到皮膚中，例如W099/34850 (通過引用并入本文)中描述的那些和其功能性等同物。射流注射裝置也是適合的，其通過液體射流注射器或者通過刺穿角質(zhì)層并且產(chǎn)生到達(dá)真皮的射流的針將液體疫苗遞送至真皮。射流注射裝置例如描述于 US5, 480，381、US5, 599，302、US5, 334，144、US5, 993，412、US5, 649，912、US5, 569，189、US5, 704，911、US5, 383，851、US5, 893，397、US5, 466，220、US5, 339，163、US5, 312，335、US5, 503，627、US5, 064，413、US5, 520，639、US4, 596，556、US4, 790，824、US4, 941，880、US4, 940, 460、W097/37705和W097/13537中。彈道粉末/顆粒遞送裝置也是適合的，其利用壓縮氣體使粉末形式的疫苗加速通過皮膚外層到達(dá)真皮。此外，常規(guī)注射器可以用于經(jīng)皮膚施用的經(jīng)典曼托(mantoux)方法中。然而，使用常規(guī)注射器需要高度熟練的操作人員，因此優(yōu)選無需高度熟練的使用者即能夠精準(zhǔn)遞送的裝置。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于經(jīng)皮膚施用的本發(fā)明的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物不是通過利用常規(guī)注射器的曼托方法施用的。
[0015]在本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案中，提供了包含如本文中描述的本發(fā)明免疫原性組合物的貼劑。一般貼劑將包括包含固體基質(zhì)(例如封閉性或非封閉性手術(shù)敷料)的墊板。本發(fā)明的貼劑將本發(fā)明的抗原和佐劑遞送至真皮或表皮。相應(yīng)地，本發(fā)明的貼劑包含適應(yīng)于將本發(fā)明的免疫原性組合物遞送至表皮或真皮的一個(gè)或多個(gè)微突出物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)微突出物在ΙΟμπι和2mm之間，例如20 μ m至500 μ m、30 μ m至 1mm、100 至 200,200 至 300,300 至 400,400 至 500,500 至 600,600 至 700、700、800、800至900、100 μ m至400 μ m，具體地是大約200 μ m和300 μ m之間或大約150 μ m和250 μ m之間。
[0016]在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的貼劑包含多個(gè)微突出物。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的貼劑包含2和5000之間的顯微操作針，例如1000和2000之間的微突出物。
[0017]在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，微突出物的間隔距離在大約50μπι和ΙΟΟΟμπι之間。
[0018]微突出物可以是適于刺穿角質(zhì)層、表皮和/或真皮的任意形狀，并且將抗原和佐劑遞送至表皮或真皮。微突出物可以是例如如W02000/074765和W02000/074766中公開的形狀。微突出物可以具有至少3: 1、至少大約2: I或至少大約1:1的高寬比(高度比基部的直徑)。微突出物的特別優(yōu)選的形狀是具有多邊形，例如六邊形或菱形底部的錐體。其他可能的微突出物形狀顯示于例如美國已公開的專利申請(qǐng)2004/0087992中。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的微突出物具有向底部變厚的形狀。
[0019]陣列中微突出物的數(shù)量優(yōu)選是至少大約100、至少大約500、至少大約1000、至少大約1400、至少大約1600或至少大約2000?？紤]到其較小，微突出物的表面密度可能不是很高，但是例如每cm2微突出物的數(shù)量可以是至少大約50、至少大約250、至少大約500、至少大約750、至少大約1000或至少大約1500。
[0020]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗原和佐劑在將貼劑放置于宿主皮膚上的5小時(shí)內(nèi)，例如4小時(shí)、3小時(shí)、2小時(shí)、I小時(shí)或30分鐘內(nèi)被遞送至宿主中。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗原和佐劑在放置皮膚貼劑的20分鐘內(nèi)被遞送，例如30秒、
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18 或 19 分鐘內(nèi)。
[0021]微突出物可以用技術(shù)人員已知的任意適宜的材料制備。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，微突出物的至少 一部分是生物可降解的，特別是微突出物的最外層的微突出物的末端。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，基本上所有的微突出物是生物可降解的。本文中使用的術(shù)語“生物可降解的”是指在體內(nèi)使用(例如插入皮膚中)的預(yù)期條件下可以降解，無論生物降解的機(jī)制如何。生物降解的示例性機(jī)制包括分解、分散、溶解、腐蝕、水解和酶促降解?；旧纤械氖侵钢辽?0%的微突出物是生物可降解的，例如至少75%、80%、85%、90%或至少95%是生物可降解的。
[0022]在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，生物可降解的微突出物包含生物可降解的聚合物。例如，適宜的生物相容性的、生物可降解的或生物可蝕性聚合物包括聚乳酸(PLA)，聚羥基乙酸(PGA)，聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGAs)，聚酸酐，聚原酸酯，聚醚酯，聚己內(nèi)酯(PCL)，聚酯酰胺，聚丁酸，聚戊酸，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙烯醇(PVA)，聚乙二醇(PEG)，PEG-PLA、PEG-PLA-PEG、PLA-PEG-PLA、PEG-PLGA, PEG-PLGA-PEG、PLGA-PEG-PLGA、PEG-PCL, PEG-PCL-PEG, PCL-PEG-PCL的嵌段共聚物，乙二醇-丙二醇-乙二醇的共聚物(PEG-PPG-PEG,商品名為 Pluronic?或Poloxamer? )，右旋糖苷，六聚淀粉(hetastarch),四聚淀粉(tetrastarch),五聚淀粉(pentastarch),輕乙基淀粉，纖維素，輕丙基纖維素(HPC)，羧甲基纖維素鈉(Na CMC)，熱敏性HPMC(羥丙基甲基纖維素)，聚磷腈，羥乙基纖維素(HEC)，其他多糖、多元醇、凝膠、藻酸鹽、殼聚糖、透明質(zhì)酸和其衍生物，膠原和其衍生物，聚氨酯以及這些聚合物的共聚物和混合物。優(yōu)選的羥乙基淀粉具有0-0.9范圍內(nèi)的取代度。
[0023]在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，微突出物的生物可降解部分包含抗原和/或佐劑?？乖?或佐劑可以出現(xiàn)在不同的微突出物中，例如分別大約90%、80%、70%、60%、50%、40%,30%的微突出物可以包含抗原并且10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%的微突出物可以包含佐劑。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，提供了包含一個(gè)或多個(gè)特別是許多生物可降解的微突出物的貼劑，所述微突出物包含如本文中描述的免疫原性組合物。包含活性物質(zhì)例如抗原的微突出物的實(shí)例公開于W02008/130587和W02009/048607中?？纱x顯微操作針的制造方法公開于W02008/130587和W02010/124255中。
[0024]在又一個(gè)實(shí)施方案中，將佐劑和抗原涂覆于一個(gè)或多個(gè)微突出物上。可以通過技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行涂覆，例如通過W006/055844、W006/055799中公開的方法。
[0025]抗原和/或佐劑可以涂覆在不同的微突出物中。分別90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%的微突出物可以涂覆有抗原并且10%、20%、30%、40%、50%、60%或70 %的微突出物可以涂覆有佐劑。
[0026]本發(fā)明的貼劑可以通過任意方法應(yīng)用于佩戴者的皮膚上，例如通過用手將貼劑放置于皮膚上。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，利用敷抹器將本發(fā)明的貼劑應(yīng)用于皮膚上，例如W02008/091602中描述的敷抹器。具體地，所述應(yīng)用包括用于保證所述貼劑已經(jīng)以足夠的壓力施加到皮膚以保證一個(gè)或多個(gè)微突出刺穿角質(zhì)層、表皮和/或真皮的手段，例如當(dāng)已施加了足夠的壓力時(shí)發(fā)出可聽到的聲音的裝置。
[0027]本發(fā)明的貼劑還可以包含粘合劑以輔助貼劑在抗原和佐劑釋放/遞送至真皮和/或表皮的過程中滯留于皮膚上。
[0028]本發(fā)明的免疫原性組合物包含抗原和佐劑兩者。佐劑是免疫原性組合物的組分，其有助于誘導(dǎo)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。在本發(fā)明中，用于經(jīng)皮膚免疫的免疫原性組合物包含佐劑，該佐劑為TLR-5激動(dòng)劑。
[0029]所述TLR-5激動(dòng)劑可以是鞭毛蛋白或者可以是保留TLR-5激動(dòng)劑活性的鞭毛蛋白片段。鞭毛蛋白可以包括選自下列的多肽:幽門螺桿菌(H.pylori)、鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、霍亂弧菌(V.cholera)、粘質(zhì)沙雷菌(S.marcesens)、弗氏志賀菌(S.flexneri)、梅毒密螺旋體(T.pallidum)、嗜肺軍團(tuán)菌(L.pneumophila)、博氏疏螺旋體(B.burgdorferei)、艱難梭狀芽孢桿菌(C.difficile)、苜猜根瘤菌(R.meliloti)、根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)、羽扇豆根瘤菌(R.1upini)、卡氏巴爾通體(B.clarridgeiae)、奇異變形桿菌(P.mirabilis)、枯草芽孢桿菌(B.subtilus)、單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌(L.moncytogenes)、銅綠假單胞菌(P.aeruginoa)和大腸桿菌(E.coli)。
[0030]在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，鞭毛蛋白選自由以下組成的組:鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白B(Genbank登錄號(hào)AF045151)、鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白B的片段、大腸桿菌FliC (Genbank登錄號(hào)AB028476)、大腸桿菌FliC的片段、鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白FliC(ATCC14028)和鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白FliC的片段。
[0031]在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述TLR-5激動(dòng)劑是如W02009/156405中描述的截短的鞭毛蛋白，即其中超變結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被缺失的鞭毛蛋白。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，所述TLR-5 激動(dòng)劑選自 FliC賴_400、FliCm5 和 FliCM38_405。
[0032]在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述TLR-5激動(dòng)劑是如W02009/128950中描述的鞭毛蛋白。[0033]如果TLR-5激動(dòng)劑是鞭毛蛋白的片段，將要理解的是，所述片段將保留TLR5激動(dòng)劑活性，并且必須因而保留其負(fù)責(zé)TLR-5活化的那部分序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知鞭毛蛋白的NH2和C00H末端結(jié)構(gòu)域?qū)τ赥LR-5的相互作用和活化是重要的，特別是例如沙門氏菌中的第86-92位氨基酸。
[0034]在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含如本文中限定的TLR-5激動(dòng)劑并且無其他佐劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含TLR-5激動(dòng)劑和一種或多種其他佐劑。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，所述一種或多種其他佐劑選自TLR-4激動(dòng)劑、TLR7/8激動(dòng)劑和具有免疫學(xué)活性的皂角苷級(jí)分。
[0035]特別適合用于本發(fā)明中的皂角苷是Quil A和其衍生物。Quil A是分離自南美樹木石堿木(Quillaja Saponaria Molina)的阜角苷制備品，其在1974年由Dalsgaard等人首次描述("Saponin adjuvants" , Archiv.fur die gesamte Virusforschung, Vol.44,Springer Verlag, Berlin, p243_254)為具有佐劑活性。已經(jīng)通過HPLC分離出了 Quil A的經(jīng)純化片段，其保留佐劑活性但是沒有與Quil A相關(guān)的毒性(EP0362278)，例如QS7和QS21(也被稱為 QA7 和 QA21)。QS-21 是一種來源于 Quillaja Saponaria Molina 的樹皮的天然皂角苷，其誘導(dǎo)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTLs)、Thl細(xì)胞和優(yōu)勢(shì)性IgG2a抗體應(yīng)答，是本發(fā)明中優(yōu)選的皂角苷。在本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案中，具有免疫學(xué)活性的皂角苷是QS21。具體地，QS21是基本上純的形式，也就是說，QS21是至少90%純，優(yōu)選至少95%純，最優(yōu)選至少98%純。在本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案中，QS21用留醇配制。優(yōu)選的留醇包括β -谷留醇、豆留醇、麥角留醇、麥角鈣化醇和膽固醇。這些留醇是本領(lǐng)域熟知的，例如膽固醇公開于默克索引，第11^版，第341頁中，作為在動(dòng)物脂肪中發(fā)現(xiàn)的天然存在的留醇。在本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案中，留醇是膽固醇。在本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案中，QS21與膽固醇的比率在1: 100和1:1之間，特別是1: 2和1: 10之間，例如1: 5。
[0036]TLR-4激動(dòng)劑是Toll樣受體家族成員Toll樣受體4的激動(dòng)劑。這是熟知的受體家族，其所有成員在某種程度上均參與免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，TLR-4激動(dòng)劑是脂多糖，合適地，是脂質(zhì)A的非毒性衍生物，具體地是單磷酰脂質(zhì)A或更具體地是3-脫?；鶈瘟柞Ｖ|(zhì) A(3D-MPL)。
[0037]3D-MPL 由 GlaxoSmithKline Biologicals N.A 以 MPL 的名稱售賣，并在本文中被稱為 MPL 或 3D-MPL。參見例如美國專利號(hào) 4，436，727,4, 877，611,4, 866，034 和 4，912，094。3D-MPL主要促進(jìn)具有IFN-g(Thl)表型的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。3D-MPL可以依照GB2220211A中公開的方法生產(chǎn)。從化學(xué)上來說，其是具有3、4、5或6條乙?；湹?-脫酰基單磷酰脂質(zhì)A的混合物。
[0038]可以用于本發(fā)明中的其他TLR-4激動(dòng)劑是氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯(aminoalkyl glucoasminide phosphate, AGPs)，其是合成的 TLR-4 激動(dòng)劑，可從GlaxoSmithKline Biologicals S.A.獲得。適宜的示例是W098/50399或美國專利號(hào)6，303，347中公開的那些(還公開了制備AGPs的過程)，適宜地是如公開于美國專利號(hào)6，764，840中的RC527或RC529，或者AGPs的藥學(xué)上可接受的鹽。
[0039]TLR7和8是toll樣受體家族的另外的成員。已知一些小分子是TLR7受體或TLR8受體或兩者的激動(dòng)劑。TLR7/8激動(dòng)劑是指能夠激動(dòng)化(agonise，即增加)TLR7受體或TLR8受體或兩者的信號(hào)傳導(dǎo)的分子。因此在一個(gè)方面中，TLR7/7配體是TLR7激動(dòng)劑而非TLR8激動(dòng)劑的分子。在另一個(gè)方面中，TLR7/8配體是TLR8激動(dòng)劑而非TLR7激動(dòng)劑。在又一個(gè)方面中，TLR7/8配體作為TLR7和TLR8受體兩者的激動(dòng)劑而發(fā)揮作用。適宜的TLR7/8配體可以在例如 W02010/018133、TO2010048520、TO2010/018134、W02008004948, W02007034882和TO2005092893中找到。
[0040]如本文中進(jìn)一步討論的，對(duì)于技術(shù)人員來說顯而易見的是，一些天然佐劑可以存在于抗原制備品中，如果這種制備品是含有天然的病原體相關(guān)分子模式的活的減毒病毒或滅活的完整病毒 。在本文中，術(shù)語“無其他佐劑”并非意在排除一些抗原制備品中存在的那些天然佐劑，而是意指免疫原性組合物中沒有特別添加另外的佐劑。
[0041]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物用于經(jīng)皮膚的初次免疫。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物用于對(duì)象中經(jīng)皮膚的加強(qiáng)免疫，所述對(duì)象已經(jīng)通過非透皮途徑(例如舌下、鼻內(nèi)或肌內(nèi))接受了初次免疫。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物可以提供經(jīng)皮膚的初次免疫和經(jīng)皮膚的加強(qiáng)免疫兩者。
[0042]術(shù)語初次免疫意在是指對(duì)象接受的針對(duì)特定病原體的首次接種過程。例如，在UK接種進(jìn)度中，嬰兒在13月齡時(shí)接種麻疹、腮腺炎和風(fēng)疹(初次免疫)。在3歲4個(gè)月年齡時(shí)，其再次接種相同的病原體(加強(qiáng)免疫)。另一個(gè)實(shí)例可以見于乙型肝炎領(lǐng)域。需要接種的人(成人或嬰兒)在0、1和6個(gè)月時(shí)被給予3次疫苗劑量的初次進(jìn)度。如果需要，(例如按照加速的初次免疫進(jìn)度，或者抗體效價(jià)已經(jīng)減少)可以在初始接種后I年或5年時(shí)給予另一次接種(加強(qiáng)免疫)。另外的實(shí)例可以見于所謂的“DTP”疫苗-白喉、破傷風(fēng)、百日咳疫苗中。一般來講，破傷風(fēng)和白喉的初次免疫在生命第一年中以2次劑量進(jìn)行。根據(jù)國家不同，在第二年和/或4歲和10歲之間施用加強(qiáng)劑量。
[0043]本領(lǐng)域熟知，術(shù)語抗原是指產(chǎn)生免疫應(yīng)答的試劑。抗原可以是能夠在人或動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的一種或多種蛋白、多糖、肽、核酸、蛋白-多糖綴合物、分子或半抗原?；蛘?，抗原可以是完整的病原體，例如減毒或滅活的病原體。完整的滅活的病原體可以進(jìn)一步被拆分，例如拆分的流感病毒。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗原來源于甲型肝炎病毒和/或乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎病毒表面抗原)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原來源于人乳頭瘤病毒。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原是尼古丁或來源于尼古丁。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原來源于登革熱病毒。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原來源于呼吸道合胞體病毒(RSV)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原與阿爾茨海默氏病(Alzheimer’ sdisease)相關(guān)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原來源于引起麻疫、腿腺炎、風(fēng)疫或其組合的病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原來源于水痘-帶狀皰疫病毒(VZV)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,抗原來源于腫瘤相關(guān)抗原(例如MAGE和/或PRAME)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,抗原來源于一種在人體中引起痕疾的寄生蟲，具體地是鐮狀痕原蟲(Plasmodium falciparum)和/或間日痕原蟲(Plasmodium vivax)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原來源于巨細(xì)胞病毒(CMV)。
[0044]如果本發(fā)明的免疫原性組合物用作加強(qiáng)免疫，那么初次免疫可能已經(jīng)加入佐劑或未加入佐劑。顯而易見的是，一些疫苗天然地含有佐劑，例如活的減毒或滅活的病毒疫苗將保留一些在初始病原體中發(fā)現(xiàn)的病原體相關(guān)分子模式(PAMPS)。當(dāng)初次免疫“未加入佐劑”時(shí)，該術(shù)語意在 是指所述初次免疫不含除抗原制備品中可能存在的那些以外的任何佐劑。
[0045]在本發(fā)明的一個(gè)特別的實(shí)施方案中，初次免疫加入了佐劑(即已經(jīng)摻入了除抗原制備品中天然存在的那些以外的額外佐劑)。術(shù)語佐劑在本領(lǐng)域被理解為是指輔助誘導(dǎo)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的組分?？捎糜诔醮谓臃N的佐劑是例如金屬鹽、TLR調(diào)控物、水包油乳劑、脂質(zhì)體免疫原性組合物、皂角苷佐劑或這些的任意組合。
[0046]在一個(gè)實(shí)施方案中，初次免疫中使用的佐劑包含TLR調(diào)控物，例如TLR-4調(diào)控物，例如脂多糖或其衍生物，如單磷酰脂質(zhì)A或3-脫酰基單磷酰脂質(zhì)A (被稱為3D-MPL，可從GlaxoSmithKline Biologicals North America 獲得，參見例如美國專利號(hào) 4，436，727、4，877，611,4, 866，034 和 4，912，094)。
[0047]在另一個(gè)實(shí)施方案中，初次免疫中使用的佐劑包含皂角苷佐劑，例如QuilA和其衍生物。Quil A是分離自南美樹木石堿木的皂角苷制備品，其在1974年由Dalsgaard等人首次描述("Saponin adjuvants" , Archiv.fur die gesamte Virusforschung, Vol.44,Springer Verlag, Berlin, p243_254)為具有佐劑活性。已經(jīng)通過HPLC分離出了 Quil A的經(jīng)純化片段，其保留佐劑活性但是沒有與Quil A相關(guān)的毒性(EP0362278)，例如QS7和QS21 (也被稱為QA7和QA21)。
[0048]在一個(gè)實(shí)施方案中，初次免疫中使用的佐劑包含皂角苷佐劑和TLR-4調(diào)控物兩者，例如被稱為ASOlB的佐劑(脂質(zhì)體免疫原性組合物中的3D-MPL和QS21，50 μ g3D_MPL和SOyg QS21)或被稱為ASOlE的佐劑(脂質(zhì)體免疫原性組合物中的3D-MPL和QS21，25 μ g3D-MPL 和 25 μ g QS21)。
[0049]在一個(gè)實(shí)施方案中，初次免疫中使用的佐劑包含金屬鹽，例如氫氧化鋁或磷酸鋁和3-脫?；鶈瘟柞Ｖ|(zhì)A。在該實(shí)施方案的一個(gè)特別的實(shí)例中，初次免疫中使用的佐劑是被稱為AS04的佐劑(50 μ g3D-MPL吸附于500 μ g鋁鹽上)。
[0050]在又一個(gè)實(shí)施方案中，初次免疫中使用的佐劑包含水包油乳劑，其本身包含可代謝油(例如角鯊烯)和表面活性劑(例如Tween80和/或span85)。在該實(shí)施方案的一個(gè)特別的實(shí)例中，水包油乳劑是MF59。在該實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)例中，水包油乳劑可以包含可代謝油的組合，例如角鯊烯和α-生育酚。在該實(shí)施方案的一個(gè)特別的實(shí)例中，水包油乳劑是AS03a、AS03b、AS03。或 AS03D，所有這些是來自 GlaxoSmithKline Biologicals S.A.的基于α-生育酚的水包油乳劑。
實(shí)施例[0051]為了估測(cè)來自鼠沙寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的天然鞭毛蛋白(FliC蛋白)作為佐劑的潛能，在第O天和第14天，用單獨(dú)的2 μ g乙型肝炎表面抗原(HBsAg)或用HBsAg與增加劑量(0.001 μ g、0.01 μ g或0.1 μ g)的來源于鼠沙寒沙門氏菌天然FliC蛋白的組合，對(duì)C57BL/6小鼠的組進(jìn)行皮內(nèi)注射。對(duì)照組也接受相同劑量的混有DQ佐劑的HBsAg(通過皮內(nèi)途徑)或吸附于50yg明礬上的HBsAg(經(jīng)由肌內(nèi)途徑)。在第28天對(duì)小鼠實(shí)施安樂死，并通過心臟穿刺收集血液樣品。還在每次免疫前收集血液樣品。對(duì)血液樣品進(jìn)行處理，并將血清樣品冷凍于_80°C，以用于通過ELISA確定抗原特異性抗體。HBsAg用作固相抗原。簡單地講，微孔板的孔用最佳濃度的HBsAg于室溫包被4小時(shí)。對(duì)微孔進(jìn)行清洗和封閉后，將血清樣品系列釋稀到板中并使板于4°C孵育過夜。充分清洗步驟后，利用HRP綴合的第二抗體檢測(cè)小鼠IgG (于37°C 30分鐘)，隨后用TMB底物溶液孵育。30分鐘后,用IM硫酸終止反應(yīng)。在450nm下進(jìn)行讀板。利用經(jīng)純化的小鼠抗體從在每個(gè)板上運(yùn)行得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算測(cè)試樣品中的抗體濃度。利用四參數(shù)等式通過SoflMaxPiO從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算特異性血清IgG的濃度。數(shù)值表示為每毫升血清中特異性抗體的納克量，并且通過單因素ANOVA隨后是Dunnett’ s多重比較測(cè)試，將測(cè)試組抗體濃度的平均值與已經(jīng)皮內(nèi)接受未加入佐劑的HBsAg的對(duì)照組(圖中的空心圓)進(jìn)行比較。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明免疫原性增加，其顯示為與已經(jīng)接受單獨(dú)的HBsAg的動(dòng)物相比，當(dāng)HBsAg與0.1yg FliC共同注射時(shí)，抗原特異性血清抗體濃度增加。觀察到抗體濃度增加了約7倍。另一項(xiàng)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)表明，F(xiàn)liC劑量增加至Iyg不會(huì)進(jìn)一步提高HBsAg的免疫原性。有趣的是，已經(jīng) 接受了 HBsAg和0.1 μ gFliC的小鼠的抗體效價(jià)與接受了 1/10人體劑量的Engerix疫苗(2 μ g HBsAg吸附于50 μ g明帆上)的小鼠的抗體效價(jià)之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。
【權(quán)利要求】
1.用于經(jīng)皮膚免疫的免疫原性組合物，其包含一種或多種抗原和佐劑，其中所述佐劑是TLR-5激動(dòng)劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物進(jìn)一步包含一種或多種額外的佐劑，所述額外的佐劑選自TLR-4激動(dòng)劑、TLR7/8激動(dòng)劑或具有免疫學(xué)活性的皂角苷。
3.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其以貼劑形式施用。
4.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其利用短針裝置施用。
5.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其中所述TLR-5激動(dòng)劑是鞭毛蛋白或其具有TLR-5活性的片段。
6.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其中所述TLR-5激動(dòng)劑是其中超變結(jié)構(gòu)域已經(jīng)缺失的TLR-5激動(dòng)劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的免疫原性組合物，其中所述TLR-5激動(dòng)劑選自FliCM74_4(K1、Fl ICa 161-405 和 Fl ?0Δ 138-405°
8.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其中所述抗原來源于乙型肝炎病毒，具體地，其中所述抗原是乙 型肝炎表面抗原(HBsAg)。
【文檔編號(hào)】A61P31/22GK103957934SQ201280057103
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月20日
【發(fā)明者】N·M-J·加爾松-約翰遜, M·P·范梅切倫, M·普蘭特 申請(qǐng)人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司