專利名稱：一種膠乳比濁法進行視黃醇結(jié)合蛋白檢測的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及應(yīng)用雙抗體制備膠乳免疫試劑用膠乳免疫比濁法進行視黃醇結(jié)合蛋白檢測的試劑盒。
背景技術(shù)：
視黃醇結(jié)合蛋白(retinol binding protein, RBP)是單一肽鏈蛋白質(zhì)，分子量約21kD，有一個位點特異結(jié)合一分子全反式視黃醇，即維生素A。視黃醇結(jié)合蛋白根據(jù)序列同源性分為5類分泌型RBP、細胞內(nèi)RBP、視黃酸的核受體、視覺組織特異性的細胞外RBP和視覺組織特異性的細胞內(nèi)RBP。血清RBP4為分泌型RBP，是細胞外最主要的轉(zhuǎn)運蛋白，負(fù)責(zé)結(jié)合、轉(zhuǎn)運血液中的視黃醇。
視黃醇結(jié)合蛋白是血液中維生素的轉(zhuǎn)運蛋白，由肝臟合成，廣泛分布于人體血清、腦脊液、尿液及其他體液中，但脂肪組織中的視黃醇結(jié)合蛋白仍占其合成量的15% 30%，機體約20%的視黃醇存儲在脂肪組織。在血液循環(huán)中RBP與視黃醇、甲狀腺素運載蛋白(TTR)以I : I : I形成高分子蛋白復(fù)合物，其生物學(xué)作用是將視黃醇從肝細胞轉(zhuǎn)運到靶組織，以及實現(xiàn)VitA的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運代謝。血清中視黃醇結(jié)合蛋白正常值是男36 56mg/L (36. O 56. O μ g/ml)、女:26. 7 57. 9mg/L(26. 7 57. 9 μ g/ml)。體內(nèi)90%RBP與視黃醇結(jié)合，形成視黃醇、視黃醇結(jié)合蛋白和甲狀腺素的高分子復(fù)合物，不能被腎小球濾出，而10%游離狀態(tài)的RBP則會經(jīng)腎小球濾出，99. 97%由近端小管上皮細胞重吸收，并被分解成氨基酸，供體內(nèi)合成利用，僅有少量從尿中排泄。健康人尿中含量極低，小于O. 7mg/L。當(dāng)腎小管重吸收障礙時，尿RBP排出增多，目前認(rèn)為是反映近端腎小管功能的一項較好的標(biāo)志物。近年來研究顯示尿RBP含量與腎小管間質(zhì)受損有較好的相關(guān)性，并認(rèn)為腎小管間質(zhì)病變較腎小球病變更早引起腎功能損傷，30%以上的腎小球疾病伴有腎小管間質(zhì)病變，在這種情況下可能進展為腎功能衰竭。故尿RBP測定對腎小管間質(zhì)病變在進行性腎小球受損中的重要性受到越來越多國內(nèi)外學(xué)者的重視。腎病早期腎損傷時常無任何臨床表現(xiàn)，常規(guī)檢查尿蛋白多為陰性，血清尿素氮與C r作為傳統(tǒng)反映腎臟功能的指標(biāo)，兩者的靈敏性較差。因為腎小球的代償能力很強，只有當(dāng)50%以上的腎小球受損時才會引起兩者的升高。國外報道在高血壓病腎損害的早期診斷中，RBP較β 2 — MG、mAlb更靈敏。在糖尿病腎病早期，尿RBP4排泄增加先于微白蛋白尿出現(xiàn)，被認(rèn)為是反映早期腎損害的標(biāo)志。尿RBP檢測是評價腎功能早期損傷的良好指標(biāo)，具有較好的臨床應(yīng)用價值。目前檢測尿RBP的方法，由最初的免疫電泳的定性檢測，到有單向免疫擴散RID、酶聯(lián)免疫吸附EIA、熒光免疫的定量檢測，以及到免疫比濁的自動化檢測，發(fā)展十分迅速。目前臨床進行大量樣本檢測常采用的方法是免疫比濁法。目前臨床上進行大量樣本檢測的方法是免疫透射比濁法和免疫散射比濁法。免疫比濁法是抗原抗體結(jié)合動態(tài)測定方法。其基本原理是當(dāng)抗原與抗體在特殊稀釋系統(tǒng)中反應(yīng)而且比例合適(一般規(guī)定抗體過量)時，形成的可溶性免疫復(fù)合物在稀釋系統(tǒng)中的促聚齊IJ(聚乙二醇等)的作用下，自液相析出，形成微粒，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當(dāng)抗體濃度固定時，形成的免疫復(fù)合物的量隨著檢樣中抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度也隨之增加。通過測定反應(yīng)液的濁度與一系列標(biāo)準(zhǔn)品對照，即可計算出檢樣中抗原的含量。但是當(dāng)抗原量很低時，抗原抗體結(jié)合物較少，形成的濁度低，不易被檢測，從而造成靈敏度低。膠乳增強免疫比濁法則是將抗體標(biāo)記在膠乳顆粒上，當(dāng)抗原抗體反應(yīng)時，形成的結(jié)合物將膠乳包含在內(nèi)，從而放大濁度效應(yīng)，易于被檢測到。目前市場上有多種免疫透射比濁方法的試劑盒，可以同時檢測血清和尿液的RBP濃度，但因為健康人血清RBP濃度是26. 7 68. 6mg/L，尿中RBP濃度小于O. 7mg/L,試劑盒的線性范圍寬檢測限10 140mg/L，導(dǎo)致在測定尿液RBP低濃度時，都存在靈敏度不足的問題。因此選擇合適的線性范圍，研制能夠準(zhǔn)確、靈敏進行尿液RBP濃度測定的試劑盒，具有很大的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服目前現(xiàn)有RBP檢測試劑盒的不足，提供一種靈敏度高的檢測RBP的膠乳增強免疫比濁試劑盒。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種采用膠乳免疫比濁法檢測視黃醇結(jié)合蛋白含量的試劑盒，包含試劑R1、試劑R2、校準(zhǔn)品；所述試劑Rl為pH值6-9的緩沖液，所述試劑R2為抗視黃醇結(jié)合蛋白的雙抗體包被的膠乳試劑，所述校準(zhǔn)品是pH值5-8的視黃醇結(jié)合蛋白溶液。所述試劑R2中雙抗體是配對的一株單克隆抗體和一種多克隆抗體，單克隆抗體親和力高，與RBP先結(jié)合，起到捕獲作用，多克隆抗體含多株可結(jié)合RBP不同表位的抗體，起檢測功能。單克隆抗體選自鼠抗人、兔抗人抗體，優(yōu)選地，選自鼠抗人單克隆抗體；多克隆抗體選自鼠抗人、兔抗人、羊抗人抗體，優(yōu)選地，選自兔抗人多克隆抗體。優(yōu)選地，試劑I、試劑2、校準(zhǔn)品溶液的緩沖液選自Tris/HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、HEPES緩沖液、甘氨酸緩沖液、巴比妥緩沖液、MOPSO緩沖液、DIPSO緩沖液、HEPPS緩沖液中的一種，試劑Rl的PH范圍為6-9 ;試劑R2的pH范圍是6_8 ;校準(zhǔn)品的pH范圍是5_8，優(yōu)選為5. 9-6. I。優(yōu)選地，試劑Rl 含有 O. 7%-0. 9% 的 NaCl、l%_6% 的 PEG 6000、O. 01%_0· 1% 的
Tween80o優(yōu)選地，試劑R2中，選用的視黃醇結(jié)合蛋白抗體濃度為O. 1-lmg/ml，是配對的一株視黃醇結(jié)合蛋白單克隆抗體和一種視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體。單克隆抗體選自鼠抗人或兔抗人單克隆抗體，優(yōu)選鼠單克隆抗體；多克隆抗體選自鼠抗人、兔抗人或羊抗人多克隆抗體，優(yōu)選兔抗人多克隆抗體。所述試劑R2由以下方法制備將抗視黃醇結(jié)合蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體按重量比1:1-4:1混合均勻后與膠乳顆粒充分孵育，加封閉液封閉，離心去上清，用Tris/HCl緩沖液分散至膠乳顆粒濃度至2mg/ml。單克隆抗體和多克隆抗體優(yōu)選的比例是
I.5:1-3 :1，更優(yōu)選地，制備試劑R2選用的膠乳顆粒是疏水性膠乳顆粒聚乙烯基芐基氯膠乳，采用化學(xué)交聯(lián)的方法將抗體標(biāo)記于膠乳顆粒上，膠乳顆粒的粒徑范圍為50-250nm，優(yōu)選60_140nm。聚乙烯基芐基氯膠乳顆粒是一種核殼形式的膠乳顆粒，其膠乳核是甲苯乙烯聚合物，膠乳殼為乙烯基芐基氯的聚合物，是一種疏水性膠乳。在殼的表面具有氯甲基活性基團，這些活性基團可以在溫和的水溶液中直接與抗體、抗原或其他配體的氨基基團反應(yīng)，通過一步反應(yīng)產(chǎn)生一種穩(wěn)定的共價化合物。在本發(fā)明的具體實施方式
中，標(biāo)準(zhǔn)品視黃醇結(jié)合蛋白溶液濃度分別為8mg/L、4mg/L、2mg/L、lmg/L、0. 5mg/L、0mg/L。校準(zhǔn)品的pH范圍是5-8,健康人尿液的pH值在6左右,故優(yōu)選為5. 9-6. I優(yōu)選地，本發(fā)明所述試劑盒中含有穩(wěn)定劑和防腐劑。所述穩(wěn)定劑選自蛋白質(zhì)、氨基酸、無機鹽、表面活性劑、助懸劑或抗氧劑中的一種或多種；所述的防腐劑選自O(shè). 1%的疊氮鈉、Proclin 300或慶大霉素。 本發(fā)明測定樣本的原理是膠乳增強免疫比濁法，所選樣本為人體尿液，樣本與試劑Rl (pH值為6-9的緩沖液)預(yù)孵育35分鐘后(使樣本中的抗體結(jié)合位點充分暴露)，加入試劑R2 (視黃醇結(jié)合蛋白抗體膠乳試劑)，繼續(xù)孵育35分鐘，尿液中的視黃醇結(jié)合蛋白與膠乳顆粒的抗體結(jié)合，形成不溶性的抗原抗體-膠乳復(fù)合物，產(chǎn)生一定的濁度，其濁度高低與檢測樣本中的特異性抗體濃度成正比。在規(guī)定波長下測定該不溶性抗原抗體復(fù)合物的吸光度值，與已知濃度的視黃醇結(jié)合蛋白校準(zhǔn)品進行比較，則可計算出樣本中視黃醇結(jié)合蛋白的濃度。本發(fā)明中采用配對的單克隆抗體和多克隆抗體包被到膠乳顆粒上，包被到膠乳顆粒上的抗體與待測RBP結(jié)合，形成絡(luò)合物，可以檢測到濁度變化。通過檢測6個校準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測樣本時，通過反應(yīng)吸光度值計算待測樣本中的RBP的濃度。本試劑盒采用膠乳增強免疫比濁法，與RBP形成的絡(luò)合物比未采用膠乳增強的免疫比濁法，濁度變化明顯，信號反應(yīng)值高，對極微量蛋白的檢測亦有好的信號響應(yīng)。本試劑盒采用高親和力的一株單克隆抗體和一種多克隆抗標(biāo)記膠乳。當(dāng)單用單克隆抗體標(biāo)記膠乳時，樣本中的抗原被抗體完全捕獲，形成膠乳-抗體-抗原復(fù)合物，但抗原可以結(jié)合抗體的表位已被占據(jù)，不會繼續(xù)跟抗體結(jié)合形成絡(luò)合物，不形成濁度的變化。當(dāng)只用兔多抗標(biāo)記膠乳時，可形成膠乳-抗體-抗原-抗體-膠乳的絡(luò)合物，有很好的檢測靈敏度，但線性不好，反應(yīng)吸光度的變化與濃度不是正比例關(guān)系。本發(fā)明將單克隆抗體和多克隆抗體一起使用，既保證了單獨使用多抗時的靈敏度，又獲得了良好的線性。


圖I顯示本發(fā)明所述試劑盒O. 005 8mg/L線性范圍的相關(guān)性。
具體實施例方式本發(fā)明公開了一種膠乳比濁法進行視黃醇結(jié)合蛋白檢測的試劑盒，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，通過適當(dāng)改進工藝參數(shù)而實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明所要求保護的技術(shù)方案之內(nèi)。本發(fā)明的產(chǎn)品及方法已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例I :視黃醇結(jié)合蛋白膠乳免疫試劑盒的制備I、試劑Rl的制備先以雙蒸水溶解NaCl (7. O 9. Og)，再加入Tris-HCl緩沖液，最后加雙蒸水至1000ml，使Tris終濃度為O. 05mol/L,充分搖勻，再加入少量PEG 6000和Tween80，混合均勻即可。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可選擇其他的常規(guī)緩沖液，如磷酸鹽緩沖液、HEPES緩沖液、甘氨酸緩沖液、巴比妥緩沖液中的一種或多種。
2、試劑R2的制備抗體混合液配制取lmg/ml抗視黃醇結(jié)合蛋白鼠單克隆抗體溶液2ml,取lmg/ml的抗視黃醇結(jié)合蛋白兔多克隆抗體溶液1ml，將兩個溶液混合均勻備用。取500ul 4% (g/ml)聚乙烯基節(jié)基氯顆粒(膠乳顆粒粒徑IlOnm)混懸液，加入
2.5ml去離子蒸懼水稀釋,將混合好的抗體溶液在300rpm磁力攪拌下加入膠乳溶液中，在室溫下(20-25°C)下繼續(xù)攪拌45分鐘，再在37°C孵育3小時，形成穩(wěn)定的膠乳顆粒_抗體復(fù)合物。然后加入Iml封閉液(含O. 2 (g/ml) B SA的IXPBS緩沖液，pH7. 4)在37°C封閉I小時，離心傾去上清液，再用pH=7. 4的IXPBS洗滌膠乳兩次，最后用IOml 20mol/L Tris/HCl緩沖液(含O. 1%BSA、0. 8%NaCl、0. 1%疊氮鈉、O. 1%吐溫80)分散膠乳，使膠乳顆粒濃度為 2mg/ml。3、校準(zhǔn)品的制備(也可選用市售的視黃醇結(jié)合蛋白)配制pH=6的磷酸緩沖液，以之溶解視黃醇結(jié)合蛋白，使之濃度為8mg/ml，然后以此溶液倍比稀釋，得一系列梯度溶液8mg/ml、4mg/ml、2mg/ml、lmg/ml、O. 5mg/ml、0. 25mg/ml、0mg/ml 置于 4°C備用。實施例2 :視黃醇結(jié)合蛋白檢測試劑的測定方法本試劑盒適用于貝克曼、日立、奧林巴斯、東芝、羅氏、雅培、西門子、邁瑞等品牌的全自動或半自動生化分析儀，測定方法如下I、測定條件本發(fā)明所述試劑盒的測定條件溫度37°C主波長560nm副波長800nm樣本量5yLRl 用量200 μ LR2 用量40 μ L分析類型兩點終點法2、測定方法如下測定空白吸光度，在200ul Rl試劑中加入5μ L樣本，預(yù)孵育5分鐘，測定空白吸光度后，加入40 μ LR2試劑，孵育5分鐘，測定反應(yīng)吸光度。
樣本量、Rl用量及R2用量可按不同型號生化分析儀的要求，按“測定條件”中規(guī)定的樣本與試劑用量的比例進行調(diào)整。如儀器內(nèi)無指定波長，可選擇與指定波長最接近的數(shù)值輸入。(3)定標(biāo)及樣本測定使用試劑盒中的校準(zhǔn)品按所使用分析儀器說明書中的校準(zhǔn)程序要求定標(biāo)，模式為多點定標(biāo)，建立工作曲線。定標(biāo)后，測定血清樣本，依據(jù)工作曲線可算出樣本中的抗體濃度。實施例3 :視黃醇結(jié)合蛋白免疫試劑的分析性能評估I、分析靈敏度或最低檢出限對照試劑國外某知名品牌
檢測原理采用膠乳增強免疫透射比濁法，在570nm檢測其濁度變化，其變化程度與樣本中的RBP含量成線性關(guān)系。靈敏度評價方法將校準(zhǔn)品稀釋成接近靈敏度的一系列濃度，經(jīng)ELISA方法確定其濃度為O. 05mg/L、0. 10mg/L、0. 15mg/L、0. 21mg/L,增加零標(biāo)準(zhǔn)品為樣本，使用兩種試劑盒，按照各自測量方法，進行重復(fù)測定10次，記錄反應(yīng)吸光度值表I :實施例I靈敏度測值
權(quán)利要求
1.一種采用膠乳比濁法檢測視黃醇結(jié)合蛋白含量的試劑盒，包含試劑R1、試劑R2、校準(zhǔn)品；所述試劑Rl為pH值6-9的緩沖液，所述試劑R2為抗視黃醇結(jié)合蛋白的雙抗體包被的膠乳試劑，所述校準(zhǔn)品是PH值5-8的視黃醇結(jié)合蛋白溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述緩沖液選自Tris/HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、HEPES緩沖液、甘氨酸緩沖液、巴比妥緩沖液、MOPSO緩沖液、DIPSO緩沖液、HEPPS緩沖液中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，試劑Rl還含有O.7%-0· 9%的NaCl、l%-6%的PEG6000、O. 01%-0. 1% 的 Tween80o
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述R2試劑pH范圍是6-8，所述抗視黃醇結(jié)合蛋白的雙抗體為配對的一株抗視黃醇結(jié)合蛋白單克隆抗體和一種抗視黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述單克隆抗體選自鼠抗人或兔抗人單克隆抗體；所述多克隆抗體選自鼠抗人、兔抗人或羊抗人多克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的試劑盒，其特征在于所述試劑R2由以下方法制備將抗視黃醇結(jié)合蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體按重量比1:1-4:1混合均勻后與膠乳顆粒充分孵育，加封閉液封閉，離心去上清，用Tris/HCl緩沖液分散至膠乳顆粒濃度至2mg/mlο
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述膠乳顆粒為疏水性膠乳顆粒聚乙烯基芐基氯膠乳，其粒徑范圍為50-250nm，優(yōu)選60_140nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述單克隆抗體和多克隆抗體的重量比是1.5:1-3 1 ;所述封閉液為含O. 2g/ml BSA的IXPBS緩沖液，ρΗ7· 4。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述的試劑盒，其特征在于還包含穩(wěn)定劑和防腐劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑選自蛋白質(zhì)、氨基酸、無機鹽、表面活性劑、助懸劑或抗氧劑中的一種或多種；所述的防腐劑選自O(shè). 1%的疊氮鈉、Proclin 300或慶大霉素。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體公開一種采用膠乳免疫比濁法檢測視黃醇結(jié)合蛋白含量的試劑盒。本發(fā)明所述試劑盒包含試劑R1、試劑R2、校準(zhǔn)品；所述試劑R1為pH值6-9的緩沖液，所述試劑R2為抗視黃醇結(jié)合蛋白的雙抗體包被的膠乳試劑，所述校準(zhǔn)品是pH值5-8的視黃醇結(jié)合蛋白溶液。本發(fā)明所述試劑盒采用膠乳免疫比濁法檢測樣品中視黃醇結(jié)合蛋白含量，靈敏度高，可達到0.042mg/L；穩(wěn)定性好，操作簡單、快速；特異性強，不易受干擾；定量準(zhǔn)確，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N33/577GK102944679SQ201210460559
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月15日
發(fā)明者張英偉 申請人:北京康美天鴻生物科技有限公司