專利名稱：胸腺體液因子THF-γ2及其衍生物，其合成方法及其在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胸腺體液因子THF-Y 2的衍生物，具體講，涉及該胸腺體液因子THF- Y 2的衍生物的合成、純化方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胸腺是免疫系統(tǒng)中重要的中樞免疫器官，負(fù)責(zé)T細(xì)胞的分化和成熟。其功能的正常與否和直接影響著機(jī)體的健康狀態(tài)。人類在胚胎期間，胸腺是第一個(gè)出現(xiàn)的淋巴器官。嬰兒初生時(shí)期胸腺約重10 15克，是一生中胸腺相對(duì)重量最大的時(shí)期。隨著年齡的增長(zhǎng)，胸腺逐步成熟，至青春期成長(zhǎng)為30 40克，此后，胸腺重量隨年齡老化而逐漸減退。到老年時(shí)，胸腺僅重15克左右。胸腺的免疫功能在抗感染、抗腫瘤和自身免疫性疾病中起著重要作用。所以，研究胸腺，尤其是它所分泌的胸腺素對(duì)了解某些疾病的發(fā)病機(jī)理及其治療極為 重要。胸腺(Thymus) —詞來(lái)源于古希臘的Herb和Heart。因此,人們將胸腺看作是機(jī)體健康的“心臟”。1901年Laquer等報(bào)告了一名重癥肌無(wú)力患者伴有胸腺腫瘤。1911年Sauerbruch給患有重癥肌無(wú)力的病人做了首例胸腺切除術(shù)。自1936年開始,Blalock接連做了幾十例胸腺切除術(shù)，成功地治愈了大部分患有重癥肌無(wú)力的病人。雖然如此，由于那時(shí)人們尚不了解胸腺的功能，仍將它看作是一個(gè)多余的器官。此后，越來(lái)越多的科學(xué)家和醫(yī)生投入到胸腺的研究領(lǐng)域中來(lái)，但大都集中于研究胸腺形態(tài)學(xué)，直到1966年Goldstein等報(bào)告了從小牛胸腺中提純出具有生物活性的物質(zhì)，并命名為胸腺素(Thymosin)，引起免疫學(xué)家及科學(xué)家的極大興趣，對(duì)胸腺深入的研究才廣泛開始?，F(xiàn)已認(rèn)識(shí)到胸腺對(duì)于淋巴系統(tǒng)的發(fā)育和維持免疫系統(tǒng)的平衡起著重要作用，它在抗腫瘤免疫，移植免疫及抗微生物感染等作用中地位十分重要。最近的研究顯示，胸腺及胸腺因子通過(guò)表達(dá)高密度的T細(xì)胞受體而促進(jìn)T細(xì)胞的增殖。胸腺與中樞神經(jīng)系統(tǒng)也存在相互調(diào)節(jié)作用，其機(jī)理是目前研究的熱點(diǎn)之一 O如今我們所熟知的胸腺因子主要有以下幾類胸腺肽、胸腺素、胸腺噴丁、胸腺刺激素和胸腺體液因子等。THF為從胸腺組織中得到的一種粗制品，具有免疫學(xué)活性。在T淋巴細(xì)胞亞群的分化、成熟，⑶4+/⑶8+正常比率的維持及在加強(qiáng)脾細(xì)胞對(duì)有絲分裂原PHA、ConA的反應(yīng)、對(duì)切除胸腺的新塵小鼠的移植排斥反應(yīng)的恢復(fù)等方面起重要作用。同時(shí)，THF還可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和TNFa。Burstein等從THF中純化得到了活性組分，命名為THF- Y 2，它含有8個(gè)氨基酸，其氨基酸序列為 NH2-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu。胸腺體液因子的粗品(THF)是從胸腺組織中提取得到的混合物，先后通過(guò)離心、勻漿并在中性PH狀態(tài)下透析等步驟，最終將分子量控制在IOkDa左右。低分子量的透析液被命名為CT0(calf thymus outer fraction)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，切除胸腺的小鼠給予CTO后能夠減輕其消瘦程度，還能夠促使其恢復(fù)正常體重。另有實(shí)驗(yàn)證明，CTO還能在一定程度上通過(guò)修復(fù)脾細(xì)胞的免疫能力，使異源性皮膚或腫瘤移植的排斥反應(yīng)增強(qiáng)，并且在T細(xì)胞對(duì)綿陽(yáng)紅細(xì)胞的反應(yīng)中也能起到輔助作用。Burstein等人又對(duì)CTO進(jìn)行了一系列步驟的純化，他們首先使用凝膠層析方法進(jìn)行分離，材料為SephadexG-IO和G_25,隨后使用DEAE-Sephadex離子交換色譜在pH 8. O條件下進(jìn)行氯化鈉梯度洗脫，整個(gè)過(guò)程都通過(guò)一系列的活性實(shí)驗(yàn)對(duì)收集到的各成分進(jìn)行活性測(cè)定，得到了活性成分命名為THF-1。該活性成分又經(jīng)由一系列反向色譜的分離步驟，得到了七個(gè)中間產(chǎn)物，依次命名為THF-2至THF-8。制備獲得的這些中間產(chǎn)物注射到NTx小鼠體內(nèi)能夠恢復(fù)其脾細(xì)胞IL-2的活性，在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)它們能夠在ConA刺激下增強(qiáng)健康小鼠脾細(xì)胞IL-2的產(chǎn)量。在分離出THF- Y 2的最終階段，一共得到了九個(gè)主要組分，分別命名為 THF-α ,THF-β、THF-Y 2、THF-Y 3、THF-Y 4、THF-Y 5、THF-8、THF- ε 和 THF-Φ。然而在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，只有THF-Y 2在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出活性。經(jīng)測(cè)定，THF- Y 2是一個(gè)八肽，分子量為918Da,其氨基酸序列為NH2/Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe_Leu。這一序列和其它發(fā)表的胸腺因子沒有同源性。 一、THF- Y 2具有免疫促進(jìn)活性。純品THF-Y 2在體外實(shí)驗(yàn)中能夠提高低IL-2產(chǎn)量的小鼠脾細(xì)胞株的IL-Y 2產(chǎn)量，在NTx小鼠的體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)中，THF-Y 2能夠恢復(fù)小鼠的脾細(xì)胞IL-2產(chǎn)量。對(duì)老年免疫低下小鼠使用THF- Y 2治療后，小鼠胸腺T細(xì)胞對(duì)絲裂原的響應(yīng)增強(qiáng)，脾細(xì)胞的輔助細(xì)胞活性增加。研究證明，THF-Y2治療的效果要優(yōu)于胸腺素。在集落刺激因子不足的情況下，將THF- Y 2和普通小鼠的骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)，THF- Y 2能夠使骨髓細(xì)胞數(shù)量增加。一項(xiàng)研究顯示，THF- Y 2與人臍帶血淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)，THF- Y 2能夠增加細(xì)胞⑶4和⑶8分子的表達(dá)，在PHA不能充分刺激的條件下THF- Y 2還能增加IL-2的表達(dá)。在rGM或rEpo分別存在時(shí)，THF- Y 2可以促進(jìn)骨髓，外周髓和紅細(xì)胞祖細(xì)胞克隆的增加?；加新砸腋蔚幕颊叩牧馨图?xì)胞功能會(huì)表現(xiàn)出異常，THF- Y 2能夠提高這些患者的IL-2和TNF- α的產(chǎn)量，但是IFN-Y 2的產(chǎn)量不受影響。因此，胸腺體液因子THF-Y 2能夠調(diào)節(jié)骨髓中定向干細(xì)胞的功能，還能夠重建和活化T細(xì)胞的各項(xiàng)功能。二、THF- Y 2的抗腫瘤活性早期的研究結(jié)果顯示，當(dāng)THF與小鼠脾細(xì)胞和Lewis肺癌細(xì)胞混合培養(yǎng)時(shí)，THF能夠顯著提高T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。有研究用荷瘤小鼠來(lái)評(píng)價(jià)THF-Y 2的免疫治療作用，分別使用了四種不同的瘤種，兩種為漿細(xì)胞瘤(M0PC-15和RPC-5)，另外兩種為鼠源Lewis肺癌和B16黑素瘤。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中THF-Y 2治療與化療同時(shí)進(jìn)行。Ben-Efraim及其同事發(fā)現(xiàn)，若僅用5-氟尿嘧啶治療M0PC-315腫瘤只能暫時(shí)使腫瘤消退，并不能提升抗腫瘤應(yīng)答。而用THF- Y 2和5-氟尿嘧啶同時(shí)使用時(shí)則能延長(zhǎng)M0PC-315荷瘤小鼠的存活時(shí)間，使CD4+數(shù)量恢復(fù)到正常水平，可以增強(qiáng)脾細(xì)胞體外對(duì)SRBC的抗體應(yīng)答。但是對(duì)于M0PC-315腫瘤的荷瘤小鼠單獨(dú)使用THF- Y 2治療沒有上述效果。接受美法蘭治療的M0PC-315荷瘤小鼠具備抗腫瘤反應(yīng)，但是仍然表現(xiàn)為免疫缺陷。用THF- Y 2繼續(xù)治療這些小鼠能夠改善其免疫缺陷的狀態(tài)，提升細(xì)胞的和體液的應(yīng)答。Ophir和其同事發(fā)現(xiàn)，用免疫接種法和THF- Y 2共同治療RPC-5荷瘤小鼠后，小鼠脾細(xì)胞對(duì)RPC-5腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用增加，并且可以增強(qiáng)小鼠脾細(xì)胞對(duì)抗RPC-5腫瘤的能力。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出與單獨(dú)使用化療相比，在治療中添加THF-Y 2后在阻止腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移方面效果更優(yōu)；使用THF- Y 2對(duì)于化療后免疫活性的恢復(fù)能起到很好的作用。三、THF- Y 2抗感染活性由于一般的病毒感染都伴隨著免疫系統(tǒng)的損傷，因此也有人做了實(shí)驗(yàn)來(lái)探討THF-Y 2是否能在病毒感染的狀態(tài)下提升胸腺的功能，增強(qiáng)機(jī)體抵御病毒感染的能力。該項(xiàng)研究的第一個(gè)實(shí)驗(yàn)是THF對(duì)Sendai病毒感染小鼠的抗病毒效果實(shí)驗(yàn)。鼻腔內(nèi)感染Sendai病毒后,小鼠會(huì)出現(xiàn)體重降低，胸腺退化，肺炎，抗體響應(yīng)低等癥狀。使用THF治療感染小鼠后，小鼠體重增加，小鼠肺炎感染率降低，抗Sendai病毒抗體滴度升高。之后，研究人員又對(duì)感染鼠源巨細(xì)胞病毒(MCMV)的小鼠進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)。BALB/c小鼠感染了MCMV后會(huì)表現(xiàn)出T細(xì)胞免疫損傷，使用THF后這一現(xiàn)象得以緩解。但是THF對(duì)于感染病毒 后小鼠干擾素合成和NK細(xì)胞毒作用無(wú)影響?；赥HF得出的結(jié)果，研究人員又進(jìn)一步對(duì)THF- Y 2進(jìn)行了類似的活性測(cè)定。成年BALB/c小鼠注射環(huán)磷酰胺后對(duì)MCMV易感，注射環(huán)磷酰胺后使這些小鼠感染MCMV。感染后的小鼠接受同基因型供體小鼠的脾細(xì)胞被動(dòng)免疫治療。供體小鼠均受過(guò)病毒感染并且每天注射THF- Y 2治療。受體小鼠接受THF- Y 2免疫治療后的供體小鼠的脾細(xì)胞被動(dòng)轉(zhuǎn)移治療后，近93%都未出現(xiàn)不治之癥，接受THF-Y 2治療的供體小鼠脾細(xì)胞治療，未出現(xiàn)不治之癥的比率僅為38%。THF- Y 2能夠使小鼠因MCMV感染而產(chǎn)生的T細(xì)胞⑶4+及⑶8+亞群降低得到恢復(fù)，還能夠提高IL-2的分泌產(chǎn)量。特異性地去除⑶4+或⑶8+亞群的數(shù)量會(huì)削弱THF- Y 2免疫的脾細(xì)胞的效能，這就進(jìn)一步證明了 THF- Y 2的保護(hù)作用和其對(duì)⑶4’或⑶8+水平的調(diào)節(jié)作用之間的關(guān)系。THF- Y 2治療MCMV的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，THF- Y 2能夠通過(guò)提升T細(xì)胞功能提升機(jī)體的抗病毒反應(yīng)性。多肽合成是一個(gè)重復(fù)添加氨基酸的過(guò)程，一般從C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。自從1963年Merrifield成功創(chuàng)立了固相多肽合成方法以來(lái),經(jīng)過(guò)不斷的改進(jìn)和完善，固相法已成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個(gè)常用技術(shù)，表現(xiàn)出了經(jīng)典液相合成無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。其基本原理是先將所要合成肽鏈的羥基末端氨基酸的羥基以共價(jià)鍵的結(jié)構(gòu)同一個(gè)不溶性的高分子樹脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經(jīng)過(guò)脫去氨基保護(hù)基并同過(guò)量的活化羧基組分反應(yīng)，接長(zhǎng)肽鏈。本發(fā)明設(shè)計(jì)并合成了 THF-Y 2的一系列衍生物，通過(guò)藥效試驗(yàn)篩選，篩選出一種藥效學(xué)活性極高的衍生物。下面對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行說(shuō)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提供胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z。本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提供這種胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z的制備方法。本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提供這種胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z的用途。為了完成本發(fā)明的第一發(fā)明目的，采用的技術(shù)方案為本發(fā)明提供一種胸腺體液因子THF- Y 2衍生物Z，該胸腺體液因子THF- Y 2的衍生物Z具有如SEQ ID NO 1所不的氣基酸序列。SEQ ID NO : I 所不的氨基酸序列為 Leu-Glu-Asp-Ala-Pro-Lys-Phe-Leu。本發(fā)明提供一種胸腺體液因子THF- Y 2，具有如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。SEQ ID NO 2 所不的氨基酸序列為 Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu。為了完成本發(fā)明的第二發(fā)明目的，采用的技術(shù)方案為本發(fā)的胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物是用化學(xué)合成方法進(jìn)行制備，而后進(jìn)行分離純化后得到。本發(fā)明該技術(shù)方案的第一優(yōu)選技術(shù)方案為所述的化學(xué)合成方法中米用Fmoc-氨基酸-樹脂，氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基采用叔丁基，反應(yīng)過(guò)程中采用茚三酮監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。
本發(fā)明該技術(shù)方案的第二優(yōu)選技術(shù)方案為所述的化學(xué)合成方法的制備方法包括以下步驟(I) Fmoc-氨基酸-樹脂的洗滌稱量Fmoc-氨基酸-樹脂，用氮?dú)獯蹬莼靹?，加入二甲基甲酰?DMF)，室溫浸泡20 45分鐘后抽濾，同法重復(fù)I 2次；(2)Fmoc的脫除將步驟(I)中的樹脂加入含有30%無(wú)水哌啶(PIP)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液，活化反應(yīng)2 10分鐘，抽濾，同法重復(fù)一次；抽干后用DMF洗漆；(3)縮合反應(yīng)將步驟⑵中抽干的樹脂加入Fmoc-氨基酸-0H、HBTU，以及N，N_二異丙基乙胺(DIPEA)或N-甲基嗎啉(NMM)溶液中的一種，室溫縮合反應(yīng)30 60分鐘，氮?dú)獯蹬荩闉V，DMF洗滌；(4)Fmoc的脫除經(jīng)檢測(cè)為反應(yīng)為陽(yáng)性，將步驟(3)中得到的樹脂加入含有質(zhì)量百分比為30%無(wú)水哌啶(PIP)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液反應(yīng)I 5分鐘，抽濾，再以同樣的方法處理I 2次，抽干后用DMF洗滌；(5)按照氨基酸序列的順序重復(fù)步驟(2) (4)，直至氨基酸合成完畢，最后一步重復(fù)步驟⑵；(6)洗滌，干燥；(7)將步驟(6)得到的樹脂加入酸解液中，充氮?dú)?，封口，室溫?cái)嚢?0分鐘 I小時(shí)；將樹脂酸解液抽濾，收集濾液，用TFA洗滌2 3次，抽濾，合并濾液；(8)將濾液轉(zhuǎn)移至另一容器，氮?dú)獯等FA，逐滴加入冷乙醚沉淀多肽，收集沉淀的多肽，放入砂板布氏漏斗，用乙醚或者離心法洗滌，吹干，-20 V保存。本發(fā)明該技術(shù)方案的第三優(yōu)選技術(shù)方案為在步驟(I)中浸泡的時(shí)間為20 40分鐘，優(yōu)選30分鐘。本發(fā)明該技術(shù)方案的第四優(yōu)選技術(shù)方案為在步驟(2)中活化的時(shí)間為5 10分鐘，優(yōu)選5分鐘。本發(fā)明該技術(shù)方案的第五優(yōu)選技術(shù)方案為在步驟(3)中所述Fmoc-氨基酸-OH和HBTU的重量為步驟(2)中抽干后樹脂重量的4 6倍；DIPEA或NMM溶液的重量為氨基酸量的I. 5 2. 5 ;縮合反應(yīng)的時(shí)間為45 60分鐘，優(yōu)選60分鐘；本發(fā)明該技術(shù)方案的第六優(yōu)選技術(shù)方案為在步驟(7)中的酸解液為體積比的TFA TIS :水=90 95 2. 5 5 2. 5 5，優(yōu)選體積比為95 2. 5 2. 5的混合溶液。本發(fā)明該技術(shù)方案的第七優(yōu)選技術(shù)方案為所合成的多肽的純化方法為采用中低壓液相色譜，流動(dòng)相A 0. I % TFA水溶液；B :用A相配成的80% ACN溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)214nm ;流速ZmLmirT1 ;進(jìn)樣100 μ I ;梯度洗脫15 40% B 5個(gè)柱體積。本發(fā)明制備的胸腺體液因子THF- Y 2衍生物Z通過(guò)Edman化學(xué)降解法，證實(shí)其氨基酸序列為L(zhǎng)eu-Glu-Asp-Ala-Pro-Lys-Phe-Leu。本發(fā)明制備的胸腺體液因子THF- Y 2通過(guò)Edman化學(xué)降解法,證實(shí)其氨基酸序列為L(zhǎng)eu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu。本發(fā)明還涉及胸腺體液因子THF- Y 2及其 衍生物在制備抗腫瘤藥物、腫瘤物理治療及化學(xué)治療藥物、抗輻射藥物中的應(yīng)用。下面對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容做進(jìn)一步的說(shuō)明本發(fā)明設(shè)計(jì)并合成了胸腺體液因子THF-Y 2的一系列衍生物，通過(guò)藥效試驗(yàn)篩選，篩選出一種藥效學(xué)活性極高的衍生物Z。該衍生物的制備方法包括如下步驟(I)Fmoc-AA-樹脂的洗漆稱量O. Immol Fmoc-AA-樹脂,用氮?dú)獯蹬莼靹?，加入ImL DMF，室溫浸泡30分鐘，抽濾，同法重復(fù)I次；(2) Fmoc的脫除將步驟(I)中的樹脂加入30 % PIP/DMF溶液lmL，活化反應(yīng)5分鐘，抽濾，同法重復(fù)一次，抽干后用DMF洗滌5次，每次lmin，反應(yīng)及洗滌過(guò)程均伴隨氮?dú)獯蹬輸嚢瑁?3)縮合將上述抽干的樹脂加入4倍于樹脂取代量的Fmoc-AA-OH和HBTU，及I. 5倍于氨基酸量的DIPEA或NMM溶液，室溫縮合反應(yīng)30 60分鐘，氮?dú)獯蹬?，抽濾，ImL DMF洗漆5次，每次Imin ；(4)檢測(cè)取少量樹脂進(jìn)行茚三酮檢測(cè)。若樹脂顯藍(lán)色，表示縮合反應(yīng)未進(jìn)行完全，需延長(zhǎng)時(shí)間，或者重新加入活化的保護(hù)氨基酸進(jìn)行反應(yīng)；若樹脂為淺黃色或無(wú)色，表示反應(yīng)完全，可洗滌并進(jìn)行下一步反應(yīng)；(5) Fmoc的脫除經(jīng)檢測(cè)為反應(yīng)為陽(yáng)性，將上述樹脂加入30% PIP/DMF溶液ImL反應(yīng)5分鐘，抽濾，再以同樣的方法處理I次，抽干后用DMF洗滌5次，每次2分鐘；反應(yīng)及洗滌過(guò)程均用氮?dú)鈹嚢瑁?6)按照氨基酸序列的順序重復(fù)步驟(2) (4)，直至氨基酸合成完畢，最后一步重復(fù)步驟⑵；(6)洗滌，干燥；(7)將步驟(6)得到的樹脂加入體積比為TFA TIS :水=95 2. 5 2. 5的酸解液中，充氮?dú)?，封口，室溫磁力攪拌I小時(shí)；將樹脂酸解液抽濾，收集濾液，用TFA洗滌2 3次,抽濾,合并濾液；(8)將濾液轉(zhuǎn)移至另一容器，氮?dú)獯等FA，逐滴加入冷乙醚沉淀多肽，收集沉淀的多肽，放入砂板布氏漏斗，用乙醚或者離心法洗滌，吹干，-20 V保存。本發(fā)明制備的胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，具有很強(qiáng)的生理活性，并且具有較小的副作用。經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明的胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z具有可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖活性，并具有顯著的抑瘤作用及抗輻射作用，可用于制備抗腫瘤藥物、腫瘤物理治療及化學(xué)治療藥物、抗輻射藥物。從T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出，胸腺體液因子THF-Y 2促T淋巴細(xì)胞增殖活性很明顯，劑量為5 μ g · ml/1時(shí)刺激指數(shù)達(dá)到最高值，胸腺體液因子THF- Y 2衍生物Z顯示出明確的促使T淋巴細(xì)胞增殖活性。從未添加ConA組的數(shù)據(jù)中可以看出，胸腺體液因子THF- Y 2及衍生物Z在無(wú)ConA刺激下對(duì)脾淋巴細(xì)胞仍有增殖作用，但這一作用在ConA刺激下表現(xiàn)得更強(qiáng)。從結(jié)構(gòu)上分析，胸腺體液因子THF- Y 2衍生物Z與THF- Y 2的不同點(diǎn)則是將THF- Y 2 中的 Gly 換成了 Ala。T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，如果使用健康小鼠的脾臟進(jìn)行此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物的結(jié)果均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即使調(diào)整劑量，也沒有得到具有顯著性差異的結(jié)果。而使用免疫力低下的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到的活性結(jié)果則是很明顯的。本實(shí)驗(yàn)推斷，胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物對(duì)于健康機(jī)體免疫力的提高作用不明顯，而對(duì)于先天免疫缺陷或免疫損傷機(jī)體的免疫力恢復(fù)作用顯著。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映出胸腺體液因子THF-Y 2及衍生物Z均具有較顯著的抑瘤作用。胸腺體液因子THF- Y 2在對(duì)H22肝癌實(shí)體瘤抑瘤實(shí)驗(yàn)中，劑量為O. 25mg · Kg—1時(shí)顯示出最強(qiáng)的抑瘤作用，抑瘤率達(dá)到47. 2 %，在此劑量上下浮動(dòng)的抑瘤作用都有所下降。陽(yáng)性對(duì) 照組使用環(huán)磷酰胺，該藥物對(duì)于該腫瘤的抑制作用非常明顯，抑瘤率高達(dá)91. 7%，但是在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，使用環(huán)磷酰胺后小鼠精神狀態(tài)欠佳，其中一些出現(xiàn)厭食、消瘦等跡象，個(gè)別甚至出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。在解剖時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行稱重，該重量減去瘤重作為小鼠解剖前的凈重，從以上相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，接受胸腺體液因子THF-Y 2治療的各組以及空白對(duì)照組的小鼠體重均與陽(yáng)性對(duì)照組有顯著性差異，各給藥組合對(duì)照組之間則未見顯著性差異，而在實(shí)驗(yàn)前分組時(shí)各組小鼠的體重均無(wú)顯著性差異。胸腺體液因子THF-Y2衍生物Z在對(duì)S180實(shí)體瘤的抑瘤實(shí)驗(yàn)中，劑量為O. 025mg -Kg-1時(shí)顯示出最強(qiáng)的抑瘤作用，抑瘤率為38. 2%。陽(yáng)性對(duì)照組依然使用環(huán)磷酰胺，但在這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，環(huán)磷酰胺對(duì)該腫瘤的抑瘤率較對(duì)H22腫瘤抑制率低，為38. 2%，而在實(shí)驗(yàn)前分組時(shí)各組小鼠的體重均無(wú)顯著性差異的前提下，使用衍生物Z治療的各組及空白對(duì)照組解剖前凈重也都與環(huán)磷酰胺組有顯著性差異。由此結(jié)果可知，雖然環(huán)磷酰胺對(duì)于腫瘤的抑制作用很強(qiáng)，然而其副作用也是不能忽視的。而合成胸腺體液因子THF- Y 2及衍生物Z對(duì)于機(jī)體的副作用較小，其作為抗瘤作用藥物的潛力不容小覷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化學(xué)合成的胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z在體外T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中顯示了良好的活性。胸腺體液因子THF-Y2在時(shí)活性最佳。H22體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)，胸腺體液因子THF- Y 2的最佳劑量為O. 25mg · Kg—1 ；S180體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)，胸腺體液因子THF- Y 2衍生物Z的最佳劑量為O. 025mg · Kg'并且通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z對(duì)受輻射小鼠在免疫指標(biāo)上確有保護(hù)作用。本發(fā)明的多肽可采用各種制備方法制備，且并不限于本發(fā)明所述的合成方法。本發(fā)明的多肽可采用任何已知的方法，添加任何已知的藥物輔料，制備成多種劑型，其中優(yōu)選凍干粉針。在應(yīng)用時(shí)，本發(fā)明多肽每天的合適劑量范圍為0.001 3mg/Kg體重，優(yōu)選為O. 01 2mg/Kg體重。上述劑量可以一個(gè)劑量單位或分成幾個(gè)劑量單位給藥，這取決于醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)以及包括運(yùn)用其它治療手段的給藥方案。本發(fā)明還可也其他藥物聯(lián)用或者形成藥物組合物，以達(dá)到更好的治療效果。當(dāng)本發(fā)明的多肽與其它治療藥物存在協(xié)同作用時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整它的劑量。


圖I為胸腺體液因子THF- Y 2衍生物Z制備后經(jīng)純化后的HPLC色譜圖；圖2為胸腺體液因子THF- Y 2衍生物Z的質(zhì)譜圖。圖3為胸腺體液因子THF- Y 2制備后經(jīng)純化后的HPLC色譜圖；圖4為胸腺體液因子THF- Y 2的質(zhì)譜圖。本發(fā)明的具體實(shí)施方式
僅限于進(jìn)一步的解釋和說(shuō)明本專利，并不對(duì)本專利的內(nèi)容構(gòu)成限制。本發(fā)明所用試劑均為市售，所采用的儀器為一般實(shí)驗(yàn)室常備儀器。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z的化學(xué)合成(I)Fmoc-氨基酸-樹脂的洗漆稱量O. Immol Fmoc-氨基酸-樹脂,用氮?dú)獯蹬莼靹颍尤隝mLDMF,室溫浸泡20分鐘后抽濾，同法重復(fù)I次；(2) Fmoc的脫除將步驟(I)中的樹脂加入含有30% PIP的DMF溶液lmL，活化反應(yīng)2分鐘，抽濾，同法重復(fù)一次；抽干后用Iml的DMF洗滌5次，每次lmin，反應(yīng)及洗滌過(guò)程均伴隨氮?dú)獯蹬輸嚢瑁?3)縮合反應(yīng)將步驟⑵中抽干的樹脂加入Fmoc-氨基酸_0H、HBTU、DIPEA，室溫縮合反應(yīng)30分鐘，氮?dú)獯蹬?，抽濾，Iml DMF洗滌5次，每次I分鐘；所述Fmoc-氨基酸-OH和HBTU的重量為抽干后樹脂重量的4倍；DIPEA溶液的重量為氨基酸量的I. 5倍；(4)Fmoc的脫除茚三酮檢測(cè)為反應(yīng)為陽(yáng)性，洗滌，將步驟(3)中得到的樹脂加入含有質(zhì)量百分比為30% PIP的DMF溶液ImL反應(yīng)I分鐘，抽濾，再以同樣的方法處理I 2次，抽干后用DMF洗滌4次，每次2分鐘；反應(yīng)及洗滌過(guò)程均用氮?dú)鈹嚢?；反?yīng)后取少量樹脂進(jìn)行茚三酮檢驗(yàn)；(5)按照氨基酸序列的順序重復(fù)步驟(2) (4)，直至氨基酸合成完畢，最后一步重復(fù)步驟⑵；(6)加入二氯乙烷1ml，洗滌5次，每次I分鐘，甲醇2ml洗滌5次，每次I分鐘，最后一次保持10分鐘；用錫紙及PARA膜封閉多肽反應(yīng)管口，真空干燥I小時(shí)；(7)將步驟(6)得到的樹脂加入酸解液中，充氮?dú)?，封口，室溫?cái)嚢?0分鐘；將樹脂酸解液抽濾，收集濾液，用2 3ml TFA洗滌2 3次，抽濾，合并濾液；酸解液為體積比的 TFA TIS 水=90 2. 5 2. 5 ；(8)將濾液轉(zhuǎn)移至另一容器，氮?dú)獯等FA，逐滴加入冷乙醚沉淀多肽，收集沉淀的多肽，放入砂板布氏漏斗，用乙醚或者離心法洗滌，吹干，-20 V保存。所合成的多肽的純化方法為采用中低壓液相色譜，流動(dòng)相A 0. I % TFA水溶液；B :用A相配成的80% ACN溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)214nm ;流速ZmLmirT1 ;進(jìn)樣100 μ I ;梯度洗脫15 40% B 12個(gè)柱體積。圖I為胸腺體液因子THF- Y 2衍生物Z制備后經(jīng)純化后的HPLC色譜圖；圖2為胸腺體液因子THF- Y 2衍生物Z的質(zhì)譜圖；圖3為胸腺體液因子THF- Y 2制備后經(jīng)純化后的HPLC色譜圖4為胸腺體液因子THF- Y 2的質(zhì)譜圖。 實(shí)施例2胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z的化學(xué)合成(I) Fmoc-氨基酸-樹脂的洗滌稱量Fmoc-氨基酸-樹脂，用氮?dú)獯蹬莼靹?，加入Iml DMF,室溫浸泡45分鐘后抽濾，同法重復(fù)2次；(2) Fmoc的脫除將步驟⑴中的樹脂加入含有30% PIP的DMF溶液1ml，活化反應(yīng)10分鐘，抽濾，同法重復(fù)一次；抽干后用Iml DMF洗滌5次，每次I分鐘；反應(yīng)及洗滌過(guò)程均伴隨氮?dú)獯蹬輸嚢瑁?3)縮合反應(yīng)將步驟⑵中抽干的樹脂加入Fmoc-氨基酸-0H、HBTU，以及NMM溶液，室溫縮合反應(yīng)60分鐘，氮?dú)獯蹬?，抽濾，Iml DMF洗滌5次，每次I分鐘；所述Fmoc-氨基酸-OH和HBTU的重量為抽干后樹脂重量的6倍；NMM溶液的重量為氨基酸量的2. 5倍；(4)Fmoc的脫除經(jīng)茚三酮檢測(cè)為反應(yīng)為陽(yáng)性，洗滌，將步驟(3)中得到的樹脂加 入含有質(zhì)量百分比為30% PIP的DMF溶液反應(yīng)5分鐘，抽濾，再以同樣的方法處理2次，抽干后用DMF洗滌5次，每次2分鐘；反應(yīng)及洗滌過(guò)程均用氮?dú)鈹嚢?；反?yīng)后取少量樹脂進(jìn)行茚三酮檢驗(yàn)；(5)按照氨基酸序列的順序重復(fù)步驟(2) (4)，直至氨基酸合成完畢，最后一步重復(fù)步驟⑵；(6)加入二氯乙烷1ml，洗滌5次，每次I分鐘，甲醇2ml洗滌5次，每次I分鐘，最后一次保持10分鐘；用錫紙及PARA膜封閉多肽反應(yīng)管口，真空干燥I小時(shí)；(7)將步驟(6)得到的樹脂加入酸解液中，充氮?dú)?，封口，室溫?cái)嚢?0分鐘 I小時(shí)；將樹脂酸解液抽濾，收集濾液，用2 3ml TFA洗滌2 3次，抽濾，合并濾液；酸解液為體積比的TFA TIS :水=95 2. 5 2. 5的混合溶液。(8)將濾液轉(zhuǎn)移至另一容器，氮?dú)獯等FA，逐滴加入冷乙醚沉淀多肽，收集沉淀的多肽，放入砂板布氏漏斗，用乙醚或者離心法洗滌，吹干，-20 V保存。所合成的多肽的純化方法為采用中低壓液相色譜，流動(dòng)相A 0. I % TFA水溶液；B :用A相配成的80% ACN溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)214nm ;流速ZmLmirT1 ;進(jìn)樣100 μ I ;梯度洗脫15 40% B 5個(gè)柱體積。所制備得到的胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z經(jīng)高效液相色譜、質(zhì)譜分析，所得的圖譜與圖I 4相似。實(shí)施例3胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z的化學(xué)合成(I)Fmoc-氨基酸-樹脂的洗滌稱量Fmoc-氨基酸-樹脂，用氮?dú)獯蹬莼靹?，加入二甲基甲酰?DMF)，室溫浸泡30分鐘后抽濾，同法重復(fù)I次；(2) Fmoc的脫除將步驟(I)中的樹脂加入含有30% PIP的DMF溶液，活化反應(yīng)5分鐘，抽濾，同法重復(fù)一次；抽干后用DMF洗滌5次，每次I分鐘；反應(yīng)及洗滌過(guò)程均伴隨氮?dú)獯蹬輸嚢瑁?3)縮合反應(yīng)將步驟(2)中抽干的樹脂加入Fmoc-氨基酸_0H、HBTU、DIPEA溶液中，室溫縮合反應(yīng)60分鐘，氮?dú)獯蹬?，抽濾，Iml DMF洗滌5次，每次I分鐘；所述Fmoc-氨基酸-OH和HBTU的重量為抽干后樹脂重量的5倍；DIPEA溶液的重量為氨基酸量的I. 5倍；(4)Fmoc的脫除經(jīng)茚三酮檢測(cè)為反應(yīng)為陽(yáng)性，將步驟(3)中得到的樹脂加入含有質(zhì)量百分比為30% PIP的DMF溶液反應(yīng)5分鐘，抽濾，再以同樣的方法處理I 2次，抽干后用DMF洗滌5次，每次2分鐘；反應(yīng)及洗滌過(guò)程均用氮?dú)鈹嚢?；反?yīng)后取少量樹脂進(jìn)行茚
二酮檢驗(yàn)；(5)按照氨基酸序列的順序重復(fù)步驟(2) (4)，直至氨基酸合成完畢，最后一步重復(fù)步驟⑵；(6)加入二氯乙烷1ml，洗滌5次，每次一分鐘，甲醇2ml洗滌5次，每次I分鐘，最后一次保持10分鐘；用錫紙及PARA膜封閉多肽反應(yīng)管口，真空干燥I小時(shí)；(7)將步驟(6)得到的樹脂加入酸解液中，充氮?dú)?，封口，室溫?cái)嚢鐸小時(shí)；將樹脂酸解液抽濾，收集濾液，用2 3ml的TFA洗滌2次，抽濾，合并濾液；酸解液為體積比的TFA TIS 水=95 2.5 2. 5 的混合溶液。(8)將濾液轉(zhuǎn)移至另一容器，氮?dú)獯等FA，逐滴加入冷乙醚沉淀多肽，收集沉淀 的多肽，放入砂板布氏漏斗，用乙醚或者離心法洗滌，吹干，-20 V保存。所合成的多肽的純化方法為采用中低壓液相色譜，流動(dòng)相A 0. 1% TFA水溶液；B :用A相配成的80% ACN溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)214nm ;流速2mL · mirT1 ;進(jìn)樣100 μ I ;梯度洗脫15 40% B 5個(gè)柱體積。所制備得到的胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z經(jīng)高效液相色譜、質(zhì)譜分析，所得的圖譜與圖I 4相似。實(shí)施例4胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z的化學(xué)合成(I)Fmoc-氨基酸-樹脂的洗滌稱量Fmoc-氨基酸-樹脂，用氮?dú)獯蹬莼靹颍尤攵谆柞０?DMF)，室溫浸泡40分鐘后抽濾，同法重復(fù)2次；(2) Fmoc的脫除將步驟(I)中的樹脂加入含有30% PIP的DMF溶液，活化反應(yīng)8分鐘，抽濾，同法重復(fù)一次；抽干后用DMF洗滌；反應(yīng)及洗滌過(guò)程均伴隨氮?dú)獯蹬輸嚢瑁?3)縮合反應(yīng)將步驟⑵中抽干的樹脂加入Fmoc-氨基酸-0H、HBTU，以及DIPEA溶液，室溫縮合反應(yīng)45分鐘，氮?dú)獯蹬?，抽濾，Iml DMF洗滌5次，每次2分鐘；所述Fmoc-氨基酸-OH和HBTU的重量為抽干后樹脂重量的4. 5倍；DIPEA溶液的重量為氨基酸量的I. 5倍;(4)Fmoc的脫除經(jīng)茚三酮檢測(cè)為反應(yīng)為陽(yáng)性，洗滌，將步驟(3)中得到的樹脂加入含有質(zhì)量百分比為30% PIP的DMF溶液反應(yīng)5分鐘，抽濾，再以同樣的方法處理2次，抽干后用DMF洗滌；反應(yīng)及洗滌過(guò)程均用氮?dú)鈹嚢瑁?5)按照氨基酸序列的順序重復(fù)步驟(2) (4)，直至氨基酸合成完畢，最后一步重復(fù)步驟⑵；(6)加入二氯乙烷1ml，洗滌5次，每次I分鐘，甲醇2ml洗滌5次，每次I分鐘，最后一次保持10分鐘；用錫紙及PARA膜封閉多肽反應(yīng)管口，真空干燥I小時(shí)；(7)將步驟(6)得到的樹脂加入酸解液中，充氮?dú)猓饪?，室溫?cái)嚢?0分鐘 I小時(shí)；將樹脂酸解液抽濾，收集濾液，用2 3ml TFA洗滌3次，抽濾，合并濾液；酸解液為體積比的TFA TIS :水=90 5 2. 5的混合溶液。(8)將濾液轉(zhuǎn)移至另一容器，氮?dú)獯等FA，逐滴加入冷乙醚沉淀多肽，收集沉淀的多肽，放入砂板布氏漏斗，用乙醚或者離心法洗滌，吹干，-20 V保存。所合成的多肽的純化方法為采用中低壓液相色譜，流動(dòng)相A 0. 1% TFA水溶液；B :用A相配成的80% ACN溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)214nm ;流速2mL · mirT1 ;進(jìn)樣100 μ I ;梯度洗脫15 40% B 5個(gè)柱體積。所制備得到的胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z經(jīng)高效液相色譜、質(zhì)譜分析，所得的圖譜與圖I 4相似。實(shí)驗(yàn)例I一、實(shí)驗(yàn)材料I. I樣品來(lái)源及前處理取實(shí)施例3制備的胸腺體液因子THF-Y 2和衍生物Z凍干品各取適量，分別用Hanks液配制并稀釋成適當(dāng)濃度,分裝備用。I. 2材料與儀器
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明小鼠，體重20 22g ；中國(guó)藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。瘤細(xì)胞中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供。主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)液北京天象鑫隆技術(shù)有限公司生產(chǎn)環(huán)磷酰胺山西普德藥業(yè)有限公司生產(chǎn)批號(hào)14023686Hanks液現(xiàn)用現(xiàn)配、I. 8% NaCl溶液、純水等主要儀器CO2 培養(yǎng)箱FormaScientific333 型酶標(biāo)儀METERTECHΣ 960 型，臺(tái)灣 METERTECH 公司其它96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(圓底)等。二、實(shí)驗(yàn)方法2. I動(dòng)物模型的建立取接種于小鼠腹腔第7天的S180肉瘤和H22肝癌腫瘤配成瘤胞懸液分別接種于同種試驗(yàn)組鼠前肢腋窩皮下，每鼠接種IO6個(gè)瘤細(xì)胞mL-1的細(xì)胞懸液O. 2mL。2. 2T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT)法取接種S180肉瘤瘤細(xì)胞一周，接種成功的昆明鼠I.小鼠眼球摘除放血；2.取脾臟，在Hanks液中洗滌兩次，取出剪碎，加入適量Hanks液；3.過(guò)濾，收集濾液，分裝于小試管中；4.離心，lOOOrpm，IOmin ;5.棄上清，加入少量Hanks液，將細(xì)胞懸起后加入3mL純水，混勻，靜置一分鐘左右加入3mLl. 8% NaCl溶液，混勻，再次離心；6.棄去上清，觀察紅細(xì)胞破碎狀況，如需要，重復(fù)第5步；7.加入1640培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸起，細(xì)胞計(jì)數(shù)；8.將細(xì)胞稀釋，用排槍向96孔細(xì)胞板內(nèi)加入100 μ L細(xì)胞，每孔IO5個(gè)；9.加入IOOmL樣品，混勻，空白孔加入Hanks液，每種濃度設(shè)6個(gè)平行孔，其中3孔含 ConAlO μ g · mL S 每孑L 50 μ L ；10.放入37 V CO2孵箱中孵育72h，終止孵育前4h，每孔加入5mg · mL—1 MTT20 μ L；
11.細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后加二甲基亞砜200yL，待紫色結(jié)晶全部溶解后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570nm處測(cè)OD值。2. 3體內(nèi)實(shí)驗(yàn)第O天接種動(dòng)物，第I天檢查培養(yǎng)情況，如無(wú)污染，則將動(dòng)物稱重并隨機(jī)均勻分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。劑量設(shè)置根據(jù)量效曲線設(shè)高劑量組、中劑量組、低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組、對(duì)照組。THF-Y 2 高、中、低劑量組分別為 O. 25mg .kg'O· 125mg · kg'O. 0625mg · kg4，衍生物 Z 高、中、低劑量組分別為O. 025mg · kg'O. 0125mg · kg'O. 00625mg · kg-1,陽(yáng)性對(duì)照環(huán)磷酰胺給藥劑量20mg · kg_S空白對(duì)照組給予生理鹽水，給藥體積均為O. lmL/10g。
皮下注射給藥，陽(yáng)性對(duì)照組環(huán)磷酰胺一次性給藥；其他組每天給藥一次，連續(xù)14天。第十四天稱體重，解剖并稱量瘤重。三、檢測(cè)指標(biāo)及計(jì)算方法T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果，依下式判定受試藥物對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖效果，以刺激指數(shù)SI (stimulationindex)表示增殖強(qiáng)度SI =試驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值(I)體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果，抑瘤率計(jì)算公式為抑瘤率=[(空白對(duì)照組瘤重-給藥組瘤重)/空白對(duì)照組瘤重]X 100% (2)抑瘤率需大于30%評(píng)定為抗腫瘤作用明確。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用MicrosoftExcel軟件處理,計(jì)算給藥后抑瘤率及x 土 s,以t檢驗(yàn)考察組間的顯著性差異。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4. IT淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT)法每個(gè)濃度下，加ConA與不加ConA組分別平行三孔，測(cè)量其OD值后取其平均值。結(jié)果表明，THF- Y 2及其衍生物Z具有使T淋巴細(xì)胞增殖的活性。添加ConA后，從OD值結(jié)果可以看出，除8. OOX 10_3 μ g · ι Γ1外，THF- Y 2各劑量組與空白組相比均有顯著性差異；未添加ConA的情況下，除8. 00 X 1(Γ3與4. 00 X 1(Γ2 μ g πιΓ1濃度組外，各劑量組與空白組相比均有顯著性差異，THF-Υ 2劑量在左右時(shí)表現(xiàn)出的活性最佳(見表I)。衍生物Z各組OD值與相應(yīng)空白對(duì)照組相比均有顯著性差異(見表2)。按公式(I)計(jì)算出各化和物的刺激指數(shù)(SI)，結(jié)果如下(見表3、4)。表ITHF- Y 2對(duì)T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的影響(x 土 s)齊Li量(pg.mL·1) Non-ConA stimulated(n=3)ConA stimulated(n=3)
8.00X10'3 0.089±0.0140.089±0.014
4.00xl0-2 0.111±0.0080.169±0.011***
2.00xl0_1 0.157±0.020**0.463±0.030***
1.000.267±0.020***1.243±0.052***
5.000.735±0.022***1.766±0.098***
25.000.386±0.033***1.298±0.101*** 125 0.373±0.071**1.056±0.019*** 625 0.233±0.044**0.789±0.016*** 空白 0.091±0.0100.118±0.005與空白對(duì)照組比較** P < 0. 01 ；*** P < 0.001.表2 :衍生物Z對(duì)T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的影響(X 土 s)
齊Li量(pg.mL·1) Non-ConA stimulated(n=3)ConA stimulated(n=3)
3.2χ10'2 0.342±0.016***0.263±0.024**
Ι. χΙΟ'1 0.704±0.061***0.821±0.011***
0.8 0.712±0.012***0.851±0.034***
4.000.981±0.030***1.118±0.017***
20 1.347±0.031***1.405±0.008***
100 1.479±0.071***1.558±0.042***
500 1.685±0.056***1.664±0.017***
空白 0.167±0.0260.173±0.024與空白對(duì)照組比較** Ρ < O. 01 ；*** Ρ < O.001.表3 :衍生物Z對(duì)T淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)
劑量(pg.mL—1)SI (Z)
0.0321.520.164.75
0.84.92
4.006.46
208.12
1009.01
5009.62表4 THF- Y 2對(duì)T細(xì)胞刺激指數(shù)(SI)
劑量(pg.mL·1)SI
8.OOxlO-30.813
4.00χ10_21.43
2.00χ10_13.92
1.0010.5
5.0015.0
25.0011.0 125 8.95 625 6.694. 2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，THF-Y 2和衍生物Z顯示出很好的抗瘤作用。THF-Y 2在對(duì)H22實(shí)體瘤抑瘤實(shí)驗(yàn)中，各組瘤重與空白對(duì)照組相比均有顯著性差異，劑量為O. 25mg -Kg-1時(shí)活性最高，解剖時(shí)給藥組及空白對(duì)照組小鼠除去腫瘤后的凈重與陽(yáng)性對(duì)照組相比均有顯著性差異。從計(jì)算所得的抑瘤率數(shù)值來(lái)看，高劑量組抑瘤效果最佳，抑瘤率為47. 2% (結(jié)果見表5)。表5 THF- Y 2對(duì)H22實(shí)體瘤的抑瘤作用(η = 10)
組別給藥前體重(g) 瘤重(g)給藥后體重(體重-瘤重)(g) 抑瘤率％
高劑量組 20.82±0.531.120±0.347*** 31.90±3.25**47.2
中劑量組 20.61±0.611.296±0.161**31.27±3.25*38.9
低劑量組 20.88±0.591.478±0.342*31.28±3.2330.3
陽(yáng)性對(duì)照組 20.75±0.600.176±0.086*** 27.82±2.5691.7
空白對(duì)照組 20.83±0.722.122±0.84431.54±3.71**—瘤重于空白對(duì)照組比較給藥后(體重-瘤重)與陽(yáng)性對(duì)照組比較％P <0.05;** P < O. 01 ；*** P < O. 001.在衍生物Z在S180實(shí)體瘤抑瘤實(shí)驗(yàn)中，高、中劑量組瘤重與空白對(duì)照組相比有顯著性差異，劑量為O. 025mg · Kg—1時(shí)活性最高，解剖時(shí)給藥組和空白對(duì)照組小鼠除去腫瘤后的凈重與陽(yáng)性對(duì)照組相比均有顯著性差異。從計(jì)算所得的抑瘤率數(shù)值來(lái)看，高劑量組抑瘤效果最佳，抑瘤率為38. 2% (結(jié)果見表6)。表6 :衍生物Z對(duì)S180實(shí)體瘤的抑瘤作用(η = 10)
組別給藥前體重(g) 瘤重(g)給藥后體重(體重-瘤重)(g) 抑瘤率％
高劑量組20.04±0.64 1.592±0.267** 30.41±2.09**38.2
中劑量組20.08±0.88 1.647±0.341*30.19±1.51*36.1
低劑量組19.90±0.60 1.955±0.36230.19±2.62*24.2 陽(yáng)性對(duì)照組 20.75±0.60 1.593±0.0.059** 26.61±2.4838.2
空白對(duì)照組 20.22±0.69 2.578±0.72230.55±3.23*—瘤重與空白對(duì)照組比較；給藥后(體重-瘤重)與陽(yáng)性對(duì)照組比較％P <0.05;** P < O. 01 ；*** P < O. 001.五、討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化學(xué)合成的THF- Y 2及其衍生物Z在體外T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中顯示了良好的活性。THF- Y 2在5 μ g · mL—1時(shí)活性最佳。H22體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)，THF- Y 2的最佳劑量為O. 25mg · Kg-1 ；S180體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)，衍生物Z的最佳劑量為O. 025mg · Kg-1。實(shí)驗(yàn)例2THF- Y 2及其衍生物Z的抗輻射作用所用材料和儀器龍膽紫(北京惠澤奧公司)，印度墨水(北京篤信精細(xì)制劑廠)，環(huán)磷酰胺(山西泰盛制藥有限公司)，實(shí)驗(yàn)例3制備的胸腺體液因子THF- Y 2衍生物Z，鈷源(軍科院北京放射醫(yī)學(xué)研究所)，顯微鏡(CH20BMF 200, Olympus)，分光光度計(jì)(UV-2550，SHIMADZU)。所用的方法I、白細(xì)胞計(jì)數(shù)白細(xì)胞稀釋液取冰醋酸I. 5mL和1%龍膽紫lmL，混勻，加蒸餾水至lOOmL。(I)在小試管中加O. 38mL白細(xì)胞稀釋液；(2)從鼠尾取血，用吸管準(zhǔn)確吸血20 μ L，擦凈吸管外沾附的血液。(3)迅速將血輕輕放入上述小試管中，并用上清液洗吸管2 3次，搖勻。(4)將白細(xì)胞混懸液滴入計(jì)數(shù)池內(nèi)，靜置2 3分鐘，待白細(xì)胞下沉后計(jì)數(shù)。(5)在低倍鏡下，白細(xì)胞呈圓形，漿透亮，核呈紫黑色，稍有折光，借此特點(diǎn)可與雜質(zhì)相區(qū)別。計(jì)數(shù)池四角的4個(gè)大方格中所有的白細(xì)胞數(shù)，將總數(shù)乘以50，即得每Imm3血中白細(xì)胞數(shù)。計(jì)算原理每個(gè)大方格面積為1mm3，計(jì)數(shù)池深度為O. 1mm，血稀釋20倍,故每Imm3血中白細(xì)胞數(shù)為4個(gè)大方格的白細(xì)胞數(shù)X10X20 + 4。2、碳粒廓清法操作步驟體重18 22g小白鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，分別給與藥物和溶劑。實(shí)驗(yàn)時(shí)每鼠尾靜脈注射印度墨汁O. 05mL/10g體重，于I U1)和5 (t2)分鐘后，分別從眼眶靜脈取血20 μ L，加到2ml、0. 1% Na2CO3溶液中搖勻，用分光光度計(jì)在680nm比色，測(cè)光密度。3、結(jié)果昆明鼠17± lg，10只/組，雌雄各半。650拉德Co60照射，照射率236. I倫/分，照射時(shí)間為2分鐘39. 4秒。陰性對(duì)照組每天皮下注射O. ImL生理鹽水，給藥組I每天皮下注射不同劑量的THF- Y 2衍生物Z (實(shí)施例I制備)0. 5 μ g/只、5 μ g/只、50 μ g/只；給藥組2每天皮下注射不同劑量的THF- Y 2 (實(shí)施例I制備):0. 5μ g/只、5 μ g/只、50 μ g/只。陽(yáng)性對(duì)照物為尼爾雌醇，一次性灌胃取尼爾雌醇2片(2mg)，碾碎，加4mL水，力口O. 5%羧甲基纖維素鈉(CMC)，攪勻，灌胃O. ImL/只，即O. 05mg/只。
一周后檢測(cè)血液白細(xì)胞總數(shù)，碳粒廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)，胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。用T檢驗(yàn)比較給藥組與陰性對(duì)照組的差異顯著性。結(jié)果如表7所示表7 =THF- Y 2衍生物Z抗輻射作用的指標(biāo)檢測(cè)
組別體重增加白細(xì)胞個(gè)數(shù)廓清指數(shù)K 吞噬指數(shù)α胸腺指數(shù)脾指數(shù)
(g)(個(gè)/mm3)(mg/10g)(mg/10g)
未輻射 5.76*5948**0.0415.5632.56**82.21**
陰性對(duì)照 3.579360.0417.6520.6618.67
陽(yáng)性對(duì)照 3.342578**0.0336.1228.54*8.76**
0.5μ§4.081467**0.0537.76*25.25*13.85*
5μδ4.751821**0.063**8.25**26.85**11.58**
50μδ2.46*1818**0.063*8.32*26.34**10.65** Ρ < O. 05 ；** Ρ < O. 01.表8 THF- Y 2抗輻射作用的指標(biāo)檢測(cè)
組別體重增加白細(xì)胞個(gè)數(shù)廓清指數(shù)K 吞噬指數(shù)α胸腺指數(shù)脾指數(shù)
(g)(個(gè)/mm3)(mg/10g)(mg/10g)
未輻射5.35*5658**0.0435.4532.89**83.23**
陰性對(duì)照3.869570.0437.5620.6818.67
陽(yáng)性對(duì)照3.432534**0.0306.2528.67*8.23**
0.5pg4.121489**0.0537.65*25.34*13.75*
5pg4.641865**0.061**8.21**25.95**12.32**
50μδ2.51*1834**0.061*8.23*26.76**10.56** Ρ < O. 05 ；** Ρ < O. 01.表7、表8的結(jié)果表明，給藥組與陽(yáng)性對(duì)照組相比，白細(xì)胞總數(shù)明顯增大，具有統(tǒng)計(jì)意義，給藥組的廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)也明顯提高，其中5μ g組和50 μ g組具有顯著性。給藥組的胸腺指數(shù)也有所提高，其中50 μ g組具有顯著性。THF- Y 2及其衍生物Z對(duì)受輻射小鼠在免疫指標(biāo)上確有保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)例3對(duì)受輻射小鼠存活率的影響昆明鼠20± lg，20只/組，雌雄各半。分別用600拉德和700拉德Co60照射，照射率246. 72倫/分。陰性對(duì)照每天皮下注射O. ImL生理鹽水，給藥組每天皮下注射不同劑量的THF- Y 2衍生物Z :0. 5 μ g/只，5 μ g/只，50 μ g/只，200 μ g/只。兩周后停藥，繼續(xù)觀察，到30天為止。陽(yáng)性對(duì)照組為尼爾雌醇，一次性灌胃，取尼爾雌醇2片(2mg)，碾碎，加4mL水，力口0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC)，攪勻，灌胃O. ImL/只，即O. 05mg/只。結(jié)果表明，Co60照射后，皮下注射THF-Y 2衍生物Z明顯降低了小鼠的死亡率。無(wú)論是在較低輻射劑量600拉德，還是較高輻射劑量700拉德，THF- Y 2衍生物Z都對(duì)小鼠有保護(hù)作用。 表9 =THF- Y 2對(duì)受輻射小鼠在6. OGy照射下的影響
組別存活率％存活天數(shù)％
陰性對(duì)照3021.6
陽(yáng)性對(duì)照5524.6
0、g5026.7
5 pg6027.8
5(^g6526.4
20(^g 5523.8表10 THF- Y 2對(duì)受輻射小鼠在7. OGy照射下的影響
組別存活率存活天數(shù)
陰性對(duì)照1014.7
陽(yáng)性對(duì)照3022.6
0.5pg3020.4
5pg5025.7
5(^g5023.8
20(^g2521.4表11 :THF_ y 2衍生物Z對(duì)受輻射小鼠在6. OGy照射下的影響組別存活率％存活天數(shù)％
陰性對(duì)照3021.6
陽(yáng)性對(duì)照5524.6
0.5μg5026.3
5pg6028.2
50μg6525.5
200μg6023.4表12 =THF- Y 2衍生物Z對(duì)受輻射小鼠在7. OGy照射下的影響
組別存活率存活天數(shù)
陰性對(duì)照1014.7
陽(yáng)性對(duì)照3022.6
0、g3022.1
5pg5024.5
5(^g5525.3
20(^g2523.5從上表可以看到，本發(fā)明的THF- Y 2及其衍生物Z對(duì)于輻射照射的小鼠具有明顯的保護(hù)作用。
權(quán)利要求
1.一種胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物，其特征在于，胸腺體液因子THF- Y 2的衍生物Z具有如SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列，胸腺體液因子THF-Y 2具有如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求I所述的胸腺體液因子THF-Y 2及其衍生物Z的制備方法，其特征在于，采用化學(xué)合成方法進(jìn)行制備然后進(jìn)行分離純化后得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的化學(xué)合成方法中采用Fmoc-氨基酸-樹脂，氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基采用叔丁基，反應(yīng)過(guò)程中采用茚三酮監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的化學(xué)合成方法的制備方法包括以下步驟 (1)Fmoc-氨基酸-樹脂的洗滌稱量Fmoc-氨基酸-樹脂，用氮?dú)獯蹬莼靹?，加入DMF室溫浸泡20 45分鐘后抽濾，同法重復(fù)I 2次； (2)Fmoc的脫除將步驟(I)中的樹脂加入含有30% PIP的DMF溶液，活化反應(yīng)2 10分鐘，抽濾，同法重復(fù)一次；抽干后用DMF洗滌； (3)縮合反應(yīng)將步驟(2)中抽干的樹脂加入Fmoc-氨基酸-OH、HBTU,以及DIPEA或NMM溶液中的一種，室溫縮合反應(yīng)30 60分鐘，氮?dú)獯蹬荩闉V，DMF洗滌； (4)Fmoc的脫除經(jīng)檢測(cè)為反應(yīng)為陽(yáng)性，將步驟(3)中得到的樹脂加入含有質(zhì)量百分比為30% PIP的DMF溶液反應(yīng)I 5分鐘，抽濾，再以同樣的方法處理I 2次，抽干后用DMF洗漆; (5)按照氨基酸序列的順序重復(fù)步驟(2) (4)，直至氨基酸合成完畢，最后一步重復(fù)步驟⑵； (6)洗漆，干燥； (7)將步驟(6)得到的樹脂加入酸解液中，充氮?dú)猓饪?，室溫?cái)嚢?0分鐘 I小時(shí)；將樹脂酸解液抽濾，收集濾液，用TFA洗滌2 3次，抽濾，合并濾液； (8)將濾液轉(zhuǎn)移至另一容器，氮?dú)獯等FA，逐滴加入冷乙醚沉淀多肽，收集沉淀的多肽，放入砂板布氏漏斗，用乙醚或者離心法洗滌，吹干，_20°C保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，在步驟(I)中浸泡的時(shí)間為20 40分鐘，優(yōu)選30分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，在步驟(2)中活化的時(shí)間為5 10分鐘，優(yōu)選5分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，在步驟(3)中所述Fmoc-氨基酸-OH和HBTU的重量為步驟(2)中抽干后樹脂重量的4 6倍；DIPEA或NMM溶液的重量為氨基酸量的I. 5 2. 5 ;縮合反應(yīng)的時(shí)間為45 60分鐘，優(yōu)選60分鐘；
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，在步驟(7)中的酸解液為體積比為TFA TIS :水=90 95 2. 5 5 2. 5 5，優(yōu)選體積比為95 2. 5 2. 5的混合溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所合成的多肽的純化方法為采用中低壓液相色譜，流動(dòng)相A 0. 1% TFA水溶液；B :用A相配成的80% ACN溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)214nm ;流速2mL · mirT1 ;進(jìn)樣:100 μ I ;梯度15 40% B 5個(gè)柱體積。
10.權(quán)利要求I所述的胸腺體液因子THF-Y 2及其衍生物Z在制備抗腫瘤藥物、腫瘤物理 治療及化學(xué)治療藥物、抗輻射藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種胸腺體液因子THF-γ2及其衍生物Z，胸腺體液因子THF-γ2衍生物Z具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本發(fā)明中的胸腺體液因子THF-γ2及其衍生物Z采用化學(xué)合成方法進(jìn)行制備，而后進(jìn)行分離純化后得到。本發(fā)明還涉及其化學(xué)合成方法及分離方法。經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明的胸腺體液因子THF-γ2衍生物Z具有可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖活性，并具有顯著的抑瘤作用及抗輻射作用，本發(fā)明還涉及了該衍生物在制備抗腫瘤藥物、腫瘤物理治療及化學(xué)治療藥物、抗輻射藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K1/06GK102875645SQ20111019542
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2011年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月12日
發(fā)明者徐康森, 王悅, 樂嘉靜, 李湛軍 申請(qǐng)人:中國(guó)生化制藥工業(yè)協(xié)會(huì)