專利名稱：基于膠乳粒子包被視黃醇結(jié)合蛋白檢測試劑盒的制作方法
基于膠乳粒子包被視黃醇結(jié)合蛋白檢測試劑盒本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)免疫體外診斷領(lǐng)域，特別是一種基于膠乳粒子包被視黃醇結(jié)合蛋白檢測試劑盒。 [背景技術(shù)]視黃醇結(jié)合蛋白屬于Lipocalin超家族,相對分子質(zhì)量約21 X IO3,配體主要是全反式視黃醇，即維生素A，Kd = 20Nm，結(jié)合位點I。RBP主要負(fù)責(zé)結(jié)合、轉(zhuǎn)運血漿中的維生素A0外源性的維生素A進入血液循環(huán)系統(tǒng)后，首先與RBP結(jié)合，視黃醇-RBP復(fù)合體進一步與甲狀腺素運載蛋白(transthyretin, TTR)形成三元復(fù)合物而被轉(zhuǎn)運。肝臟是維生素A儲存及RBP合成與分泌的主要場所。RBP的分泌嚴(yán)格受機體視黃醇含量的影響。有關(guān)RBP突變體和基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，血液中RBP的缺失，除了引起視覺功能障礙外，對機體其他方面功能沒有明顯影響，因此，RBP可能只是在膳食維生素A缺乏時為機體視黃醇的代謝穩(wěn)定提供一種保障。與疾病的關(guān)系RBP是一種可自由通過腎小球、重吸收率很高的小分子量蛋白，在健康人尿中含量很低。糖尿病腎病患者早期就出現(xiàn)腎小管損害，尿RBP是診斷早期糖尿病腎病的一個較敏感的指標(biāo)；慢性腎功能衰竭(CRF)患者血中RBP大量積聚。RBP由肝細(xì)胞合成，當(dāng)肝細(xì)胞損傷時，RBP合成受抑制，故檢測血液RBP水平，可敏感地反映肝功能的改變。放免法檢測發(fā)現(xiàn)，肝硬化和急、慢性肝炎的血清RBP水平均明顯低于正常對照組，急性病毒性肝炎早期血清RBP含量下降比晚期更明顯RBP與機體的營養(yǎng)狀態(tài)RBP不僅參與視黃醇的運轉(zhuǎn)，其分泌也嚴(yán)格受機體維生素A含量的影響，大量口服視黃醇可導(dǎo)致血液及肝臟RBP下降。維生素A的缺乏可改變血液中RBP含量并抑制肝臟分泌RBP,機體營養(yǎng)不良或應(yīng)激反應(yīng)時RBP可迅速下降。由于RBP的半衰期相對較短，變化早于前白蛋白(PA)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)等且靈敏性更高，故可作為判斷營養(yǎng)狀態(tài)應(yīng)激反應(yīng)的指標(biāo)診斷方法膠乳顆粒增強比池法(particle-enhancedturbidimetric immunoassay, PETIA)是近年來出現(xiàn)的一種較為穩(wěn)定、準(zhǔn)確的體液蛋白均相免疫比濁檢測方法。PETIA法大體分為兩種。一種是散射比濁檢測法；另一種是透射比濁檢測法。這兩種方法的基本原理非常相似，都是在高分子膠乳微球的表面交聯(lián)單克隆抗體，當(dāng)交聯(lián)有抗體的微球與抗原結(jié)合后，在短時間內(nèi)會迅速聚集在一起，改變了反應(yīng)液的散光性能或透光性能。而且，反應(yīng)液散光性能或透光性能(即吸光度)的改變與被測抗原的濃度有較強的相關(guān)性，在一定范圍內(nèi)可以反映被測抗原的濃度。PETIA檢測方法是在均相反應(yīng)體系中進行抗原、抗體反應(yīng)及結(jié)果的測定?？乖?、抗體反應(yīng)后，直接測定反應(yīng)液的吸光度值，省卻了 ELISA法反復(fù)孵育和洗板等煩瑣操作步驟，幾分鐘就能獲得結(jié)果，省時省力。此外，納米免疫比濁法操作步驟的簡化也相應(yīng)地避免了許多人為操作因素和試劑、環(huán)境等外界因素的干擾，穩(wěn)定性和重復(fù)性都較好，能較真實地反映被測物質(zhì)的含量。免疫比濁法的靈敏度雖然比ELISA法差一些，但足于檢測到健康人血漿中許多標(biāo)志蛋白的下限值，可完全滿足臨床檢測要求。
視黃醇結(jié)合蛋白檢測方法，由最初免疫電泳的定性檢測，到放射免疫、熒光免疫和酶免疫的定量檢測，以及到免疫比濁的自動化檢測，發(fā)展十分迅速。目前，國內(nèi)外免疫比濁法是最為普遍通用的方法。但是免疫比濁法原理基于抗體抗原免疫反應(yīng)結(jié)合形成濁度，來檢測血清中RBP的濃度。并沒有采用檢測信號方法技術(shù)，其最低檢測限只能達(dá)到10mg/l。同時存在著開瓶穩(wěn)定性不好、較易受溶血干擾等問題。在臨床上只能用于腎功能的輔助診斷。本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種高靈敏度、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高、抗干擾能力強的視黃醇結(jié) 合蛋白檢測試劑盒。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明設(shè)計了一種基于膠乳粒子包被視黃醇結(jié)合蛋白檢測試劑盒，包括試劑R1，試劑R2以及校準(zhǔn)品，其中試劑Rl為Tris-HCl緩沖體系，包括Tris-HCl緩沖液30-60mmol/l, PH值為
7.2-7. 6 ;聚合物 60_95mmol/l ;乙二胺四乙酸二納 6-1 3mmoI / I ；試劑R2，包括羊抗人視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體包被聚苯乙烯乳膠粒子致敏顆粒；磷酸鹽緩沖液35-60mmol/l, PH值為7. 2-7. 6 ；參考校準(zhǔn)品，包括牛血清基質(zhì)；根據(jù)牛血清基質(zhì)的體積用量百分比，還包括防腐劑
O.2-2. 2% ;穩(wěn)定劑 1-10%。所述試劑R2中，聚苯乙烯乳膠粒子的直徑為45_92nm。所述試劑Rl中，聚合物為乙二醇6000-8000 ;或為聚乙二醇6000-8000，葡聚糖，聚
氧乙烯類多聚物。所述羊抗人視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體包被聚苯乙烯乳膠粒子采用物理吸附法，具體步驟為將羊抗人視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體和聚苯乙烯膠乳混合，將兩者混勻后37°C吸附8小時，之后透析除去未連接上的抗體，加入封閉液，封閉2小時，離心去上清，用膠乳稀釋液稀釋至I. 2-2. 5%。所述羊抗人視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體與聚苯乙烯乳膠粒子質(zhì)量比1/20-5/10。所述的封閉液包括脫脂奶粉和甘氨酸。所述膠乳稀釋液包括，35-60mmol/l, PH值為7. 2-7. 6磷酸鹽緩沖液；
O.01% -O. I %脫脂奶粉，O. 9% 的 NaN3。本發(fā)明同現(xiàn)技術(shù)相比，采用聚苯乙烯膠乳包被視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體，與待測標(biāo)本(血清或血漿)中的視黃醇結(jié)合蛋白發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物，用光透射強度檢測這種變化，以視黃醇結(jié)合蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的校準(zhǔn)曲線得出樣本中目標(biāo)檢測物視黃醇結(jié)合蛋白的濃度。本發(fā)明采用納米微球信號放大技術(shù)，使得試劑最低檢測限檢達(dá)到lmg/1，抗血紅蛋白干擾達(dá)到了 500mg/dl，開瓶穩(wěn)定性達(dá)到了 I個月。在臨床上，不但能用于腎功能疾病的輔助診斷，同時也能用于營養(yǎng)不良的輔助診斷。具有很高的臨床應(yīng)用價值。圖I為本發(fā)明試劑中5種不同含量的視黃醇結(jié)合蛋白參考標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2為普通免疫比濁法試劑中5種不同含量的視黃醇結(jié)合蛋白參考標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3為本發(fā)明試劑對照普通免疫比濁法試劑相關(guān)性曲線圖。下面結(jié)合附圖
對本發(fā)明作進一步描述。實施例I :試劑Rl
PH 值為 7. 4，Tris-Hcl 緩沖液45mmol/l
聚乙二醇 600085mmol/l
乙二胺四乙酸二鈉8. 5mmol/l
NaN3O. 9%將上述各種成分在室溫下依次添加，或者同時添加，或者是分別單獨包裝并與檢測之前在即時配制。
試劑R2，包括羊抗人視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體包被聚苯乙烯乳膠粒子致敏顆粒；磷酸鹽緩沖液35-60mmol/l，PH值為7. 2-7. 6 ;其制備方法如下稱取直徑為45nm的聚苯乙烯膠乳粒子，在經(jīng)過濃度為45mmol/l，PH值為7. 4的Tris-Hcl緩沖液清洗后，與羊抗人視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體以5 10的質(zhì)量比混合，將兩者混勻后37°C吸附8小時，之后透析除去未連接上的抗體。加入封閉液，封閉2小時，封閉液的主要成分為O. I %脫脂奶粉和O. 2mm的甘氨酸。離心去上清，用膠乳稀釋液稀釋至1.5%，膠乳稀釋液的主要成分PH值為7. 4磷酸鹽緩沖液45mmol/l，乙二胺四乙酸二鈉10. 2mmol/l,0. 05%脫脂奶粉，O. 9% NaN3。參考校準(zhǔn)品校準(zhǔn)品制備將經(jīng)過處理的牛血清，加入BAS O. 1%，NaN30. 9%得到校準(zhǔn)品稀釋液。用重組視黃醇結(jié)合蛋白溶于制備的類似人血清基質(zhì)的溶液，制備不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(O、5mg/1、15mg/
I、30mg/1、60mg/1、120mg/1)本實施例描述的視黃醇結(jié)合蛋白檢測試劑盒，適用于各種類型的全自動生化儀，以日立7170全自動生化儀為例，其操作如表I。分析方法兩點終點法，即試劑Rl，R2的用量分別為120ul和120ul，樣本量3ul。120ul試劑Rl加入3ul樣本于37C5min后加入120ulR2，即開始讀點，反應(yīng)5min后讀取另一點；檢測波長分別主波長570nm副波長800nm。表I :
—加人物空白管校準(zhǔn)管質(zhì)控管樣品管蒸餾水__3ul____
~校準(zhǔn)品I 3ul I
權(quán)利要求
1.一種基于膠乳粒子包被視黃醇結(jié)合蛋白檢測試劑盒，包括試劑R1，試劑R2以及校準(zhǔn)品7其中 試劑Rl為Tris-HCl緩沖體系，包括Tris-HCl緩沖液30-60mmol/l,PH值為7. 2-7. 6 ；聚合物60_95mmol/l ;乙二胺四乙酸二納6-1 3mmoI / I ； 試劑R2，包括羊抗人視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體包被聚苯乙烯乳膠粒子致敏顆粒；磷酸鹽緩沖液 35-60mmol/l, PH 值為 7. 2-7. 6 ； 參考校準(zhǔn)品，包括牛血清基質(zhì)；根據(jù)牛血清基質(zhì)的體積用量百分比，還包括防腐劑O. 2-2. 2% ;穩(wěn)定劑 1-10%。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于膠乳粒子包被視黃醇結(jié)合蛋白檢測試劑盒，其特征在于所述試劑R2中，聚苯乙烯乳膠粒子的直徑為45-92nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于膠乳粒子包被視黃醇結(jié)合蛋白檢測試劑盒，其特征在于所述試劑Rl中，聚合物為乙二醇6000-8000 ;或為聚乙二醇6000-8000，葡聚糖，聚氧乙烯類多聚物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于膠乳粒子包被視黃醇結(jié)合蛋白檢測試劑盒，其特征在于所述羊抗人視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體包被聚苯乙烯乳膠粒子采用物理吸附法，具體步驟為將羊抗人視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體和聚苯乙烯膠乳混合，將兩者混勻后37°C吸附8小時，之后透析除去未連接上的抗體，加入封閉液，封閉2小時，離心去上清，用膠乳稀釋液稀釋至1.2-2. 5%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于膠乳粒子包被視黃醇結(jié)合蛋白檢測試劑盒，其特征在于所述羊抗人視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體與聚苯乙烯乳膠粒子質(zhì)量比1/20-5/10。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于膠乳粒子包被視黃醇結(jié)合蛋白檢測試劑盒，其特征在于所述的封閉液包括脫脂奶粉和甘氨酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于膠乳粒子包被視黃醇結(jié)合蛋白檢測試劑盒，其特征在于所述膠乳稀釋液包括，35-60mmol/l，PH值為7. 2-7. 6磷酸鹽緩沖液；0. 01% -O. 1%脫脂奶粉，O. 9%的NaN3。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)免疫體外診斷領(lǐng)域，特別是一種基于膠乳粒子包被視黃醇結(jié)合蛋白檢測試劑盒，包括試劑R1，試劑R2以及校準(zhǔn)品，其中試劑R1為Tris-HCl緩沖體系，包括Tris-HCl緩沖液，聚合物，乙二胺四乙酸二鈉。試劑R2，包括羊抗人視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體包被聚苯乙烯乳膠粒子致敏顆粒；磷酸鹽緩沖液。參考校準(zhǔn)品，包括牛血清基質(zhì)；根據(jù)牛血清基質(zhì)的體積用量百分比，還包括防腐劑0.2-2.2％，穩(wěn)定劑1-10％。本發(fā)明同現(xiàn)技術(shù)相比，不但能用于腎功能疾病的輔助診斷，同時也能用于營養(yǎng)不良的輔助診斷。具有很高的臨床應(yīng)用價值。
文檔編號G01N33/68GK102621332SQ20121009953
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月6日
發(fā)明者房君江, 李子樵 申請人:上海藍(lán)怡科技有限公司