專利名稱：一種胸腺生成素-Ⅱ突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程重組蛋白領(lǐng)域，其中該基因工程蛋白是一種胸腺生成素-Ii 突變體。通過對(duì)天然蛋白的分子設(shè)計(jì)與基因工程改造，得到了具有更高穩(wěn)定性的胸腺生成 素-II突變體。
二.
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)是人體的防御系統(tǒng)。參與免疫反應(yīng)的主要細(xì)胞有T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞 和巨噬細(xì)胞。而胸腺是T淋巴細(xì)胞發(fā)育、分化的免疫中樞器官。胸腺分泌的胸腺因子(或 胸腺激素)是T淋巴細(xì)胞發(fā)育分化所需的一系列必需物質(zhì)，其中最為重要的兩種免疫增強(qiáng) 因子是胸腺素α 1(Τα 1)和胸腺生成素-II。胸腺素α 1的結(jié)構(gòu)和功能目前已經(jīng)研究得非常清楚，并且已經(jīng)作為藥品(如日達(dá) 仙)在市場上進(jìn)行銷售。相對(duì)來說，對(duì)胸腺生成素-I I的研究較少。從機(jī)體免疫系統(tǒng)的復(fù) 雜性和協(xié)同性來講，胸腺生成素-II作為另一種重要的免疫增強(qiáng)因子，值得進(jìn)行深入的研胸腺生成素-II是最早Goldstein等從小牛胸腺分離出的一種多肽，是一種49個(gè) 氨基酸的多肽，由13種氨基酸組成的。相對(duì)分子質(zhì)量為4818Da。胸腺生成素-II具有調(diào) 節(jié)神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)的作用和免疫激活作用，能夠促進(jìn)胸腺細(xì)胞和外周T細(xì)胞及B細(xì)胞分化發(fā) 育，并且能夠雙向調(diào)節(jié)機(jī)體失衡的免疫功能，具有獨(dú)特的生物學(xué)作用，是一種重要的免疫調(diào) 節(jié)劑，其32-36位氨基酸稱為胸腺五肽，是胸腺生成素-I I重要的功能活性部分。通過研究發(fā)現(xiàn)了胸腺生成素-I I在體外酸性狀態(tài)下(pH5)不夠穩(wěn)定，容易水解， 水解的位置發(fā)生在序列中6-7位的Asp-Pro肽鍵處，并且文獻(xiàn)表明，蛋白中的Asp-Pro序列 ￠011 ^牛T"胃m角軍(Acid-catalyzed peptide bond hydrolysi
s of recombinant
human interleukin 11. Pharmaceutical Res. 1994. Vol. 11. N01，72-74)，影響其分子穩(wěn)定 性。所以本發(fā)明通過對(duì)胸腺生成素-II 6位的氨基酸位點(diǎn)改造，從原來的Asp同源替換為 Glu，解決了分子在體外不穩(wěn)定的問題，為其作為免疫增強(qiáng)藥物的開發(fā)研究打下了基礎(chǔ)。
三.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及一種胸腺生成素-II突變體，其為SEQ ID NO :2所示的氨
基酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉，所述胸腺生成素-II突變體可以通過基因重組表達(dá)的 方法或者化學(xué)合成的方法制備。在本發(fā)明中，所述胸腺生成素-II突變體是通過基因工程 重組表達(dá)的方法獲得的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過如下方法獲得胸腺生成素-II和胸腺生成 素-II突變體，包括如下步驟1)表達(dá)載體的構(gòu)建依據(jù)已知胸腺生成素-II氨基酸序列(SEQ ID NO 1)，選用大腸桿菌偏好密碼子全基因合成胸腺生成素-II和胸腺生成素-II突變體(SEQ ID NO: 2) DNA序列，同時(shí)在相應(yīng) 于所編碼的氨基酸序列之5’端和3’端加上限制性酶切位點(diǎn)，加入EK酶酶切位點(diǎn)，得到編 碼胸腺生成素-II突變體的核酸序列。再分別將如上述制備的胸腺生成素-II序列和胸腺生成素-II突變體以及篩選質(zhì) 粒PBSK用限制性內(nèi)切酶處理好，經(jīng)計(jì)算各樣品濃度后按一定摩爾比加入T4連接體系。用限制性酶切下融合蛋白基因，再將該基因與用限制性酶處理好的Wmrmacia公 司質(zhì)粒pGEX連接，經(jīng)篩選得到正確的重組子pGEX-T2.2)胸腺生成素-II和重組胸腺生成素-II突變體的表達(dá)及分離純化將如上述所得重組子轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21，經(jīng)表達(dá)篩選出高表達(dá)基因工程菌 PGEX-T2/BL21，然后經(jīng)發(fā)酵，離心收集目的蛋白高表達(dá)的菌體。高壓均質(zhì)機(jī)破碎菌體并離心 得到含目的前體蛋白上清液，將上清液上樣到GST親和柱上，洗脫目的前體蛋白并用EK酶 酶切后，再將樣品通過陰離子柱進(jìn)一步純化，使得最終目的蛋白純度大于95%。3)重組胸腺生成素-II突變體的體外生物活性測定用E玫瑰花結(jié)實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品進(jìn)行生物活力測試首先分離健康人外周血單核細(xì)胞， 使用小牛血清調(diào)整細(xì)胞數(shù)至2 XlO6Ail。各取200 μ 1細(xì)胞液加入EP管中，再分別加入測試 樣品胸腺生成素-II突變體(lOOug/mL)與胸腺生成素-II (100ug/mL)，37°C水浴90分鐘， 每支EP管中加入200 μ 1綿羊紅細(xì)胞OX106/ml)，4°C放置3小時(shí)，涂片、染色后放于高倍鏡 下計(jì)數(shù)200個(gè)，淋巴細(xì)胞中形成玫瑰花結(jié)的細(xì)胞數(shù)(結(jié)合3個(gè)或以上的為一個(gè)玫瑰花結(jié))。 計(jì)算玫瑰藥形成細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。按以下公式計(jì)算增殖率。增殖率=樣品管藥結(jié)百分比-對(duì)照藥結(jié)百分比經(jīng)測試，本發(fā)明生產(chǎn)的胸腺生成素-II突變體的體外生物活性優(yōu)于胸腺生成 素-II。4)重組胸腺生成素-II突變體的體外穩(wěn)定性測定經(jīng)過測試，經(jīng)過改造后分子的體外穩(wěn)定性大大提高。5)重組胸腺生成素-II和胸腺生成素-II突變體的體內(nèi)生物活性測定7周大的雌性Balb/C小鼠(每組6只)連續(xù)IOd腹膜內(nèi)分別注射0. 2mL生理鹽 水，以及30 μ g/kg的胸腺生成素-II和胸腺生成素-II突變體，IOd后取血做流式細(xì)胞儀分 析。經(jīng)測試，本發(fā)明生產(chǎn)的胸腺生成素-II突變體體內(nèi)生物活性大于胸腺生成素-II。從上述結(jié)果可以看出，本發(fā)明的胸腺生成素-II突變體提高了分子穩(wěn)定性，從而 提高了其體內(nèi)生物活性。
四.
具體實(shí)施例方式1.胸腺生成素-II和胸腺生成素-II突變體前體蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與工程菌的 獲得表達(dá)載體的構(gòu)建依據(jù)已知胸腺生成素-I I氨基酸序列(SEQ ID NO 1)，選用大腸桿菌偏好密碼子 全基因合成胸腺生成素-II和胸腺生成素-II突變體(SEQ ID NO 2)的DNA序列，同時(shí)在 相應(yīng)于所編碼的氨基酸序列之5’端和3’端加上限制性酶切位點(diǎn)，加入EK酶酶切位點(diǎn)，得到編碼胸腺生成素-ii突變體的核酸序列。gga tcc |gat Gac gat gag aag |tct cm ttt ctt gaa gag cct tcc gtt ctt actBanHI EK 酶切位點(diǎn)MA GAA AAG TTA AM TCT GAA TTG GTC GCT AAT MC GTC ACC TTACCT GCC GGT GAA CAA CGT AAA GAT GTT TAT GTC CAG TTG TAC TTA CAAACT TTG ACT GCT GTT A 從 CGT TAA TGA GAA TTCEcoRI目的片段經(jīng)BamH I,EcoR I雙酶切后分別回收小片段，質(zhì)粒PGEX經(jīng)BamH I.EcoR I雙酶切后回收大片段，14°C在T4連接酶體系中兩段目的基因片段進(jìn)行連接，經(jīng)篩選得到 的重組質(zhì)粒命名為PGEX-T2。然后用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，涂布在含有100ug/ml氨 芐青霉素的LB平板，挑選陽性菌落在LA中培養(yǎng)至0D600為0. 6-0. 8時(shí)加入IPTG 0. ImM誘 導(dǎo)3-4小時(shí)離心收集菌體，8M尿素破菌后15% SDS-PAGE電泳時(shí)出現(xiàn)一條30KD左右的蛋 白帶，表達(dá)量為菌體可溶性蛋白的35%。所獲得的高效表達(dá)前體蛋白的工程菌分別命名為 PGEX-T2/BL21.2.胸腺生成素-II和胸腺生成素-II突變體的發(fā)酵1).搖瓶表達(dá)含胸腺生成素-II和胸腺生成素-II突變體前體蛋白基因的 PGEX-T2/BL21，在含100ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中搖瓶過夜(37°C，200rpm)，再按 1 30接種含有100ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3小時(shí)后，加入0. ImM IPTG 誘導(dǎo)4小時(shí)。收集菌體經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)含胸腺生成素-I I和胸腺生成素-II 突變體的前體蛋白(30KD)以可溶性表達(dá)為主，表達(dá)量占菌體可溶性蛋白的40%。2)發(fā)酵工藝a.培養(yǎng)基a)種子液培養(yǎng)基(LA)胰蛋白胨10克/升、酵母粉5克/升、氯化鈉10克/升、氨芐青霉素100微克
/毫升。b)培養(yǎng)基(I5 升)磷酸氫二鈉375克、磷酸二氫鉀80克、 氯化鈉10.克、氯化銨45克、 胰蛋白胨50克。以上成分一起在罐中滅菌；下面的成分單獨(dú)滅菌后加入發(fā)酵罐。硫酸鎂15克、 葡萄糖150克、補(bǔ)料(500克/升)葡萄糖b.發(fā)酵過程(a)種子培養(yǎng)從已鑒定的平皿上劃取菌種，接種到50毫升O50毫升的三角瓶)LA中，37度、200 轉(zhuǎn)/分、8小時(shí)后將這50毫升種子液轉(zhuǎn)接到700毫升LA中，36度、200轉(zhuǎn)/分，過夜。(b)發(fā)酵過程將培養(yǎng)好的種子液(0D_ = 3-4)加入罐中，調(diào)好各參數(shù)，37度、150轉(zhuǎn)、溶氧 100%，開始發(fā)酵；5小時(shí)后開始以2. 5速流加2小時(shí)，加入終濃度0. 3mM的IPTG誘導(dǎo)(五 小時(shí))。
3.胸腺生成素-II和胸腺生成素-II突變體的純化(1)親和層析采用GST Fast Flow層析介質(zhì)(GE公司)，平衡液采用25mM Tris-HCl, pH8，菌體 經(jīng)過破碎并離心取上清，上樣平衡后，裂菌的離心上清上Glutathione Sepharose層析柱， 平衡后用含IOmM還原型谷胱甘肽(GSH)的洗脫液洗下融合蛋白。(2)酶解上一步的洗脫液加入EK酶(5NIHU/mL) 37°C酶切20小時(shí)。(3)陰離子交換層析采用SOurce30Q層析介質(zhì)，平衡液為20mM PB, pH7，上一步得到的樣品用水稀釋1 倍進(jìn)行上樣，平衡后采用20mM PB, ρΗ7，0-1Μ NaCl，20個(gè)柱體積的梯度洗脫，收集目的蛋白 洗脫峰。4.檢測得到的胸腺生成素-II和胸腺生成素-II突變體通過SDS-PAGE純度檢測和反相 HPLC檢測，純度均大于95%。5.體外活性檢測E玫瑰藥結(jié)實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品進(jìn)行生物活力測試 基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)液1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基10. 0g, NaHCO3 2. 2g，Hepes5. 9g，丙酸鈉 0. llg，0. 05M巰基乙醇2. 0ml，ddH20 1000ml ；細(xì)胞培養(yǎng)基基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基90ml，小牛血清 10ml，雙抗(青霉素+鏈霉素)100U/ml，谷胱甘肽0. 03g/ml ；測活培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基95ml小牛血清5. 0ml，雙抗及谷胱甘肽濃度與上相同。過 濾滅菌；裂解液:SDS IOg,，DMSO 25ml, ddH20 19ml，調(diào) PH = 4. I0方法首先分離健康人外周血單核細(xì)胞，使用小牛血清調(diào)整細(xì)胞數(shù)至2X106/ml。 各取200 μ 1細(xì)胞液加入EP管中，再分別加入測試樣品胸腺生成素-I I突變體(IOOug/ mL)與胸腺生成素-II(100ug/mL)，37°C水浴90分鐘，每支EP管中加入200μl，綿羊紅細(xì)胞 QX 106/ml)，4°C放置3小時(shí)，涂片、染色后放于高倍鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)，淋巴細(xì)胞中形成玫瑰 花結(jié)的細(xì)胞數(shù)(結(jié)合3個(gè)或以上的為一個(gè)玫瑰花結(jié))。計(jì)算玫瑰藥形成細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。按以下公式計(jì)算激活率。激活率=樣品管藥結(jié)百分比-對(duì)照藥結(jié)百分比樣品對(duì)E玫瑰花結(jié)形成率的影響
E玫瑰花結(jié)形成數(shù)增殖率陰性對(duì)照26. 2%0胸腺生成素-II (100ug/ml)40. 3%14. 1%胸腺生成素-II突變體(100ug/ml)47. 7%21. 5% 由上表可知，本發(fā)明生產(chǎn)的胸腺生成素-II突變體的體外生物活性優(yōu)于胸腺生成
6素-II。6.重組胸腺生成素-II和重組胸腺生成素-II突變體的體外穩(wěn)定性測定
權(quán)利要求
1. 一種胸腺生成素-II突變體(SEQ ID NO :2)，其氨基酸序列為Ser Gln Phe Leu Glu Glu Pro Ser Val Leu Thr Lys Glu Lys Leu Lys Ser Glu Leu Val Ala Asn Asn Val Thr Leu Pro Ala Gly Glu Gln Arg Lys Asp Val Tyr Gln Leu TyrLeu Gln Thr Leu Thr Ala Val Lys Arg0
2. 一種多核苷酸序列，其編碼權(quán)利要求1所述的胸腺生成素-II突變體。
3.權(quán)利要求1中的胸腺生成素-II突變體，使用大腸桿菌為宿主細(xì)胞，應(yīng)用基因工程的 方法進(jìn)行表達(dá)。
4. 一種治療受試對(duì)象中免疫力低下的方法以及疫苗輔助增強(qiáng)的方法，包括向所述受試 對(duì)象施用治療有效量的權(quán)利要求1中所述的胸腺生成素-II突變體。
5.權(quán)利要求4中的方法，其中所述受試對(duì)象是哺乳動(dòng)物。
全文摘要
利用基因工程手段對(duì)天然胸腺生成素-II進(jìn)行改造，制備出的胸腺生成素-II突變體，在體外具有更高的穩(wěn)定性，為其作為免疫增強(qiáng)藥物的開發(fā)研究打下了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102079785SQ200910250188
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2009年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月30日
發(fā)明者汪曉東 申請(qǐng)人:汪曉東