專利名稱：包含抗egf受體抗體的凍干制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含抗表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抗體的穩(wěn)定的凍干藥物制劑，并涉及其制備。
各種體外和體內(nèi)研究已顯示抗體對(duì)EGFR的阻斷可在各種水平發(fā)揮抗腫瘤作用，例如通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、減少腫瘤介導(dǎo)的血管形成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)放射治療和常規(guī)化療的毒性作用。
MAB c225(西妥昔單抗，Cetuximab)是臨床上已經(jīng)被證實(shí)與EGF受體結(jié)合的抗體。Cetuximab是嵌合抗體，其可變區(qū)為鼠源的，恒定區(qū)為人源的，并首次在Naramura等人，Cancer Immunol.Immuotherapy.1993，37343-349和WO 96/40210 A1中述及。
MAB 425最初是在腫瘤細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)的鼠源抗體，其對(duì)抗EGFR、特別是A431癌細(xì)胞的EGFR。其人源化和嵌合形式被公開(kāi)于例如EP0531472 A1；Kettleborough等人，Protein Engineering 1991，4773-783；Bier等人，Cancer Chemother.Pharmacol 2001，47519-524；Bier等人，Cancer Immunol.Immuother 1998，46167-173。本文中的EMD 72000是處于I/II期臨床階段的抗體(h425)，其恒定區(qū)由κ和人γ-1鏈組成。
人抗-EGFR抗體可通過(guò)基因轉(zhuǎn)殖鼠(XenoMouse)技術(shù)提供，如WO91/10741 A1、WO 94/02602 A1和WO 96/33735 A1所述。已通過(guò)該技術(shù)制備且目前正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的一種特殊抗體是ABX-EGF(Abgenix，Crit.Rev.Oncol.Hematol.2001，3817-23；Cancer Research 1999，591236-43)。
其它抗EGFR抗體在例如EP 0586002 B1和J.Natl.Cancer Inst.1993，8527-33中述及(MAB 528)。
和其它抗體一樣，EGFR抗體也作為治療用溶液經(jīng)胃腸外使用。含有這些抗體的溶液的一個(gè)特殊問(wèn)題是它們的聚集趨勢(shì)和蛋白多聚體的形成。就可還原多聚體而言，這可歸因于通過(guò)接近部分之間的相互作用而偶然形成的分子間二硫橋鍵。疏水性相互作用和隨之形成不可還原多聚體也是可能的。此外，隨后可導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解反應(yīng)的脫酰胺反應(yīng)也可發(fā)生。所述的變性反應(yīng)特別發(fā)生于升高溫度下的貯藏期間或經(jīng)受剪切應(yīng)力期間，如例如運(yùn)輸期間。因此，從各方面而言，液體制劑作為用于廣泛使用的藥物形式是低穩(wěn)定性的。
常規(guī)的穩(wěn)定抗體的方法是將含有抗體和助劑的溶液凍干。水的去除可減少分解產(chǎn)物和聚集物的形成。(Hsu等人，Dev.Biol.Stand.1991，74255-267和Pikal等人，Dev.Biol.Stand.1991，7421-27)。
WO 93/00807 A1描述了蛋白質(zhì)凍干制劑，其為了穩(wěn)定而包含聚乙二醇和糖。然而聚乙二醇在毒理學(xué)方面是有爭(zhēng)議的，因此如果可能應(yīng)避免在藥物中使用，特別是如果預(yù)計(jì)將所述藥物用于胃腸外施用。
WO 98/22136 A2描述了包含抗體、糖或氨基糖、氨基酸和表面活性劑的凍干制劑。盡管該制劑要求廣泛地保護(hù)抗體，但是作為工作實(shí)施例所公開(kāi)的制劑僅僅是那些包含抗乙型肝炎病毒(AK HBV)的單克隆抗體的制劑，和每種情況下包含抗L-選擇蛋白(抗-L-選擇蛋白)抗體的制劑和包含抗抗-L神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(抗-LNGFR)抗體的制劑。然而，包含AK HBV和抗-L-選擇蛋白的制劑由最大抗體濃度分別為8mg/ml和7mg/ml的溶液制成，包含抗生長(zhǎng)因子抗體即抗-LNGFR的制劑由僅包含0.25mg/ml抗體及另外的相同性質(zhì)和數(shù)量的助劑成分的溶液制成。盡管包含抗-LNGFR的制劑具有低至20倍或更低的抗體含量并因此可預(yù)計(jì)產(chǎn)生相應(yīng)較低量的降解產(chǎn)物，但是未公開(kāi)與包含其它抗體的制劑相對(duì)照的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。
本發(fā)明的目的是提供穩(wěn)定的抗EGFR抗體的制劑。該制劑不應(yīng)包含任何毒理學(xué)上不可接受的助劑，應(yīng)當(dāng)在增加的應(yīng)力條件如升高的溫度和空氣濕度下穩(wěn)定較長(zhǎng)時(shí)間，并且應(yīng)當(dāng)可用水性溶劑重構(gòu)以提供具有高活性成分含量的備用溶液。
令人驚訝的是，符合這些要求的制劑已通過(guò)將水溶液凍干而提供，所述水溶液除包含這些抗-EGFR抗體之一外，還包含糖或氨基糖、氨基酸和表面活性劑。因此本發(fā)明涉及包含糖或氨基糖、氨基酸和表面活性劑的穩(wěn)定的單或多克隆抗體的凍干制劑，其特征在于所述抗體是抗表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的抗體。
可存在的抗體為任何抗表皮生長(zhǎng)因子的抗體，尤其是開(kāi)篇提到的鼠源、人源或嵌合抗體和已經(jīng)并可借助所述基因轉(zhuǎn)殖鼠技術(shù)制備的人抗-EGFR抗體。本發(fā)明制劑中存在的抗-EGFR抗體優(yōu)選Cetuximab或EMD 72000或與其相對(duì)應(yīng)的鼠源、人源或嵌合抗體類似物之一。特別優(yōu)選的是包含Cetuximab或EMD 72000作為抗體的制劑。
本發(fā)明的制劑在生理上耐受良好、可容易地制備、可精確調(diào)劑并且對(duì)于檢測(cè)貯藏期間和反復(fù)冷凍和解凍期間的降解產(chǎn)物和聚集物而言是穩(wěn)定的。其在冷藏溫度(2-8℃)和室溫(23-27℃，60％相對(duì)空氣濕度(RAH))條件下貯藏可穩(wěn)定至少3個(gè)月的時(shí)間至一到兩年的時(shí)間。令人驚訝的是，本發(fā)明的制劑在升高的溫度和較高的空氣濕度水平、例如在40℃的溫度和75％相對(duì)空氣濕度下貯藏于所述時(shí)間段內(nèi)也是穩(wěn)定的。
凍干制劑可通過(guò)加入水性溶劑、例如注射用水或等滲水溶液以簡(jiǎn)單的方法重構(gòu)，以提供不含可見(jiàn)顆粒的備用溶液。重構(gòu)的溶液在約5天的時(shí)間內(nèi)是穩(wěn)定的，但特別優(yōu)選于4小時(shí)內(nèi)使用。
使用水性溶劑對(duì)本發(fā)明的制劑進(jìn)行重構(gòu)優(yōu)選使含抗體的溶液制劑的pH為5至8、優(yōu)選6.0至7.4、特別優(yōu)選pH為約7.2，且重量克分子滲透濃度為250至350mOsmol/kg。由此，重構(gòu)的制劑可直接經(jīng)靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、還可經(jīng)皮下施用，基本上無(wú)痛覺(jué)。此外，還可將所述制劑加入輸注溶液中，如例如葡萄糖溶液、等滲鹽溶液或林格氏液，所述溶液還可包含其它活性成分，從而也使得能夠施用較大量的活性成分。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，凍干藥物制劑實(shí)際上由抗體、糖或氨基糖、氨基酸、緩沖劑和表面活性劑組成。
本發(fā)明的制劑使得能夠制備濃度符合臨床需要的抗體溶液。優(yōu)選的抗體溶液的抗體濃度為約0.5至25mg/ml、特別優(yōu)選5至20mg/ml、非常特別優(yōu)選10至15mg/ml。因此，本發(fā)明的制劑使得能夠制備備用制劑，其抗體濃度顯著高于所述WO 98/22136 A2中制劑的抗體濃度。
本發(fā)明制劑中所使用的糖可為單糖、二糖和三糖。可提及的單糖的實(shí)例有葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖和山梨糖，可提及的二糖的實(shí)例有蔗糖、乳糖、麥芽糖和海藻糖，可提及的三糖的實(shí)例有棉子糖。優(yōu)選蔗糖、乳糖、麥芽糖和海藻糖，特別優(yōu)選蔗糖。
也可能存在氨基糖，即含有伯、仲或叔氨基或?；被?-NH-CO-R)替代羥基的單糖。用于本發(fā)明的目的時(shí)，此處特別優(yōu)選的是葡糖胺、N-甲基-葡糖胺、半乳糖胺和神經(jīng)氨糖酸。
糖/氨基糖以這樣的量存在于本發(fā)明的制劑中其在用建議體積的溶劑重構(gòu)后得到的溶液中的濃度為約1至200mg/ml。糖在重構(gòu)溶液中的濃度優(yōu)選為30至65mg/ml。
根據(jù)本發(fā)明所使用的適宜的氨基酸為堿性氨基酸，如例如精氨酸、組氨酸、鳥(niǎo)氨酸、賴氨酸，特別地，氨基酸優(yōu)選以它們的無(wú)機(jī)鹽形式使用(優(yōu)選以鹽酸鹽形式即氨基酸鹽酸鹽)。在使用游離氨基酸的情況下，所需pH通過(guò)加入適宜的生理上耐受的緩沖物質(zhì)而調(diào)節(jié)，如例如有機(jī)或無(wú)機(jī)酸，如檸檬酸或磷酸、硫酸、乙酸、甲酸或其鹽。優(yōu)選檸檬酸鹽和磷酸鹽，用它們獲得了特別穩(wěn)定的凍干物質(zhì)。
優(yōu)選的氨基酸為精氨酸、賴氨酸和鳥(niǎo)氨酸。此外，也可能使用酸性氨基酸如例如谷氨酸和天冬氨酸，或中性氨基酸如例如異亮氨酸、亮氨酸和丙氨酸，或芳香族氨基酸如例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。本發(fā)明制劑中的氨基酸含量為1至100mg/ml、優(yōu)選1至50mg/ml、特別優(yōu)選3至30mg/ml(在每種情況下均基于重構(gòu)溶液)。
可使用的表面活性劑是所有通常用于藥物制劑中的表面活性劑，優(yōu)選聚山梨酯和聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物。特別優(yōu)選聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯和聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯。根據(jù)本發(fā)明，制劑包含以重量計(jì)0.001至1％、優(yōu)選以重量計(jì)0.005至0.1％并特別優(yōu)選以重量計(jì)約0.01％的表面活性劑(在每種情況下均基于重構(gòu)溶液)。
如果本發(fā)明的制劑包含緩沖劑，則其大體上可為任何生理上耐受的適宜于用來(lái)調(diào)節(jié)所需pH的物質(zhì)。緩沖物質(zhì)的量以如下方式選擇例如用注射用水將凍干制劑重構(gòu)后，所得水溶液的緩沖劑濃度為5mmol/l至20mmol/l、優(yōu)選約10mmol/l。優(yōu)選的緩沖劑為檸檬酸鹽緩沖劑或磷酸鹽緩沖劑。適宜的磷酸鹽緩沖劑為磷酸的單-和/或二鈉和-鉀鹽如磷酸氫二鈉或磷酸二氫鉀的溶液，以及鈉鹽和鉀鹽混合物如例如磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀混合物的溶液。
如果重構(gòu)溶液通過(guò)抗體和起穩(wěn)定作用的助劑的滲透特性而還未達(dá)到等滲，則還可以存在建立等滲性所必需濃度的等滲劑、優(yōu)選生理上耐受的鹽如例如氯化鈉或氯化鉀，或生理上耐受的多元醇如例如葡萄糖或甘油。
此外，本發(fā)明的凍干物質(zhì)可包含其它生理上耐受的助劑，如例如抗氧化劑如抗壞血酸或谷胱甘肽，防腐劑如苯酚、間甲酚、對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯、氯代丁醇、硫柳汞或苯扎氯銨，聚乙二醇(PEG)如PEG3000、3350、4000或6000，或環(huán)糊精如羥丙基-β-環(huán)糊精、磺基丁基乙基-β-環(huán)糊精或γ環(huán)糊精。
本發(fā)明的制劑可如下制備制備包含Cetuximab或EMD 72000作為活性成分以及糖或氨基糖、氨基酸和表面活性劑作為添加劑、并且如果需要還包含藥用助劑的水性配制物，隨后將該溶液凍干。
水性配制物可通過(guò)將所述助劑加至包含Cetuximab或EMD 72000的溶液中而制備。為此，優(yōu)選將規(guī)定體積的包含規(guī)定濃度的所述其它助劑的儲(chǔ)備溶液加至所制得的含有規(guī)定濃度的Cetuximab或EMD 72000的溶液中，并且如果需要，將該混合物用水稀釋至預(yù)先計(jì)算的濃度。或者，所述助劑也可以以固體形式加至包含Cetuximab的初始溶液中。如果Cetuximab或EMD 72000呈固體形式、例如呈凍干物質(zhì)的形式，則本發(fā)明的制劑可如下制備首先將各種抗體溶解于水或包含一種或多種其它助劑的水溶液中，隨后加入各種情況下所需量的包含其它助劑的儲(chǔ)備溶液、固體形式的其它助劑和/或水。Cetuximab或EMD 72000還可有利地直接溶于包含所有其它助劑的溶液中。
本發(fā)明制劑中存在的一種或多種助劑可有利地已在特定EGFR抗體的制備方法過(guò)程中或結(jié)束時(shí)被加入。這可優(yōu)選通過(guò)將Cetuximab或EMD72000在其制備后所進(jìn)行的純化的最后一步中直接溶解于包含一種、多于一種或所有其它助劑的水溶液中進(jìn)行。為制備所述制劑，則各種其它一種或多種成分在各種情況下僅需以較小的量加入和/或根本無(wú)需加入。特別優(yōu)選將各種成分在其制備后所進(jìn)行的純化的最后一步中直接溶解于包含所有其它助劑的水溶液中，直接得到待凍干的溶液。
將包含各個(gè)抗體和助劑的溶液的pH調(diào)節(jié)至5至8、無(wú)菌過(guò)濾并凍干。
實(shí)施例闡述本發(fā)明而非對(duì)其進(jìn)行限制。
如果使用10mmol/l pH 7.2的磷酸鈉緩沖劑或磷酸鉀緩沖劑，則其包含2.07g/l的磷酸氫二鈉七水合物和0.31g/l的磷酸二氫鈉一水合物，或1.220g/l的磷酸氫二鉀和0.4050g/l的磷酸二氫鉀。
實(shí)施例1自水溶液得到凍干物質(zhì)，所述水溶液包含10mg/ml的EMD 7200010mmol/l的磷酸鉀緩沖劑pH7.217mmol/l的精氨酸以重量計(jì)3％的蔗糖以重量計(jì)0.01％的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯以重量計(jì)0.4％的PEG 6000通過(guò)將規(guī)定體積的包含規(guī)定濃度的各種助劑的水溶液混合而進(jìn)行制備。使用了以下溶液溶液A(活性成分溶液)，包含20mg/ml的EMD 7200010mmol/l的磷酸鉀緩沖劑pH7.2溶液B(緩沖劑/鹽溶液)10mmol/l的磷酸鉀緩沖劑pH7.2以重量計(jì)6％的蔗糖以重量計(jì)0.02％的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯
34mmol/l的精氨酸以重量計(jì)0.8％的聚乙二醇6000為制備本發(fā)明的制劑，將相同體積的溶液A和溶液B彼此合并。
將所制備的溶液在包裝前無(wú)菌過(guò)濾。每瓶填裝2ml溶液。隨即用塞子將瓶不完全密封并凍干。凍干后，將瓶密封并卷邊。
實(shí)施例2自水溶液得到凍干物質(zhì)，所述水溶液包含10mg/ml的EMD 7200010mmol/l的磷酸鉀緩沖劑pH7.214mmol/l的精氨酸以重量計(jì)3％的蔗糖以重量計(jì)0.01％的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯通過(guò)將規(guī)定體積的包含規(guī)定濃度的各種助劑的水溶液混合而進(jìn)行制備。使用了以下溶液溶液A(活性成分溶液)，包含20mg/ml的EMD 7200010mmol/l的磷酸鉀緩沖劑pH7.2溶液B(緩沖劑/鹽溶液)10mmol/l的磷酸鉀緩沖劑pH7.2以重量計(jì)6％的蔗糖以重量計(jì)0.02％的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯34mmol/l的精氨酸為制備本發(fā)明的制劑，將相同體積的溶液A和溶液B彼此合并。
將所制備的溶液在包裝前無(wú)菌過(guò)濾。每瓶填裝20ml溶液。隨即用塞子將瓶不完全密封并凍干。凍干后，將瓶密封并卷邊。
實(shí)施例3自水溶液得到凍干物質(zhì)，所述水溶液包含15mg/ml的Cetuximab5mmol/l的檸檬酸鹽100mmol/l的精氨酸以重量計(jì)4％的甘露醇以重量計(jì)0.01％的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯通過(guò)將規(guī)定體積的包含規(guī)定濃度的各種助劑的水溶液混合而進(jìn)行制備。使用了以下溶液溶液A(活性成分溶液)，包含19mg/ml的Cetuximab5mmol/l的檸檬酸鹽127mmol/l的精氨酸以重量計(jì)0.01％的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯溶液B(緩沖劑/鹽溶液)5mmol/l的檸檬酸鹽以重量計(jì)19.05％的甘露醇以重量計(jì)0.01％的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯為制備本發(fā)明的制劑，將7.9ml溶液A和2.1ml溶液B彼此合并。
將所制備的溶液在包裝前用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾。每瓶用移液管填裝2ml溶液。隨即用塞子將瓶不完全密封并凍干。凍干后，將瓶密封并卷邊。
實(shí)施例4自水溶液得到凍干物質(zhì)，所述水溶液包含15mg/ml的Cetuximab5mmol/l的檸檬酸鹽100mmol/l的精氨酸以重量計(jì)1.5％的蔗糖以重量計(jì)0.01％的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯通過(guò)將規(guī)定體積的包含規(guī)定濃度的各種助劑的水溶液混合而進(jìn)行制備。使用了以下溶液溶液A(活性成分溶液)，包含19mg/ml的Cetuximab5mmol/l的檸檬酸鹽127mmol/l的精氨酸以重量計(jì)0.01％的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯溶液B(緩沖劑/鹽溶液)5mmol/l的檸檬酸鹽7.1％的蔗糖以重量計(jì)0.01％的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯為制備本發(fā)明的制劑，將7.9ml溶液A和2.1ml溶液B彼此合并。
將所制備的溶液在包裝前用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾。每瓶用移液管填裝2ml溶液。隨即用塞子將瓶不完全密封并凍干。凍干后，將瓶密封并卷邊。
實(shí)施例5自水溶液得到凍干物質(zhì)，所述水溶液包含15mg/ml的Cetuximab10mmol/l的磷酸鉀緩沖劑pH 7.214mmol/l的L-精氨酸鹽酸鹽88mmol/l的蔗糖以重量計(jì)0.01％的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.5通過(guò)將規(guī)定體積的包含規(guī)定濃度的各種助劑的水溶液混合而進(jìn)行制備。使用了以下溶液溶液A(活性成分溶液)，包含25mg/ml的Cetuximab
10mmol/l的磷酸鉀緩沖劑pH7.2注射用水溶液B(緩沖劑/鹽溶液)10mmol/l的磷酸鉀緩沖劑pH7.235.6mmol/l的L-精氨酸鹽酸鹽219mmol/l的蔗糖以重量計(jì)0.025％的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.5為制備本發(fā)明的制劑，將6ml溶液A和4ml溶液B彼此合并。
將所制備的溶液在包裝前用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾。每瓶用移液管填裝2ml溶液。隨即用塞子將瓶不完全密封并凍干。凍干后，將瓶密封并卷邊。
實(shí)施例6(對(duì)比制劑1)水溶液，包含5mg/ml的Cetuximab10mmol/l的磷酸鈉緩沖劑pH7.2145mmol/l的氯化鈉通過(guò)將規(guī)定體積的包含規(guī)定濃度的各種助劑的水溶液混合而進(jìn)行制備。使用了以下溶液溶液A(活性成分溶液)，包含10mg/ml的Cetuximab10mmol/l的磷酸鈉緩沖劑pH7.2145mmol/l的氯化鈉(該溶液通過(guò)在活性成分制備后進(jìn)行的活性成分色譜純化的最后一步中用溶液B自色譜柱中將活性成分洗脫而獲得。)溶液B(緩沖劑/鹽溶液)和溶液A一致，但不包含活性成分。
為制備該對(duì)比制劑，將溶液A和B各10ml彼此合并。
實(shí)施例7(對(duì)比制劑2)水溶液，包含5mg/ml的Cetuximab10mmol/l的磷酸鈉緩沖劑pH7.245mmol/l的氯化鈉以重量計(jì)0.01％的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯通過(guò)將規(guī)定體積的包含規(guī)定濃度的各種助劑的水溶液混合而進(jìn)行制備。使用了以下溶液溶液A(活性成分溶液)，包含9.7mg/ml的Cetuximab10mmol/l的磷酸鈉緩沖劑pH7.2145mmol/l的氯化鈉(該溶液通過(guò)在活性成分制備后進(jìn)行的活性成分色譜純化的最后一步中用溶液B自色譜柱中將活性成分洗脫而獲得。)溶液B(緩沖劑/鹽溶液)和溶液A一致，但不包含活性成分。
溶液C(聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯溶液)和溶液B一致，但另外包含以重量計(jì)1％的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯為制備該對(duì)比制劑，將10ml溶液A、9.8ml溶液B和0.2ml溶液C彼此合并。
將所制備的溶液在包裝前用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾。每瓶用移液管填裝2ml溶液。隨即用塞子將瓶不完全密封并凍干。凍干后，將瓶密封并卷邊。
制劑的穩(wěn)定性研究用應(yīng)力實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)施例1和2的本發(fā)明制劑的穩(wěn)定性進(jìn)行檢驗(yàn)。為此，將所制備的凍干物質(zhì)在40℃和75％相對(duì)空氣濕度(RAH)下貯藏。將所述制劑貯藏一定時(shí)間并用適宜的分析方法進(jìn)行分析?？贵w中可能的不穩(wěn)定性主要體現(xiàn)在聚集物的形成和降解產(chǎn)物的形成。降解產(chǎn)物優(yōu)選通過(guò)凝膠電泳(十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和等離子聚焦(IEF))進(jìn)行檢測(cè)，而目測(cè)和濁度測(cè)量用于檢測(cè)可見(jiàn)聚集物，采用空間排阻色譜法(HPLC-SEC)檢測(cè)可溶聚集物。ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))實(shí)驗(yàn)同樣被用于評(píng)價(jià)所述制劑，其用以檢驗(yàn)完整性和結(jié)合受體的能力。
表1和2中的結(jié)果清楚地證實(shí)了所制備制劑的性質(zhì)和穩(wěn)定性，甚至證實(shí)了在升高的貯藏溫度和升高的相對(duì)空氣濕度下(40℃/75％RAH)的性質(zhì)和穩(wěn)定性。
表1實(shí)施例1的制劑的穩(wěn)定性
表2實(shí)施例2的制劑的穩(wěn)定性實(shí)施例3至7的本發(fā)明制劑的穩(wěn)定性同樣用應(yīng)力實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。為此，將含有實(shí)施例3至5的溶液的瓶和用于對(duì)照目的的含有實(shí)施例6至7的溶液的瓶貯藏于25℃和60％相對(duì)空氣濕度(RAH)和40℃和75％RAH條件下。貯藏前和規(guī)定的貯藏時(shí)間后，每種情況下取3瓶在冷光源直接照明下進(jìn)行目測(cè)評(píng)價(jià)，并且測(cè)定溶液在350和550nm處的吸收，其代表濁度的量度。此外，每種情況各取3瓶并借助HPLC凝膠過(guò)濾對(duì)Cetuximab和分解產(chǎn)物的含量進(jìn)行分析。
用乙腈/水95/5(v/v)梯度(B)和pH2.5的緩沖溶液/乙腈95/5(v/v)(A)作為洗脫劑進(jìn)行HPLC色譜研究。色譜柱LiChroCHART125-2 HPLCcartridge；Super-spher60 RP-select B，流速0.3ml/min，在210nm處檢測(cè)。
所述穩(wěn)定性研究的結(jié)果見(jiàn)表3。
表3
此外，

圖1至5顯示了實(shí)施例4的本發(fā)明制劑和對(duì)比制劑1和2在40℃和75％RAH下貯藏規(guī)定時(shí)間后的各種穩(wěn)定性研究的結(jié)果對(duì)比。在進(jìn)行每次試驗(yàn)前，將實(shí)施例4的凍干制劑用注射用水重構(gòu)以獲得水溶液，所述水溶液與用于經(jīng)凍干制備凍干制劑的起始溶液相比包含三倍量的水。
圖1顯示對(duì)比制劑1和2與實(shí)施例4的本發(fā)明制劑相比活性成分含量的降低，以HPLC-SEC中的單體含量測(cè)量。
圖2顯示對(duì)比制劑1和2與實(shí)施例4的本發(fā)明制劑相比降解產(chǎn)物的增加，以HPLC-SEC測(cè)量。
圖3顯示對(duì)比制劑1和2與實(shí)施例4的本發(fā)明制劑相比聚合物的增加，以HPLC-SEC測(cè)量。
圖4顯示對(duì)比制劑1和2與實(shí)施例4的本發(fā)明制劑相比在λ＝350nm處的光密度的增加。
圖5顯示對(duì)比制劑1和2與實(shí)施例4的本發(fā)明制劑相比在λ＝550nm處的光密度的增加。
結(jié)果清楚地顯示與液體對(duì)比溶液相比，本發(fā)明組合物的穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)。
權(quán)利要求
1.包含糖或氨基糖、氨基酸和表面活性劑的單或多克隆抗體的凍干藥物制劑，其特征在于所述抗體是抗表皮生長(zhǎng)因子受體(EGF受體)抗體。
2.權(quán)利要求1的凍干藥物制劑，其特征在于所述抗體是Cetuximab或EMD 72000或與其相對(duì)應(yīng)的鼠源、人源或嵌合抗體類似物之一。
3.權(quán)利要求2的凍干藥物制劑，其特征在于所述抗體是Cetuximab或EMD 72000。
4.權(quán)利要求1至3的一項(xiàng)或多項(xiàng)的凍干藥物制劑，其基本上由抗體、糖或氨基糖、氨基酸、緩沖劑和表面活性劑組成。
5.權(quán)利要求1至4的一項(xiàng)或多項(xiàng)的凍干藥物制劑，其特征在于所述糖是單糖、二糖或三糖，優(yōu)選蔗糖、麥芽糖或海藻糖。
6.權(quán)利要求1至5的一項(xiàng)或多項(xiàng)的凍干藥物制劑，其特征在于所述氨基糖是葡糖胺、N-甲基-葡糖胺、半乳糖胺或神經(jīng)氨糖酸。
7.權(quán)利要求1至6的一項(xiàng)或多項(xiàng)的凍干藥物制劑，其特征在于所述氨基酸是堿性、酸性或中性氨基酸，優(yōu)選精氨酸、賴氨酸或鳥(niǎo)氨酸。
8.權(quán)利要求1至7的一項(xiàng)或多項(xiàng)的凍干藥物制劑，其特征在于所述表面活性劑是聚山梨酯或聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物。
9.權(quán)利要求8的凍干藥物制劑，其特征在于所述表面活性劑是聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯或聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯。
10.權(quán)利要求1至9的一項(xiàng)或多項(xiàng)的凍干藥物制劑，其特征在于還存在建立等滲性所必需濃度的等滲劑。
11.權(quán)利要求10的凍干藥物制劑，其特征在于氯化鈉作為等滲劑存在。
12.通過(guò)將權(quán)利要求1至11的一項(xiàng)或多項(xiàng)的凍干物質(zhì)用水性溶劑重構(gòu)可獲得的單或多克隆抗體的水性藥物制劑。
13.權(quán)利要求12的水性藥物制劑，其特征在于所述溶液的pH為5至8、優(yōu)選6至7.4。
14.權(quán)利要求13的水性藥物制劑，其特征在于所述溶液的pH為約7.2。
15.制備權(quán)利要求1至11的一項(xiàng)或多項(xiàng)的凍干藥物制劑的方法，其特征在于制備包含Cetuximab或EMD 72000作為活性成分并包含糖或氨基糖、氨基酸和表面活性劑作為添加劑、并且如果需要還包含其它藥用助劑的水性配制物，隨后將溶液凍干。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含抗表皮生長(zhǎng)因子受體(EGF受體)抗體的凍干藥物制劑。該制劑的貯藏穩(wěn)定性提高，甚至在升高的溫度下，并且重構(gòu)后可經(jīng)胃腸外使用以治療腫瘤。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1606455SQ02825694
公開(kāi)日2005年4月13日 申請(qǐng)日期2002年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月21日
發(fā)明者H-C·梅勒, H-P·措貝爾, R·米勒, C·巴赫曼, U·哈斯, L·克呂格爾, U·馬丁尼-馬爾 申請(qǐng)人:默克專利有限公司