專利名稱：固相合成胸腺肽α1的16肽階段的缺失肽及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及固相合成胸腺肽α 1中的缺失肽及檢測(cè)方法，尤其涉及固相合成胸腺肽α 1的16肽階段的缺失肽及檢測(cè)方法，屬于固相合成胸腺肽α 1領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
胸腺肽α 1是從胸腺素組分5 (TF-5)中分離出的一種活性多肽，由28個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為3108.37。在TF-5中，胸腺肽α 1的含量為0.6%，是人體胸腺激素的重要活性組分。例如胸腺肽α 1可調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞發(fā)育、分化和成熟。此外，胸腺肽α 1能修復(fù)受損的T淋巴細(xì)胞。雖然從TF-5中分離的胸腺肽α 1無明顯毒副反應(yīng)，但由人工固相合成的市售胸腺肽α1可因不純而造成不良反應(yīng)。目前，人工固相合成胸腺肽α1的操作規(guī)程千篇一律，幾乎沒有優(yōu)化空間。市售的保護(hù)氨基酸和相關(guān)試劑的純度也足以支持人工固相合成高純度胸腺肽α1。在操作規(guī)程不出差錯(cuò)的前提下，人工固相合成的胸腺肽α 1是否純，取決于它含的缺失肽的狀況。與小分子藥物不同，多肽的生物活性非常強(qiáng)。在人工固相合成的胸腺肽α 1中，SP使存在微量的缺失肽也可造成嚴(yán)重的毒副作用。控制人工固相合成的胸腺肽α 1的質(zhì)量的關(guān)鍵是控制缺失肽。目前國內(nèi)外既沒有披露人工固相合成的胸腺肽α 1中的缺失肽狀況，也沒有公開測(cè)定人工固相合成的胸腺肽α 1中的缺失肽的方法。這種狀態(tài)不適應(yīng)胸腺肽α 1的臨床地位。為了改善這種狀況，保障胸腺肽α 1的臨床用藥安全性，形成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種能夠準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)固相合成胸腺肽α I的16肽階段是否含有缺失肽的方法；本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供固相合成胸腺肽α 1的16肽階段的缺失肽譜；本發(fā)明的目的之三是將固相合成胸腺肽α 1的16肽階段的缺失肽譜應(yīng)用于胸腺肽α I固相合成中的質(zhì)量控制。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:一種檢測(cè)固相合成胸腺肽α 1的16肽階段是否含有缺失肽的方法，包括以下步驟:將固相合成胸腺肽α 1過程中的16肽樣品采用LC/MS聯(lián)用儀進(jìn)行梯度洗脫獲取離子流譜；如果所獲取的離子流譜在5.1lmin時(shí)出現(xiàn)峰面積為9.86%的離子流峰、在7.27min時(shí)出現(xiàn)峰面積為4.09%的離子流峰、在16.35min時(shí)出現(xiàn)峰面積為2.73%的離子流峰、在17.02min時(shí)出現(xiàn)峰面積為1.84%的離子流峰、在17.93min時(shí)出現(xiàn)峰面積為7.26%的離子流峰、在19.16min時(shí)出現(xiàn)峰面積為2.69%的離子流峰、在19.79min時(shí)出現(xiàn)峰面積為0.58%的離子流峰、在20.75min時(shí)出現(xiàn)峰面積為0.43%的離子流峰或在24.97min時(shí)出現(xiàn)峰面積為2.14%的離子流峰；則說明固相合成胸腺肽α I的16肽階段中含有缺失肽。本發(fā)明所述的胸腺肽α 1的16肽的氨基酸序列為SEQ ID N0.1所示。所述的梯度洗脫優(yōu)選為用0.1%甲酸/乙腈梯度洗脫，流速為0.4ml/min，梯度為:0-5min, 0.1% 甲酸 / 乙臆=97/3 ；5-30min, 0.1% 甲酸 / 乙臆=75/25。本發(fā)明方法中LC/MS聯(lián)用儀中的LC采用Agilent 1200自動(dòng)進(jìn)樣，Waters XterraRP18分析柱的規(guī)格為5 μ m，3.0 X 150mm ；LC/MS聯(lián)用儀中的MS采用Bruker SolatixFT-1CR-MS，離子流檢測(cè)器。本發(fā)明進(jìn)一步提供了固相合成胸腺肽α I的16肽階段的缺失肽，其氨基酸序列分別為 SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQID N0.7、SEQ ID N0.8SEQ ID N0.9 或 SEQ ID N0.10 所示；本發(fā)明所提供的缺失肽作為胸腺肽α I固相合成過程中的質(zhì)量控制物，應(yīng)用于提高固相合成胸腺肽α I的質(zhì)量或純度。本發(fā)明方法可以準(zhǔn)確、靈敏的鑒別出固相合成胸腺肽α I的11肽階段是否含有缺失肽或非肽雜質(zhì)，可以有效地保障和控制胸腺肽α I的質(zhì)量，在制備高純度固相合成胸腺肽α I中有重要應(yīng)用價(jià)值。


圖1 胸腺妝 α I 的十六妝片段 Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的離子流。圖2 胸腺妝 α I 的十六妝片段 Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的質(zhì)譜。圖3 胸腺肽 α I 的十六肽片段缺失肽 Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的質(zhì)譜。圖4 胸腺肽 α I 的十六肽片段的缺失肽 Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的質(zhì)譜.
圖5 胸腺肽 α I 的十六肽片段缺失肽 Thr-Lys-Asp-Leu-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的質(zhì)譜。圖6 胸腺肽 α I 的十六肽片段缺失肽 Lys-Asp-Leu-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-GIu-Glu-Ala-Glu-Asn 的質(zhì)譜。圖1 胸腺肽 α I 的十六肽片段缺失肽 Thr-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的質(zhì)譜.
圖8 胸腺肽 α I 的十六肽片段缺失肽 Thr-Asp-Leu-Lys-Lys-Lys-Glu-Val-Val-GIu-Glu-Ala-Glu-Asn 的質(zhì)譜。圖9 胸腺肽 α I 的十六肽片段缺失肽 Asp-Leu-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-GIu-Ala-Glu-Asn 的質(zhì)譜。圖10 胸腺肽 α I 的十六肽片段缺失肽 Thr-Leu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的質(zhì)譜.
圖 11F3CC0-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn的質(zhì)譜。圖12 胸腺肽 α I 的十六肽片段缺失肽 Thr-Asp-Leu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的質(zhì)譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1固相合成胸腺肽α I1.制備 Fmoc-Asn (Trt)-Wang Resin稱取IOg (3.lmmol) Wang Resin置于固相反應(yīng)合成柱中。加入60ml DCM溶脹樹脂lOmin，抽走DCM。用DMF洗樹脂三次，每次50ml，吹氣兩分鐘，抽走溶劑。于磨口三角瓶中稱取 5.5g(9.3mmol)Fmoc-Asn(Trt)和 1.38g(10.23mmol)HOBt，加入 50ml DMF 溶解。在冰水浴中冷卻下加2.15ml (13.95mmol)DIC活化5min。將活化后的氨基酸加入用DMF洗好的樹脂中，然后加入0.23g(l.86mmol)DMAP，用氮?dú)獯禋膺M(jìn)行攪拌，室溫反應(yīng)2_4h。反應(yīng)結(jié)束后用DMF洗樹脂三次，每次50ml，吹氣兩分鐘，抽干溶劑。取少量樹脂，用甲醇收縮三次,真空干燥至恒重，測(cè)替代值，如替代值達(dá)到預(yù)期，將樹脂用乙酸酐封閉未反應(yīng)的羥基，封閉反應(yīng)2-4h后，用DMF洗樹脂三次，每次50ml，吹氣兩分鐘，抽走溶劑。用甲醇收縮樹脂三次，每次50ml,吹氣5min,抽走溶劑,真空干燥至恒重,測(cè)替代值。如替代值達(dá)到預(yù)期。2.Fmoc-Asn (Trt) -ffang Resin 的溶脹和脫 Fmoc上面得到的Fmoc-Asn (Trt)-Wang Resin并置于固相反應(yīng)合成柱中，加60mlDCM溶脹lOmin，然后抽走DCM。用DMF洗滌樹脂，每次用50ml DMF,每次洗2min，共洗三次。用濃度為20 %的piperidine的DMF溶液脫Fmoc,共脫兩次，每次50ml, —次脫3min,另一次脫8min。然后用DMF洗滌樹脂，每次用50ml DMF洗2min，共洗四次。最后用DCM洗滌Asn (Trt) -ffang Resin,每次洗2min,共洗兩次。抽走溶劑。樹脂對(duì)卻三酮顯黃色。3.制備 Glu (OtBu)-Asn (Trt)-Wang Resin稱取2.12g (4.98mmol) Fmoc-Glu (OtBu)和 0.74g (5.5mmol) HOBt 于干燥磨 口 三角瓶中，用50ml DMF溶解，溶液置冰浴冷卻。加1.15ml (7.47mmol)DIC活化5min。然后將活化后的氨基酸加到上面得到的Asn(Trt)-Wang Resin中反應(yīng)2h。抽走反應(yīng)液。用DMF洗漆樹脂，每次用50ml DMF，每次洗2min，共洗三次。樹脂對(duì)茚三酮不顯色。用濃度為20%的piperidine的DMF溶液脫Fmoc,共脫兩次,每次50ml,第一次脫3min,第二次脫8min。然后用DMF洗滌樹脂，每次用50ml DMF洗2min，共洗四次。最后用DCM洗滌樹脂，每次洗2min，共洗兩次。抽走溶劑。樹脂對(duì)茚三酮顯黃色。4.制備 Ser (tBu)-Asp (OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp (OtBu)-Thr (tBu)-Ser (tBu)-Ser(tBu)-Glu-(OtBu)-1le-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys (Boc)-Glu(OtBu) -Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-ffang Resin按照制備Glu (OtBu) -Asn (Trt) -ffang Resin 的方法依次將 1.55g (4.98mmol)Fmoc-Ala,2.12g(4.98mmol)Fmoc-Glu(OtBu),2.12g(4.98mmol)Fmoc-Glu(OtBu),2.53g(7.47mmol)Fmoc-Val,2.53g (7.47mmo1)Fmoc-Val,3.17g(7.47mmo1)Fmoc-Glu(OtRu)，
3.50g (7.47mmol) Fmoc-Lys (Boc) , 4.67g (9.96mmol) Fmoc-Lys (Boc)，4.23g (9.96mmol)Fmoc-Glu (OtBu),4.67g (9.96mmol)Fmoc-Lys(Boc),3.52g(9.96mmol)Fmoc-Leu,4.09g (9.96mmol) Fmoc-Asp (OtBu)，4.67g (9.96mmol) Fmoc-Lys (Boc)，3.96g (9.96mmol)Fmoc-Thr (tBu)，3.96g (9.96mmol)Fmoc-Thr (tBu)，3.52g (9.96mmol)Fmoc-1Ie，
3.17g (7.47mmol) Fmoc-Glu (OtBu)，2.86g (7.47mmol) Fmoc-Ser (tBu)，2.86g (7.47mmol)Fmoc-Ser (tBu)，2.97g (7.47mmol)Fmoc-Thr (tBu)，3.07g(7.47mmol)Fmoc-Asp(OtBu)，2.53g(7.47mmol) Fmoc-Val，2.32g(7.47mmol)Fmoc-Ala，3.1Og(9.96mmol)Fmoc-Ala，
4.09g(9.96mmol)Fmoc-Asp (OtBu)和 3.81g(9.96mmol)Fmoc-Ser (tBu)偶聯(lián)到Glu (OtBu) -Asn (Trt) -Wang Resin 上并脫 Fmoc。5.制備Ac-Ser (tBu)-Asp (OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp (OtBu)-Thr (tBu)-Ser (tBu)-Ser (tBu) -Glu-(OtBu) -1le-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys (Boc)-Glu (OtBu)-Lys (Boc)-Lys (Boc)-Glu (OtBu)-Val-Val-Glu (OtBu)-Glu (OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Wang Resin0°C下將1.18ml(12.45mmol)乙酸酐于干燥磨口三角瓶中與50ml DMF混合，然后加 0.44ml (2.49mmol) DIPEA 活化 5min。將活化后的乙酸酐與 Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Ala-Ala-Val-Asp (OtBu)-Thr (tBu)-Ser (tBu)-Ser (tBu)-Glu(OtBu)-1le-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys-(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys (Boc)-Glu(OtBu)-Lys (Boc)-Lys(Boc)-Glu (OtBu)-Val-Val-Glu- (OtBu) -Glu (OtBu) -Ala-Glu (OtBu) -Asn (Trt) -WangResin 反應(yīng) 2h。抽走反應(yīng)液。樹脂用DMF洗滌4次，每次50ml DMF,每次洗2min。樹脂用DCM洗滌2次，每次用50ml DCM,每次洗3min。抽走溶劑。樹脂對(duì)茚三酮不顯色。樹脂用MeOH收縮3次，每次用50ml MeOH,每次收縮5min，抽干。得18.5g干燥肽樹脂。低溫保存。 6.從 Ac-Ser (tBu)-Asp (OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu) -Ser (tBu)-Glu-(OtBu)-1le-Thr (tBu)-Thr (tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys (Boc)-Glu (OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu (OtBu)-Asn (Trt)-Wang Resin 切割胸腺肽 α I0°C下將18.5g干燥的肽樹脂與180ml裂解液(TFA/TIS/H20)反應(yīng)0.5h，室溫反應(yīng)2.5h。反應(yīng)結(jié)束后，用砂芯漏斗過濾分離樹脂。樹脂用少量TFA洗滌三次。合并的濾液用0°C的1800ml的乙醚沉淀出胸腺肽α I粗品。離心分離出胸腺肽α I粗品。胸腺肽α I粗品用O°C的乙醚洗滌粗肽三次，用N2吹走殘余乙醚，置于真空干燥器干燥至恒重，得6.27g胸腺肽α I粗品，收率為81%，含量為68 %。試驗(yàn)例IFmoc-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys (Boc)-Glu (OtBu)-Lys (Boc)-Lys (Boc) -Glu-(OtBu) -Val-Val-Glu(OtBu) -Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Wang Resin的缺失肽譜及其鑒定取少量Fmoc-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys (Boc)-Glu (OtBu)-Lys (Boc)-Lys (Boc) -Glu-(OtBu) -Val-Val-Glu(OtBu) -Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Wang Resin不經(jīng)純化，按照標(biāo)準(zhǔn)方法切割并脫保護(hù)。得到的胸腺肽α I的十六肽片段Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(SEQ ID N0.1)在 LC(Agilent1200 自動(dòng)進(jìn)樣，Waters Xterra RP18 分析柱，5 μ m，3.0 X 150mm)/MS (Bruker SolatixFT-1CR-MS，離子流檢測(cè)器)聯(lián)用儀上進(jìn)行分析。用0.1 %甲酸/乙腈梯度洗脫，洗脫梯度見表I。表I胸腺肽α I的十六肽片段的洗脫梯度
權(quán)利要求
1.檢測(cè)固相合成胸腺肽αI的16肽階段是否含有缺失肽的方法，包括以下步驟:將固相合成胸腺肽α I過程中獲得的16肽采用LC/MS聯(lián)用儀進(jìn)行梯度洗脫獲取離子流譜；如果所獲取的離子流譜在5.1lmin時(shí)出現(xiàn)峰面積為9.86%的離子流峰、在7.27min時(shí)出現(xiàn)峰面積為4.09%的離子流峰、在16.35min時(shí)出現(xiàn)峰面積為2.73%的離子流峰、在17.02min時(shí)出現(xiàn)峰面積為1.84%的離子流峰、在17.93min時(shí)出現(xiàn)峰面積為7.26%的離子流峰、在19.16min時(shí)出現(xiàn)峰面積為2.69%的離子流峰、在19.79min時(shí)出現(xiàn)峰面積為0.58%的離子流峰、在20.75min時(shí)出現(xiàn)峰面積為0.43%的離子流峰或者在24.97min時(shí)出現(xiàn)峰面積為2.14%的離子流峰；說明固相合成胸腺肽α I的11肽階段中含有缺失肽。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的胸腺肽αI的16肽的氨基酸序列為 SEQ ID N0.1 所示。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的梯度洗脫為用0.1 %甲酸/乙腈梯度洗脫，流速為0.4ml/min,梯度為:0-5min,0.1%甲酸/乙腈=97/3 ；5-30min,0.1%甲酸/ 乙腈=75/25。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述LC/MS聯(lián)用儀中的LC采用Agilent1200自動(dòng)進(jìn)樣，Waters Xterra RP18分析柱的規(guī)格為5 μ m，3.0X 150mm ;LC/MS聯(lián)用儀中的MS 米用 Bruker Solatix FT-1CR-MS,離子流檢測(cè)器。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述缺失肽的氨基酸序列分別為SEQIDN0.2,SEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4,SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.6,SEQ ID N0.7,SEQ ID N0.8,SEQ ID N0.9 或 SEQ ID N0.10 所示。
6.固相合成胸腺肽αI的16肽階段中的缺失肽譜，其特征在于:其氨基酸序列分別為SEQ ID N0.2,SEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4,SEQ ID N0.5,SEQ IDN0.6,SEQ ID N0.7,SEQ IDN0.8、SEQ ID N0.9 或 SEQ ID N0.10 所示。
7.權(quán)利要求6所述的缺失肽譜作為質(zhì)量控制物提高固相合成胸腺肽αI的質(zhì)量或純度中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了檢測(cè)固相合成胸腺肽α1的16肽階段是否含有缺失肽的方法，包括將固相合成胸腺肽α1的16肽采用LC/MS聯(lián)用儀進(jìn)行梯度洗脫獲取離子流譜；如果所獲取的離子流譜在5.11min、7.27min、16.35min、17.02min、17.93min、19.16min、19.79min、20.75min或24.97min時(shí)分別出現(xiàn)峰面積為9.86％、4.09％、2.73％、1.84％、7.26％、2.69％、0.58％、0.43％或2.14％的離子流峰；說明固相合成胸腺肽α1的16肽合成階段中含有缺失肽。本發(fā)明可有效保障和控制胸腺肽α1的質(zhì)量。
文檔編號(hào)C07K7/08GK103163235SQ20121023952
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月12日
發(fā)明者朱正兵, 彭濤, 王玲, 張金花 申請(qǐng)人:海南合瑞制藥股份有限公司