一種線性范圍更寬的視黃醇結(jié)合蛋白測(cè)定試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及一種納米膠乳微粒型的視黃醇結(jié)合蛋白測(cè)定 試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 視黃醇結(jié)合蛋白（Retinolbindingprotein,RBP)是一種單一肽鏈蛋白質(zhì)，含 有183個(gè)氨基酸殘基和3個(gè)二硫鍵，相對(duì)分子量為21000,半衰期約為3~12小時(shí)，屬于 Lipocalin蛋白超家族成員。RBP是血液中視黃醇(維生素A)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由肝臟合成、廣 泛分布于血液、腦脊液、尿液及其他體液中，其主要功能是將視黃醇從肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到上皮細(xì) 胞。血液中RBP主要以視黃醇、前白蛋白結(jié)合的復(fù)合物形式存在，當(dāng)復(fù)合物中視黃醇與靶細(xì) 胞結(jié)合后，RBP便與前白蛋白分離，自腎小球?yàn)V出，由近端腎小管上皮細(xì)胞吸收、降解。
[0003] 近年來(lái)的深入研究表明，RBP是低分子量蛋白，能由腎小球自由濾過(guò)，近端腎小管 幾乎完全重吸收，其在血、尿中的含量變化與腎臟疾病密切相關(guān)，能夠敏感地反映近端腎小 管功能和損害程度；同時(shí)RBP由肝細(xì)胞合成，當(dāng)肝細(xì)胞損傷時(shí)，RBP合成受抑制，故檢測(cè)血液 RBP水平，可敏感地反應(yīng)肝功能的改變。因此，測(cè)定RBP含量變化可以早期發(fā)現(xiàn)腎功能的改 變和腎近曲小管的損害程度，還可作為肝功能早期損害和監(jiān)護(hù)治療的指標(biāo)，在肝臟、腎臟疾 病的早期診斷和療效觀察中有重要臨床意義。
[0004] 有關(guān)檢測(cè)血清視黃醇結(jié)合蛋白的方法主要采用免疫學(xué)方法，以酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 法（enzyme-1inkedimmunosorbentassay,ELISA)、放身寸免疫測(cè)定法（radioimmunoassay, RIA)和顆粒增強(qiáng)透射免疫比池法（particle-enhancedturbidimetricimmunoassay， PETIA)這幾種方法為主。ELISA方法雖然在臨床上使用了近二十年，但它依然存在一些致 命缺點(diǎn)，定量準(zhǔn)確性差、操作時(shí)間長(zhǎng)、自動(dòng)化程度低，一般只能用于定性檢測(cè)。RIA靈敏度高， 但不穩(wěn)定，重復(fù)性比ELISA差，而且存在放射性污染的危險(xiǎn)。PETIA是近年來(lái)出現(xiàn)的一種較 為穩(wěn)定、快速、準(zhǔn)確測(cè)定視黃醇結(jié)合蛋白血清濃度的檢測(cè)方法。PETIA的基本原理是在高分 子膠乳微粒的表面交聯(lián)單克隆抗體，當(dāng)交聯(lián)有抗體的微粒與抗原結(jié)合后，在短時(shí)間內(nèi)會(huì)迅 速聚集在一起，改變了反應(yīng)液的透光性能。而且，反應(yīng)液透光性能（即吸光度）的改變與被 測(cè)抗原的濃度有較強(qiáng)的相關(guān)性，即膠乳顆粒凝集越多，越會(huì)阻礙光線的透光性，反應(yīng)液的吸 光度就越大，在一定范圍內(nèi)與被測(cè)抗原的濃度成正比。PETIA檢測(cè)方法反應(yīng)時(shí)間短，精密度 好，檢測(cè)范圍寬，黃疸、溶血和脂血標(biāo)本均不受影響，易于自動(dòng)化，是目前使用非常廣泛的一 種檢測(cè)方法，但該方法的檢測(cè)靈敏度和線性范圍還有待進(jìn)一步提高。
[0005]目前，PETIA檢測(cè)試劑所采用的膠乳顆粒多為惰性微粒、羧基化微粒及氨基化微 粒。表面修飾的膠乳粒子與抗體的結(jié)合是通過(guò)其表面的羧基或氨基與抗體的氨基端共價(jià)結(jié) 合，在微粒與抗體之間有一個(gè)橋聯(lián)化學(xué)臂，降低了位阻效應(yīng)，不僅提高了抗體的結(jié)合率，而 且還為抗體提供合適的三維空間立體結(jié)構(gòu)，有效地保護(hù)了抗體與抗原結(jié)合的活性區(qū)域。國(guó) 內(nèi)外已有多家公司提供納米級(jí)表面修飾的微粒粒子原料，并廣泛應(yīng)用于PETIA。這些廠家提 供的粒子直徑在20nm~4iim，可以作為多克隆抗體和單克隆抗體的載體。納米級(jí)粒子的推 出解決了對(duì)單克隆抗體結(jié)合的能力不強(qiáng)，臨床檢測(cè)的線性范圍窄，靈敏度低，干擾因素多， 實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性差等問(wèn)題，大大促進(jìn)了免疫比濁法在臨床上的廣泛應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是進(jìn)一步提高檢測(cè)血清中視黃醇結(jié)合蛋白含量的分 析靈敏度和檢測(cè)范圍；提供一種特異性好，靈敏度高，精密度好，準(zhǔn)確度高的納米膠乳微粒 型視黃醇結(jié)合蛋白測(cè)定試劑盒。
[0007] 發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：一種線性范圍更寬的視黃醇結(jié)合蛋 白測(cè)定試劑盒，包括試劑R1和試劑R2,其中試劑R1和試劑R2的體積比為4 : 1。所述試劑 R1為促進(jìn)抗體抗原特異性結(jié)合的反應(yīng)液，組分包括：l〇~30mmol/L的緩沖液、0. 01%~4% (w/ v)的增乳劑、0. 05%~2% (w/v)的穩(wěn)定劑、0. 1% (w/v)的防腐劑；所述試劑R2為結(jié)合有抗人 視黃醇結(jié)合蛋白抗體納米膠乳微粒的緩沖液，組分包括：〇. 1%~〇. 5% (w/v)標(biāo)記有抗人視黃 醇結(jié)合蛋白抗體的納米膠乳微粒、〇. 〇2%~2% (w/v)的穩(wěn)定劑、10~30mmol/L的緩沖液、0. 1% (w/v)的防腐劑。
[0008] 所述緩沖液為三羥甲基氨基甲烷緩沖液、2-嗎啉乙橫酸（NES)緩沖溶液、磷酸鹽 緩沖液、硼酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液、羥乙基哌嗪乙硫磺酸（ffiPES)緩沖液和三羥甲基氨 基甲烷（Tris)緩沖液中的一種或多種；所述緩沖液pH值為6~9。所述緩沖液可以為其他 具有相似特征的緩沖液。
[0009] 所述增乳劑為聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇辛基苯基 醚、NaCl、吐溫20或吐溫80。增乳劑主要作用是可以增加抗體抗原的反應(yīng)速率。本發(fā)明所 述的增乳劑優(yōu)選品種為聚乙二醇6000。
[0010] 所述防腐劑為疊氮化鈉、硫柳汞、苯酚中的一種或多種。本發(fā)明優(yōu)選品種為疊氮化 鈉。
[0011] 所述穩(wěn)定劑為牛血清白蛋白、聚乙二醇6000、乙二胺四乙酸鈉中的一種或多種。
[0012] 所述抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體為單克隆抗體或多克隆抗體或單克隆抗體與多克 隆抗體的混合物。
[0013] 所述標(biāo)記有抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體的納米膠乳微粒的制備方法為：選擇不同 粒徑的羧基化聚苯乙烯納米膠乳微粒，通過(guò)活化劑1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基）碳化二 亞胺鹽酸鹽（EDAC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺（Sulfo-NHS)活化微粒表面的羧基，生成活 性酯，再與視黃醇結(jié)合蛋白單克隆抗體或多克隆抗體上的伯氨基反應(yīng)，形成共價(jià)鍵，完成偶 聯(lián)，制成不同粒徑的視黃醇結(jié)合蛋白單克隆抗體或多克隆抗體納米膠乳微粒偶聯(lián)物。所述 不同粒徑的羧基化聚苯乙烯納米膠乳微粒的直徑在50~300nm(為市售產(chǎn)品)。其中，小粒徑 納米膠乳粒偶聯(lián)單克隆抗體，可提高檢測(cè)的線性范圍；大粒徑納米膠乳微粒偶聯(lián)多克隆抗 體，可提_檢測(cè)靈敏度。
[0014] 本發(fā)明的原理：本發(fā)明利用交聯(lián)了抗體的納米膠乳微粒偶聯(lián)物，與相應(yīng)標(biāo)本中的 抗原發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成聚集顆粒，在一定波長(zhǎng)下，通過(guò)測(cè)定聚集物形成時(shí)所產(chǎn)生的濁 度，即可測(cè)出標(biāo)本中被檢物的含量。進(jìn)一步的，所述本發(fā)明中，血清中的視黃醇結(jié)合蛋白與 交聯(lián)在納米膠乳微粒上的抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗體結(jié)合，產(chǎn)生抗體抗原反應(yīng)，使納米膠乳 微粒形成聚集，在600nm波長(zhǎng)處測(cè)定反應(yīng)物吸光度，通過(guò)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算出標(biāo)本中視 黃醇結(jié)合蛋白的含量。
[0015] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1.本發(fā)明試劑盒的線性范圍為0~150mg/L，高于同類產(chǎn)品的線性范圍。是一種靈敏度 高、特異性好、準(zhǔn)確性高、精密度好、穩(wěn)定性好的納米膠乳微粒型的視黃醇結(jié)合蛋白測(cè)定試 劑盒。
[0016] 2.本發(fā)明所涉及的納米膠乳微粒的粒徑在50~300nm;將不同粒徑的微粒分別與 視黃醇結(jié)合蛋白單克隆抗體或視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體交聯(lián)，可以形成多種粒徑的偶聯(lián) 物；將不同粒徑、不同抗體的偶聯(lián)物按不同比例混合，可以拓寬視黃醇結(jié)合蛋白測(cè)定試劑盒 的線性范圍，提高檢測(cè)靈敏度。