化學(xué)修飾的胸腺肽α1及其合成方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種化學(xué)修飾的胸腺肽α1及其合成方法，其具有以下結(jié)構(gòu)：A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-IIe-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH或Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-IIe-Thr-Thr-Lys(A)-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH，所述A為與人血清白蛋白親和性結(jié)合的脂肪酸，或與人血清白游離巰基偶聯(lián)的馬來(lái)酰亞胺衍生物。本發(fā)明的化學(xué)修飾的胸腺肽α1修飾位點(diǎn)精確，化學(xué)結(jié)構(gòu)明確，合成方法工藝簡(jiǎn)練，經(jīng)化學(xué)修飾的胸腺肽α1在靜脈注射后立即特異性地與人體自身的血清白蛋白結(jié)合，將以人體自身的血清白蛋白作為緩釋載體，從而大大延長(zhǎng)其半衰期，顯著增加有效藥物濃度的持續(xù)時(shí)間，生物利用度高。
【專(zhuān)利說(shuō)明】化學(xué)修飾的胸腺肽Ct 1及其合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化學(xué)材料合成領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種化學(xué)修飾的胸腺肽α I及其合成方法。
【背景技術(shù)】
[0002]胸腺肽α I是化學(xué)合成的一種多肽藥物，生物活性比動(dòng)物提取胸腺肽更高。胸腺肽α I作為免疫增強(qiáng)劑被廣泛應(yīng)用于重度感染、肝炎以及腫瘤的免疫治療。
[0003]藥代動(dòng)力學(xué)研究表明:胸腺肽α I在人血漿中很快由蛋白酶和氨肽酶降解，半衰期約為1.65小時(shí)。目前在臨床使用的制劑是注射用胸腺肽α I凍干粉針，因而半衰期很短，極易在血漿中被酶降解而失去生物活性，生物利用度很低，臨床使用時(shí)需要多次反復(fù)和長(zhǎng)期注射等缺陷是目前胸腺肽αI產(chǎn)品的主要問(wèn)題。
[0004]目前主要采用微球制劑或聚乙二醇(PEG)化學(xué)修飾兩大技術(shù)方案延長(zhǎng)多肽藥物的半衰期:微球注射劑目前是多肽緩釋最成功的制劑技術(shù)之一，本技術(shù)以生物可降解聚合物如PLGA為骨架材料包裹多肽藥物，使其在體內(nèi)達(dá)到緩釋效果，近10年來(lái)取得了許多成功的先例，如法國(guó)IPSEN公司研發(fā)的曲普瑞林PLGA微球、日本武田制藥開(kāi)發(fā)的亮丙瑞林微球等。但是，微球制劑技術(shù)目前存在包封率低，突釋效應(yīng)明顯以及制劑工藝技術(shù)要求高，因此目前在國(guó)內(nèi)多肽藥物行業(yè)還難以推廣。
[0005]PEG修飾在化學(xué)修飾法延長(zhǎng)蛋白類(lèi)藥物取得了成功:如先靈葆雅公司的PEG化IFN a -2b、羅氏公司的PEG化IFN a -2a等。PEG修飾在化學(xué)修飾法的缺點(diǎn)是:由于PEG本身是聚合物，難以得到修飾位點(diǎn)精確、產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)唯一的產(chǎn)物。此外，PEG分子量大，修飾后藥物的生物活性大大下降。
[0006]近年來(lái)，以白蛋白的親和性小分子配體如肉豆蘧酸修飾蛋白和多肽藥物取得了極大的成功。諾和諾德(Novo Nordisk)公司的胰島素產(chǎn)品諾和平(Levemir)就是以白蛋白的親和性小分子配體肉豆蘧酸修飾的多肽藥物，其半衰期從原來(lái)的4-6分鐘延長(zhǎng)至5-7小時(shí)。此后，諾和諾德公司利用類(lèi)似的技術(shù)推出了肉豆蘧酸修飾的胰高血糖素(GLP-1)(商品名=Victoza)，將其半衰期從1.5-2分鐘延長(zhǎng)至11_15小時(shí)。然而，諾和諾德公司這兩種產(chǎn)品的工藝都是先用基因工程表達(dá)胰島素或胰高血糖素，而后通過(guò)肉豆蘧酸修飾得到最終產(chǎn)物。由于胰島素或胰高血糖素中存在多個(gè)氨基修飾位點(diǎn)，因此應(yīng)用本工藝難以得到修飾位點(diǎn)精確、產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)唯一的產(chǎn)物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]基于此，本發(fā)明提供了一種新的化學(xué)修飾的胸腺肽α I及其合成方法，化學(xué)修飾的胸腺肽α I修飾位點(diǎn)精確，化學(xué)結(jié)構(gòu)明確，在保持胸腺肽α I療效的基礎(chǔ)上，延長(zhǎng)胸腺肽α I的半衰期，提高胸腺肽α I的生物利用度。
[0008]一種化學(xué)修飾的胸腺肽α 1，具有以下結(jié)構(gòu):
[0009]A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-1Ie-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 或
[0010]Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-1Ie-Thr-Thr-Lys(A)-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH,
[0011]所述A為小分子配體，所述小分子配體為與人血清白蛋白親和性結(jié)合的脂肪酸，或與人血清白游離巰基偶聯(lián)的馬來(lái)酰亞胺衍生物。
[0012]在其中三個(gè)實(shí)施例中，所述脂肪酸為肉豆蔻酸，白蛋白上有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)能夠高親和性、高選擇性地與肉豆蔻酸相結(jié)合。所述化學(xué)修飾的胸腺肽α I的結(jié)構(gòu)為:
[0013]Myr-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-1Ie-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 或
[0014]Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-1Ie-Thr-Thr-Lys(Myr)-Asp-Leu_Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OHo
[0015]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述馬來(lái)酰亞胺衍生物為馬來(lái)酰亞胺的羧酸衍生物如丁酸、己酸或辛酸等。馬來(lái)酰亞胺能夠選擇性地與白蛋白游離巰基發(fā)生親核加成反應(yīng)。
[0016]本發(fā)明還提供了上述化學(xué)修飾的胸腺肽α I的合成方法，包括以下步驟:
[0017](I)以Fmoc保護(hù)的天冬酰胺王樹(shù)脂為起始原料,按照標(biāo)準(zhǔn)Fmoc策略合成Fmoc保護(hù)的載有胸腺肽αI的王樹(shù)脂；
[0018](2)以20%哌啶的DMF溶液(v/v)脫去末端氨基Fmoc保護(hù)基團(tuán)后，將小分子配體溶于二甲基甲酰胺，以HBTU和DIEA活化后與載有胸腺肽α I的王樹(shù)脂混合，縮合I小時(shí)后抽干，DMF洗滌，得到載有小分子配體修飾的胸腺肽α I的王樹(shù)脂；所述小分子配體與Fmoc保護(hù)的天冬酰胺王樹(shù)脂的摩爾比為2~6: I ；
[0019](3)用三氟乙酸切割王樹(shù)脂，得到小分子配體修飾的胸腺肽α I粗產(chǎn)物，純化、凍干得到純產(chǎn)物。
[0020]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述小分子配體與Fmoc保護(hù)的天冬酰胺王樹(shù)脂的摩爾比為 4:1。
[0021]或包括如下步驟:
[0022](1)以Fmoc 保護(hù)的天冬酰胺王樹(shù)脂和Fmoc-Lys (Dde) -OH為起始原料,按照標(biāo)準(zhǔn)Fmoc策略合成Fmoc保護(hù)的載有胸腺肽α I的王樹(shù)脂；隨后脫去末端氨基Fmoc保護(hù)基團(tuán)后，加入乙酸酐和DIEA，室溫反應(yīng)10-20分鐘得到乙?；叵匐摩?I的王樹(shù)脂；
[0023](2)用肼的體積百分含量為2-10%的DMF溶液脫去賴(lài)氨酸側(cè)鏈氨基Dde保護(hù)基團(tuán)后，將小分子配體溶于二甲基甲酰胺，以HBTU和DIEA活化后與乙?；叵匐摩?I的王樹(shù)脂混合，縮合I小時(shí)后抽干，DMF洗滌四次后，得到載有小分子配體修飾的乙酰化胸腺肽α I的王樹(shù)脂；所述小分子配體與Fmoc保護(hù)的天冬酰胺王樹(shù)脂的摩爾比為2~6:1 ;
[0024](3)用三氟乙酸切割王樹(shù)脂，得到小分子配體修飾的乙?；叵匐摩?I粗產(chǎn)物，純化、凍干得到純產(chǎn)物。
[0025]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述小分子配體與Fmoc保護(hù)的天冬酰胺王樹(shù)脂的摩爾比為 4:1。
[0026]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述DMF溶液中肼的體積百分含量為2%。
[0027]或包括如下步驟:
[0028](1)將小分子配體偶聯(lián)到Fmoc-Lys-OH上得到Fmoc-Lys (A)-0Η,其中A為小分子配體；所述小分子配體與Fmoc-Lys-OH的摩爾用量比為I~3:1 ；
[0029](2)以Fmoc保護(hù)的天冬酰胺王樹(shù)脂和Fmoc-Lys (A) -OH為起始原料，按照標(biāo)準(zhǔn)Fmoc策略合成的Fmoc保護(hù)的載有小分子配體修飾的胸腺肽α I的王樹(shù)脂；隨后脫去末端氨基Fmoc保護(hù)基團(tuán)后，加入乙酸酐和DIEA，室溫反應(yīng)10-20分鐘得到載有小分子配體修飾的乙?；叵匐摩罥的王樹(shù)脂；
[0030](3)用三氟乙酸切割王樹(shù)脂，得到小分子配體修飾的乙?；叵匐摩?I粗產(chǎn)物，純化、凍干得到純產(chǎn)物。
[0031]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(1)中所述小分子配體與Fmoc-Lys-OH的摩爾用量比為 1:1。
[0032]在其中一個(gè)實(shí)施例中，上述制備方法中三氟乙酸的用量為lml/lOOmgFmoc保護(hù)的天冬酰胺王樹(shù)脂。
[0033] 本發(fā)明根據(jù)人血清白蛋白的結(jié)構(gòu)特征及其與小分子親和性配體的結(jié)合方式，選擇和優(yōu)化高特異性、高親和力的小分子配體定點(diǎn)修飾胸腺肽α I，小分子配體包括人血清白蛋白親和性結(jié)合的脂肪酸如肉豆蘧酸等，以及能夠特異性地與人血清白游離巰基偶聯(lián)的馬來(lái)酰亞胺(maleimido)衍生物如馬來(lái)酰亞胺基己酸等。由于人血清白蛋白能夠特異性結(jié)合小分子配體，因此，小分子配體偶聯(lián)的藥物分子進(jìn)入血液后快速與白蛋白結(jié)合，而人血清白蛋白的半衰期長(zhǎng)達(dá)19天，因此配體偶聯(lián)的胸腺肽α I在靜脈注射后立即特異性地與人體自身的血清白蛋白結(jié)合，將以人體自身的血清白蛋白作為緩釋載體，從而大大延長(zhǎng)其半衰期，顯著增加有效藥物濃度的持續(xù)時(shí)間，生物利用度高，克服了臨床使用時(shí)需要多次反復(fù)和長(zhǎng)期注射等缺陷，為研發(fā)新一代長(zhǎng)效胸腺肽α I提供了新工藝。
[0034]本發(fā)明通過(guò)改進(jìn)的化學(xué)全合成胸腺肽α I工藝，可以利用特殊的保護(hù)基團(tuán)選擇性地保護(hù)所要修飾的氨基酸位點(diǎn)，從而得到修飾位點(diǎn)精確，化學(xué)結(jié)構(gòu)唯一的產(chǎn)物。本發(fā)明胸腺肽α I的合成也可直接將小分子配體修飾賴(lài)氨酸的側(cè)鏈氨基，然后用固相多肽合成法將配體修飾的賴(lài)氨酸整合到胸腺肽α I中，得到化學(xué)修飾的胸腺肽α I產(chǎn)物。
[0035]采用本發(fā)明的化學(xué)修飾的胸腺肽α I的合成方法工藝簡(jiǎn)練，可在現(xiàn)有固相多肽合成法的基礎(chǔ)上直接應(yīng)用，也可用于液相多肽合成法合成的胸腺肽α 1，所得產(chǎn)物的修飾位點(diǎn)精確，化學(xué)結(jié)構(gòu)清楚，完全符合國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)關(guān)于化學(xué)合成多肽類(lèi)新藥的要求。
【具體實(shí)施方式】
[0036]以下結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
[0037]Fmoc-Asn (Trt) -Wang Resin樹(shù)脂購(gòu)自天津南開(kāi)和成科技有限公司，各種保護(hù)的氨基酸原料、肽鍵縮合劑(HBTU、DIEA)以及三氟乙酸均購(gòu)自吉爾生化(上海)有限公司。
[0038]實(shí)施例1化學(xué)修飾的胸腺肽α I的合成方法
[0039]包括以下步驟:
[0040](1)稱(chēng)量200毫克Fmoc保護(hù)的天冬酰胺王樹(shù)脂(Fmoc-Asn(Trt)-WangResin0.12mmol/g)于手動(dòng)固相多肽合成器中，加入DCM( 二氯甲烷)溶脹30分鐘。依次以Fmoc-保護(hù)的氨基酸原料，以苯并三氮唑-N，N, N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)為多肽縮合劑，樹(shù)脂與每種保護(hù)氨基酸以及多肽縮合劑的當(dāng)量比為酪氨酸王樹(shù)脂:氨基酸:HBTU: DIEA=I: 3: 3: 6，按照標(biāo)準(zhǔn)Fmoc策略合成Fmoc保護(hù)的載有胸腺肽α I的王樹(shù)脂(化合物I)。
[0041](2)以2毫升哌啶脫保護(hù)劑(哌啶:DMF = 20: 80 (v/v))脫去末端氨基Fmoc保護(hù)基團(tuán)后，將46毫克肉豆蘧酸(0.2mmol)溶于2毫升二甲基甲酰胺(DMF)，以HBTU和DIEA活化后與載有胸腺肽α I的王樹(shù)脂混合，樹(shù)脂與肉豆蘧酸以及多肽縮合劑的當(dāng)量比為天冬酰胺王樹(shù)脂:肉豆蘧酸:HBTU: DIEA =1:4:4: 8，室溫縮合I小時(shí)后抽干，DMF洗滌四次后，得到載有肉豆蘧酸修飾的胸腺肽αI的王樹(shù)脂；
[0042](3)用三氟乙酸(TFA，2毫升)室溫切割2小時(shí)得到肉豆蘧酸修飾的胸腺肽α I粗產(chǎn)物，經(jīng)高效液相色譜純化后凍干得到純產(chǎn)物肉豆蘧酸修飾的的胸腺肽α I—化合物2(收率 12% )。
[0043]該實(shí)施例的化學(xué)修飾的胸腺肽α I的合成反應(yīng)方程式如下:
[0044]
【權(quán)利要求】
1.一種化學(xué)修飾的胸腺肽α 1，其特征在于，其具有以下結(jié)構(gòu):
A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-1le-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 或
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-1Ie-Thr-Thr-Lys(A)-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH, 所述A為小分子配體，所述小分子配體為與人血清白蛋白親和性結(jié)合的脂肪酸，或與人血清白游離巰基偶聯(lián)的馬來(lái)酰亞胺衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)修飾的胸腺肽α?，其特征在于，所述脂肪酸為肉豆蔻酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)修飾的胸腺肽α1，其特征在于，所述馬來(lái)酰亞胺衍生物為馬來(lái)酰亞胺丁酸、馬來(lái)酰亞胺己酸或馬來(lái)酰亞胺辛酸。
4.一種權(quán)利要求1所述的化學(xué)修飾的胸腺肽α I的合成方法，其特征在于， 包括以下步驟: (1)以Fmoc保護(hù)的天冬酰胺王樹(shù)脂為起始原料,按照標(biāo)準(zhǔn)Fmoc策略合成Fmoc保護(hù)的載有胸腺肽αI的王樹(shù)脂； (2)脫去末端氨基Fmoc保護(hù)基團(tuán)后，將小分子配體溶于二甲基甲酰胺，以HBTU和DIEA活化后與載有胸腺肽α I的王樹(shù)脂混合，縮合后抽干，DMF洗滌，得到載有小分子配體修飾的胸腺肽α I的王樹(shù)脂；所述小分子配體與Fmoc保護(hù)的天冬酰胺王樹(shù)脂的摩爾比為2~6:1; (3)用三氟乙酸切割王樹(shù)脂，得到小分子配體修飾的胸腺肽αI粗產(chǎn)物，純化、凍干得到純產(chǎn)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的化學(xué)修飾的胸腺肽αI的合成方法，其特征在于，步驟(2)中所述小分子配體與Fmoc保護(hù)的天冬酰胺王樹(shù)脂的摩爾比為4: I。
6.一種權(quán)利要求1所述的化學(xué)修飾的胸腺肽α I的合成方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)以Fmoc保護(hù)的天冬酰胺王樹(shù)脂和Fmoc-Lys(Dde) -OH為起始原料,按照標(biāo)準(zhǔn)Fmoc策略合成Fmoc保護(hù)的載有胸腺肽α I的王樹(shù)脂；隨后脫去末端氨基Fmoc保護(hù)基團(tuán)后，加入乙酸酐和DIEA，室溫反應(yīng)10-20分鐘得到乙酰化胸腺肽α I的王樹(shù)脂； (2)用肼的體積百分含量為2-10%的DMF溶液脫去賴(lài)氨酸側(cè)鏈氨基Dde保護(hù)基團(tuán)后，將小分子配體溶于二甲基甲酰胺，以HBTU和DIEA活化后與乙?；叵匐摩?I的王樹(shù)脂混合，縮合I小時(shí)后抽干，DMF洗滌四次后，得到載有小分子配體修飾的乙?；叵匐摩?I的王樹(shù)脂；所述小分子配體與Fmoc保護(hù)的天冬酰胺王樹(shù)脂的摩爾比為2~6:1 ; (3)用三氟乙酸切割王樹(shù)脂，得到小分子配體修飾的乙酰化胸腺肽αI粗產(chǎn)物，純化、凍干得到純產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的化學(xué)修飾的胸腺肽αI的合成方法，其特征在于，步驟(2)中所述小分子配體與Fmoc保護(hù)的天冬酰胺王樹(shù)脂的摩爾比為4: I。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的 化學(xué)修飾的胸腺肽αI的合成方法，其特征在于，步驟(2)中所述DMF溶液中肼的體積百分含量為2%。
9.一種權(quán)利要求1所述的化學(xué)修飾的胸腺肽α I的合成方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將小分子配體偶聯(lián)到Fmoc-Lys-OH上得到Fmoc-Lys(A) -OH,其中A為小分子配體；所述小分子配體與Fmoc-Lys-OH的摩爾用量比為I~3:1 ； (2)以Fmoc保護(hù)的天冬酰胺王樹(shù)脂和Fmoc-Lys(A)-OH為起始原料，按照標(biāo)準(zhǔn)Fmoc策略合成的Fmoc保護(hù)的載有小分子配體修飾的胸腺肽α I的王樹(shù)脂；隨后脫去末端氨基Fmoc保護(hù)基團(tuán)后，加入乙酸酐和DIEA，室溫反應(yīng)10-20分鐘得到載有小分子配體修飾的乙?；叵匐摩罥的王樹(shù)脂； (3)用三氟乙酸切割王樹(shù)脂，得到小分子配體修飾的乙?；叵匐摩罥粗產(chǎn)物，純化、凍干得到純產(chǎn)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的化學(xué)修飾的胸腺肽α I的合成方法，其特征在于，步驟(1)中所述小分子配體與 Fmoc-Lys-OH的摩爾用量比為1:1。
【文檔編號(hào)】C07K1/06GK103897053SQ201210572736
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月25日
【發(fā)明者】粟武 申請(qǐng)人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院