專利名稱：直接靶定的結(jié)合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
總體來說，本發(fā)明涉及多價(jià)的、單特異性結(jié)合蛋白。具體說來，本發(fā)明涉及單特異性雙體(diabodies)、三體(triabodies)和四體(tetrabodies)的組合物，以及它們的使用方法，還涉及用于在微生物宿主中表達(dá)這些功能結(jié)合蛋白的重組載體。
背景技術(shù)：
提供以下描述是為了便于讀者理解。所有提供的信息或引入的參考均不作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。人工結(jié)合蛋白，特別是單克隆抗體和工程化抗體或抗體片段已經(jīng)過廣泛地檢驗(yàn)，其在治療多種人類疾病，包括癌癥、自身免疫疾病、傳染性的疾病、炎癥和心血管疾病中起作用已得到證實(shí)(Filpula和McGuire，Exp. Opin. Ther. Patents 9231-245(1999))。例如，將用放射性同位素標(biāo)記的抗體注射到患者體內(nèi)后，可通過本領(lǐng)域已知的檢測(cè)器觀察腫瘤。抗體或由抗體衍生的試劑的臨床應(yīng)用主要依賴于其與靶抗原的特異結(jié)合能力。選擇能力對(duì)將診斷或治療劑(比如藥物、毒素、細(xì)胞因子、激素、生長(zhǎng)因子、共軛物、放射性核素或金屬)有效遞送到靶位點(diǎn)，用來檢測(cè)和/或治療人類病癥階段很重要，特別是在所述的診斷或治療劑對(duì)機(jī)體的正常組織有毒性的時(shí)候。
抗體系統(tǒng)的潛在限制是本領(lǐng)域已知的(參見例如，Goldenberg，Am.J.Med.94297-312(1993))。檢測(cè)和治療技術(shù)中的重要參數(shù)包括，例如特異地定位在包含靶抗原的細(xì)胞位點(diǎn)處的注射劑量值和攝取率，即特異結(jié)合的抗體與存在于周圍正常組織的游離的抗體的比率(通過放射性檢測(cè))。將抗體注射到血流中后，隨著抗體的代謝和分泌其可穿透許多生理間隔。最佳地，該抗體能定位并結(jié)合于靶細(xì)胞抗原，而穿過機(jī)體的其余部分。控制抗原靶定的因素包括，例如抗原的位置和大小，抗原密度，抗原可接近性，靶組織的細(xì)胞組合物和靶定抗體的藥物動(dòng)力學(xué)。其他特異影響抗體靶定腫瘤的因素包括，靶抗原在腫瘤和正常組織中的表達(dá)水平和放射性標(biāo)記的抗體緩慢血液清除所引起的骨髓毒性。
由被靶定腫瘤細(xì)胞增積的靶向抗體數(shù)值受下列因素的影響，即腫瘤的血管化、腫瘤的抗體穿越屏障和腫瘤內(nèi)壓力。非靶器官(如肝、腎或骨髓)的非特異的攝入是上述技術(shù)，尤其是放射性免疫治療的另一個(gè)潛在的限制，其中骨髓照射經(jīng)常引起劑量限制毒性。
所設(shè)計(jì)的稱作直接靶定的方法是利用攜帶診斷或治療用放射性同位素的抗體靶定腫瘤抗原。直接靶定方法需要可特異識(shí)別定位于腫瘤上或腫瘤內(nèi)的、放射性標(biāo)記的抗腫瘤單特異性抗體。這種技術(shù)通常包括將經(jīng)標(biāo)記的單特異性抗體注射到病人體內(nèi)，使所述抗體定位于腫瘤以獲得診斷或治療效果，而未結(jié)合的抗體從體內(nèi)清楚。然而，所述的放射性標(biāo)記抗體并不與靶抗原形成非常穩(wěn)定的復(fù)合物，因此并不長(zhǎng)期停留在腫瘤位點(diǎn)處。
因此，本領(lǐng)域仍需要應(yīng)用于直接靶定系統(tǒng)的多價(jià)的、單特異性抗體組合物，以及利用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)上述抗體的方法。特別地、還需要表現(xiàn)提高的抗體攝入和與靶抗原結(jié)合的抗體，以在循環(huán)中遺留較少的游離抗體，并且理想地保護(hù)正常組織和細(xì)胞不受與所述抗體結(jié)合的毒性試劑的影響。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及多價(jià)的、單特異性結(jié)合蛋白。
這些結(jié)合蛋白包含兩個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其中，每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)均特異地與相同類型的靶細(xì)胞結(jié)合，優(yōu)選地與上述靶細(xì)胞上的相同抗原結(jié)合。本發(fā)明進(jìn)一步涉及單特異性雙體、三體和四體的組合物，以及用于在微生物宿主中表達(dá)這些功能結(jié)合蛋白重組載體。本發(fā)明還提供利用本發(fā)明的組合物治療和/或診斷腫瘤的方法。本發(fā)明的一個(gè)特定的目的在于提供一種具有提高了抗體攝入和靶抗原結(jié)合的抗體，用于腫瘤的診斷治療。
本發(fā)明一方面提供多價(jià)的、單特異性結(jié)合蛋白，其具有兩個(gè)或多個(gè)特異于相同靶抗原的結(jié)合位點(diǎn)。各結(jié)合位點(diǎn)都是由兩個(gè)或多個(gè)單鏈Fv(scFv)片段締合而成的，每個(gè)scFv包含由人源化或人單克隆抗體衍生出的至少兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。在多種可備選的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多價(jià)的、單特異性結(jié)合蛋白可以是單特異性雙體，單特異性三體、或單特異性四體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的人源化或人單克隆抗體特異于腫瘤關(guān)聯(lián)抗原，最優(yōu)選地是癌胚抗原(CEA)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述多價(jià)的、單特異性結(jié)合蛋白還可以包含診斷試劑、治療劑和/或這些試劑中的兩種或多種的組合。在不同的實(shí)施方案中，所述的診斷試劑可以是共軛物、放射性核素、金屬、造影劑、示蹤劑、檢測(cè)劑或其組合。在不同的實(shí)施方案中，所述的治療劑可以是放射性核素、化療藥物、細(xì)胞因子、激素、生長(zhǎng)因子、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑或其組合。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明還提供包含編碼不同多價(jià)的、單特異性結(jié)合蛋白的核苷酸序列的表達(dá)載體，以及經(jīng)這些表達(dá)載體轉(zhuǎn)化以生產(chǎn)所述結(jié)合蛋白的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步提供診斷腫瘤存在的方法和利用本發(fā)明的結(jié)合蛋白治療腫瘤的方法。本發(fā)明的結(jié)合蛋白還可用作在受試者體內(nèi)將一種或多種診斷試劑，一種或多種治療劑、或上述兩種或多種試劑的組合遞送到腫瘤的有效方式，也可作為治療的和/或診斷試劑盒提供，以便于從業(yè)人員使用。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1是在大腸桿菌中由hMN-14-scFv-L5表達(dá)質(zhì)粒合成hMN-14scFv多肽，以及形成hMN-14雙體的示意圖。編碼未加工的多肽的核酸構(gòu)建體包含編碼pelB信號(hào)肽的序列，通過5個(gè)氨基酸的接頭連接的hMN-14VH和hMN-14VK編碼序列，以及羧基末端的組氨酸親和標(biāo)記。該圖還顯示由蛋白水解去除了pelB信號(hào)肽之后的成熟多肽的點(diǎn)狀圖，和包括CEA結(jié)合位點(diǎn)的hMN-14雙體的點(diǎn)狀圖。
圖2集中顯示出hMN-14雙體純化的大小排阻高效液相色譜(HPLC)分析的結(jié)果。圖2A是IMAC-純化的hMN-14雙體的HPLC洗脫分布圖。hMN-14雙體在圖2A和2B中的HPLC洗脫峰用箭頭指示。圖2B是經(jīng)WI2抗-特異基因型親和色譜純化的hMN-14雙體HPLC洗脫分布圖。在圖BX軸上指示出的*9.75是對(duì)照hMN-14-Fab′-S-NEM(MW~50kDa)的HPLC保留時(shí)間(9.75分鐘)。
圖3集中顯示hMN-14scFv多肽的蛋白質(zhì)分析結(jié)果。圖3A是經(jīng)考馬斯藍(lán)染色的還原SDS-PAGE凝膠圖，其說明hMN-14雙體樣品經(jīng)IMAC純化和WI2抗特異基因型親和純化后的純度。用箭頭指示分子量標(biāo)準(zhǔn)和hMN-14scFv多肽的位置。圖3B是等電點(diǎn)聚焦(IEF)凝膠圖。用箭頭指示pI標(biāo)準(zhǔn)和hMN-14scFv多肽的位置。圖3B中1道包含hMN-14Fab′-S-NEM用作標(biāo)準(zhǔn)。該圖中的2道包含WI2純化的hMN-14雙體。3道包含來自WI2親和層析柱的未結(jié)合的流出組分，由此顯示出hMN-14scFv雙體在這一過程中得到有效地純化。
圖4顯示在腫瘤和血樣中監(jiān)控的注射了所述雙體后的頭96小時(shí)131I-hMN-14雙體的水平。畫出以每克組織的注射劑量(％ID/g)測(cè)定的131I-hMN-14雙體的量對(duì)時(shí)間的曲線。實(shí)心方塊表示腫瘤樣品的數(shù)據(jù)點(diǎn)，空心方塊表示血樣的數(shù)據(jù)點(diǎn)。
圖5顯示131I-hMN-14雙體在注射后48小時(shí)的生物分布。樣品是從腫瘤和正常組織，包括肝、脾、腎、肺、血、胃、小腸和大腸中獲取的。131I-hMN-14雙體的量以每克組織的注射劑量(％ID/g)的百分比表示。
圖6是在大腸桿菌中由hMN-14-0表達(dá)質(zhì)粒合成hMN-14-0多肽，以及形成hMN-14三體的示意圖。編碼未加工的多肽的核酸構(gòu)建體包含編碼pelB信號(hào)肽的序列，hMN-14VH和hMN-14VK編碼序列和羧基末端的組氨酸親和標(biāo)記。該圖還顯示由蛋白水解去除了pelB信號(hào)肽之后的成熟多肽的點(diǎn)狀圖和包括CEA結(jié)合位點(diǎn)的hMN-14三體的點(diǎn)狀圖。
圖7集中顯示出hMN-14三體純化的大小排阻HPLC分析的結(jié)果。hMN-14三體的HPLC洗脫峰出現(xiàn)在第9.01分鐘?？扇艿鞍踪|(zhì)在經(jīng)Q-瓊脂糖凝膠陰離子交換色層分離后由Ni-NTA IMAC純化。將Q瓊脂糖凝膠柱的流出組分用于HPLC分析。用箭頭指示hMN-14雙體和hMN-14F(ab′)2的保留時(shí)間。
圖8集中顯示注射后頭96小時(shí)hMN-14雙體(圖8A)、hMN-14三體(圖8B)和hMN-14四體(圖8C)的腫瘤攝取和血液清除率比較。畫出以每克組織的注射劑量(％ID/g)測(cè)定的125I-標(biāo)記的蛋白的量對(duì)時(shí)間的曲線。
圖9是在大腸桿菌中由hMN-14-1G表達(dá)質(zhì)粒合成hMN-14-1G多肽，以及形成hMN-14四體的示意圖。編碼未加工的多肽的核酸構(gòu)建體包含編碼pelB信號(hào)肽的序列，和通過單一的甘氨酸殘基連接的hMN-14VH和VK的編碼序列，以及羧基末端的組氨酸親和標(biāo)記。該圖還顯示由蛋白水解去除了pelB信號(hào)肽之后的成熟多肽的點(diǎn)狀圖，和包括CEA結(jié)合位點(diǎn)的hMN-14四體的點(diǎn)狀圖。
圖10集中顯示出hMN-14-1G多肽純化的大小排阻高效液相色譜(HPLC)分析的結(jié)果。可溶蛋白質(zhì)在經(jīng)Q-瓊脂糖凝膠陰離子交換色層分離后由Ni-NTA IMAC純化。將Q瓊脂糖凝膠柱的流出組分用于HPLC分析。用箭頭指示雙體、三體和四體的HPLC洗脫峰。
圖11是hMN-14-scFv-L5的核酸序列(SEQ ID NO1)和推定的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。核酸堿基1-66編碼pelB信號(hào)肽；70-423編碼hMN-14VH；424-438編碼該接頭肽(GGGGS)；439-759編碼hMN-14VK；766-783編碼組氨酸親和標(biāo)記。
圖12是hMN-14VH(SEQ ID NO3)和hMN-14VK(SEQ ID NO4)的推定氨基酸序列。
圖13是hMN-14-0的核酸序列(SEQ ID NO5)和推定的氨基酸序列(SEQ ID NO6)。核酸堿基1-66編碼pelB信號(hào)肽；70-423編碼hMN-14VH；424-744編碼hMN-14VK；751-78編碼組氨酸親和標(biāo)記。
圖14是hMN-14-1G的核酸序列(SEQ ID NO7)和推定的氨基酸序列(SEQ ID NO8)。核酸堿基1-66編碼pelB信號(hào)肽；70-423編碼hMN-14VH；424-427編碼該接頭肽(G)；427-747編碼hMN-14VK；754-771編碼組氨酸親和標(biāo)記。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述除非另作說明、″某″或″某個(gè)″指″一或多個(gè)″。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及多價(jià)的、單特異性結(jié)合蛋白。這些結(jié)合蛋白包括兩個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，各結(jié)合位點(diǎn)均對(duì)相同的單個(gè)靶抗原具有親和力。各結(jié)合位點(diǎn)都是由兩個(gè)或多個(gè)單鏈Fv(scFv)片段結(jié)合形成。各scFv包含至少兩個(gè)來源于人源化或人單克隆抗體的可變結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明進(jìn)一步涉及單特異性的雙體、三體和四體，其可進(jìn)一步包括診斷或治療劑，或其兩個(gè)或多個(gè)的組合。
由此，本發(fā)明提供包含兩個(gè)或多個(gè)對(duì)相同的單個(gè)靶抗原具有親和性的結(jié)合位點(diǎn)的多價(jià)的、單特異性結(jié)合蛋白，其中所述的結(jié)合位點(diǎn)由兩個(gè)或多個(gè)單鏈Fv(scFv)片段結(jié)合形成，每個(gè)scFv片段包含至少兩個(gè)來源與人源化或人單克隆抗體的可變結(jié)構(gòu)域。在確定的實(shí)施方案中，所述的單克隆抗體特異于腫瘤相關(guān)抗原。
在結(jié)構(gòu)上，完整的抗體由一個(gè)或多個(gè)Y形單位組成，所述的Y形單位包含四條多肽鏈。兩條相同拷貝的多肽鏈稱為重鏈，兩條相同拷貝的多肽鏈稱作輕鏈。各條多肽由單獨(dú)的DNA或相連接的DNA所編碼。兩條重鏈由一個(gè)或多個(gè)二硫鍵連接在一起，每條輕鏈通過一個(gè)二硫鍵與一條重鏈相連。每條鏈都具有N-末端可變結(jié)構(gòu)域，相對(duì)于重鏈和輕鏈分別稱作VH和VL，稱作Fv片段的非共價(jià)結(jié)合的一對(duì)VH和VL形成一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。
分離的Fv片段在低蛋白濃度和生理?xiàng)l件下易于分解(Glockshuber等，Biochemistry 291362-1367(1990))，因此使用受到限制。為了改善穩(wěn)定性和提高潛在效用，廣泛地研究并生產(chǎn)出重組單鏈Fv(scFv)，其中VH結(jié)構(gòu)域(或VL)的C末端通過可變長(zhǎng)度的肽接頭與VL結(jié)構(gòu)域(或VH)的N末端相連(最近的綜述參見Hudson和Kortt，J.Immunol.Meth.231177-189(1999))。
帶有大于12個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)度接頭的(例如15或18個(gè)殘基的接頭)的ScFvs可使同一多肽鏈的VH和VL區(qū)域之間相互作用，形成單體、二聚體(稱作雙體)和少量的高分子多聚體的混合物(Kortt等，Eur.J.Biochem.221151-157(1994))。帶有由5個(gè)或更少氨基酸殘基的接頭的ScFvs抑制同一多肽鏈VH和VL區(qū)域的分子內(nèi)的連接，迫使其與不同多肽鏈上的VH和VL結(jié)構(gòu)域配對(duì)。具有3-12個(gè)氨基酸殘基的接頭主要形成二聚體(Atwell等，Prot.Eng.12597-604(1999))。具有0-2個(gè)氨基酸殘基的接頭的ScFvs形成三聚體(稱作三體)、四聚體(稱作四體)或更高級(jí)的寡聚體結(jié)構(gòu)；然而除接頭長(zhǎng)度之外，寡聚體的確切型式還取決于組合物以及V-結(jié)構(gòu)域的方向。例如，抗-神經(jīng)氨糖酸苷酶抗體NC10的scFvs與0氨基酸殘基接頭主要形成三聚體(VH到VL方向)或四聚體(VL到VH方向)(Dolezal等，Prot.Etig.13565-574(2000))。由NC10構(gòu)建的ScFvs與1到兩個(gè)氨基酸殘基的接頭以VH到VL方向主要形成雙體(Atwell等，出處同上)；相反，VL到VH方向形成四聚體、三聚體、二聚物和更高分子量多聚體的混合物(Dolezal等，出處同上)。由抗-CD19抗體HD37構(gòu)建的ScFvs與0氨基酸殘基接頭以VH到VL方向形成單獨(dú)地三聚體，而相同的構(gòu)建體與1個(gè)氨基酸殘基的接頭形成單獨(dú)地四聚體(Le Gall等，F(xiàn)EBS Lett.453164-168(1999))。
兩個(gè)或多個(gè)scFv分子非共價(jià)的相連可以形成功能性雙體、三體和四體，它們是多價(jià)的但是單特異性的。單特異性雙體是相同scFv的同型二聚體，其中，每個(gè)scFv包含所選擇抗體的VH結(jié)構(gòu)域，并通過一短接頭與相同抗體的VL結(jié)構(gòu)域相連。雙體是由兩個(gè)scFv通過非共價(jià)相連形成的二價(jià)二聚體，形成兩個(gè)Fv結(jié)合位點(diǎn)。三體是由三個(gè)scFv形成的三價(jià)三聚體，形成三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，四體由四個(gè)scFv形成的四價(jià)四聚體，形成四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。已利用包含帶有VH1-接頭-VL1的重組基因構(gòu)建體的表達(dá)載體制備出幾個(gè)單特異性雙體(參見Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448(1993)；Atwell等，Mol.Immunol.331301-1312(1996)；Holliger等，Nature Biotechnol.15632-636(1997)；Helfrich等，Vint.J.Cancer 76232-239(1998)；Kipriyanov等，Vint.J.Cancer 77763-772(1998)；Holliger等，Cancer Res.592909-2916(1999))。在美國專利U.S.Patent Nos.4,946,778和5,132,405中公開了構(gòu)建scFv的方法。在美國專利U.S.Patent Nos.5,837,242和5,844,094以及PCT申請(qǐng)WO98/44001中公開了生產(chǎn)基于scFv的多價(jià)單特異性結(jié)合蛋白的方法。
人源化抗體是一種重組蛋白，其中來自一個(gè)物種，例如嚙齒動(dòng)物抗體的CDRs從該嚙齒動(dòng)物抗體重鏈和輕鏈可變鏈轉(zhuǎn)移到了人重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。該抗體分子的恒定結(jié)構(gòu)域來自人抗體。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案利用一個(gè)單克隆抗體hMN-14生產(chǎn)抗原特異的雙體、三體和四體。hMN-14是與CEA特異結(jié)合的人源化單克隆抗體(MAb)(Shevitz等，J.Nucl.Med.534217(1993)；和美國專利U.S.Patent No.6,254,868)。盡管起始的MAbs是鼠源的，現(xiàn)在使用人源化抗體試劑減少人抗小鼠的抗體應(yīng)答。如實(shí)施例1所述，這一抗體的可變區(qū)構(gòu)建到了表達(dá)構(gòu)建體(hMN-14-scFv-L5)中。如圖1所示，表達(dá)hMN-14雙體的核酸構(gòu)建體(hMN-14-scFv-L5)編碼的多肽具有下述的特征(i)VH的羧基末端通過肽接頭Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G4S)與VK的氨基末端相連(利用G4S肽接頭使分泌的多肽二聚體化形成雙體，形成兩個(gè)CEA結(jié)合位點(diǎn)))；(ii)VH基因之前的pelB信號(hào)肽序列使所述多肽于大腸桿菌的壁膜間隙合成；和(iii)將六個(gè)組氨酸(6His)氨基酸殘基加到羧基末端以便于用IMAC純化。
hMN-14-scFv-L5的核酸(SEQ ID NO1)的編碼序列和相應(yīng)推導(dǎo)出的氨基酸序列(SEQ ID NO2)如圖11所示。圖1還顯示出通過蛋白水解除去了pelB信號(hào)肽所得成熟多肽的點(diǎn)狀圖，和包括CEA結(jié)合位點(diǎn)的hMN-14雙體的點(diǎn)狀圖。
人抗體是從經(jīng)“工程化”成針對(duì)抗原刺激產(chǎn)生特異的人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的抗體。在這一技術(shù)中，人重鏈和輕鏈位點(diǎn)的元件被引入到小鼠品系中，所述小鼠來源于包含內(nèi)源性重鏈和輕鏈的靶定破壞位點(diǎn)的胚胎干細(xì)胞系。該轉(zhuǎn)基因的小鼠可以合成特異于人抗原的人抗體，并且所述的小鼠可用于生產(chǎn)分泌人抗體的雜交瘤。從轉(zhuǎn)基因小鼠獲得人抗體的方法參見Green等，Nature Genet.713(1994)，Lonberg等，Nature368856(1994)，和Taylor等，Iyat.Immun.6579(1994)。
完整的人抗體也可以通過遺傳的或染色體轉(zhuǎn)染的方法，以及噬菌體顯示技術(shù)構(gòu)建，所有這些都是本領(lǐng)域已知的。參見例如，McCafferty等，348552-553(1990)公開了由未經(jīng)免疫的供體免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的所有基因組成成分，在體外生產(chǎn)的人抗體及其片段。這一技術(shù)中，將抗體可變結(jié)構(gòu)域框內(nèi)克隆到絲狀噬菌體主要或次要外殼蛋白基因中，作為功能性抗體片段在所述噬菌體顆粒表面展示。由于絲狀的顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基于該抗體功能特性的選擇也影響編碼表現(xiàn)所述性質(zhì)的抗體的基因的選擇。通過這種方式，所述的噬菌體模仿B細(xì)胞的一些特性。噬菌體展示可通過多種形式進(jìn)行，關(guān)于它們的綜述參見，例如Johnson和Chiswell，Curr.Opin.Struct.Biol.35564-571(1993)。
人抗體也可以通過在體外激活B細(xì)胞來產(chǎn)生。參見美國專利U.S.Patent Nos.5,567,610和5,229,275，它們皆在此引入作為參考。
因此，本發(fā)明提供包含對(duì)相同靶抗原具有親合力的結(jié)合位點(diǎn)的多價(jià)的、單特異性結(jié)合蛋白(稱作單特異性雙體)，其中，所述的結(jié)合位點(diǎn)都是由兩個(gè)單鏈Fv(scFv)片段結(jié)合形成的，每個(gè)scFv包含至少兩個(gè)來源于人源化或人單克隆抗體的可變結(jié)構(gòu)域。在特定的實(shí)施方案中，所述的單克隆抗體特異于腫瘤相關(guān)抗原。優(yōu)選地，所述的腫瘤相關(guān)抗原是癌胚抗原(CEA)。
在又一實(shí)施方案中，所述的單特異性雙體的人源化單克隆抗體是hMN-14。在該實(shí)施方案中，各scFv優(yōu)選地包含hMN-14的VH和VK區(qū)域。選擇性地、各scFv進(jìn)一步包含連接hMN-14VH和VK區(qū)域的氨基酸接頭。在優(yōu)選的實(shí)施方案中各scFv包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
表達(dá)載體是通過如圖1和實(shí)施例2中描述的一系列亞克隆程序構(gòu)建的。圖1中以圖解的方式顯示出單特異性hMN-14結(jié)合蛋白的表達(dá)盒。該表達(dá)盒可包含在質(zhì)粒中，所述的質(zhì)粒是在宿主細(xì)胞內(nèi)形成染色體外自我復(fù)制的遺傳元件的一種小的雙鏈DNA?？寺≥d體是可以在微生物宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制的DNA分子。本發(fā)明描述了表達(dá)單特異性雙體、三體和四體的載體。寄主細(xì)胞接受載體復(fù)制，所述載體在每次宿主細(xì)胞分裂時(shí)進(jìn)行復(fù)制。
因此，本發(fā)明也提供包含編碼所述單特異性雙體的核苷酸序列的表達(dá)載體。
通常所用的宿主細(xì)胞是大腸桿菌(E.coli)，但其他宿主細(xì)胞也是本領(lǐng)域所公知的，例如多種細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞和植物細(xì)胞。在酵母中有多種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的載體可用于將構(gòu)建體引入到釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(面包酵母)，非洲粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(裂殖酵母)，巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)和多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)(甲基營(yíng)養(yǎng)酵母)并使其表達(dá)。此外有多種哺乳動(dòng)物表達(dá)載體是可商購的。另外，還可以使用多種基于病毒的表達(dá)體系，例如腺病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒。應(yīng)用這些表達(dá)體系，通過本發(fā)明的方法可以生產(chǎn)大量的重組抗體，將其用作可行的遞送系統(tǒng)。
因此，本發(fā)明也提供包含編碼所述的單特異性雙體表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
當(dāng)如圖1所示的表達(dá)盒在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，一些多肽折疊并自然地形成可溶性單特異性雙體。圖1所示的單特異性雙體具有兩條多肽鏈，它們之間相互作用形成對(duì)CEA抗原具有親合性的兩個(gè)CEA結(jié)合位點(diǎn)?？乖c特異性抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，其中的抗原抗體分子通過非共價(jià)相互作用結(jié)合在一起。
在這一實(shí)施方案中是利用五個(gè)氨基酸殘基的接頭將含hMN-14MAb的VH區(qū)域的兩條多肽與hMN-14MAb的VK區(qū)域連接。每條多肽形成hMN-14雙體的一半。編碼每條多肽的核酸(SEQ ID NO1)的編碼序列和相應(yīng)推導(dǎo)出的氨基酸序列(SEQ ID NO2)如圖11所示。
就三體而言，當(dāng)如圖6所示的表達(dá)盒在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，一些多肽自然地形成可溶性單特異性三體。如圖6所示該單特異性三體具有三條多肽鏈，它們之間相互作用形成三個(gè)對(duì)CEA抗原具有高親合性的CEA結(jié)合位點(diǎn)。三條多肽的任何一條均包含與hMN-14MAb無接頭相連的hMN-14MAb的VH區(qū)域。每條多肽形成hMN-14三體的三分之一。編碼每條多肽的核酸(SEQ ID NO5)的編碼序列和相應(yīng)推導(dǎo)出的氨基酸序列(SEQ ID NO6)如圖13所示。
由此，本發(fā)明提供包含對(duì)同一單個(gè)靶抗原具有親合性的三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的多價(jià)的，單特異性結(jié)合蛋白(稱作單特異性三體)，在其中所述的結(jié)合位點(diǎn)是由三條單鏈Fv(scFv)片段相連形成的，每個(gè)scFv片段包含至少兩個(gè)來源于人源化或人單克隆抗體的可變結(jié)構(gòu)域。在特定的實(shí)施方案中，所述的單克隆抗體特異于腫瘤相關(guān)抗原。優(yōu)選地，所述的腫瘤相關(guān)抗原是癌胚抗原(CEA)。
在又一實(shí)施方案中，所述的單特異性三體的人源化單克隆抗體是hMN-14。在該實(shí)施方案中，各scFv優(yōu)選地包含hMN-14的VH和VK區(qū)域。在特定的實(shí)施方案中，各scFv包含SEQ ID NO6的氨基酸序列。本發(fā)明也提供包含編碼該單特異性三體的核苷酸序列的表達(dá)載體和包含這些表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
就四體而言，當(dāng)如圖9所示的表達(dá)盒在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，一些多肽自然地形成可溶性單特異性四體。如圖9所示該單特異性四體具有4條多肽鏈，它們之間相互作用形成四個(gè)對(duì)CEA抗原具有高親合性的CEA結(jié)合位點(diǎn)。四條多肽中的每一條均包含通過單個(gè)氨基酸殘基接頭與hMN-14MAb的VK多肽相連的hMN-14MAb的VH多肽。每條多肽形成hMN-14四體的四分之一。編碼每條多肽的核酸(SEQ ID NO7)的編碼序列和相應(yīng)推導(dǎo)出的氨基酸序列(SEQ ID NO8)如圖14所示。
由此，本發(fā)明提供包含對(duì)同一單個(gè)靶抗原具有親合性的四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的多價(jià)單特異性結(jié)合蛋白(稱作單特異性四體)，在其中所述的結(jié)合位點(diǎn)是由4條單鏈Fv(scFv)片段相連形成的，每個(gè)scFv片段包含至少兩個(gè)來源于人源化或人單克隆抗體的可變結(jié)構(gòu)域。在特定的實(shí)施方案中，所述的單克隆抗體特異于腫瘤相關(guān)抗原。優(yōu)選地，所述的腫瘤相關(guān)抗原是癌胚抗原(CEA)。
在另一實(shí)施方案中，該人源化單克隆抗體是hMN-14。在該實(shí)施方案中，各scFv優(yōu)選地包含hMN-14的VH和VK區(qū)域。選擇性地、各scFv進(jìn)一步包含連接hMN-14VH和VK區(qū)域的氨基酸接頭。在特定的實(shí)施方案中，各scFv包含SEQ ID NO8的氨基酸序列。本發(fā)明也提供包含編碼該單特異性四體的核苷酸序列的表達(dá)載體和包含這些表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中、本發(fā)明的單特異性雙體、三體和四體用作直接靶定CEA陽性腫瘤的診斷或治療劑。也可以靶定其他的腫瘤相關(guān)抗原，例如A3，A33，BrE3，CD1，CD1a，CD3，CD5，CD15，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD30，CD45，CD74，CD79a，CEA，CSAp，EGFR，EGP-1，EGP-2，Ep-CAM，Ba733，HER2/neu，KC4，KS-1，KS1-4，Le-Y，MAGE，MUC1，MUC2，MUC3，MUC4，PAM-4，PSA，PSMA，RS5，S100，TAG-72，粘蛋白、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、腫瘤壞死抗原、VEGF、17-1A、血管生成標(biāo)記、細(xì)胞因子、免疫調(diào)節(jié)劑、致癌基因標(biāo)記和致癌基因產(chǎn)物。該單特異性分子選擇性地與靶抗原結(jié)合，隨著該分子上的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目增多，對(duì)靶細(xì)胞的親合性也隨之提高。強(qiáng)的親合性使本發(fā)明的組合物長(zhǎng)時(shí)間停留在包含該靶抗原的預(yù)定位置。此外，游離的未結(jié)合分子很快從身體中清除出去，從而使正常組織暴露于有害物劑的可能性最小化。
Herberman對(duì)腫瘤相關(guān)標(biāo)記進(jìn)行了分類(參見例如，癌癥的免疫診斷、癌癥的該臨床生物化學(xué)、Fleisher版、American Association ofClinical Chemists，1979)將其分成許多種類，包括胎性癌抗原、胎盤抗原、致癌的或腫瘤病毒結(jié)合抗原、組織結(jié)合抗原、器官結(jié)合抗原、異位激素和正?？乖蚱渥凅w。如美國專利U.S.Patent Nos.4,361,644和4,444、744中所描述的，有時(shí)可方便地利用腫瘤結(jié)合標(biāo)記的亞-單位，例如人絨毛膜促性腺激素(HCG)的β-亞基或癌胚抗原CEA的γ區(qū)域增加具有高腫瘤特異性的抗體，所述的亞單位刺激了對(duì)非腫瘤物質(zhì)的交叉反應(yīng)大大降低的抗體產(chǎn)生。腫瘤脈管系統(tǒng)(例如VEGF)、腫瘤壞死、膜受體(例如、葉酸受體、EGFR)、橫跨膜抗原(例如PSMA)，以及致癌基因產(chǎn)物的標(biāo)記還可以用作抗體或抗體片段的適當(dāng)?shù)哪[瘤-結(jié)合靶。在腫瘤細(xì)胞上過表達(dá)的正常細(xì)胞成分的標(biāo)記，例如B細(xì)胞復(fù)合抗原和由特定腫瘤細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子(例如T-細(xì)胞惡性腫瘤中的IL-2受體)也是本發(fā)明的抗體和抗體片段的適當(dāng)?shù)陌凶印?br> 在Couto等，Cancer Res.555973s-5977s(1995)中描述了BrE3抗體。美國在先申請(qǐng)No.60/360,229中描述了EGP-1抗體，Staib等，Int.J.Cancer 9279-87(2001)，Schwartzberg等，Crit.Rev.Oncol.Hemato.4017-24(2001)中引述了一些EGP-2抗體。Koda等，A4f2ticancer Res.21621-627(2001)中引述了KS-1抗體；Ritter等，Cancer Res.616854-6859(2001)中引述了A33抗體；Di Carlo等，Oncol.Rep.8387-392(2001)中描述了Le(y)抗體B3；Tordsson等，Int.J.Cancer 87559-568(2000)中描述了A3抗體。
還可以應(yīng)用針對(duì)致癌基因標(biāo)記或產(chǎn)物的抗體、或針對(duì)血管生成因子，如VEGF的抗體。在美國專利U.S.Patent Nos.6,342、221,5、965,132和6,004、554中描述了VEGF抗體，所述文獻(xiàn)均在此完全引入作為參考。Todryk等，J.Immunol.Meth.248139-147(2001)和Turner等，J.Immunol.16689-94(2001)中描述了針對(duì)特定免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的抗體，例如針對(duì)CD40的抗體。其他適合于聯(lián)合治療的抗體包括抗壞死抗體，參見Epstein等U.S.Patent Nos.5,019,368；5,882,626；and 6,017,514。
因此，本發(fā)明提供所述的多價(jià)的、單特異性結(jié)合蛋白，其包含至少兩個(gè)來源于對(duì)與下述疾病狀態(tài)相關(guān)的腫瘤相關(guān)抗原特異的人源化或人單克隆抗體的可變結(jié)構(gòu)域，所述的疾病狀態(tài)選自惡性腫瘤、黑素瘤、肉瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、白血病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、淋巴瘤和骨髓瘤。所述的腫瘤相關(guān)抗原可與選自下述的一種癌癥相關(guān)，所述的癌癥選自急性淋巴母細(xì)胞性白血病、急性髓性白血病、膽的、胸部的、頸的慢性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性髓性白血病、結(jié)腸直腸的、子宮內(nèi)膜的、食管的、胃的、頭和頸的Hodgkin淋巴瘤、肺、骨髓的，甲狀腺的非Hodgkin淋巴瘤、卵巢的、胰腺的、衰竭的和膀胱的癌癥。所述的腫瘤相關(guān)抗原可以選自A3，A33，BrE3，CD1，CD1a，CD3，CD5，CD15，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD30，CD45，CD74，CD79a，CEA，CSAp，EGFR，EGP-1，EGP-2，Ep-CAM，Ba733，HER2/neu，KC4，KS-1，KS1-4，Le-Y，MAGE，MUC1，MUC2，MUC3，MUC4，PAM-4，PSA，PSMA，RS5，S100，TAG-72，粘蛋白、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、腫瘤壞死抗原、VEGF、17-1A、血管生成標(biāo)記、細(xì)胞因子、免疫調(diào)節(jié)劑、致癌基因標(biāo)記和致癌基因產(chǎn)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的腫瘤相關(guān)抗原是癌胚抗原(CEA)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該人源化單克隆抗體是hMN-14。
本發(fā)明的又一實(shí)施方案包括利用本發(fā)明的抗體或抗體片段檢測(cè)、診斷和/或治療患病組織(例如，癌癥)，其包括施用有效量的二價(jià)、三價(jià)或四價(jià)的抗體或抗體片段，所述的抗體或抗體片段包含至少兩個(gè)與靶組織特異結(jié)合的臂。
因此，本發(fā)明提供所述的多價(jià)的、單特異性結(jié)合蛋白，進(jìn)一步包含選自下述的至少一種試劑，即診斷試劑、治療劑以及它們當(dāng)中的兩種或多種的組合。所述的診斷試劑可以選自共軛物、放射性核素、金屬、造影劑、示蹤試劑、檢測(cè)劑，以及它們當(dāng)中兩種或多種的組合。
在特定的實(shí)施方案中包含診斷放射性核素，所述的放射性核素選自11C，13N，15O，18F，32P，51Mn，52Fe，52mMn，55Co，62Cu，64Cu，67Cu，67Ga，68Ga，72As，75Br，76Br，82mRb，83Sr，86Y，89Zr，90Y，94mTc，94Tc，99mTc，110In，111In，120I，123I，124I，125I，131I，154-158Gd，177Lu，186Re，188Re，γ-發(fā)射器、β-發(fā)射器、正電子發(fā)射器以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。在其他的特定實(shí)施方案中，所述的放射性核素選自51Cr，57Co，58Co，59Fe，67Cu，67Ga，75Se，97Ru，99mTc，111In，114mIn，123I，125I，131I，169Yb，197Hg，201Tl，以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。
在特定的實(shí)施方案中包含金屬，所述的金屬選自釓、鐵、鉻、銅、鈷、鎳、鏑、錸、銪、鋱、鈥、釹以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。
在特定的實(shí)施方案中包含造影劑、所述的造影劑可以是核磁共振成像造影劑、CT造影劑，或超聲造影劑。造影劑可以選自釓離子、鑭離子、錳離子、鐵、鉻、銅、鈷、鎳、鏑、錸、銪、鋱、鈥、釹、另一種類似的造影劑以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。
在特定的實(shí)施方案中包含示蹤試劑、所述的示蹤試劑選自碘化物、鋇化合物、鎵化合物、鉈化合物、鋇、泛影葡胺、乙碘油、檸檬酸鎵、碘卡明酸、碘酸胺酸、碘達(dá)酸、膽影酸、碘沙酸、iogulamide、iohexol、碘異肽醇、碘番酸、ioprocemicacid、碘西法酸、碘絲酸、iosulamidemeglumine、iosemeticacid、iotasul、iotetricacid、iothalamicacid、碘托西酸、ioxaglic acid、ioxotrizoic acid、ipodate、甲基葡胺、碘葡酰胺非離子型造影劑、甲泛影鈉、丙碘酮、氯化亞鉈、以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。
在特定的實(shí)施方案中包含檢測(cè)劑、所述的檢測(cè)劑選自酶、熒光化合物、化學(xué)發(fā)光的化合物、生物發(fā)光的化合物、放射性同位素、以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。
在特定的實(shí)施方案中包含治療劑、所述的治療劑選自放射性核素、化學(xué)治療的藥、細(xì)胞因子、激素、生長(zhǎng)因子、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。
在特定的實(shí)施方案中包含治療性的放射性核素，其選自32P，33P，47Sc，59Fe，62Cu，64Cu，67Cu，67Ga，75Se，77As，89Sr，90Y，99Mo，105Rh，109Pd，111Ag，111In，125I，131I，142Pr，143Pr，149Pm，153Sm，161Tb，166Dy，166Ho，169Er，177Lu，186Re，188Re，189Re，194Ir，198Au，199Au，211At，211Pb，212Bi，212Pb，213Bi，223RA，225Ac，以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。在其他的特定實(shí)施方案中，所述的放射性核素選自58Co，67Ga，80mBr，99mTc，103mRh，109Pt，111In，119Sb，125I，161Ho，189mOs和192Ir，152Dy，211At，211Bi，212Bi，213Bi，215Po，217At，219Rn，221Fr，223Ra，225Ac，255Fm，以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。
在特定的實(shí)施方案中包含化療藥物，所述的化療藥物選自長(zhǎng)春花生物堿、anthracyclines、epidophyllotoxins、taxanes、抗代謝物、烷化劑、抗生素、Cox-2抑制劑、抗有絲分裂的、抗血管生成試劑、編程性細(xì)胞死亡試劑(apoptotoic agents)、阿霉素、氨甲蝶呤、紅豆杉醇、CPT-11、喜樹堿(camptothecans)、氮芥類、烷基磺酸鹽、亞硝基脲、三氮烯、葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤類似物、鉑配位絡(luò)合物、激素、以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。
在特定的實(shí)施方案中包含毒素、所述的毒素選自蓖麻毒、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶I、金黃色葡萄球菌(Staphylococcal)腸毒素A、美洲商陸抗病毒蛋白、gelonin、白喉毒素毒素、假單胞菌屬外毒素、假單胞菌屬內(nèi)毒素、以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。
在特定的實(shí)施方案中包含免疫調(diào)節(jié)劑，所述的免疫調(diào)節(jié)劑選自細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、淋巴細(xì)胞毒素、生血的因子、集落刺激因子、干擾素、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促紅細(xì)胞生成素、促血小板生成素、以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。
多種診斷和治療試劑可以方便地與本發(fā)明的抗體共軛結(jié)合。此處所述的治療劑是那些可分別與本發(fā)明所描述的多價(jià)結(jié)合蛋白一起施用的試劑。治療劑包括，例如，化療藥物，如長(zhǎng)春花生物堿、anthracyclines、epidophyllotoxins、taxanes、抗代謝物、烷化劑、抗生素、Cox-2抑制劑、抗有絲分裂的、抗血管生成和編程性細(xì)胞死亡試劑、特別阿霉素、氨甲蝶呤、紅豆杉醇、CPT-11、喜樹堿，以及由此及其他類型抗癌劑而來的治療劑等等。其他對(duì)免疫共軛和抗體融合蛋白有用的癌癥化療藥物包括氮芥類、烷基磺酸鹽、亞硝基脲、三氮烯、葉酸類似物、COX-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、鉑配位絡(luò)合物、激素、等等。有用的治療組合物可以包含通常用于治療CEA-產(chǎn)生的癌癥的其他試劑、抗-HER2抗體(例如Herceptin)和抗-EGF抗體。用于與本發(fā)明的多價(jià)結(jié)合蛋白結(jié)合的抗體可以是單克隆的、多克隆的或人源化抗體。其他合適的化療劑參見REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES，第19版(Mack Publishing Co.1995)，和GOODMAN AND GILMAN′S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OFTHERAPEUTICS，第7版(MacMillan Publishing Co.1985)，以及這些出版物的修訂版。其他合適的治療劑包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的實(shí)驗(yàn)藥物和在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的藥物。
毒素，如假單胞菌(Pseudomonas)外毒素、也可與本發(fā)明的抗體免疫共軛物絡(luò)合或形成所述治療劑的一部分。其他適合用于所述共軛物制劑或其他融合蛋白的毒素包括蓖麻毒、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNase)、脫氧核糖核酸酶I、葡萄球菌的腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、gelonin、白喉毒素毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌屬內(nèi)毒素(參見，例如Pastan等，Cell 47641-648(1986)，和Goldenberg，CA Cancer J.Clin.4443964(1994))。此外適用于本發(fā)明的毒素是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的參見美國專利U.S.Patent No.6,077,499，其在此全部引入作為參考。
所述的診斷和治療劑可以包括藥物、毒素、細(xì)胞因子、帶有細(xì)胞因子的共軛物、激素、生長(zhǎng)因子、共軛物、放射性核素、造影劑、金屬、細(xì)胞毒類藥物和免疫的調(diào)節(jié)劑。例如，釓金屬用于磁共振成象，偶聯(lián)熒光染料可用于在光力學(xué)治療。此外、造影劑可以是核磁共振成像造影劑、比如釓離子、鑭離子、錳離子、鐵、鉻、銅、鈷、鎳、鏑、錸、銪、鋱、鈥、釹或其他的可比較的標(biāo)記物、CT造影劑和超聲造影劑。
在本發(fā)明的方法中，可進(jìn)行靶定的構(gòu)建體可以包含一種或多種用于檢測(cè)患病組織的放射性同位素。特別有用的診斷放射性核素包括、但不限于11C，13N，15O，18F，32P，51Mn，52Fe，52mMn，55Co，62Cu，64Cu，67Cu，67Ga，68GA，72As，75Br，76Br，82mRb，83SR，86Y，89Zr，90Y，94mTc，94Tc，99mTc，110In，111In，120I，123I，124I，15I，131I，154-158Gd，177Lu，186Re，188Re，或其他γ-、-β或正電子發(fā)射器，優(yōu)選在20到4,000keV衰變能量范圍內(nèi)，更優(yōu)選在25到4,000keV范圍內(nèi)，更優(yōu)選在20到1,000keV范圍內(nèi)更優(yōu)選地在70到700keV范圍內(nèi)。有用的正電子發(fā)射的放射性核素總衰變能量?jī)?yōu)選地＜2,000keV、更優(yōu)選低于1,000keV，最優(yōu)選＜700keV。
用作適合利用γ射線探測(cè)的診斷試劑的放射性核素包括但不限于51Cr，57Co，58Co，59Fe，57Cu，67Ga，75SE，97Ru，99mTc，111In，114mIn，123I，125I，131I，169Yb，197Hg，和201Tl。發(fā)射γ-射線的有用的放射性核素衰變的能量?jī)?yōu)選地是20-2000keV、更優(yōu)選是60-600keV，最優(yōu)選是100-300keV。
在本發(fā)明的方法中，可進(jìn)行靶定的構(gòu)建體可以包含一種或多種用于治療患病組織的放射性同位素。特別有用的治療的放射性核素包括、但不限于32P，33P，47Sc，59Fe，62Cu，64Cu，67Cu，67Ga，75Se，77As，89Sr，90Y，99Mo，105Rh，109Pd，111Ag，111In，125I，131I，142Pr，143Pr149Pm，153Sm，161Tb，166Dy，166Ho，169Er，177Lu，186Re，188Re，189Re，194Ir，198Au，199Au，211At211Pb，212Bi，212Pb，213Bi，223Ra和225Ac。所述的治療性放射性核素的衰變能量?jī)?yōu)選在20到6,000keV范圍內(nèi)，優(yōu)選地對(duì)于螺旋推運(yùn)器發(fā)射器在60到200keV范圍內(nèi)，對(duì)于β發(fā)射體在100-2,500keV范圍內(nèi)，對(duì)于α發(fā)射體在4,000-6,000keV范圍內(nèi)。
還優(yōu)選的是基本上隨螺旋推運(yùn)器放射顆粒衰變的放射性核素。上述的放射性核素包括但不限于58Co，67Ga，80mBr，99mTc，103mRh，109Pt，111In，119Sb，125I，161Ho，189Os and192Ir。還優(yōu)選的是基本上隨α顆粒的產(chǎn)生而衰變的放射性核素。上述的放射性核素包括但不限于152Dy，211At，211Bi，212Bi，213Bi，215Po，217At，219Rn，221Fr，223Ra，225Ac和255Fm。有用的發(fā)射α顆粒的放射性核素的衰變能量?jī)?yōu)選在2,000-9,000keV，更優(yōu)選3,000-8,000keV，最優(yōu)選4,000-7,000keV。
本發(fā)明的抗體及其片段可以包括附加的示蹤試劑。不透射線的和對(duì)照材料用于增強(qiáng)X-射線和計(jì)算層析成象，其包括碘化物、鋇化合物、鎵化合物、鉈化合物、等等。特異的化合物包括鋇、泛影葡胺、乙碘油、鎵檸檬酸鹽、碘卡明酸、碘酸胺酸、碘達(dá)酸、膽影酸、碘沙酸、iogulamide、iohexol、碘異肽醇、碘番酸、ioprocemic acid、碘西法酸、碘絲酸、iosulamide meglumine、iosemeticacid、iotasul、iotetric acid、iothalamic acid、碘托西酸、ioxaglic acid、ioxotrizoic acid、ipodate、甲基葡胺、碘葡酰胺非離子型造影劑、甲泛影鈉、丙碘酮和氯化亞鉈。
本發(fā)明的抗體及其片段也可以用熒光化合物標(biāo)記。通過將靶抗原結(jié)合蛋白暴露于適當(dāng)波長(zhǎng)的光確定熒光標(biāo)記的MAb的存在并檢測(cè)所得的熒光。熒光標(biāo)記物化合物包括異硫氰酸熒光素、若丹明、藻紅蛋白、藻青蛋白、別藻藍(lán)蛋白、o-phthaldehyde和熒光胺。熒光標(biāo)記的抗原結(jié)合蛋白對(duì)流式細(xì)胞光度術(shù)分析特別有用。
換句話說，可通過將所述結(jié)合蛋白與化學(xué)發(fā)光的化合物偶聯(lián)使抗體及其片段成為可檢測(cè)的標(biāo)記物。通過檢測(cè)在化學(xué)反應(yīng)的過程中發(fā)生的熒光確定化學(xué)發(fā)光的-標(biāo)記的MAb的存在?；瘜W(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的實(shí)例包括魯米諾、異魯米諾、芳香吖啶酯、咪唑、acridinium鹽和草酸酯。
類似地，生物發(fā)光的化合物可用于標(biāo)記抗體及其片段。生物發(fā)光是在生物系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的一種化學(xué)發(fā)光，其中催化蛋白提高了化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率。通過檢測(cè)熒光的存在來確定生物發(fā)光的蛋白的存在?？捎糜跇?biāo)記的生物發(fā)光的化合物包括螢光素、熒光素酶和水母發(fā)光蛋白。
換句話說，可通過將所述抗體與酶連接使抗體及其片段成為可檢測(cè)的標(biāo)記物。當(dāng)在適當(dāng)?shù)牡孜锎嬖谙路趸贵w-酶共軛物時(shí)，酶組分與底物反應(yīng)生成可由例如，分光光度法、熒光的或直觀的方式檢測(cè)的化學(xué)組分。用于形成可檢測(cè)的標(biāo)記抗體的酶的實(shí)例包括蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌的核酸酶、δ-V-類固醇異構(gòu)酶、酵母乙醇脫氫酶、磷酸甘油脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、辣根過氧化酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。
免疫調(diào)節(jié)劑，如細(xì)胞因子、也可以與本發(fā)明的嵌合的、人源化的或人抗體或其片段偶聯(lián)，或形成抗體免疫共軛物的治療劑部分，再或以非偶聯(lián)的方式施用。此處所用的術(shù)語″免疫調(diào)節(jié)劑″包括細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、淋巴細(xì)胞毒素、比如腫瘤壞死因子(TNF)和生血的因子、比如白細(xì)胞間介素(例如、白細(xì)胞間介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12和IL-18)、集落刺激因子(例如、粒性白細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)和粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF))、干擾素(例如、干擾素-α、-(β和γ)、所述的干細(xì)胞生長(zhǎng)因子指定為″S1因子、″促紅細(xì)胞生成素和促血小板生成素。適當(dāng)?shù)拿庖哒{(diào)節(jié)劑元件的實(shí)例包括IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、干擾素-γ、TNF-α等等。換句話說，受試者可以承受裸抗體和在所述裸抗體施用之前、同時(shí)或之后單獨(dú)施用的細(xì)胞因子。所述抗體也可以與免疫調(diào)節(jié)劑相偶聯(lián)。該免疫調(diào)節(jié)劑也可以與由和不同抗原結(jié)合的一種或多種抗體組成的雜合抗體相偶聯(lián)。
通過形成二硫鍵治療或診斷試劑可以附著于經(jīng)簡(jiǎn)化的抗體組分的鉸鏈區(qū)。作為一種替代，上述的肽可以利用異源雙功能交聯(lián)接頭，如N-琥珀酰3-(2-吡啶二硫)-丙酸酯(SPDP)附著于抗體組分(Yu等，Int.J.Cancer 56244-248(1994))。這種偶聯(lián)的常規(guī)技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，參見，例如，Wong，蛋白結(jié)合和交聯(lián)化學(xué)(CRC Press 1991)；Upeslacis等，″通過化學(xué)法修飾抗體，″單克隆抗體原理與應(yīng)用，Birch等(編)，187-230頁(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，″合成肽衍生的抗體的生產(chǎn)與表征，″單克隆抗體生產(chǎn)、工程化與臨床應(yīng)用，Ritter等(編)，60-84頁(Cambridge University Press1995)。換句話說，治療或診斷試劑可以通過碳水化物元件在抗體的Fc區(qū)域與之偶聯(lián)。該碳水化合物基團(tuán)可用于增加與硫醇基結(jié)合的相同的肽，或者所述的碳水化合物組分可用于結(jié)合不同的肽。
這些試劑用來診斷和/或治療哺乳動(dòng)物病癥。哺乳動(dòng)物可以包括人、家畜和寵物、比如貓和狗。哺乳動(dòng)物病癥可以包括癌癥、比如惡性腫瘤、黑素瘤、肉瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、白血病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤與骨髓瘤。癌癥的類型包括、但不局限于、膽汁的、胸部、頸的、結(jié)腸直腸的、子宮內(nèi)膜的、食管的、胃的、頭和頸、肺、骨髓的甲狀腺、卵巢的、胰腺的、衰竭的(prostrate)和膀胱癌癥。
因此、本發(fā)明提供診斷腫瘤存在的方法，該方法包括對(duì)懷疑患有腫瘤的受試者施用可檢測(cè)量的上述多價(jià)的、單特異性結(jié)合蛋白，該結(jié)合蛋白包含上述的診斷試劑，監(jiān)控受試者以檢測(cè)任何結(jié)合蛋白與腫瘤的結(jié)合。
本發(fā)明進(jìn)一步提供治療腫瘤的方法，該方法包括對(duì)所需受試者使用有效劑量的上述多價(jià)的、單特異性結(jié)合蛋白，所述結(jié)合蛋白包含上述的診斷試劑。
本發(fā)明進(jìn)一步提供診斷腫瘤存在的方法，該方法包括對(duì)懷疑患有腫瘤的受試者施用可檢測(cè)量的上述多價(jià)的、單特異性結(jié)合蛋白的同時(shí)，施用可與上述結(jié)合蛋白結(jié)合的可檢測(cè)元件，監(jiān)控受試者以檢測(cè)任何結(jié)合蛋白與腫瘤的結(jié)合。
本發(fā)明進(jìn)一步提供治療腫瘤的方法，該方法包括對(duì)所需受試者使用有效劑量的上述多價(jià)的、單特異性結(jié)合蛋白的同時(shí)施用治療劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的治療劑選自化療藥物、毒素、外輻射、短程治療輻射試劑、放射性標(biāo)記的蛋白、抗癌藥和抗癌抗體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供將一種或多種診斷試劑、一種或多種治療劑或其兩種或多種的組合遞送到腫瘤的方法，該方法包括，對(duì)所需受試者施用上述的多價(jià)的、單特異性結(jié)合蛋白，以及選自診斷試劑、治療劑、以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合的至少一種的試劑。
向靶遞送本發(fā)明的診斷或治療劑包括，提供帶有診斷或治療劑的結(jié)合蛋白，對(duì)所需受試者施用所述結(jié)合蛋白。診斷進(jìn)一步的要求利用已知的技術(shù)檢測(cè)結(jié)合蛋白的步驟。
將本發(fā)明的帶有診斷或治療劑的結(jié)合蛋白施用于哺乳動(dòng)物的方法可以是靜脈內(nèi)的、動(dòng)脈內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、肌內(nèi)的、皮下的、胸膜內(nèi)的、鞘內(nèi)的、通過局部導(dǎo)管灌注或通過直接的損害注射。當(dāng)通過注射施用所述結(jié)合蛋白時(shí)可以通過連續(xù)地灌注或通過單一的或多重的丸劑施用。
所述的帶有診斷或治療劑的結(jié)合蛋白可與藥學(xué)上可接受的注射載體一起作為試劑盒用于人或哺乳動(dòng)物的治療或診斷，所述的載體優(yōu)選地是在生理pH和濃度下的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。所述的制劑優(yōu)選地是無菌的，尤其是在應(yīng)用于人時(shí)。該試劑盒的可任選組分包括穩(wěn)定劑、緩沖液、標(biāo)記試劑、放射性同位素、順磁化合物、用于增強(qiáng)清除作用的第二抗體和常規(guī)的注射器、柱、小瓶等等。
因此、本發(fā)明也提供診斷和治療用試劑盒，所述的試劑盒包含至少一個(gè)上述的多價(jià)的、單特異性結(jié)合蛋白，至少一項(xiàng)選自診斷試劑、治療劑、以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合的試劑，以及附加的試劑、設(shè)備與使用說明。
實(shí)施例下述的實(shí)施例是用于說明本發(fā)明的實(shí)施方案，不應(yīng)將其以任何形式作為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。
實(shí)施例1-在大腸桿菌中表達(dá)hMN-14雙體的質(zhì)粒的構(gòu)建如下所示利用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA方法獲得hMN-14-scFv-L5。應(yīng)用Pfu聚合酶通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)由構(gòu)建用于表達(dá)hMN-14Fab′的載體(Leung等，Cancer Res.555968s-5972s(1995))擴(kuò)增hMN-14VK和VK序列。用下述的寡核苷酸引物擴(kuò)增hmn-14VH序列hMN-14VH-左5′-CGTACCATGGAGGTCCAACTGGTGGAGA-3′(SEQ ID NO9)hMN-14VH-右(G4S)5′-CATAGGATCCACCGCCTCCGGAGACGGTGACCGGGGT-3′(SEQ ID NO10)。
左側(cè)的PCR引物包含5′NcoI限制酶切位點(diǎn)。右側(cè)的PCR引物包含5個(gè)氨基酸殘基的接頭(G4S)和BamHI限制酶切位點(diǎn)。將PCR產(chǎn)物用NcoI和BamHI消化并與pelB信號(hào)肽序列框內(nèi)連接，插入到NcoI/BamHI消化的pET-26b載體以生產(chǎn)hMN-14VHL5-pET26。用下述的寡核苷酸引物擴(kuò)增hMN-14VK序列hMN-14VK-左5′-CTGAGGATCCGACATCCAGCTGACCCAGAG-3′(SEQ IDNO11)hMN-14VK-右5′-GCTACTCGAGACGTTTGATTTCCACCTTGG-3′(SEQ IDNO12)。
左側(cè)和右側(cè)的PCR引物分別包含BamHI和XhoI限制酶切位點(diǎn)。該P(yáng)CR產(chǎn)物用XhoI和BamHI消化，與hMN-14VH，G4S接頭和6His序列框內(nèi)連接，插入到經(jīng)XhoI/BamHI消化的hMN-14VHL5-pET26構(gòu)建體中以形成表達(dá)構(gòu)建體hMN-14-scFv-L5。該構(gòu)建體的DNA序列經(jīng)自動(dòng)DNA測(cè)序儀驗(yàn)證，列于圖11中。核酸構(gòu)建體hMN-14-scFv-L5列于圖1。
實(shí)施例2-hMN-14雙體在大腸桿菌中的表達(dá)用hMN-14-scFv-L5構(gòu)建體轉(zhuǎn)化BL21(P-LysS)大腸桿菌。培養(yǎng)物條件、誘導(dǎo)和純化按如下方式進(jìn)行。以標(biāo)準(zhǔn)的方法用hMN-14-scFv-L5轉(zhuǎn)化感受態(tài)的E.coli BL21(P-Lys-S)。培養(yǎng)物在添加了100μg/ml卡那霉素硫酸鹽和34μg/ml氯霉素的2xYT培養(yǎng)基中，于37℃下振蕩培養(yǎng)至OD600值為1.6-1.8。室溫下向培養(yǎng)物中加入等量的添加了抗生素和0.8M蔗糖的2xYT培養(yǎng)基，然后轉(zhuǎn)移到20℃。20℃下30分鐘后，添加40μMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)，再繼續(xù)在20℃下培養(yǎng)15-18小時(shí)。
在下述物質(zhì)中檢測(cè)hMN-14雙體的表達(dá)(1)細(xì)胞培養(yǎng)物條件培養(yǎng)基；(2)在非變性條件下從離心所得的細(xì)胞顆粒中抽提可溶性蛋白；和(3)經(jīng)過幾輪的抽提和離心后保留在顆粒中的不溶物質(zhì)。
如下所述從細(xì)菌細(xì)胞顆粒中提取可溶性蛋白。凍融細(xì)胞顆粒，然后用相當(dāng)于培養(yǎng)物體積1％的裂解緩沖液(2％Triton X-100；300mMNaCl；10mM咪唑；5mM MgSO4；25單位/ml benzonase；50mMNaH2PO4(pH8.0))將其重懸。將所述懸液通過超聲處理攪勻，通過離心作用澄清，加載到Ni-NTA IMAC柱。用含20mM咪唑的緩沖液洗柱后，用100mM咪唑緩沖液(100mM咪唑；50mM NaCl；25mM Tris(pH7.5))洗脫，洗脫物進(jìn)一步的通過親和層析與固定于Affi-凝膠上的抗-id抗體結(jié)合來純化。
不溶性的顆粒物質(zhì)在變性Ni-NTA結(jié)合緩沖液(8M尿素；10mM咪唑；0.1M NaH2PO4；10mM Tris(8.0))中溶解，并與1ml Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen，Inc.)混合。將所述混合物在室溫下?lián)u動(dòng)1小時(shí)，然后將樹脂用50毫升同樣的緩沖液洗一次后上柱。該柱用20ml同樣緩沖液洗后再用20ml洗滌緩沖液(8M尿素；20mM咪唑；0.1M NaH2PO4；10mM Tris(pH8.0))洗。結(jié)合蛋白用5毫升的變性洗脫緩沖液(8M尿素；250mM咪唑；0.1M NaH2PO4；10mM Tris(pH8.0))洗脫。
結(jié)合的可溶性蛋白從Ni-NTA樹脂上洗脫并加載到WI2抗-特異基因型親和層析柱上。該柱用PBS洗，用0.1M甘氨酸；0.1M NaCl(pH2.5)洗脫結(jié)合多肽并立即中和。
雖然表達(dá)的大多數(shù)hMN-14scfv是不溶蛋白，但是仍從可溶組分中純化出約1.5mg/L的可溶性hMN-14scFv培養(yǎng)物。如大小排阻高效液相色譜法(HPLC)所示，IMAC純化和親合純化材料的主要的峰出現(xiàn)在第9.8分鐘(參見圖2A和2B)。如圖2BX軸所示，分子量大約50kDa的hMN-14Fab′的保留時(shí)間是9.75分鐘。由于單體的hMN-14scFv的推算分子量是26kDa，所以hMN-14scFv的非常類似的保留時(shí)間表明它作為二聚體或雙體存在于溶液中。SDS-PAGE凝膠分析(參見圖3a)顯示出預(yù)計(jì)大小在26kDa的單一帶，等電點(diǎn)聚焦(IEP)凝膠分析(參見圖3B)得到一條pI8.2的帶，接近計(jì)算出的pI7.9。競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附顯示hMN-14雙體是功能性的并表現(xiàn)出優(yōu)異的結(jié)合性質(zhì)。
用131I-標(biāo)記的hMN-14雙體注射帶有CEA陽性GW-39腫瘤的裸鼠，在注射后不同的時(shí)間分析其生物分布。如圖4所示一方面大量的雙體保持與腫瘤結(jié)合超過96小時(shí)，另一方面游離的雙體迅速地從血液中清除。圖5顯示在注射后48小時(shí)與腫瘤和正常組織例如肝、脾、腎、肺、血液、胃、小腸和大腸結(jié)合的注射劑量百分比。與腫瘤中的數(shù)量相比，在每一正常組織中的注射劑量數(shù)值都極低。表1總結(jié)了在24，48和72小時(shí)腫瘤中超過所列出的正常組織中的活性提高量(例如，在24小時(shí)，腫瘤中的放射性是肝臟中的22.47倍)。
表1.腫瘤與非腫瘤的比率
實(shí)施例3-表達(dá)hMN-14三體的質(zhì)粒的構(gòu)建設(shè)計(jì)、生產(chǎn)并檢驗(yàn)了hMN-14scFv質(zhì)粒構(gòu)建體。大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒指導(dǎo)具有以下特點(diǎn)的單一多肽合成(1)在沒有任何附加的氨基酸的情況下hMN-14VH的羧基末端直接與hMN-14VIc的氨基末端相連(利用零接頭使所分泌的多肽形成稱作三體的三聚體結(jié)構(gòu)，以形成三個(gè)CEA結(jié)合位點(diǎn))；(2)VH基因之前的pelB信號(hào)肽序列使所述多肽于大腸桿菌的壁膜間隙合成；和(3)六個(gè)組氨酸(6His)氨基酸殘基加到羧基末端以便于用IMAC純化。該多肽和三體的略圖如圖6所示。
利用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA方法獲得hMN-14-0構(gòu)建體。利用Pfu聚合酶通過PCR從hMN-14scFv-L5構(gòu)建體擴(kuò)增hMN-14VH和VK序列。用下述的寡核苷酸引物擴(kuò)增hMN-14VH序列hMN-14VH-左5′-CGTACCATGGAGGTCCAACTGGTGGAGA-3′(SEQ IDNO13)hMN-14VH-0-右5′-GATATCGGAGACGGTGACCGGG-3′(SEQ ID NO14)原先用來構(gòu)建hMN-14scFv-L5的左側(cè)PCR引物包含一5′NcoI限制酶切位點(diǎn)。右側(cè)PCR引物包含EcoRV限制酶切位點(diǎn)。將PCR產(chǎn)物克隆到PCR克隆載體pGemT(promega)。
用下述的寡核苷酸引物擴(kuò)增hMN-14VK序列hMN-14VK-0左5′-GATATCCAGCTGACCCAGAGCC-3′(SEQ ID NO15)hMN-14Vx-右5′-GCTACTCGAGACGTTTGATTTCCACCTTGG-3′(SEQ IDNO16)左側(cè)PCR引物包含EcoRV限制酶切位點(diǎn)。原先用來構(gòu)建hMN-14scFv-L5的右側(cè)PCR引物包含XhoI限制酶切位點(diǎn)。將PCR產(chǎn)物克隆到pGemT載體。用EcoRV和SalI從Vx-0-pGemT構(gòu)建體中切下VK-0序列，將其連接到VH-0-pGemT構(gòu)建體的相同位點(diǎn)上以在pGemT中產(chǎn)生hMN-14-0。用NcoI和XhoI將VH-VK序列切下，轉(zhuǎn)移到pET26b以產(chǎn)生hMN-14三體表達(dá)構(gòu)建體hMN-14-0。該構(gòu)建體的DNA序列經(jīng)自動(dòng)DNA測(cè)序儀驗(yàn)證，列于圖13中。核酸構(gòu)建體hMN-14scFv-0列于圖6。
實(shí)例4-hMN-14三體在大腸桿菌中的表達(dá)用hMN-14-0構(gòu)建體轉(zhuǎn)化BL21(P-LysS)大腸桿菌。除hMN-14-0三體是用Q-Sepharose陰離子交換色譜法而非親和層析純化外，培養(yǎng)物條件、誘導(dǎo)和純化均按類似于實(shí)施例2中對(duì)hMN-14雙體的描述進(jìn)行。如期望的那樣，hMN-14-0主要形成三體(~80kda)。
從誘導(dǎo)培養(yǎng)物的可溶性細(xì)胞組分中純化出大約2.4mg/l可溶性hMN-14三體培養(yǎng)物。如大小排阻高效液相層析法(參見圖7)所示，利用IMAC和mono-Q陰離子交換色譜法純化，主要的峰出現(xiàn)在在9.01分鐘。相比之下，hMN-14雙體(~52kDa)和hMN-14F(ab′)2(~100kDa)的保留時(shí)間分別為9.6分鐘和8.44分鐘。事實(shí)上，由于計(jì)算的單體hMN-14-0多肽的分子量是～26kDa，而hMN-14-0的保留時(shí)間剛好在52kDa和100kDa蛋白的保留時(shí)間之間，表明它作為三聚體或三體存在于溶液中。
用131I標(biāo)記的hMN-14三體注射帶有CEA陽性的GW-39腫瘤的裸鼠，在注射后不同的時(shí)間分析其生物分布。圖8顯示hMN-14三體的腫瘤攝入和保持顯著地高于hMN-14雙體。一個(gè)小時(shí)以后，三體在腫瘤中積累到在雙體水平的大約60％。然而一個(gè)小時(shí)以后，在雙體穩(wěn)定減少的時(shí)候、三體腫瘤攝入增多至在24到48小時(shí)之間所達(dá)到的最大值。三體腫瘤攝入最大值(24-48小時(shí))是雙體(1小時(shí))攝入量的2倍多。由于三體利用全部三個(gè)CEA結(jié)合位點(diǎn)表現(xiàn)為三價(jià)腫瘤結(jié)合，所以與雙體相比三體的腫瘤保持時(shí)間顯著延長(zhǎng)。其他可能對(duì)腫瘤攝入有顯著影響的因素是分子大小。如圖8所示，與54kDa的雙體相比，80kDa三體的血液清除速度要慢得多。這可使三體有更長(zhǎng)的時(shí)間與腫瘤發(fā)生相互作用，可比雙體實(shí)現(xiàn)更高水平的腫瘤攝入。三體的血液清除延遲無疑有助于其優(yōu)勢(shì)的腫瘤駐留。但也對(duì)其他的因素，包括由于多價(jià)產(chǎn)生的增加的親合力或改進(jìn)的體內(nèi)穩(wěn)定性起作用。對(duì)所有的組織腫瘤對(duì)非腫瘤的比率均隨時(shí)間而提高(表2)。所述的比率基本上是在其后的時(shí)間點(diǎn)。
表2腫瘤相對(duì)于非腫瘤的hMN-14三體比率
實(shí)施例5-表達(dá)hMN-14四體的質(zhì)粒的構(gòu)建設(shè)計(jì)、生產(chǎn)并檢驗(yàn)了hMN-14 1G質(zhì)粒構(gòu)建體。大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒指導(dǎo)具有以下特點(diǎn)的單一多肽合成(1)hMN-14VH的羧基末端通過單個(gè)甘氨酸殘基與hMN-14VK氨基末端相連(通過利用1G接頭使一些分泌的多肽形成稱作四體的四聚體結(jié)構(gòu)，形成四個(gè)CEA結(jié)合位點(diǎn))；(2)VH基因之前的pelB信號(hào)肽序列使所述多肽于大腸桿菌的壁膜間隙合成；和(3)六個(gè)組氨酸(6His)氨基酸殘基加到羧基末端以便于用IMAC純化。該多肽和四體的略圖如圖9所示。
利用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA方法獲得hMN-14-1G構(gòu)建體。利用Pfu聚合酶通過PCR從hMN-14scFv-L5構(gòu)建體擴(kuò)增hMN-14VH和VK序列。用下述的寡核苷酸引物擴(kuò)增hMN-14VH序列hMN-14VH-左5′-CGTACCATGGAGGTCCAACTGGTGGAGA-3′(SEQ IDNO17)hMN-14VH-1G右5′-GCTGGATATCACCGGAGACGGTGACCGGGGTCC-3′(SEQID NO18)原先用來構(gòu)建hMN-14scFv-L5的左側(cè)PCR引物包含一5′NcoI限制酶切位點(diǎn)。右側(cè)PCR引物包含單個(gè)甘氨酸的編碼序列和EcoRV限制酶切位點(diǎn)。將PCR產(chǎn)物克隆到PCR克隆載體pGemT(Promega)。用EcoRV和SalI從hMN-14VK-0-pGemT構(gòu)建體中切下hMN-14VK-0序列(參見實(shí)施例3)序列，將其連接到hMN-14VH-1C-pGemT構(gòu)建體的相同位點(diǎn)上以在pGemT中產(chǎn)生hMN-14-1G。用NcoI和XhoI將VH-1G-VK序列切下，轉(zhuǎn)移到pET26b以產(chǎn)生hMN-14四體表達(dá)構(gòu)建體hMN hMN-14 hMN-14-1G。該構(gòu)建體的DNA序列經(jīng)自動(dòng)DNA測(cè)序儀驗(yàn)證，列于圖14中。核酸構(gòu)建體hMN-14scFv-1G列于圖9。
實(shí)例6 hMN-14四體在大腸桿菌中的表達(dá)用hMN-14-1G構(gòu)建體轉(zhuǎn)化BL21(P-LysS)大腸桿菌。除hMN-14-0四體是用Q-Sepharose陰離子交換色譜法而非親和層析純化外，培養(yǎng)物條件、誘導(dǎo)和純化均按類似于實(shí)施例2中對(duì)hMN-14雙體的描述進(jìn)行?？扇苄员磉_(dá)水平高，每升培養(yǎng)物可分離出多于2mg的可溶性產(chǎn)物。大小排阻高效液相層析法分析(參見圖10)顯示hMN-14-1G是以雙體(53kDa)、三體(80kDa)和四體(105-120kDa)的混合物形式存在的。通過凝膠過濾色譜法可將四體以相對(duì)純的形式分離出來。然而在2-8℃下幾天以后、類似于圖10所示，其逐漸恢復(fù)成雙體、三體和四體的混合物。
實(shí)例7 hMN-14雙體、三體和四體的腫瘤攝入利用放射性碘標(biāo)記的樣品在帶有CEA-陽性的人結(jié)腸腫瘤異種移植的小鼠中評(píng)價(jià)腫瘤靶定。在24小時(shí)，在腫瘤中的雙體(由hMN-14-15獲得)顯示出2.7％的注射劑量每克(ID/g)，0.3％在血液中，0.1到0.4％在其他所有的器官中。對(duì)于三體(由hMN-14-0獲得)，在24、48、72和96小時(shí)，腫瘤攝入分別是12.0、12.2、11.1和7.1％ID/g，腫瘤對(duì)血液的比率從第24小時(shí)的3.4提高到第48小時(shí)的12.4，直到第96小時(shí)的55。四體(由hMN-14-1G獲得)在三者中表現(xiàn)出最高的腫瘤攝入量，在第24小時(shí)達(dá)到25.4％ID/g，腫瘤對(duì)血液比率為3.9，在第72小時(shí)降低到17.1％腫瘤對(duì)血液比率為29.3。這些生物分布結(jié)果與三個(gè)新的基于scFv的試劑各自的分子大小和多價(jià)性相一致，所有的，特別是hMN-14三體對(duì)造影和治療用途非常有用。
雖然本發(fā)明已對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)行了描述并充分詳細(xì)地舉例說明如何制造和使用本發(fā)明，多種替代、修飾、和改進(jìn)均顯然不超出本發(fā)明的精神和范圍。除了其所固有的，本發(fā)明已恰當(dāng)?shù)貙?shí)現(xiàn)了所述的目的并獲得了所述的結(jié)果和效果。此處提供的實(shí)施例代表優(yōu)選實(shí)施方案，它們是示例性的，并非試圖對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定。其中的修飾和其他應(yīng)用是本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以想見的。這些修飾均包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)，由權(quán)利要求的范圍所定義。
上述引用的所有出版物的內(nèi)容均明確地引入此處作為參考，其引入程度與它們各自分別被引入一樣。
序列表<110>ROSSI，EDMUND<120>直接靶定的結(jié)合蛋白<130>042418/0113<140>PCT/US02/32718<141>2002-10-15<150>60/328,835<151>2001-10-15<150>60/341,881<151>2001-12-21<150>60/345,641<151>2002-01-08<150>60/404,919<151>2002-08-22<160>20<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>786<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的hMN-14scFv-L5核苷酸序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(783)<400>1atg aaa tac ctg ctg ccg acc gct gct gct ggt ctg ctg ctc ctc gct 48Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1 5 10 15
gcc cag ccg gcg atg gcc atg gag gtc caa ctg gtg gag agc ggt gga 96Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly20 25 30ggt gtt gtg caa cct ggc cgg tcc ctg cgc ctg tcc tgc tcc gca tct 144Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser35 40 45ggc ttc gat ttc acc aca tat tgg atg agt tgg gtg aga cag gca cct 192Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro50 55 60gga aaa ggt ctt gag tgg att gga gaa att cat cca gat agc agt acg 240Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr65 70 75 80att aac tat gcg ccg tct cta aag gat aga ttt aca ata tcg cga gac 288Ile Ash Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp85 90 95aac gcc aag aac aca ttg ttc ctg caa atg gac agc ctg aga ccc gaa 336Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu100 105 110gac acc ggg gtc tat ttt tgt gca agc ctt tac ttc ggc ttc ccc tgg 384Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp115 120 125ttt gct tat tgg ggc caa ggg acc ccg gtc acc gtc tcc gga ggc ggt 432Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Gly Gly Gly130 135 140gga tcc gac atc cag ctg acc cag agc cca agc agc ctg agc gcc agc 480Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser145 150 155 160gtg ggt gac aga gtg acc atc acc tgt aag gcc agt cag gat gtg ggt 528Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly165 170 175act tct gta gcc tgg tac cag cag aag cca ggt aag gct cca aag ctg 576Thr Ser Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu180 185 190
ctg atc tac tgg aca tcc acc cgg cac act ggt gtg cca agc aga ttc 624Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe195 200 205agc ggt agc ggt agc ggt acc gac ttc acc ttc acc atc agc agc ctc 672Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu210 215 220cag cca gag gac atc gcc acc tac tac tgc cag caa tat agc ctc tat 720Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr225 230 235 240cgg tcg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgt ctc gag cac 768Arg Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Leu Glu His245 250 255cac cac cac cac cac tga 786His His His His His260<210>2<211>261<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的hMN-14scFv-L5氨基酸序列<400>2Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1 5 10 15Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly20 25 30Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser35 40 45Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr65 70 75 80Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp85 90 95Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu100 105 110Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp115 120 125Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Gly Gly Gly130 135 140Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser145 150 155 160Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly165 170 175Thr Ser Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu180 185 190Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe195 200 205Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu210 215 220Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr225 230 235 240Arg Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Leu Glu His245 250 255His His His His His260<210>3<211>118<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的hMN-14VH推定的氨基酸序列<400>3Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr20 25 30Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu50 55 60Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe65 70 75 80Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Pro Val Thr Val Ser115<210>4<211>115<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的hMN-14VK推定的氨基酸序列<400>4Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser20 25 30Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser85 90 95Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Leu Glu His His His100 105 110His His His115<210>5<211>768<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的hMN-14-0核苷酸序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(768)<400>5atg aaa tac ctg ctg ccg acc gct gct gct ggt ctg ctg ctc ctc gct48Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1 5 10 15gcc cag ccg gcg atg gcc atg gag gtc caa ctg gtg gag agc ggt gga96Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly20 25 30
ggt gtt gtg caa cct ggc cgg tcc ctg cgc ctg tcc tgc tcc gca tct144Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser35 40 45ggc ttc gat ttc acc aca tat tgg atg agt tgg gtg aga cag gca cct192Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro50 55 60gga aaa ggt ctt gag tgg att gga gaa att cat cca gat agc agt acg240Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr65 70 75 80att aac tat gcg ccg tct cta aag gat aga ttt aca ata tcg cga gac288Ile Ash Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp85 90 95aac gcc aag aac aca ttg ttc ctg caa atg gac agc ctg aga ccc gaa336Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu100 105 110gac acc ggg gtc tat ttt tgt gca agc ctt tacttc ggc ttc ccc tgg 384Asp Thr Gly ValTyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp115120 125ttt gct tat tgg ggc caa ggg acc ccg gtc acc gtc tcc gat atc cag432Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Asp Ile Gln130 135 140ctg acc cag agc cca agc agc ctg agc gcc agc gtg ggt gac aga gtg480Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val145 150 155 160acc atc acc tgt aag gcc agt cag gat gtg ggt act tct gta gct tgg528Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser Val Ala Trp165 170 175tac cag cag aag cca ggt aag gct cca aag ctg ctg atc tac tgg aca576Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr180 185 190tcc acc cgg cac act ggt gtg cca agc aga ttc agc ggt agc ggt agc624Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser195 200 205
ggt acc gac ttc acc ttc acc atc agc agc ctc cag cca gag gac atc 672Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile210 215 220gcc acc tac tac tgc cag caa tat agc ctc tat cgg tcg ttc ggc caa 720Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser Phe Gly Gln225 230 235 240ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgt ctc gag cac cac cgc cac cac cac 768Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Leu Glu His His His His His His245 250 255<210>6<211>256<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的hMN-14-0氨基酸序列<400>6Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1 5 10 15Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly20 25 30Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser35 40 45Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro50 55 60Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr65 70 75 80Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp85 90 95Asn Ala Lys Ash Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu100 105 110
Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp115 120 125Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Asp Ile Gln130 135 140Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val145 150 155 160Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser Val Ala Trp165 170 175Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr180 185 190Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser195 200 205Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile210 215 220Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser Phe Gly Gln225 230 235 240Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Leu Glu His His His His His His245 250 255<210>7<211>774<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的hMN-14-1G核苷酸序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(771)<400>7atg aaa tac ctg ctg ccg acc gct gct gct ggt ctg ctg ctc ctc gct 48Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15gcc cag ccg gcg atg gcc atg gag gtc caa ctg gtg gag agc ggt gga 96Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly20 25 30ggt gtt gtg caa cct ggc cgg tcc ctg cgc ctg tcc tgc tcc gca tct 144Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser35 40 45ggc ttc gat ttc acc aca tat tgg atg agt tgg gtg aga cag gca cct 192Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro50 55 60gga aaa ggt ctt gag tgg att gga gaa att cat cca gat agc agt acg 240Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr65 70 75 80att aac tat gcg ccg tct cta aag gat aga ttt aca ata tcg cga gac 288Ile Ash Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp85 90 95aac gcc aag aac aca ttg ttc ctg caa atg gac agc ctg aga ccc gaa 336Ash Ala Lys Ash Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu100 105 110gac acc ggg gtc tat ttt tgt gca agc ctt tac ttc ggc ttc ccc tgg 384Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp115 120 125ttt gct tat tgg ggc caa ggg acc ccg gtc acc gtc tcc ggt gat atc 432Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Gly Asp Ile130135 140cag ctg acc cag agc cca agc agc ctg agc gcc agc gtg ggt gac aga 480Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg145 150 155 160gtg acc atc acc tgt aag gcc agt cag gat gtg ggt act tct gta gcc 528Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser Val Ala165 170 175tgg tac cag cag aag cca ggt aag gct cca aag ctg ctg atc tac tgg 576Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp
180 185 190aca tcc acc cgg cac act ggt gtg cca agc aga ttc agc ggt agc ggt 624Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly195 200 205agc ggt acc gac ttc acc ttc acc atc agc agc ctc cag cca gag gac 672Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp210 215 220atc gcc acc tac tac tgc cag caa tat agc ctc tat cgg tcg ttc ggc 720Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser Phe Gly225 230 235 240caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgt ctc gag cac cac cac cac cac 768Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Leu Glu His His His His His245 250 255cac tga 774His<210>8<211>257<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的hMN-14-1G氨基酸序列<400>8Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1 5 10 15Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly20 25 30Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser35 40 45Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr65 70 75 80Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp85 90 95Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu100 105 110Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp115 120 125Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Gly Asp Ile130 135 140Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg145 150 155 160Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser Val Ala165 170 175Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp180 185 190Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly195 200 205Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp210 215 220Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser Phe Gly225 230 235 240Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Leu Glu His His His His His245 250 255His<210>9<211>28<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述；引物<400>9cgtaccatgg aggtccaact ggtggaga 28<210>10<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>10cataggatcc accgcctccg gagacggtga ccggggt37<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>11ctgaggatcc gacatccagc tgacccagag30<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>12gctactcgag acgtttgatt tccaccttgg30<210>13
<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述引物<400>14gatatcggag acggtgaccg gg 22<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述引物<400>16
gctactcgag acgtttgatt tccaccttgg30<210>17<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>17cgtaccatgg aggtccaact ggtggaga 28<210>18<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>18gctggatatc accggagacg gtgaccgggg tcc33<210>19<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的Gly-Ser接頭<400>19Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210>20<211>6<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的6X-His tag<400>20His His His His His His1 權(quán)利要求
1.多價(jià)的單特異性結(jié)合蛋白，其具有兩個(gè)或多個(gè)對(duì)相同的單個(gè)靶抗原具有親和力的結(jié)合位點(diǎn)，其中，所述的結(jié)合位點(diǎn)由兩個(gè)或多個(gè)單鏈Fv(scFv)片段結(jié)合而成，每個(gè)scFv包含至少兩個(gè)來自人源化或人單克隆抗體的可變結(jié)構(gòu)域。
2.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合蛋白，其中，所述的單克隆抗體特異于腫瘤相關(guān)抗原。
3.如權(quán)利要求2所述的結(jié)合蛋白，其中，所述的腫瘤相關(guān)抗原與下述疾病狀態(tài)相關(guān)，所述的疾病狀態(tài)選自惡性腫瘤、黑素瘤、肉瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、白血病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、淋巴瘤和骨髓瘤。
4.如權(quán)利要求2所述的結(jié)合蛋白，其中，所述的腫瘤相關(guān)抗原可與選自下述的一種類型的癌癥相關(guān)，所述的癌癥選自急性淋巴母細(xì)胞性白血病、急性髓性白血病、膽的、胸部的、頸的慢性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性髓性白血病、結(jié)腸直腸的、子宮內(nèi)膜的、食管的、胃的、頭和頸的Hodgkin淋巴瘤、肺、骨髓的，甲狀腺的非Hodgkin淋巴瘤、卵巢的、胰腺的、衰竭的和膀胱的癌癥。
5.如權(quán)利要求2所述的結(jié)合蛋白，其中，所述的腫瘤相關(guān)抗原選自A3，A33，BrE3，CD1，CD1a，CD3，CD5，CD15，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD30，CD45，CD74，CD79a，CEA，CSAp，EGFR，EGP-1，EGP-2，Ep-CAM，Ba 733，HER2/neu，KC4，KS-1，KS1-4，Le-Y，MAGE，MUC1，MUC2，MUC3，MUC4，PAM-4，PSA，PSMA，RS5，S100，T101，TAG-72，粘蛋白、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、腫瘤壞死抗原、VEGF、17-1A、血管生成標(biāo)記、細(xì)胞因子、免疫調(diào)節(jié)劑、致癌基因標(biāo)記和致癌基因產(chǎn)物。
6.如權(quán)利要求2所述的結(jié)合蛋白、其中，所述的腫瘤相關(guān)抗原是癌胚抗原(CEA)。
7.如權(quán)利要求6所述的結(jié)合蛋白，其中，所述的人源化單克隆抗體是hMN-14。
8.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合蛋白，進(jìn)一步包含至少一種選自診斷試劑、治療劑、以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合的試劑。
9.如權(quán)利要求8所述的結(jié)合蛋白，其中，所述的診斷試劑選自共軛物、放射性核素、金屬、造影劑、示蹤試劑、檢測(cè)劑，以及它們當(dāng)中兩種或多種的組合。
10.如權(quán)利要求9所述的結(jié)合蛋白，其中，所述的放射性核素選自11C，13N，15O，18F，32P，51Mn，52Fe，52mMn，55Co，62Cu，64Cu，67Cu，67Ga，68Ga，72As，75Br，76Br，82mRb，83Sr，86Y，89Zr，90Y，94mTc，94Tc，99MTc，110In，111In，120I，123I，124I，125I，131I，154-158Gd，177Lu，186Re，188Re，γ-發(fā)射器、β-發(fā)射器、正電子-發(fā)射器、以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。
11.如權(quán)利要求9所述的結(jié)合蛋白，其中，所述的放射性核素選自51Cr，57Co，58Co，59Fe，67Cu，67Ga，75Se，97Ru，99mTc，111In，114mIn，123I，125I，131I，169Yb，197Hg，201Tl，以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。
12.如權(quán)利要求9所述的結(jié)合蛋白，其中，所述的金屬選自釓、鐵、鉻、銅、鈷、鎳、鏑、錸、銪、鋱、鈥、釹、以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。
13.如權(quán)利要求9所述的結(jié)合蛋白，其中，所述的造影劑是核磁共振成像MRI造影劑。
14.如權(quán)利要求9所述的結(jié)合蛋白，其中，所述的造影劑是CT造影劑。
15.如權(quán)利要求9所述的結(jié)合蛋白，其中，所述的造影劑是超聲造影劑。
16.如權(quán)利要求9所述的結(jié)合蛋白，其中，所述的造影劑選自釓離子、鑭離子、錳離子、鐵、鉻、銅、鈷、鎳、鏑、錸、銪、鋱、鈥、釹、另一個(gè)可比較的造影劑、以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。
17.如權(quán)利要求9所述的結(jié)合蛋白，其中，所述的示蹤試劑選自碘化物、鋇化合物、鎵化合物、鉈化合物、鋇、泛影葡胺、乙碘油、鎵檸檬酸鹽、碘卡明酸、碘酸胺酸、碘達(dá)酸、膽影酸、碘沙酸、iogulamide、iohexol、碘異肽醇、碘番酸、ioprocemic acid、碘西法酸、碘絲酸、iosulamide meglumine、iosemeticacid、iotasul、iotetric acid、iothalamic acid、碘托西酸、ioxaglic acid、ioxotrizoic acid、ipodate、甲基葡胺、碘葡酰胺非離子型造影劑、甲泛影鈉、丙碘酮和氯化亞鉈、以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。
18.如權(quán)利要求9所述的結(jié)合蛋白，其中，所述的檢測(cè)劑選自酶、熒光化合物、化學(xué)發(fā)光的化合物、生物發(fā)光的化合物、放射性同位素、以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。
19.如權(quán)利要求8所述的結(jié)合蛋白，其中，所述的治療劑選自放射性核素、化學(xué)治療的藥、細(xì)胞因子、激素、生長(zhǎng)因子、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。
20.如權(quán)利要求19所述的結(jié)合蛋白，其中，所述的放射性核素選自32P，33P，47Sc，59Fe，62Cu，64Cu，67Cu，67Ga，75Se，77As，89Sr，90Y，99Mo，105Rh，109Pd，111Ag，111In，125I，131I，142Pr，143Pr149Pm，153Sm，161Tb，166Dy，166Ho，169Er，177Lu，186Re，188Re，189Re，194Ir，198Au，199Au，211At，211Pb，212Bi，212Pb，213Bi，223Ra，225Ac，以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。
21.如權(quán)利要求19所述的結(jié)合蛋白，其中，所述的放射性核素選自58Co，67Ga，80mBr，99mTc，103mRh，109Pt，111In，119Sb，125I，161Ho，189mOs和192Ir，152Dy，211At，211Bi，212Bi，213Bi，215Po，217At，219Rn，221Fr，223Ra，225Ac，255Fm，以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。
22.如權(quán)利要求19所述的結(jié)合蛋白，其中，所述的化療藥物選自長(zhǎng)春花生物堿、anthracyclines、epidophyllotoxins、taxanes、抗代謝物、烷化劑、抗生素、Cox-2抑制劑、抗有絲分裂的、抗血管生成試劑、編程性細(xì)胞死亡試劑、阿霉素、氨甲蝶呤、紅豆杉醇、CPT-11、喜樹堿、氮芥類、烷基磺酸鹽、亞硝基脲、三氮烯、葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤類似物、鉑配位絡(luò)合物、激素、以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。
23.如權(quán)利要求19所述的結(jié)合蛋白，其中，所述的毒素選自蓖麻毒、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶I、葡萄球菌的腸毒素A、美洲商陸抗病毒蛋白、gelonin、白喉毒素毒素、假單胞菌屬外毒素、假單胞菌屬內(nèi)毒素、以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。
24.如權(quán)利要求19所述的結(jié)合蛋白，其中，所述的免疫調(diào)節(jié)劑選自細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、淋巴細(xì)胞毒素、生血的因子、集落刺激因子、干擾素、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促紅細(xì)胞生成素、促血小板生成素、以及它們當(dāng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。
25.多價(jià)的單特異性結(jié)合蛋白，其包含對(duì)同一單個(gè)靶抗原具有親合性的二個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(稱作單特異性雙體)，其中所述的結(jié)合位點(diǎn)由兩個(gè)單鏈Fv(scFv)片段相連形成，其中每個(gè)scFv片段包含至少兩個(gè)來源于人源化或人單克隆抗體的可變結(jié)構(gòu)域。
26.如權(quán)利要求25所述的單特異性雙體，其中，所述的單克隆抗體特異于腫瘤相關(guān)抗原。
27.如權(quán)利要求26所述的單特異性雙體，其中，所述的腫瘤相關(guān)抗原是癌胚抗原(CEA)。
28.如權(quán)利要求25所述的單特異性雙體，其中，所述的人源化單克隆抗體是hMN-14。
29.如權(quán)利要求28所述的單特異性雙體，其中每個(gè)scFv包含hMN-14的VH和VK區(qū)域。
3 0.如權(quán)利要求29所述的單特異性雙體，其中每個(gè)scFv進(jìn)一步包含連接hMN-14的VH和VK區(qū)域的氨基酸接頭。
31.如權(quán)利要求30所述的單特異性雙體，其中每個(gè)scFv包含SEQID NO2的氨基酸序列。
32.表達(dá)載體，其包含編碼如權(quán)利要求25所述的單特異性雙體的核苷酸序列。
33.宿主細(xì)胞，其包含如權(quán)利要求32所述的表達(dá)載體。
34.多價(jià)的單特異性結(jié)合蛋白，其包含對(duì)同一單個(gè)靶抗原具有親合性的三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(稱作單特異性三體)，其中所述的結(jié)合位點(diǎn)由三個(gè)單鏈Fv(scFv)片段相連形成，其中每個(gè)scFv片段包含至少兩個(gè)來源于人源化或人單克隆抗體的可變結(jié)構(gòu)域。
35.如權(quán)利要求34所述的單特異性三體，其中，所述的單克隆抗體特異于腫瘤相關(guān)抗原。
36.如權(quán)利要求35所述的單特異性三體，其中，所述的腫瘤相關(guān)抗原是癌胚抗原(CEA)。
37.如權(quán)利要求34所述的單特異性三體，其中，所述的人源化單克隆抗體是hMN-14。
38.如權(quán)利要求37所述的單特異性三體，其中每個(gè)scFv包含hMN-14的VH和VK區(qū)域。
39.如權(quán)利要求38所述的單特異性三體，其中每個(gè)scFv包含SEQID NO6的氨基酸序列。
40.表達(dá)載體，其包含編碼如權(quán)利要求34所述的單特異性三體的核苷酸序列。
41.宿主細(xì)胞，其包含如權(quán)利要求40所述的表達(dá)載體。
42.多價(jià)的單特異性結(jié)合蛋白，其包含對(duì)同一單個(gè)靶抗原具有親合性的四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(稱作單特異性四體)，其中所述的結(jié)合位點(diǎn)由4條單鏈Fv(scFv)片段相連形成，其中每個(gè)scFv片段包含至少兩個(gè)來源于人源化或人單克隆抗體的可變結(jié)構(gòu)域。
43.如權(quán)利要求42所述的單特異性四體，其中，所述的單克隆抗體特異于腫瘤相關(guān)抗原。
44.如權(quán)利要求43所述的單特異性四體，其中，所述的腫瘤相關(guān)抗原是癌胚抗原(CEA)。
45.如權(quán)利要求42所述的單特異性四體，其中，所述的人源化單克隆抗體是hMN-14。
46.如權(quán)利要求45所述的單特異性四體，其中每個(gè)scFv包含hMN-14的VH和VK區(qū)域。
47.如權(quán)利要求46所述的單特異性四體，其中每個(gè)scFv進(jìn)一步包含連接的hMN-14的VH和VK區(qū)域的氨基酸接頭。
48.如權(quán)利要求47所述的單特異性四體，其中每個(gè)scFv包含SEQID NO8的氨基酸序列。
49.表達(dá)載體，其包含編碼如權(quán)利要求42所述的單特異性四體的核苷酸序列。
50.宿主細(xì)胞，其包含如權(quán)利要求49所述的表達(dá)載體。
51.診斷腫瘤存在的方法，該方法包括對(duì)懷疑患有腫瘤的受試者施用可檢測(cè)數(shù)量的如權(quán)利要求9所述的結(jié)合蛋白，監(jiān)控受試者并檢測(cè)任何結(jié)合蛋白對(duì)腫瘤的結(jié)合。
52.治療腫瘤的方法，所述的方法包括對(duì)所需受試者施用有效量的如權(quán)利要求19所述的結(jié)合蛋白。
53.診斷腫瘤存在的方法，該方法包括對(duì)懷疑患有腫瘤的受試者施用可檢測(cè)量的如權(quán)利要求1所述的結(jié)合蛋白，并聯(lián)合施用可與所述結(jié)合蛋白結(jié)合的可檢測(cè)部分，監(jiān)控受試者以檢測(cè)任何結(jié)合蛋白與腫瘤的結(jié)合。
54.治療腫瘤的方法，所述的方法包括對(duì)所需受試者施用有效量的如權(quán)利要求1所述的結(jié)合蛋白和治療劑。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，其中，所述的治療劑選自化療藥物、毒素、外輻射、短程治療輻射試劑、放射性標(biāo)記的蛋白、抗癌藥和抗癌抗體。
56.向腫瘤遞送一種或多種診斷試劑、一種或多種治療劑、或其兩個(gè)或多個(gè)的組合的方法，所述的方法包括對(duì)所需受試者施用如權(quán)利要求8所述的結(jié)合蛋白。
57.治療和/或診斷用試劑盒，所述的試劑盒包含至少一種如權(quán)利要求8所述的結(jié)合蛋白，以及附加的試劑、設(shè)備和使用說明。
全文摘要
本發(fā)明涉及多價(jià)的、單特異性結(jié)合蛋白。這些結(jié)合蛋白包含兩個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)均特異地與相同類型的靶細(xì)胞結(jié)合，優(yōu)選地與上述靶細(xì)胞上的相同的抗原結(jié)合。本發(fā)明進(jìn)一步涉及單特異性雙體、三體和四體的組合物和用于在微生物宿主中表達(dá)這些功能結(jié)合蛋白的重組載體。本發(fā)明還提供利用本發(fā)明的組合物治療和/或診斷腫瘤的方法。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1604966SQ02825068
公開日2005年4月6日 申請(qǐng)日期2002年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月15日
發(fā)明者埃德蒙·羅西, C－H·K·常, D·M·戈登博格 申請(qǐng)人:免疫醫(yī)療公司, Ibc藥品公司