專利名稱：血清胸腺因子在制備抗腫瘤藥物、腫瘤物理及化學(xué)治療藥物的保護(hù)藥物方面的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物化學(xué)物質(zhì)在制藥工程中的新用途，更具體的是血清胸腺因子 在制備抗腫瘤藥物、腫瘤物理及化學(xué)治療藥物的保護(hù)藥物或增強(qiáng)免疫藥方面的用途。
背景技術(shù)：
癌癥是引起人類死亡的主要原因之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每年死于癌癥 的病人約有五百萬(wàn)，而且最近幾年由于我們生活環(huán)境的惡化，癌癥的發(fā)病率上升，且呈現(xiàn)患 者低齡化的趨勢(shì)?？梢?jiàn)癌癥的預(yù)防和治療十分迫切。藥物治療是癌癥的主要治療手段之一。 近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，癌癥的藥物治療取得了顯著成績(jī)，開(kāi)發(fā)出了幾十種抗腫瘤藥物，有效地延 長(zhǎng)了患者的生命或提高了患者的生存質(zhì)量。其中有些腫瘤的藥物治療效果非常顯著，如藥 物治療小兒急性白血病等。采用合理的給藥方式或與其它治療手段相結(jié)合，通?？筛倪M(jìn)藥 物的治療效果。但腫瘤的藥物研究和開(kāi)發(fā)仍面臨巨大的挑戰(zhàn)，如目前腫瘤藥物種類比較單 一，多數(shù)為細(xì)胞毒藥物，能殺死各種生長(zhǎng)周期的腫瘤細(xì)胞，但是其副作用也很明顯，原因在 于這些藥物在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也限制了這些藥物療效的發(fā)揮。另外，對(duì)多數(shù)實(shí)體瘤如 肺癌、肝癌和胰腺癌等，化學(xué)藥物的治療效果常不明顯，而且到目前為止，大多數(shù)化療藥物 并不能有的放矢地“靶向”治療腫瘤，往往在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常的組織細(xì)胞產(chǎn)生影 響和損傷，所以在產(chǎn)生治療作用的同時(shí)，常伴有不同程度的不良反應(yīng)。同時(shí)還存在抗腫瘤藥 物的耐藥性問(wèn)題。上述這些問(wèn)題的解決一方面要依賴于腫瘤分子生物學(xué)的深入研究，另一 方面也要通過(guò)進(jìn)一步研究以發(fā)現(xiàn)大量更多的具有抗腫瘤活性的藥物，從中開(kāi)發(fā)出高效低毒 的新型抗腫瘤藥物。隨著科學(xué)技術(shù)及人們生活的現(xiàn)代化，環(huán)境污染給人們的健康帶來(lái)越來(lái)越多的不利 影響，尤其是在疾病的診斷與治療過(guò)程中，如在腫瘤放療、化療過(guò)程中，某些藥物對(duì)人類具 有不可低估的輻射作用。還有些帶有輻射性的職業(yè)工作都無(wú)時(shí)不在侵害著人們的機(jī)體，損 害著人類的健康。因此，研究開(kāi)發(fā)抗輻射藥物已經(jīng)受到人們的極大重視。放療和化療是治療腫瘤的主要方式，但都具有明顯的副作用。如環(huán)磷酰胺(CY)是 臨床上用于治療惡性腫瘤和自身免疫性疾病的一種常用且有效的化療劑，但其毒副作用較 大，特別是抑制骨髓造血，致外周血中紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板減少，以及明顯的胃腸道反 應(yīng)使病人食欲下降、免疫力低下。由于這些毒副作用，使CY的用量和療程均受到了限制。為 了減輕化療劑的毒副作用，臨床上常輔用一些升白細(xì)胞藥，如利血生、肌酐等，但效果不理想。胸腺是人體重要的中樞免疫器官，是T細(xì)胞成熟發(fā)育的主要器官，對(duì)于維持和發(fā) 展正常的免疫應(yīng)答及維持生命是必要的。它能分泌多種胸腺激素，血清胸腺因子(facteur thymic serique，F(xiàn)TS)就是其上皮細(xì)胞分泌的九肽。FTS由九個(gè)氨基酸Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn 組成。FTS最初由JF Bach等從豬血純化，1977年在Nature上發(fā)表以來(lái)引起廣泛關(guān)注。天 然的FTS分子中含有等摩爾的鋅離子，若將其絡(luò)合去除其生物學(xué)活性則喪失。與天然的FTS 相比，人工合成的FTS具有相同的生物學(xué)活性。華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)第31卷第6期727-730 頁(yè)公開(kāi)了利用化學(xué)方法合成血清胸腺因子(FTS)以及對(duì)所合成的血清胸腺因子進(jìn)行了活 性測(cè)定的內(nèi)容。據(jù)報(bào)道，自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化等，其 胸腺的FTS分泌減少；獲得性免疫缺陷綜合癥病人血清中的FTS含量也降低。FTS與這些 病的病因有何關(guān)系尚不明確，但是給予FTS治療后病人的免疫功能低下和免疫紊亂的狀態(tài) 皆可糾正。FTS似乎對(duì)多種免疫細(xì)胞都能產(chǎn)生作用。在胸腺內(nèi)，F(xiàn)TS對(duì)鳥(niǎo)類和哺乳動(dòng)物的T 細(xì)胞前體的發(fā)育起重要作用，有研究證明FTS可以調(diào)節(jié)鳥(niǎo)類⑶4+ ⑶8+的比例。FTS也能 增加自然殺傷細(xì)胞的活力。在雞模型中，F(xiàn)TS能增加IL-2R的表達(dá)。FTS也被提出影響人 IFN- γ受體表達(dá)。但是，到目前為止，國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)FTS作為抗腫瘤及增強(qiáng)免疫藥方面的應(yīng) 用的專利和研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供血清胸腺因子在制備抗腫瘤藥物、腫瘤物理治療及化學(xué)治 療藥物的保護(hù)藥物或增強(qiáng)免疫藥物方面的用途。本發(fā)明中藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)采用的血清胸腺因子，可以是從動(dòng)物血中自然提取的，也可 以是通過(guò)化學(xué)合成方法人工合成的。本發(fā)明的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)中所用的材料以及試驗(yàn)方法一、材料1、試驗(yàn)動(dòng)物本發(fā)明中的試驗(yàn)動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)用昆明小鼠，體重20_22g ；Wistar大鼠，體重 100-120g，均為SPF級(jí)，雄雌各半。動(dòng)物合格證號(hào)京動(dòng)許字(2000)第017號(hào)，由中國(guó)藥品 生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室為無(wú)菌空氣二級(jí)過(guò)濾，人工日光燈12h自 動(dòng)照明，恒溫恒濕，溫度22-24°C，相對(duì)濕度40%-50%o荷瘤鼠種由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研 究所提供。人肝癌Ifeps瘤，購(gòu)自于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和藥物所。裸鼠由中國(guó)藥品生物制品 檢定所動(dòng)物繁育場(chǎng)提供，清潔級(jí)，合格證號(hào)為SCXK京(2005-2004)。2、主要試劑本發(fā)明中的血清胸腺因子(FTS)由中國(guó)藥品生物制品標(biāo)準(zhǔn)化研究中心提供，是人 工合成的血清胸腺因子(FTS)，合成方法見(jiàn)華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)第31卷第6期727-30頁(yè)， 為白色凍干粉末，用前純水稀釋；環(huán)磷酰胺由山西普德藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)14023686 ； 5-氟尿嘧啶由上海旭東海普藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)H31020593 ；印度墨水由北京篤信精 細(xì)制劑廠提供；RPMI-1640培養(yǎng)液由北京天象鑫隆技術(shù)有限公司提供。
二、方法1、劑量設(shè)置根據(jù)藥效曲線結(jié)果設(shè)置高中低三個(gè)劑量組小鼠高劑量0. 25mg · kg—1、中劑量 0. 125mg · kg—1、低劑量 0. 0625mg · kg"1 ；EAC 腹 水瘤的陽(yáng)性對(duì)照5-氟尿嘧啶給藥劑量25mg · kg—1，H22實(shí)體瘤陽(yáng)性對(duì)照藥環(huán)磷酰胺給藥劑 量20mg · kg—1 ；給藥體積均為IOml · kg—1?？瞻讓?duì)照用生理鹽水。大鼠高劑量2. 2mg ·kg—1、中劑量1. Img ·kg—1、低劑量0. 55mgkg^ ；大鼠W256實(shí)體 瘤陽(yáng)性對(duì)照藥為環(huán)磷酰胺89. 2mg. kg—1，給藥體積均為2ml · kg—1?？瞻讓?duì)照用生理鹽水。裸鼠高劑量0. 125mg · kg—1 ；中劑量 0. 0625mg · kg—1 ；低劑量 0. 032mg · kg—1 ；陽(yáng)性 對(duì)照組環(huán)磷酰胺IOmg · kg—1，僅給藥一次，給藥體積均為0. Iml · lOg—1 ；空白對(duì)照用生理鹽 水。2、動(dòng)物模型制備腹水瘤取接種于小鼠的腹腔第7天的EAC瘤配成瘤細(xì)胞懸液接種于同種異體鼠 腹腔，每鼠接種含106個(gè)瘤細(xì)胞的細(xì)胞懸液0. 4ml。實(shí)體瘤<1>小鼠取接種于小鼠的腹腔第7天的H22瘤配成細(xì)胞懸液接種于同種 異體鼠前肢腋窩皮下，每鼠接種含106個(gè)瘤細(xì)胞的細(xì)胞懸液0. 2ml ；<2>取接種于大鼠腹腔 第7天的Walker-256瘤配成瘤細(xì)胞懸液接種于同種異體大鼠右側(cè)腿肌肉，每鼠接種含106 個(gè)瘤細(xì)胞的細(xì)胞懸液0. 2ml。人肝癌H印s瘤購(gòu)自于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和藥物所，取腫瘤腋下接種于裸鼠前肢 腋窩皮下，接種后觀察成活后給藥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。共給藥17天，末次給藥后第二天解剖稱瘤重、 測(cè)出長(zhǎng)短徑計(jì)算體積。3、免疫功能測(cè)試用淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(MTT法)體外實(shí)驗(yàn)在給藥結(jié)束次日小鼠眼眶放血致死，無(wú) 菌取脾。用RPMI1640培養(yǎng)液制成3X IO6-SX 106/mL的淋巴細(xì)胞懸液備用。用96孔培養(yǎng)板 培養(yǎng)淋巴細(xì)胞，每孔含備用淋巴細(xì)胞液100 μ L，每種濃度3復(fù)孔。按試驗(yàn)要求除空白對(duì)照孔 外，分別加入樣品，樣品+鋅各IOOyL以及ConAlOug/SOyL。淋巴細(xì)胞在37°C CO2孵箱中 孵育72h，終止孵育前4h，每孔加MTT20ul，5mg/mL。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后加二甲基亞砜200 μ L， 待紫色結(jié)晶全部溶解后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570nm處測(cè)OD值。小鼠碳粒廓清試驗(yàn)取末次給藥次日小鼠尾靜脈注射稀釋好的印度墨汁液 0. lml/10g，分別采5min和IOmin的眼靜脈叢血加至0. 1 % Na2C032ml，再用721型分光光度 計(jì)在600nm處測(cè)OD值。4、檢驗(yàn)指標(biāo)
給藥組生存天數(shù)-對(duì)照組生存天數(shù)腹水瘤生命延長(zhǎng)率=-
對(duì)照組生存天數(shù)實(shí)體瘤
抑瘤率=給藥組生存天數(shù)-對(duì)照組生存天數(shù)/對(duì)照組生存天數(shù)
生命延長(zhǎng)率和抑瘤率均需大于30%抗腫瘤作用明確；刺激指數(shù)SI =實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值；廓清指數(shù)K = (IogOD1-IogOD2) / (Vt1)其中OD1和OD2分別為在某一時(shí)刻、與t2所測(cè)得光密度值；
體重χκ1/3
吞噬指數(shù)=-
肝重+脾重腫瘤體積的計(jì)算公式為V = (LXW2)/2其中L——腫瘤的長(zhǎng)徑W——腫瘤的短徑本發(fā)明血清胸腺因子作為制備抗腫瘤藥物、腫瘤物理及化學(xué)治療藥物的保護(hù)藥物 或增強(qiáng)免疫藥方面的用途。生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑類抗腫瘤藥物除少數(shù)品種本身具有抗增殖作 用外，大多是通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能達(dá)到抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)殺滅癌細(xì)胞的。本發(fā)明中動(dòng)物 體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)FTS對(duì)所述的四種荷瘤鼠的腫瘤抑制作用是明顯的，高、中劑量對(duì)EAC 小鼠均達(dá)到很好的抑瘤效果，而且對(duì)照組作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異。本發(fā)明中將FTS作 為抗人肝癌H印s瘤藥時(shí)，高、中、低劑量均對(duì)人肝癌H印s瘤小鼠抑瘤作用明顯，而且對(duì)照 組作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異。因此FTS抗腫瘤作用確實(shí)。FTS還能夠多方面提高機(jī)體的 免疫活性，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。而FTS本身并不是細(xì)胞毒類抗腫瘤藥，急性毒性試驗(yàn)表明， FTS無(wú)毒，且產(chǎn)生的副作用很小，而且它的有效作用劑量范圍很廣，安全范圍較大，在作為 腫瘤物理及化學(xué)治療藥物的保護(hù)藥的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TS對(duì)受輻射小鼠的免疫指標(biāo)具有明顯 的保護(hù)作用，白細(xì)胞總數(shù)和吞噬能力都得到提高，胸腺指數(shù)也有所提高，在較高輻射劑量下 (7. OGy), FTS也提高了小鼠的存活率和平均存活時(shí)間。因此FTS可以為臨床上治療腫瘤提 供一個(gè)新的靶向和發(fā)展方向。


圖IFTS對(duì)T細(xì)胞增殖效應(yīng)刺激指數(shù)的影響圖2FTS的濃度對(duì)吞噬指數(shù)的影響圖3FTS對(duì)受輻射小鼠存活率的影響(6. OGy)圖4FTS對(duì)受輻射小鼠存活率的影響(7. OGy)圖5FTS對(duì)受輻射小鼠存活時(shí)間的影響(6. OGy)圖6FTS對(duì)受輻射小鼠存活時(shí)間的影響(7. OGy) 圖7FTS對(duì)荷瘤小鼠化療存活率的影響(1為空白對(duì)照，2為FTS5 μ g/只，3為 FTS50 μ g/ 只)圖8FTS對(duì)荷瘤小鼠化療存活時(shí)間的影響(1為空白對(duì)照，2為FTS 5yg/只，3為 FTS50 μ g/ 只)
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)的描述，應(yīng)當(dāng)指出的是，在此列 出的所有實(shí)施例僅僅是說(shuō)明性的，并不意味著對(duì)本發(fā)明范圍進(jìn)行限定。
實(shí)施例一本實(shí)施例涉及EAC腹水瘤組結(jié)果皮下注射給藥，第0天接種動(dòng)物，第1天檢查培養(yǎng)情況，如無(wú)污染，則將動(dòng)物稱重 并隨機(jī)分組開(kāi)始給藥。將腫瘤模型小鼠隨機(jī)分成5組，分別是高劑量組、中劑量組、低劑量 組、陽(yáng)性對(duì)照組和空白組，劑量分別為高劑量0. 25mg · kg—1、中劑量0. 125mg · kg—1、低劑量 0. 0625mg -kg"1,除陽(yáng)性藥組外每天給藥一次，連續(xù)14天；陽(yáng)性藥組5-氟尿嘧啶，隔日一次， 共三次。結(jié)果如表1所示表IFTS用于抗EAC腹水瘤藥的結(jié)果(χ 士s，η = 10) ΔΔΡ < 0.01，ΔΔΔΡ < 0. 001與空白組對(duì)照；生命延長(zhǎng)率與空白組對(duì)照。表1的結(jié)果表明末次給藥后觀察存活情況高劑量組、中劑量組兩組生命延 長(zhǎng)率均大于30%，且有一定的量效關(guān)系，療效確定，給藥組與對(duì)照組均有顯著性差異(P < 0. 01)。說(shuō)明FTS在作為制備抗EAC腹水瘤藥的用途時(shí)作用顯著。實(shí)施例二本實(shí)施例涉及Η22實(shí)體瘤組結(jié)果皮下注射給藥，第0天接種動(dòng)物，第1天檢查培養(yǎng)情況，如無(wú)污染，則將動(dòng)物稱重 并隨機(jī)分組開(kāi)始給藥。將腫瘤模型小鼠隨機(jī)分成5組，分別是高劑量組、中劑量組、低劑量 組、陽(yáng)性對(duì)照組和空白組，劑量分別為高劑量0. 25mg · kg—1、中劑量0. 125mg · kg—1、低劑量 0. 0625mg · kg"1,除陽(yáng)性藥組外每天給藥一次，連續(xù)14天；環(huán)磷酰胺一次性給藥。結(jié)果見(jiàn)表 2。表2FTS用于抗實(shí)體瘤藥的結(jié)果(士 s, η = 10) ΔΔΡ < 0.01, ΔΔΔΡ < 0. 001與空白組對(duì)照；抑瘤率與空白組相對(duì)照。表2的結(jié)果說(shuō)明給藥高劑量組、中劑量組抑瘤率大于30%且有一定量效關(guān)系，療效明確。高劑量組、中劑量組與對(duì)照組有顯著性差異(P <0.01)。高劑量組和中劑量組實(shí) 體瘤重量的增加比低劑量組及空白對(duì)照組重量的增加少。說(shuō)明FTS在作為制備抗H22實(shí)體 瘤藥的用途時(shí)作用顯著。實(shí)施例三本實(shí)施例涉及Walker-256瘤組結(jié)果皮下注射給藥，第0天接種動(dòng)物，第1天檢查培養(yǎng)情況，如無(wú)污染，則將動(dòng)物稱重 并隨機(jī)分組開(kāi)始給藥。將腫瘤模型大鼠隨機(jī)分成5組，分別是高劑量組、中劑量組、低劑 量組、陽(yáng)性對(duì)照組和空白組，劑量分別為高劑量2. 2mg · kg—1、中劑量1. Img · kg—1、低劑量 0. 55mg ^g—1，除陽(yáng)性藥組外每天給藥一次，連續(xù)14天；環(huán)磷酰胺一次性給藥。結(jié)果見(jiàn)表3。給藥組末次給藥后次日解剖取出實(shí)體瘤稱重，計(jì)算出抑瘤率。給藥組抑瘤率均大 于30%且有一定量效關(guān)系，療效明確。給藥組與對(duì)照組均有顯著性差異(P <0.001)。結(jié) 果見(jiàn)表3。表3FTS 用于抗 Walker-256 瘤的效果(λ' 士 s，η = 10) ΔΔΔΡ < 0. 001與空白組對(duì)照；抑瘤率與空白組相對(duì)照。表3的結(jié)果說(shuō)明給藥組抑瘤率均大于30%且有一定量效關(guān)系，療效明確，給藥 組與對(duì)照組均有顯著性差異(P <0.001)；高劑量組、中劑量組以及低劑量組測(cè)得的腫瘤 的重量關(guān)系為高劑量組< 中劑量組<低劑量組<空白對(duì)照組。說(shuō)明FTS在作為制備抗 Walker-256瘤藥的用途時(shí)作用顯著。實(shí)施例四本實(shí)施例涉及人肝癌H印s瘤組結(jié)果皮下注射給藥，第0天接種動(dòng)物，第1天檢查培養(yǎng)情況，如無(wú)污染，則將動(dòng)物稱重 并隨機(jī)分組開(kāi)始給藥。將腫瘤模型大鼠隨機(jī)分成5組，分別是高劑量組、中劑量組、低劑量 組、陽(yáng)性對(duì)照組和空白組，劑量分別為高劑量0. 125mg .kg—1、中劑量0. 0625mg .kg—1、低劑量 0. 032mg · kg"1,除陽(yáng)性藥組外每天給藥一次，共給藥17天；環(huán)磷酰胺一次性給藥，給藥劑量 為IOmg · kg—1。給藥體積均為10mL/kg。結(jié)果見(jiàn)表4。表4FTS用于抗人肝癌H印s瘤的效果(A' ±s，η = 10) *P < 0. 05，**P < 0. 01，***P < 0. 001 與空白組對(duì)照表4的結(jié)果說(shuō)明給藥組末次給藥后次日解剖取出實(shí)體瘤稱重，計(jì)算出抑瘤率。試 驗(yàn)結(jié)果表明，給藥組抑瘤率均大于30 %且有一定量效關(guān)系，療效明確。給藥組與對(duì)照組均有 顯著性差異(P <0.001)。高劑量組、中劑量組以及低劑量組測(cè)得的腫瘤的重量大小關(guān)系 為高劑量組<中劑量組<低劑量組<空白對(duì)照組。高劑量組、中劑量組以及低劑量組測(cè)得 的腫瘤的體積大小關(guān)系為高劑量組<中劑量組<低劑量組<空白對(duì)照組。實(shí)施例五本實(shí)施例涉及FTS對(duì)昆明小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響體外實(shí)驗(yàn)在給藥結(jié)束次日小鼠眼眶放血致死，無(wú)菌取脾。用RPMI1640培養(yǎng)液制 成3X IO6-SX 106/mL的淋巴細(xì)胞懸液備用。用96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)淋巴細(xì)胞，每孔含備用淋巴 細(xì)胞液100μ L，每種濃度3復(fù)孔。按試驗(yàn)要求除空白對(duì)照孔外，分別加入樣品，樣品+鋅各 100 μ L以及ConA10ug/50 μ L。淋巴細(xì)胞在37°C CO2孵箱中孵育72h，終止孵育前4h，每孔 加MTT20ul，5mg/mL。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后加二甲基亞砜200 μ L，待紫色結(jié)晶全部溶解后用酶聯(lián) 免疫檢測(cè)儀在570nm處測(cè)OD值。表5FTS對(duì)體外培養(yǎng)脾淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響(χ 士 s，η = 10) ΔΡ < 0. 05，Δ ΔΡ < 0. 01，Δ Δ Δ ΔΡ < 0. 001與空白組進(jìn)行比較；有ConA刺激組的影 響大于無(wú)ConA刺激組。由圖1及表5的結(jié)果可見(jiàn)有或無(wú)ConA刺激時(shí)，各組0. 002 0. 008mg/ml濃度依賴地增強(qiáng)T細(xì)胞增殖效應(yīng)，而當(dāng)濃度大于0. 016mg/ml時(shí)促進(jìn)作用減弱。同時(shí)FTS+Zn組均 比FTS組效應(yīng)強(qiáng)，ConA刺激后T細(xì)胞增殖效應(yīng)明顯增強(qiáng)，在0. 016mg/ml處表現(xiàn)出的增殖效 應(yīng)最強(qiáng)，兩側(cè)呈下降趨勢(shì)。實(shí)施例六本實(shí)施例涉及碳粒廓清試驗(yàn)結(jié)果本試驗(yàn)以吞噬指數(shù)高低表示小鼠廓清血流中炭粒的能力。最適劑量的標(biāo)準(zhǔn)是小鼠 注射后，30min內(nèi)，對(duì)照組小鼠的廓清率要明顯低于被陽(yáng)性藥激活的小鼠廓清率。其中高劑 量組的劑量為2. 2mg 'kg—1、中劑量組的劑量為1. Img 'kg—1、低劑量組的劑量為0. 55mg -kg"1, 結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2的結(jié)果表明高劑量組2. 2mg · kg—1、中劑量組1. Img · kg—1、低劑量組 0. 55mg · kg—1三組吞噬指數(shù)均明顯高于空白對(duì)照組，其中高劑量組與環(huán)磷酰胺組結(jié)果接近， 吞噬指數(shù)都大于5，中劑量組和低劑量組的吞噬指數(shù)都大于4，而空白對(duì)照組的吞噬指數(shù)則 小于2。這一系列的結(jié)果說(shuō)明FTS能顯著的增強(qiáng)生物機(jī)體的免疫力。實(shí)施例七本實(shí)施例涉及FTS急性毒性試驗(yàn)的結(jié)果取禁食15小時(shí)的昆明小鼠，20只/組，雌雄各半，體重為22_24g，小鼠每次尾靜脈 注射體積為10mL/kg體重，連續(xù)觀察7日內(nèi)動(dòng)物的不良反應(yīng)及死亡狀況。記錄給藥前及觀 察結(jié)束時(shí)的體重。靜脈注射給藥后，連續(xù)觀察4小時(shí)，小鼠未見(jiàn)異常，未見(jiàn)小鼠出現(xiàn)中樞神 經(jīng)興奮或抑制等異常行為。給藥次日小鼠精神好，行為正常，活動(dòng)自如，呼吸頻率無(wú)變化，對(duì) 光聲等刺激敏感，被毛潤(rùn)澤；飼料消耗、飲水及糞便等均正常，未發(fā)現(xiàn)任何毒性反應(yīng)或死亡， 尾靜脈注射局部未發(fā)現(xiàn)紅腫、淤血和壞死。詳見(jiàn)表6。表6FTS急性毒性試驗(yàn)結(jié)果 表6的結(jié)果表明給藥7日存活小鼠平均體重增長(zhǎng)4_6g，試驗(yàn)中給藥5. Omg/kg組、 10. Omg/kg組、50. Omg/kg組、100. Omg/kg組小鼠均未發(fā)現(xiàn)任何毒性反應(yīng)或死亡。FTS臨床 人擬用量為4mg/次/日，而在最大試驗(yàn)劑量280mg/人/天，相當(dāng)于臨床用量的70倍時(shí)，均 未見(jiàn)小鼠異常，未見(jiàn)小鼠出現(xiàn)中樞神經(jīng)興奮或抑制等異常行為，小鼠精神好，行為正常，活 動(dòng)自如，呼吸頻率無(wú)變化，對(duì)光聲等刺激敏感，被毛潤(rùn)澤；飼料消耗、飲水及糞便等均正常， 未發(fā)現(xiàn)任何毒性反應(yīng)或死亡，尾靜脈注射局部未發(fā)現(xiàn)紅腫、淤血和壞死。因此，認(rèn)為FTS是 無(wú)毒的抗腫瘤的多肽。
實(shí)施例八本實(shí)施例涉及FTS在作為制備腫瘤物理及化學(xué)治療藥物的保護(hù)藥方面的用途的結(jié)果。所用材料和儀器龍膽紫(北京惠澤奧公司)，印度墨水(北京篤信精細(xì)制劑廠)，環(huán)磷酰胺(山西泰 盛制藥有限公司)，血清胸腺因子(FTS)由中國(guó)藥品生物制品標(biāo)準(zhǔn)化研究中心提供，。鈷源 (軍科院北京放射醫(yī)學(xué)研究所)，顯微鏡(CH20BIMF 200, Olympus)，分光光度計(jì)(UV-2550， SHIMADZU)。所用的方法1、白細(xì)胞計(jì)數(shù)白細(xì)胞稀釋液取冰醋酸1. 5mL和龍膽紫lmL，混勻，加蒸餾水至lOOmL。(1)在小試管中加0. 38mL白細(xì)胞稀釋液；(2)從鼠尾取血，用吸管準(zhǔn)確吸血20 μ L，擦凈吸管外沾附的血液。(3)迅速將血輕輕放入上述小試管中，并用上清液洗吸管2-3次，搖勻。(4)將白細(xì)胞混懸液滴入計(jì)數(shù)池內(nèi)，靜置2-3分鐘，待白細(xì)胞下沉后計(jì)數(shù)。(5)在低倍鏡下，白細(xì)胞呈圓形，漿透亮，核呈紫黑色，稍有折光，借此特點(diǎn)可與雜 質(zhì)相區(qū)別。計(jì)數(shù)池四角的4個(gè)大方格中所有的白細(xì)胞數(shù)，將總數(shù)乘以50，即得每Imm3血中 白細(xì)胞數(shù)。計(jì)算原理每個(gè)大方格面積為1mm3，計(jì)數(shù)池深度為0. 1mm，血稀釋20倍，故每Imm3 血中白細(xì)胞數(shù)為4個(gè)大方格的白細(xì)胞數(shù)X10X20 + 4。2、碳粒廓清法操作步驟體重18_22g小白鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，分別給與藥 物和溶劑。實(shí)驗(yàn)時(shí)每鼠尾靜脈注射印度墨汁0.05mL/10g體重，于Kt1)和5(t2)分鐘后，分 別從眼眶靜脈取血20 μ L，加到2ml、0. 1 % Na2CO3溶液中搖勻，用分光光度計(jì)在680nm比色， 測(cè)光密度。3、結(jié)果FTS抗輻射作用的免疫指標(biāo)檢測(cè)昆明鼠17 士 lg，10只/組，雌雄各半。650拉德Co60照射，照射率236. 1倫/分， 照射時(shí)間為2分鐘39. 4秒。陰性對(duì)照組每天皮下注射0. ImL生理鹽水，給藥組每天皮下注射不同劑量的FTS 0.5yg/只。陽(yáng)性對(duì)照物為尼爾雌醇，一次性灌胃取尼爾雌醇2片(2mg)，碾碎，加4mL水， 加0. 5%羧甲基纖維素鈉(CMC)，攪勻，灌胃0. ImL/只，即0. 05mg/只。一周后檢測(cè)血液白細(xì)胞總數(shù)，碳粒廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)，胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。用T 檢驗(yàn)比較給藥組與陰性對(duì)照組的差異顯著性。結(jié)果如表7所示表7FTS抗輻射作用的指標(biāo)檢測(cè) 表7的結(jié)果表明，給藥組的白細(xì)胞總數(shù)明顯增大，具有統(tǒng)計(jì)意義，給藥組的廓清指 數(shù)和吞噬指數(shù)也明顯提高，其中5μ g組和50 μ g組具有顯著性。給藥組的胸腺指數(shù)也有所 提高，其中50 μ g組具有顯著性。FTS對(duì)受輻射小鼠在免疫指標(biāo)上確有保護(hù)作用，并且5 μ g/ 只的劑量更佳。(I)FTS對(duì)受輻射小鼠存活率的影響昆明鼠20士 lg，20只/組，雌雄各半。分別用600拉德和700拉德Co60照射，照 射率246. 72倫/分。陰性對(duì)照每天皮下注射0. ImL生理鹽水，給藥組每天皮下注射不同劑量的FTS 0. 5 μ g/只，5 μ g/只，50 μ g/只，200 μ g/只。兩周后停藥，繼續(xù)觀察，到30天為止。陽(yáng)性 對(duì)照組為尼爾雌醇，一次性灌胃，取尼爾雌醇2片(2mg)，碾碎，加4mL水，加0. 5%羧甲基纖 維素鈉(CMC)，攪勻，灌胃0. ImL/只，即0. 05mg/只。結(jié)果如圖3，圖4，圖5，圖6所示。結(jié) 果表明，Co60照射后，皮下注射FTS明顯降低了小鼠的死亡率。無(wú)論是在較低輻射劑量600 拉德還是較高輻射劑量700拉德，F(xiàn)TS都對(duì)小鼠有保護(hù)作用。(2) FTS對(duì)腹水瘤小鼠的作用取20士 Ig的昆明小鼠，雌性，10只/組，二級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)。肝癌H22細(xì)胞經(jīng)小 鼠腹腔傳代保種，取其腹水瘤，1 1.5稀釋，腹腔接種0.4mL。每天皮下注射給藥，連續(xù)兩 周，空白對(duì)照注射生理鹽水，F(xiàn)TS給藥50 μ g/只。第15天考察腹水重，脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。 用t檢驗(yàn)比較給藥組和空白對(duì)照組之間的差異顯著性。結(jié)果如表8所示。表8FTS對(duì)腹水瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響 表8的結(jié)果表明FTS組胸腺指數(shù)明顯提高，并具有顯著性意義。但腹水重量沒(méi)有 明顯區(qū)別，表示腹水細(xì)胞不受抑制?？梢?jiàn)FTS對(duì)腹水瘤小鼠有一定的保護(hù)作用，通過(guò)脾指數(shù) 和胸腺指數(shù)初步反應(yīng)了免疫能力得到改善。(3) FTS對(duì)荷瘤小鼠化療的結(jié)果取20士 Ig的昆明小鼠，雌性，10只/組，二級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)。取肝癌H22腹水瘤 轉(zhuǎn)接為實(shí)體瘤，兩周后收集實(shí)體瘤細(xì)胞，分散細(xì)胞，背部皮下接種。每日腹腔注射環(huán)磷酰胺 (100mg/kg)，同時(shí)皮下注射不同濃度的合成多肽FTS，連續(xù)兩周，之后繼續(xù)注射多肽。20天 后記錄存活率和平均存活時(shí)間。用卡方實(shí)驗(yàn)和t檢驗(yàn)比較給藥組和空白對(duì)照組之間的差異 顯著性。結(jié)果如圖7、圖8所示。圖7、圖8的結(jié)果表明，到第20天的存活率有一定的差異，但因?yàn)榄h(huán)磷酰胺的作用， 小鼠都沒(méi)有明顯的腫瘤生長(zhǎng)。結(jié)果主要體現(xiàn)了藥物減小環(huán)磷酰胺的副作用。而且，5ygFTS 的作用比50 μ gFTS的作用明顯。
權(quán)利要求
血清胸腺因子在制備抗EAC腹水瘤藥物、抗H22實(shí)體瘤藥物、抗Walker-256瘤藥物方面的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了將血清胸腺因子(FTS)在制備抗腫瘤藥物、腫瘤物理治療及化學(xué)治療藥物的保護(hù)藥物或增強(qiáng)免疫藥物方面的用途。試驗(yàn)結(jié)果顯示，荷瘤小鼠、W256大鼠給藥各組與生理鹽水組均有顯著性差異且抑瘤率均大于30％，因此FTS抗腫瘤作用確實(shí)。FTS還能夠多方面提高機(jī)體的免疫活性，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。FTS無(wú)毒，所產(chǎn)生的副作用很小，而且它的有效作用劑量范圍很廣，安全范圍較大。在作為腫瘤物理及化學(xué)治療藥物的保護(hù)藥的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TS對(duì)機(jī)體免疫指標(biāo)具有明顯的保護(hù)。因此FTS可以為臨床上治療腫瘤提供一個(gè)新的靶向和發(fā)展方向。
文檔編號(hào)A61K38/08GK101879305SQ201010218238
公開(kāi)日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2007年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月25日
發(fā)明者樂(lè)嘉靜, 廖曉泉, 張長(zhǎng)平, 徐康森, 李湛君, 王悅 申請(qǐng)人:中國(guó)生化制藥工業(yè)協(xié)會(huì)