專利名稱：橡膠樹膠乳小G蛋白Rop家族成員蛋白及其編碼基因的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種橡膠樹膠乳小G蛋白Rop家族成員蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
小G蛋白是結合鳥苷酸的單體蛋白，在真核細胞中具有分子開關的作用(Zhenbiao Yang, Small GTPases!Versatile Signaling Switches in Plants. The PlantCell,2002. 14, p. S375-S388;V Vernoud,V. ,et al. , Analysi s of the small GTPasegene superfamily of Arabidopsis. Plant physiology,2003. 131 (3):p. 1191-1208;Nibaua, C. , ffu, HM. and Cheung, AY. , RAC/R0P GTPases:hubs’ for signal integration anddiversification in plants. Trends in Plant Science, 11 (6) :p. 309-315. X許多石開究證實，植物小G蛋白Rop亞家族成員是植物進化中形成的一類特有基因，它們廣泛參與植物細 胞內的多種生理活動，包括肌動蛋白細胞骨架的組織、細胞極性、細胞生長、分化和死亡、細胞壁形成、細胞質內鈣離子濃度的調控，02_和H2O2生成，泛素依賴的蛋白降解系統(tǒng)，脅迫或激素誘導的信號轉導等。隨著科研工作的深入開展，人們發(fā)現(xiàn)小G蛋白Rop家族基因的功能更加多樣化，在不同的植物中，表現(xiàn)出與不同經(jīng)濟生物學特性的相關性。例如，在棉花中，與棉纖維的發(fā)育密切相關；在豆科植物中，與根瘤菌的侵入和形成相關；在桉樹中，參與桉樹次生木質部的發(fā)生發(fā)育等(Foucart, C.，et al. , Overexpression of EgROPl, a Eucalyptusvascular-expressed Rac-Iike small GTPase, affects secondary xylem formation inArabidopsis thaliana. New Phytol, 2009. 183(4) :p. 1014-29.)。那么在橡膠樹中呢，到目前為止，未見任何有關橡膠膠乳小G蛋白Rop家族基因克隆的相關報道。天然橡膠(順式-1，4-聚異戊二烯，橡膠烴)是一種重要的工業(yè)原料和不可或缺的戰(zhàn)略物資，在世界經(jīng)濟發(fā)展中扮演重要角色。目前，巴西橡膠樹是天然橡膠的主要來源。巴西橡膠樹的乳管是天然橡膠生物合成和貯存的地方，也是橡膠樹的一種防衛(wèi)結構。天然橡膠生物合成是乳管細胞內的主要代謝活動，因為橡膠烴占其細胞質(膠乳)干重的90%以上。膠乳再生過程要求乳管細胞具有非常強的代謝活性，特別是能量再生代謝、蛋白質合成和運輸?；趯χ参镄蛋白Rop家族基因功能的分析，我們推測小G蛋白Rop成員，尤其是膠乳中的Rop成員，在橡膠樹中也一定會具有重要的功能。最近李德軍等(2010)報道活性氧的產生與清除很可能在橡膠樹重要病害一死皮病(tapping panel dryness, TPD)發(fā)生中具有重要作用，而小G蛋白Rop成員參與調控ROS的產生，因此很可能參與調控死皮病的發(fā)生調控° (Li，D.，et al. , Identification and characterization of genes associatedwith tapping panel dryness from Hevea brasiliensis latex using suppressionsubtractive hybridization. BMC Plant Biol, 2010. 10:p. 140.),他們只是報道了 Rop 成員的部分序列，沒有克隆該成員基因，也沒有更多深入研究，不過他們的研究足以證明我們推測的正確性
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種小G蛋白Rop家族成員蛋白的編碼基因與應用。本發(fā)明所提供的小G蛋白Rop家族成員蛋白，來源于大戟科橡膠屬的巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis),名稱為HbRop5,是如下I)或2)的蛋白質:I)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列I的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與序列I所示蛋白具有相同活性的由I)衍生的蛋白質。序列表中的序列I由209個氨基酸殘基組成。
為了便于序列I編碼的HbRop5純化，可在由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表I所示的標簽。表I標簽的序列
標簽殘基序列
Poly-Arg5-6 (通常為 5 個)RRRRR
Poly-His2-10 (通常為 6 個)HHHHHH
FLAG8DYKDDDDK
Strep-tag II8WSHPQFEK
c-myc10EQKLISEEDL上述HbRop5可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述HbRop5的編碼基因可通過將序列表中序列2自5'末端第94-723位堿基所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表I所示的標簽的編碼序列得到。所述小G蛋白Rop家族成員蛋白(HbRop5)的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述小G蛋白Rop家族成員蛋白(HbRop5)的編碼基因為如下I)或2)或3)或4)的DNA分子I)序列表中序列2所示的DNA分子；2)序列表中序列2自5'末端第94-723位核苷酸所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述小G蛋白Rop成員的DNA分子；4)與序列表中SEQ ID No 2的核苷酸序列具有80%以上的同源性的且編碼蛋白具有蔗糖轉化酶功能的核苷酸序列。序列表中的序列2由891個核苷酸組成。序列表中序列I全長為891個核苷酸(nt)，包含一個長度為630個核苷酸的開放閱讀框(0RF，自序列2的5 ^端第94-723位核苷酸序列)、93nt的5，-UTR (自序列2的5 '端第1-93位核苷酸序列)和167nt的3，-UTR(自序列2的5 '端第724-891位核苷酸序列)。編碼一個長度為209個氨基酸(序列表中序列I)。
所述嚴格條件可為在0.1\55 6(或0.1\550，0.1%505的溶液中，在65° C下雜
交并洗膜。含有所述小G蛋白Rop家族成員編碼基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的HbRop5具有GTP結合活性，調控ROS生成，轉入植物中，可使植物具有廣泛的抗病特性，并促進植物莖的徑向發(fā)育。本發(fā)明的ffiRop5蛋白具有GTP結合活性，可以調控活性氧ROS的生成與代謝，參與脅迫應答，具有調控林木次生木質部和韌皮部發(fā)育的特征，轉基因作物或林木中，可提高其對逆境的抗性，從而提高產量。


、圖I為HbRop5的系統(tǒng)進化分析；HbRop5與16個同源基因的功能聚類分析圖，其中，開頭兩個字母的意義為=At (擬南芥)；0s (水稻)；Gh (陸地棉)；Hv (大麥)；Nt (煙草)；Zm(玉米)；Hb (橡膠樹)；其余字母為基因名稱。圖2為HbRop5氨基酸序列和17個來自其它植物中抗病Rop蛋白的功能域分析；其中，開頭兩個字母的意義為=At(擬南芥)；0s(水稻)；Gh(陸地棉)；Hv(大麥)；Nt(煙草)；Zm(玉米)；Hb (橡膠樹)；其余字母為蛋白名稱。圖3為HbRop5基因在不同死皮程度橡膠樹中的表達情況圖4為HbRop5基因的組織特異性表達分析圖5為割膠對HbRop5基因表達的影響圖6為乙烯利處理對HbRop5基因表達的影響圖7為短時間機械傷害對HbRop5基因表達的影響圖8為長時間機械傷害對橡膠樹次生乳管的誘導和對HbRop5基因表達的影響圖9為甲基茉莉酸對HbRop5基因表達的影響圖10為細胞分裂素(6-BA) HbRop5基因表達的影響圖11為HbRop5的原核表達分析.箭頭所示條帶為受IPTG誘導后所產生的特異表達的目標蛋白。
具體實施例方式下述實施例中所述的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施例I、小G蛋白Rop成員HbRop5編碼基因的獲得及其效果驗證我們首次克隆了橡膠樹膠乳中小G蛋白Rop家族成員蛋白編碼基因HbRop5的全長cDNA，并進行了序列分析和功能研究。I.小G蛋白Rop成員蛋白及其編碼基因HbRop5的獲得我們建立了橡膠樹膠乳EST序列數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)小G蛋白Rop成員編碼基因HbRop5的EST片段，進一步利用cDNA末端的快速擴增技術(3’ RACE)，最終獲得包含完整讀碼框的cDNA序列。具體方法如下〈1>保守片段獲得通過搜索我們建立的已經(jīng)注釋好的橡膠樹膠乳EST序列數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)一段399bp上下的小G蛋白Rop成員編碼基因HbRop5的EST片段。根據(jù)Genetyx軟件分析，該EST片段已經(jīng)包括完整的5’末端序列，3’末端序列尚不完全?！?>3 Ij^RACE根據(jù)小G蛋白Rop成員編碼基因HbRop5的EST片段設計3 ’ RACE引物(第一輪5’ GTGCTAATGTGGCTGTGGAT3，;第二輪5’ GCAGAITGAGGCCACTGAGTTAC3’)，通用引物QT, QO和Ql的序列及RACE操作流程參照文獻(迪芬巴赫C W，德維克斯勒G S. PCR技術實驗指南.黃培堂譯.北京科學出版社，1998 :268 277)。進行3’ RACE時，以Randomprimer反轉錄進行cDNA第一鏈合成,反應產物經(jīng)乙醇沉淀去除多余dNTP和引物后。第一輪擴增以巴西橡膠樹熱研7-33-97 (中國熱帶農業(yè)科學院橡膠研究所培育，中國熱帶農業(yè)科學院橡膠研究所長期有種苗出售)第一鏈cDNA為模板，使用引物QT、QO和第一輪引物(5’-GTGCTAATGTGGCTGTGGAT-3，)，終濃度分別為 0. 04 u mol/L、0. 4 u mol/L 和 0. 4 y mol/L,在25 ill反應體系中進行PCR擴增。擴增程序為首先，94°C變性5min，50°C退火2min，72 °C延伸40min ;然后，94°C變性lmin，54°C退火lmin，72°C延伸lmin，共30次循環(huán);最后，72°C延伸lOmin。PCR產物稀釋100倍后，取I 稀釋產物作為模板，使用終濃度均為0. 4 y mol/ L的Ql和第二輪引物(5’-GCAGATTGAGGCCACTGAGTTAC-3’)進行第二輪嵌套擴增，PCR擴增程序為94°C預變性5min ;94°C變性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸Imin，共30次循環(huán)；72°C延伸lOmin。獲得595bp左右的核苷酸片段。根據(jù)測序結果和拼接分析，已經(jīng)獲得了 3’端的完整序列。<4>HbRop5 cDNA 全長克隆根據(jù)上述所得到的巴西橡膠樹HbRop5基因的cDNA部分片段和3’端序列，利用SECentral軟件進行序列拼接,得到HbRop5基因全長cDNA的拼接序列。根據(jù)拼接序列，分別在5’末端和3’末端各設計一條引物(5-F (正義鏈引物)5’-TTGACTTTTTGGGGGAGTTC-3’;5-891R (反義鏈引物)5’ -CCTGGTTAATGGGGCTACAA-3’)。以巴西橡膠樹熱研7_33_97的第一鏈cDNA為模板,使用Taq plus polymerase進行PCR擴增，引物終濃度均為0. 4 ii mol/L,擴增程序為94°C預變性3min ;94°C變性lmin，58°C退火lmin，72°C延伸I. 5min，共30次循環(huán)；72°C延伸lOmin。將該PCR獲得的片段克隆到pMD18_T載體進行測序，經(jīng)測序表明獲得獲得片段大小為891bp的cDNA全長序列。該獲得的片段即為本發(fā)明的小G蛋白Rop成員編碼基因ffiRop5基因，該片段具有序列表中序列I的核苷酸序列，序列表中序列I全長為891個核苷酸(nt)，包含一個長度為630個核苷酸的開放閱讀框(0RF，自序列2的5 '端第94-723位核苷酸序列)、93nt的5’_UTR (自序列2的V端第1_93位核苷酸序列)和167nt的3’ -UTR (自序列2的5 ^端第724-891位核苷酸序列)，推測編碼一個長度為209個氨基酸(序列表中序列I)、分子量為23. IIKDa的蛋白，即為Rop蛋白成員HbRop5，將該小G蛋白Rop基因命名為HbRop5。將PCR獲得的片段克隆到pMD18_T載體獲得的含有序列2的核苷酸的PMD18-T重組載體命名為pMD18-HbRop5。根據(jù)小G蛋白基因參與植物抗病的相關文獻報道，我們挑選來自其它模式植物或重要經(jīng)濟作物(擬南芥、煙草、水稻、大麥、玉米和棉花)中具有代表性的16個抗病相關的Rop基因和I個橡膠樹膠乳中的Rop家族成員HbRop5的氨基酸進行比較聚類分析,來了解HbRop5的系統(tǒng)功能進化地位。利用Clustal X(versionl. 81)軟件對這17個小G蛋白Rop成員基因序列進行多重比對，并用TreeView[Win32] (versionl. 6. 6)構建系統(tǒng)進化樹(圖I)。從聚類結果可以看出(圖1)，所克隆的HbRop5基因與OsRacl聚類在一起。OsRacl被證明在水稻稻瘟病和枯萎病的抗性信號傳導途徑中具有的正調控功能(Agrawal，G. K.，H.Iwahashi and R. Rakwal, Small GTPase’Rop’ molecular switch for plant defenseresponses. FEBS Lett, 2003. 546(2-3) :p. 173-80)。這初步聚類分析的結果進一步證明了我們的推測，Rop成員一定在橡膠樹膠乳中具有重要的功能。因為在橡膠樹中，人們一直認為橡膠樹膠乳具有防御的生理功能，只是分子生物學機理還不清楚。同時，我們也分析了橡膠樹膠乳中HbRop5基因所編碼的氨基酸序列與所選擇同源基因的氨基酸的多重比對結果。結果表明所克隆的ffiRop5具有植物Rop基因的所有保守的結構域和多樣的羧基末端膜定位信號，這包括(I和III，GTPaSe區(qū)；11，效應因子互作區(qū)；IV和VI，⑶P/GTP結合區(qū)；V，植物ROP蛋白特異的插入序列區(qū))，而且根據(jù)C末端的變化，可以分為3組“CXX”，“CXXS”和“CXXL”(圖2)，這也說明我們克隆到的HbRop5具有完整的功能結構域，具有GTP結合活性。
利用不同在線軟件(Predotar, Target P和PSORT)分析了這個橡膠樹小G蛋白Rop成員HbRop5的亞細胞定位，結果顯示它可能定位在除葉綠體和線粒體的其它細胞器，只有PSORT預測定位在細胞核中。同時，比較分析了水稻的OsRacI，PSORT預測定位在線粒體而和大麥的HvRacB軟件PSORT預測也是定位在細胞核中，而其它兩個軟件的預測結果是它們同樣是定位在除葉綠體和線粒體的其它細胞器中(表2)?？梢娷浖念A測結果只能起到參考的作用，具體的亞細胞定位還需要具體檢測。表2. HbRop5亞細胞定位的預測
權利要求
1.一種蛋白質，是如下I)或2)所示的蛋白質 1)由序列表中的SEQID No . I的氣基酸殘基序列組成的蛋白質； 2)將序列表中的SEQID No . I氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有GTP結合相關功能的由SEQ ID Na 1衍生的蛋白質。
2.根據(jù)權利要求I所述的蛋白質，其特征在于所述蛋白質為具有GTP結合活性的蛋白質。
3.權利要求I或2所述的蛋白的編碼基因。
4.根據(jù)權利要求3所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因的核苷酸序列如下I)、2)、3)或4)所示 1)序列表中SEQID Na 2的核苷酸序列； 2)序列表中SEQID Na 2自5'末端第94-723位核苷酸所示的核苷酸序列； 3)在嚴格條件下可與I)或2)所述的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4)與序列表中SEQID Na 2的核苷酸序列具有80%以上的同源性的且編碼蛋白具有與GTP結合功能的核苷酸序列。
5.含有權利要求3或4所述的編碼基因的重組表達載體。
6.含有權利要求3或4所述的編碼基因的轉基因細胞系。
7.含有權利要求2或3所述的編碼基因的轉基因重組菌。
8.權利要求I所述的蛋白及其編碼基因在培育抗病性提高的轉基因橡膠樹中的應用。
9.權利要求I所述的蛋白及其編碼基因在結合鳥苷酸中的應用。
10.權利要求所述的蛋白及其編碼基因在培育抗逆境脅迫和提高林木徑向生長中的應用和/或在培育產量提高的轉基因橡膠樹種的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小G蛋白Rop的編碼基因與應用。該蛋白是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQ ID №.1氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有GTP結合功能的由SEQ ID №1衍生的蛋白質。該蛋白具有GTP結合活性，可以調控活性氧ROS的生成與代謝，參與脅迫應答，具有調控林木次生木質部和韌皮部發(fā)育的特征，轉基因作物或林木中，可提高其對逆境的抗性，從而提高產量。
文檔編號C07K14/415GK102731639SQ201210238720
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月9日 優(yōu)先權日2012年7月9日
發(fā)明者唐朝榮, 戚繼艷, 王岳坤, 秦云霞, 陽江華, 黃亞成, 龍翔宇 申請人:中國熱帶農業(yè)科學院橡膠研究所