專利名稱:全人源抗人催乳素受體單鏈抗體及其應用的制作方法
技術領域:
本發(fā)明涉及基因工程抗體技術和生物制品領域,具體涉及一種特異性全人源抗人催乳素受體單鏈抗體及其應用。
背景技術:
乳腺癌是嚴重威脅女性健康的重要疾病。全世界每年約有120萬婦女發(fā)生乳腺癌,有50萬婦女死于乳腺癌。在我國,乳腺癌已成為女性最常見的惡性腫瘤之一,居女性惡性腫瘤死亡率的首位。據(jù)近期的調查報告顯示,乳腺癌已是上升幅度最快的惡性腫瘤之一,在過去30年中,上升比例高達96%,僅次于肺癌。迄今,乳腺癌的病因學尚不十分清楚,遺傳、免疫、激素與各種環(huán)境因素相互作用,可能共同參與乳腺細胞癌變演進過程。近年來,隨著對腫瘤信號轉導途徑研究的不斷深入,分子靶向生物治療已成為腫瘤治療的一種新模式。篩選新型抗腫瘤靶標和設計組合靶標并探索其治療作用及分子機制已成為現(xiàn)今乳腺癌生物治療的重要研究方向。催乳素(prolactin,PRL)和催乳素受體(prolactin receptor, PRLR)是乳腺細胞中一類與細胞生長、分化密切相關的信號分子。PRL不僅通過內分泌機制影響乳腺細胞生長、發(fā)育和分化,還可以作為乳腺所產生、釋放的細胞因子,以旁分泌和自分泌方式調節(jié)乳腺細胞的反應。PRL作用的信號轉導機制是通過細胞膜上的PRLR來完成,PRL和PRLR結合,使JAK2磷酸化而激活,誘導受體細胞內遠側酪氨酸磷酸化,并激活STAT蛋白,激活后的STAT轉移入細胞核內,激活靶基因的轉錄,產生其生物學效應。另外,PRL信號也通過PRLR活化PI3K和MAPK信號通路,增加細胞周期素Dl的表達,并促進乳腺癌細胞生長。研究表明,在乳腺癌組織中PRL表達水平明顯高于正常乳腺組織和增生性上皮組織,與正常鄰近腫瘤組織相比,70-95%原發(fā)性乳腺癌組織中PRLR表達水平也顯著升高。在乳腺癌嚙齒類動物模型中,PRL過表達與PRLR的激活、擴增增加了乳腺腫瘤發(fā)生率和生長率。PRL也能夠與其它激素,如雌激素、生長激素等協(xié)同作用,促進乳腺癌細胞的增殖。使用PRLR拮抗劑,可競爭性地抑制內源性PRL與PRLR結合,從而干擾了 PRLR的信號轉導,抑制了乳腺癌細胞的增殖,促進細胞分化、凋亡和抗血管新生的作用。前期研究也表明,靶向PRLR的siRNA能夠特異地抑制PRLR的表達進而影響PRL/PRLR結合引起的下游信號通路,部分抑制了乳腺癌細胞的增殖。以上研究結果,提示PRLR是乳腺癌生物治療中的一個值得關注的候選抗腫瘤靶標。有效拮抗PRLR與PRL的結合或利用高表達的PRLR信號轉導途徑,為乳腺癌的生物免疫治療提供了一種新的策略。噬菌體抗體庫技術是一種將抗體基因表達產物和親和選擇相結合的技術,以改建過的噬菌體為載體,利用DNA重組技術將待選抗體基因片段定向插入噬菌體外殼蛋白基因區(qū),外源DNA片段的表達產物與噬菌體衣殼蛋白形成融合蛋白,展示在噬菌體表面,并保持一定的空間構象,再利用抗原抗體分子間的親和力進行篩選,表達特異性的噬菌體抗體,同時測定外源DNA的序列即可得知其表達產物的氨基酸序列。由于噬菌體表達的scFv抗體分子量較小,僅為完整抗體分子的六分之一,且具有較好的血管或組織屏障穿透性、能夠迅速到達靶抗原部位、半衰期短、分子結構穩(wěn)定、不形成寡聚體、易從血液循環(huán)系統(tǒng)中清除,不含F(xiàn)e段,減少了與體內Fe受體結合而帶來的不利影響等優(yōu)勢,同時人源噬菌體抗體完全避免了 HAMA (Human Anti-Mouse Antibody)反應,在一定程度上可消除單抗的免疫原性,使其在臨床上可反復地應用,從而達到治療效果而不至于引起人對其產生免疫反應,已廣泛地應用于分子生物學及免疫學、藥理學等醫(yī)學領域,是目前研究的熱點。
發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是在于為人乳腺癌的生物免疫治療提出新的方向,提供一種以人催乳素受體(PRLR)為祀標的抗乳腺癌全人源化單鏈抗體(Single chainfragment variable, scFv) HscFv 918。
本發(fā)明還要解決的技術問題是提供編碼上述特異性抗人PRLR單鏈抗體HscFv918的基因。本發(fā)明最后要解決的技術問題是提供上述特異性抗人PRLR單鏈抗體HscFv918在制備治療人乳腺癌生物免疫制劑中的應用。為解決上述技術問題,本發(fā)明采用的技術方案如下一種全人源抗人催乳素受體單鏈抗體,它是一株特異性的能夠與人催乳素受體結合的單鏈抗體,它的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。上述全人源抗人催乳素受體單鏈抗體的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。優(yōu)選的是上述抗體的編碼基因如SEQ ID No. I所示。包含上述抗體的編碼基因的重組表達載體也屬于本發(fā)明的保護范圍。由上述重組表達載體轉化的重組微生物也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述全人源抗人催乳素受體單鏈抗體在制備治療人乳腺癌藥物中的應用。發(fā)明的全人源抗人催乳素受體單鏈抗體采用如下思路獲得本發(fā)明利用噬菌體展示技術,直接從正常人外周血淋巴細胞出發(fā),構建了庫容為6. OXlO8的天然全人源噬菌體單鏈抗體庫,用BSA-PRLR表位多肽融合蛋白對上述文庫進行多輪篩選,獲得了 I株特異性能夠與乳腺癌細胞表面PRLR結合的抗人催乳素受體單鏈抗體,命名為HscFv918,抗體編碼基因與噬菌粒載體pComb3XSS連接后構建的重組表達載體pCom-HscFv918,轉化E. coli T0P10F’后,利用IPTG誘導后,可在大腸桿菌中進行可溶性表達,表達產物可利用Ni柱純化回收目的蛋白。純化的HscFv918抗體蛋白進一步采用ELISA法和細胞免疫熒光法檢測其與PRLR抗原蛋白及PRLR高表達的人乳腺癌細胞系T-47D的結合能力,從而鑒定該單鏈抗體的特異性,結果顯示HscFv918與抗原蛋白和T-47D細胞膜上的PRLR具有較強的親和力。HscFv918抗體蛋白處理T-47D細胞后,能明顯抑制T-47D細胞的生長。結果提示通過抑制PRLR蛋白功能,阻斷PRL/PRLR信號通路,可為乳腺癌特別是PRLR高表達的乳腺癌的生物免疫治療提供新的策略。本發(fā)明為以人PRLR為靶標的乳腺癌的生物免疫治療奠定了基礎,對于進一步研制抗乳腺癌藥物提供了可能性。具體的步驟如下I、天然全人源噬菌體單鏈抗體庫的構建。(I)淋巴細胞的分離純化 從50例身體健康正常女性(年齡2(T50歲)的外周血中分離淋巴細胞,提取總RNA,通過RT-PCR逆轉錄合成cDNA。
(2)PCI^;^|Vh、Vk、Va基因以cDNA為模板,用一組人源特異性抗體引物,包括12對VH,化對乂.和9對¥入基因引物,分別擴增人免疫球蛋白Vh、Vk、Va基因。(3)scFv基因的擴增等摩爾比混合VHB和VBkB,VH和V X B,利用overlap-PCR擴增scFv基因片段。(4)卩遼菌體單鏈抗體庫的建立將上述制備的scFv純化產物及載體質粒pComb3XSS同時用SfiI進行酶切,酶切產物 純化后進行連接,連接產物電轉化感受態(tài)E. coliXLl-Blue,構建了庫容為6 X IO8的全人源抗乳腺癌scFv噬菌體抗體庫。2、利用所構建的噬菌體單鏈抗體庫富集篩選出全人源抗PRLR單鏈抗體。(I) BSA-PRLR表位多肽融合蛋白的制備應用生物信息學軟件對人催乳素受體蛋白的抗原表位進行了預測,設計合成了 BSA-PRLR表位多肽融合蛋白,由南京川博生物技術公司合成。(2)抗PRLR單鏈抗體的富集篩選純化的BSA-PRLR表位多肽包被ELISA板,將噬菌體抗體庫進行一次原庫擴增后得到的新鮮噬菌體抗體加入包被過抗原的ELISA板中,進行三輪“吸附-洗脫-擴增”富集篩選,將最后一輪篩選得到的洗脫液感染E. coliXLl-Blue感受態(tài)細菌后鋪于LB培養(yǎng)板上,隨機挑取單克隆菌落分別接種加入LB培養(yǎng)其的96孔板中,每孔再加終濃度為lX109pfu/ml輔助噬菌體VCSM13超感染,次日將96孔板,離心后取上清進行Phage-ELISA鑒定。重組的BSA-PRLR表位多肽包被ELISA板,加入上述離心后的噬菌體上清,加入含5%脫脂奶粉的PBS緩沖液稀釋的HRP-Anti-M13抗體,孵育后加入TMB顯色液,用2M硫酸終止顯色反應,使用酶標儀測OD45tl值。3、抗PRLR scFv抗體基因的鑒定。(I)噬菌粒的提取選取ELISA鑒定陽性克隆的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基,擴大培養(yǎng)后收集菌體沉淀,使用質粒抽提試劑盒回收質粒DNA。(2)PCR擴增抗人乳腺癌scFv基因片段用載體pComb3XSS特異性引物Ompseq AAGACAGCTATCGCGATT 和 Gback GCCCCCTTATTAGCGTTT 擴增 scFv 基因片段。PCR 擴增產物大小約750bp。(3) DNA序列分析鑒定單鏈抗體上述PCR產物鑒定正確的菌株送公司測序,并對其進一步分析氨基酸序列和CDR區(qū)。4、HscFv918的可溶性表達、純化和功能學研究。(1)HscFv918的可溶性表達將噬菌體克隆質粒轉化入E. coli T0P10F’感受態(tài)細胞,鋪制Amp平板,挑取單克隆轉接新鮮的SB培養(yǎng)基,加入IPTG誘導表達后,收集菌體。(2)HscFv918的純化收集誘導表達后的菌體,超聲裂解后加l%Triton_100乳化后,離心收集上清,上His Trap柱,洗脫的目的蛋白用含有尿素的透析液進行透析復性,透析完成后超濾管濃縮蛋白。(3)純化的HscFv918單鏈抗體蛋白的鑒定純化的HscFv918蛋白經用HRP標記的抗His抗體進行Western blot分析后發(fā)現(xiàn),在26_34kD大小有一條目的條帶,確定抗體有可溶性表達。(4) ELISA鑒定HscFv918單鏈抗體的活性BSA_PRLR表位多肽包被96孔板,將倍比稀釋的純化scFv抗體分別加于酶標板中,每孔加入含5%脫脂奶粉的PBS以1:2000稀釋的HRP標記的抗His抗體,孵育后加入TMB顯色底物進行顯色,2M H2SO4終止反應,酶標儀讀取OD45tl吸光值。(5)細胞免疫熒光法檢測純化的HscFv918抗體蛋白的特異性將PRLR高表達的T47D細胞及陰性對照MDA-MB-231細胞分別接種于24孔板,貼壁后加入_20°C甲醇固定,3% BSA溶液封閉,加入純化的HscFv918,孵育后用PBS洗滌細胞,加入1:32稀釋的FITC-anti-Human IgG,置于熒光顯微鏡下觀察HscFv918與T-47D細胞和MDA-MB-231細胞的結合能力。(6) MTT法檢測HscFv918對T-47D細胞增殖的影響T_47D細胞及陰性對照MDA-MB-231 細胞培養(yǎng)于 96 孔板,以 50 y g/mlU00 u g/ml、150 u g/ml 三種濃度的 HscFv918處理細胞,同時設對照組,分別于6h、24h、48h、72h通過MTT法檢測細胞生長狀況。本發(fā)明米用一種卩遼菌體載體pcomb3XSS,常用于卩遼菌體抗體庫的構建。pcomb3XSS 可以插入編碼人免疫球蛋白G (IgG)基因。在載體設計時,pComb3XSS除在羧基端引入c-myc,His, HA標簽等外,在抗體基因和外殼蛋白基因P III之間插入一個琥珀終止密碼子(Amber) TAG,當此密碼子受到抑制時抗體就展示在噬菌體表面,而密碼子不受抑制時抗體就分泌表達。因此,當重組噬菌體生長在抑制型E. coli XLl-Blue時,抗體基因就與P III融合表達于噬菌體表面,用于篩選含有高親和力的噬菌體抗體。當重組噬菌體生長在非抑制型E. coli ToplOF’時,抗體基因就分泌表達于大腸桿菌的周質腔中,用于制備可溶性高親和力抗體。本發(fā)明所用的宿主細胞不受特別的限制,可選自大腸桿菌、酵母或真核細胞,優(yōu)選E.coli XLl-Blue為感受態(tài)細胞??贵w表達則選用E. coli ToplOF’。有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比,具有以下優(yōu)勢本發(fā)明以DNA重組技術從臨床確診為乳腺癌患者的外周血中擴增出人免疫球蛋白G (IgG)Va, VK, Va基因片段,插入噬菌體載體pComb3XSS相應位置,構建出天然全人源噬菌體單鏈抗體庫。利用該庫篩選獲得的PRLR為靶向分子的抗乳腺癌全人源的單鏈抗體,經鑒定證實其與PRLR有特異性結合能力,且對PRLR高表達的乳腺癌細胞株有明顯的生長抑制作用,從而為乳腺癌的生物免疫治療提供了一種新的抗體藥物的候選靶標分子。
圖I :12種重鏈可變區(qū)基因的PCR擴增結果。其中,M為DNA Marker ;1 12分別為不同Vh基因的PCR擴增產物。圖2 16種輕鏈K可變區(qū)基因的PCR擴增結果。其中,M為DNA Marker ;Tl6分別為不同Vk基因的PCR擴增產物。圖3 :9種輕鏈\可變區(qū)基因的PCR擴增結果。其中,M為DNA Marker ;T9分別為不同Va基因的PCR擴增產物。圖4 :scFv抗體基因的PCR擴增結果。其中,M為DNA Marker ;I 8分別為不同scFv抗體基因的PCR擴增產物。圖5 pComb3XSS噬菌體載體結構圖。圖6 HscFv918表達特異單鏈抗體蛋白Western blot鑒定結果。其中1、3為誘表達前蛋白純化產物;2、4為誘導表達后蛋白純化產物。圖7 :免疫熒光結合實驗驗證HscFv 918與人PRLR蛋白的特異性結合結果。其中A、B 為 T-47D 細胞;C、D 為 MDA-MB-231 細胞。圖8A =MTT法分析HscFv918對人乳腺癌T-47D細胞的生長的影響。圖8B =MTT法分析HscFv918對人乳腺癌MDA-MB-231細胞的影響。圖9 HscFv918 抗體 CDR 區(qū)分析。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例,可以更好地理解本發(fā)明。然而,本領域的技術人員容易理解,實施例所描述的具體的技術路線及其結果僅用于說明本發(fā)明,而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例I :人外周血淋巴細胞分離及總RNA提取。分批采集50份年齡分布為2(T50歲、身體健康正常女性的抗凝外周血各2ml,分別以淋巴細胞分離液分離獲得外周血淋巴細胞后混合,以滅菌PBS洗滌后重懸細胞,總RNA提純試劑盒提取外周血淋巴細胞總RNA。實施例2 :人免疫球蛋白G (IgG) VH、Vk、Va基因的PCR擴增。先將淋巴細胞總RNA逆轉錄為cDNA,用一組人源特異性抗體引物,包括Vh5,Sense PrimersHSCVHl-F5’ GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG3’HSCVH2-F5’ GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCAGATCACCTTGAAGGAGTCTGG3’HSCVH35-F5 ’ GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCGAGGTGCAGCTGGTGSAGTCTGG3,HSCVH3a-F5, GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCGAGGTGCAGCTGKTGGAGTCTGG3,HSCVH4-F5’ GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG3’HSCVH4a-F5’ GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG3’Vh3,Reverse PrimersHSCG1234-B5, CCTGGCCGGCCTGGCCACTAGTGACCGATGGGCCCTTGGTGGARGC3’HSCM-B5, CCTGGCCGGCCTGGCCACTAGTAAGGGTTGGGGCGGATGCACTCCC3’Vk 5’ Sense PrimersHSCKl-F5’ GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCC3,HSCK24-F
5’ GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGATGACYCAGTCTCC3’HSCK3-F5, GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGWTGACRCAGTCTCC3’HSCK5-F5, GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCACACTCACGCAGTCTCC3’Vk 3,Reverse PrimersHSCJK140-B 5’ GGAAGATCTAGAGGAACCACCTTTGATYTCCACCTTGGTCCC3’HSCJK20-B5’ GGAAGATCTAGAGGAACCACCTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC3’HSCJK30-B5’ GGAAGATCTAGAGGAACCACCTTTGATATCCACTTTGGTCCC3’HSCJK50-B5’ GGAAGATCTAGAGGAACCACCTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC3’Va 5,Sense PrimesHSCLamla5, GGGCCCAGGCGGCCGAGCTGGTGBTGACGCAGCCGCCCTC3’HSCLamlb5, GGGCCCAGCCGGCCGAGCTCGTGCTGACTCAGCCACCCTC3’HSCLam25’ GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGCCCTGACTCAGCCTCCCTCCGT3’HSCLam35, GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTC3,HSCLam45, GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGCTGACTCAATCGCCCTC3’HSCLam65, GGGCCCAGGCGCCCGAGCTCATGCTGACTCAGCCCCACTC3’HSCLam785, GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGGTGACYCAGGAGCCMTC3,HSCLam95’ GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGCTGACTCAGCCACCTTC3’HSCLamlO5, GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGGGCAGACTCAGCAGCTCTC3,Va3,Reverse PrimersHSCJLaml 2365,GGAAGATCTAGAGGAACCACCGCCTAGGACGGTCASCTTGGTSCC3,注R=Aor G Y=C or T M=A or C K=G or T S=C or G W=A or T H=Aor C or TB=C orG or TV=A or C or G D=A or G or T N=A or C or G or T.Vh引物組合如下
HSCVHl-FHSCVH2-FHSCVH35-FHSCVH3a_FHSCG1234-BHSCG1234-BHSCG1234-BHSCG1234-BHSCVH4-FHSCVH4a-FHSCVHl-FHSCVH2-FHSCG1234-BHSCG1234-BHSCM-BHSCM-B
HSCVH35-FHSCVH3a_FHSCVH4-FHSCVH4a-FHSCM-BHSCM-BHSCM-BHSCM-BVk引物組合如下HSCKl-FHSCK24-FHSCK3-FHSCK5-FHSCJK140-BHSCJK140_BHSCJK140_BHSCJK140_BHSCKl-FHSCK24-FHSCK3-FHSCK5-FHSCJK20-BHSCJK20_BHSCJK20_BHSCJK20_BHSCKl-FHSCK24-FHSCK3-FHSCK5-FHSCJK30-BHSCJK30_BHSCJK30_BHSCJK30_BHSCKl-FHSCK24-FHSCK3-FHSCK5-FHSCJK50-BHSCJK50_BHSCJK50_BHSCJK50_BVa引物組合如下HSCLamlaHSCLamlbHSCLam2HSCLam3HSCJLaml236HSCJLaml236 HSCJLaml236 HSCJLaml236HSCLam4HSCLam6HSCLam78HSCLam9HSCJLaml236HSCJLaml236 HSCJLaml236 HSCJLaml236HSCLamlOHSCJLaml 236以制備的cDNA為模板,利用上述的12對VH,化對乂,和9對¥入基因引物,分別擴
增Vh、Vk、Va基因片段,每個擴增體系均包含以下內容
cDNA0.5 fig
5,pi.imers60 pmol
3 'primers60 pmol
I OxPCR buffer 10|d
dNTP8 ‘ul
MgCi6 i_il
Ex Taq0.5 ^il
Jjii ddH20 ^100‘ul反應條件如下94。C5min ;94。C15sec,50。C30sec,72° Clmin,30 個循環(huán);72。ClOmin0將所有的VhJ1^PVa分別混合,1%瓊脂糖凝膠電泳觀察所擴增片段的大小。12對Vh基因的擴增結果如圖I所示,各組引物均有350bp左右的目的條帶出現(xiàn);16對輕鏈K可變區(qū)基因擴增結果如圖2所示,各組引物均有350bp左右的目的條帶出現(xiàn);9對輕鏈入可變區(qū)基因擴增結果如圖3所示,各組引物均有350bp左右的目的條帶出現(xiàn)。
實施例3 :天然全人源噬菌體單鏈抗體庫的構建。等摩爾比混合¥耶和¥81^,¥11和¥入8,利用overlap-PCR擴增scFv基因,反應體系如下
權利要求
1.一種全人源抗人催乳素受體單鏈抗體,其特征在于它的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2.權利要求I所述全人源抗人催乳素受體單鏈抗體的編碼基因。
3.根據(jù)權利要求2所述的編碼基因,其特征在于所述的編碼基因如SEQID No. I所示。
4.包含權利要求2所述的編碼基因的重組表達載體。
5.由權利要求4所述重組表達載體轉化的重組微生物。
6.權利要求I所述的全人源抗人催乳素受體單鏈抗體在制備治療人乳腺癌藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種全人源抗人催乳素受體單鏈抗體,它的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。本發(fā)明還公開了上述全人源抗人催乳素受體單鏈抗體在制備治療人乳腺癌藥物中的應用。本發(fā)明獲得了一株具有高特異性和高親和力的全人源抗人催乳素受體單鏈抗體HscFv918,初步研究證實該單鏈抗體對高表達人催乳素受體的乳腺癌細胞系具有一定的生長抑制作用,提示人催乳素受體可作為乳腺癌的生物免疫治療的潛在靶向分子,從而為進一步研制抗乳腺癌藥物提供應用基礎。
文檔編號C07K16/28GK102746402SQ201210236119
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月9日 優(yōu)先權日2012年7月9日
發(fā)明者何偉, 姚俊, 屈芫, 曹新, 魏欽俊, 魯雅潔 申請人:南京醫(yī)科大學