提高腹水型單抗產(chǎn)量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高腹水型單抗產(chǎn)量的方法，該方法在注射弗氏不完全佐劑6-10天后再次注射1次弗氏不完全佐劑，然后按常規(guī)接種雜交瘤細(xì)胞，得到的腹水型單抗的產(chǎn)量為12-16ml，比現(xiàn)有技術(shù)的制備方法產(chǎn)量高50-100%，且方法簡(jiǎn)易實(shí)用，無(wú)需增加其他設(shè)備。
【專利說(shuō)明】提高腹水型單抗產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種提高腹水型單抗產(chǎn)量的方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]目前單克隆抗體的制備方法主要是:雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)成功后，進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)。具體的制備單克隆抗體的方法有:
[0003]1)體外培養(yǎng)法:首先將96孔培養(yǎng)板中的雜交瘤細(xì)胞稀釋后移植到24孔板中，經(jīng)培養(yǎng)后再擴(kuò)大到小瓶或平皿中；如果采用更大量的培養(yǎng)，可選用滾瓶培養(yǎng)，經(jīng)培養(yǎng)3-4天后，培養(yǎng)基中的免疫球蛋白可達(dá)10-100 μ g/mL。該方法的最大缺點(diǎn)是獲得的單克隆抗體量少。
[0004]2)皮下接種法:取1× 1O6-1O7個(gè)雜交瘤細(xì)胞，皮下接種同系雌性小鼠，10-12天左右小鼠皮下會(huì)出現(xiàn)腫瘤，在腫瘤出現(xiàn)后可采用多次采血來(lái)獲得單克隆抗體，血清中單克隆抗體含量可達(dá)1-lOmg/mL。由于采血量有限，所得單克隆抗體量仍較少。
[0005]3)腹腔接種法:先給正常同系小鼠腹腔注射0.5mL降植烷或弗氏不完全佐劑，一周后在經(jīng)腹腔注射約1×1O6個(gè)雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)一周后小鼠腹腔會(huì)產(chǎn)生大量腹水，抗體含量可高于lmg/mL。
[0006]目前腹水型單抗的制備過程一般是提前一周用弗氏不完全佐劑0.5ml注射小鼠腹腔；注射佐劑一周后將生長(zhǎng)旺盛的雜交瘤細(xì)胞離心棄去培養(yǎng)基，用PBS或不完全培養(yǎng)基重懸后注射小鼠腹腔，一般7天后就可以看到小鼠腹腔明顯腫大，此時(shí)可以處死小鼠采集腹水，也可以用注射器反復(fù)隔日抽采腹水。使用這種方法每只小鼠的產(chǎn)量一般只有6-8mL，產(chǎn)量相對(duì)較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]基于此，本發(fā)明的目的是提供一種提高腹水型單抗產(chǎn)量的方法。
[0008]具體的技術(shù)方案如下:
[0009]一種提高腹水型單抗產(chǎn)量的方法，包括如下步驟:
[0010](1)取8周齡±lBALB/c雌性小鼠，腹腔注入0.3-0.6mL弗氏不完全佐劑；
[0011](2)間隔6-10天后再次經(jīng)腹腔注入0.3-0.6mL弗氏不完全佐劑；
[0012](3) 6-10天后每只小鼠接種約1 × 1O6個(gè)雜交瘤細(xì)胞(約0.5ml雜交瘤細(xì)胞懸液)，接種后7-10天，觀察小鼠生存狀況，待小鼠腹部明顯膨大，收集腹水；
[0013](4)離心收集上清液，即得。
[0014]在其中一些實(shí)施例中，步驟(1)和步驟(2)中所述弗氏不完全佐劑的注射量為
0.35ml 。
[0015]在其中一些實(shí)施例中，步驟(2)中，間隔時(shí)間為7天。
[0016]在其中一些實(shí)施例中，步驟(3)中，每只小鼠收集的腹水產(chǎn)量為12_16mL。
[0017]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明分兩次注射不完全佐劑，與一次注射相比腹水形成的陽(yáng)性率及腹水的收獲量均明顯提高，在初次注射不完全佐劑的基礎(chǔ)上再次注射可加強(qiáng)初次致敏的效果，并且能夠促使雜交瘤細(xì)胞在腹腔中分散性生長(zhǎng)阻止雜交瘤細(xì)胞的附著性生長(zhǎng)從而抑制實(shí)體瘤的形成，從而有利于腹水型單抗的形成。
[0018]本發(fā)明提高腹水型單抗產(chǎn)量的方法簡(jiǎn)易實(shí)用，不需要增加額外的設(shè)備，使小鼠腹水產(chǎn)量明顯提升50-100% (由6-8ml提升至12_16ml )，而且成本不高。
【具體實(shí)施方式】
[0019]本發(fā)明實(shí)施例中所使用的雜交瘤細(xì)胞懸液:
[0020]按常規(guī)方法制備得到雜交瘤細(xì)胞懸液，分泌抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞復(fù)蘇過程如下:
[0021]⑴從液氮罐中取出凍存管，置于37°C水浴中，快速攪拌融化；
[0022]⑵將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至IOmL離心管中，加入適量RPM1-1640不完全培養(yǎng)液，1000r/min離心5min，棄培養(yǎng)液；
[0023]⑶輕彈擊離心管底，并加入適量完全培養(yǎng)液后移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37°C，5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；
[0024]⑷待細(xì)胞布滿培養(yǎng)瓶80%底面時(shí)，取細(xì)胞上清檢測(cè)抗體活性。
[0025]本發(fā)明實(shí)施例中所使用的弗氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma。
[0026]以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述。
[0027]實(shí)施例1
[0028]本實(shí)施例一種提高腹水型單抗產(chǎn)量的方法，包括如下步驟:
[0029](I)取8周齡BALB/c雌性小鼠，腹腔注入0.35mL弗氏不完全佐劑；
[0030](2)間隔7天后再次經(jīng)腹腔注入0.35mL弗氏不完全佐劑；
[0031](3) 7天后每只小鼠接種約IX IO6個(gè)雜交瘤細(xì)胞(約0.5ml雜交瘤細(xì)胞懸液)，接種后7-10天，觀察小鼠生存狀況，待小鼠腹部明顯膨大，收集腹水，每只小鼠腹水產(chǎn)量大于12mL ；
[0032](4)4°C，2000r/min離心10min，收集上清液，分裝于無(wú)菌EP管，保存于-20°C冰箱。即得。
[0033]實(shí)施例2
[0034]本實(shí)施例一種提高腹水型單抗產(chǎn)量的方法，包括如下步驟:
[0035](I)取8周齡BALB/c雌性小鼠，腹腔注入0.4mL弗氏不完全佐劑；
[0036](2)間隔6天后再次經(jīng)腹腔注入0.5mL弗氏不完全佐劑；
[0037](3) 6天后每只小鼠接種約IX IO6個(gè)雜交瘤細(xì)胞(約0.5ml雜交瘤細(xì)胞懸液)，接種后7-10天，觀察小鼠生存狀況，待小鼠腹部明顯膨大，收集腹水，每只小鼠腹水產(chǎn)量大于12mL ；
[0038](4)4°C，2000r/min離心10min，收集上清液，分裝于無(wú)菌EP管，保存于-20°C冰箱。即得。
[0039]實(shí)施例3
[0040]本實(shí)施例一種提高腹水型單抗產(chǎn)量的方法，包括如下步驟:
[0041](I)取8周齡BALB/c雌性小鼠，腹腔注入0.6mL弗氏不完全佐劑；
[0042](2)間隔10天后再次經(jīng)腹腔注入0.6mL弗氏不完全佐劑；[0043](3) 10天后每只小鼠接種約IX IO6個(gè)雜交瘤細(xì)胞(約0.5ml雜交瘤細(xì)胞懸液)，接種后7-10天，觀察小鼠生存狀況，待小鼠腹部明顯膨大，收集腹水，每只小鼠腹水產(chǎn)量大于12mL ；
[0044](4)4°C，2000r/min離心10min，收集上清液，分裝于無(wú)菌EP管，保存于-20°C冰箱。即得。
[0045]實(shí)施例4對(duì)比試驗(yàn)
[0046]本對(duì)比例一種腹水型單抗產(chǎn)量的方法，包括如下步驟:
[0047](1)取8周齡BALB/c雌性小鼠，腹腔注入0.5mL弗氏不完全佐劑；
[0048](2) 6天后每只小鼠接種約1X 1O6個(gè)雜交瘤細(xì)胞(約0.5ml雜交瘤細(xì)胞懸液)，接種后7-10天，觀察小鼠生存狀況，待小鼠腹部明顯膨大，收集腹水，每只小鼠腹水產(chǎn)量為6_8mL ；
[0049](3)4°C，2000r/min離心10min，收集上清液，分裝于無(wú)菌EP管，保存于-20°C冰箱。即得。
[0050]本實(shí)施例1-3所得腹水型單抗與實(shí)施例4所得腹水型單抗的性能比較如下:
[0051]
【權(quán)利要求】
1.一種提高腹水型單抗產(chǎn)量的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)取8周齡土I天BALB/c雌性小鼠，腹腔注入0.3-0.6mL弗氏不完全佐劑； (2)間隔6-10天后再次經(jīng)腹腔注入0.3-0.6mL弗氏不完全佐劑； (3)6-10天后每只小鼠接種約0.8X 1O6-L 2X 1O6個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種后7-10天，觀察小鼠生存狀況，待小鼠腹部明顯膨大，收集腹水； (4)離心收集上清液，即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高腹水型單抗產(chǎn)量的方法，其特征在于，步驟(1)和步驟(2)中所述弗氏不完全佐劑的注射量為0.35ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高腹水型單抗產(chǎn)量的方法，其特征在于，步驟(2)中，間隔時(shí)間為7天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高腹水型單抗產(chǎn)量的方法，其特征在于，步驟(3)中，每只小鼠收集的腹水產(chǎn)量為12-16mL。
【文檔編號(hào)】C07K16/00GK103897055SQ201210572740
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月25日
【發(fā)明者】萬(wàn)曉春, 呂衛(wèi)東, 于廣 申請(qǐng)人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院