結(jié)核分枝桿菌tb-sa抗體酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物學檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗體酶聯(lián)免疫法 檢測試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病、艾滋病與瘧疾一起，被視為至今影響全球公共衛(wèi)生的三大疾病，結(jié)核病是 我國重點控制的重大疾病之一，也是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題和社會問題。
[0003]據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO)和全國第五次結(jié)核病流行病學調(diào)查顯示：目前全球有近 1/3的人口感染結(jié)核分枝桿菌，每年有約800萬新病例發(fā)生，接近300萬人死于該病。中國 是全球22個結(jié)核病高負擔國家之一，結(jié)核病患者數(shù)量居世界第二位。目前有肺結(jié)核病人 約450萬，結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約130萬，我國肺結(jié)核的發(fā)病率為459/10萬人，占全球發(fā)病的 14. 3%，每年因結(jié)核病死亡人數(shù)達13萬，大大超過其他傳染病死亡人數(shù)的總和。
[0004]結(jié)核病是人畜共患傳染病，可感染各個階段的人群，第五次流行病學調(diào)查顯示，隨 著年齡的增長，結(jié)核病人的發(fā)病率增加。有報道顯示，一個傳染性結(jié)核病人一年內(nèi)可能傳染 10?15人。面對如此嚴峻的形勢，我們應該及早采取措施。結(jié)核病的早期診斷及有效治療 是結(jié)核病預防工作的重中之重，對于控制結(jié)核菌傳播有著重要的臨床意義。目前國內(nèi)大多 數(shù)醫(yī)院根據(jù)直接涂片鏡檢和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)技術(shù)對活動性結(jié)合進行診斷。結(jié)核菌涂片檢 測雖然簡單易行且準確性高，但陽性率低。結(jié)核菌培養(yǎng)檢測可信度高，但耗時較長，不能滿 足臨床需求。此外，結(jié)核菌素皮試（PPD)試驗所用抗原為結(jié)核分枝桿菌粗提的抗原混合物， 和許多非結(jié)核分枝桿菌及卡介苗（BCG)均存在共同抗原成分，從而導致該法用于結(jié)核病診 斷特異性差。中國是結(jié)核病高度流行區(qū)，由于廣泛接種BCG，也造成PH)實驗假陽性率很高， 所以臨床上只能根據(jù)pro實驗皮膚的反應強弱給予輔助診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的即在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可快速定性檢測樣本中的結(jié) 核分枝桿菌TB-SA抗體酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗體酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒的 制備方法。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗體酶聯(lián)免疫 法檢測試劑盒，所述檢測試劑盒由TB-SA抗原包被板、樣品稀釋液、酶標記液、濃縮洗液、顯 色劑A液、顯色劑B液、陰性對照品、陽性對照品和終止液組成。
[0008] 進一步地，所述TB-SA抗原包被板為包被有TB-SA抗原的微孔板，所述TB-SA抗原 用磷酸鹽緩沖液稀釋，其包被濃度為0. 〇lmg/ml。
[0009] 進一步地，所述樣品稀釋液為含有吐溫-20和蛋白的緩沖液。
[0010] 進一步地，所述酶標記液為含辣根過氧化物酶標記的葡萄球菌蛋白A溶液。
[0011] 進一步地，所述濃縮洗液為含吐溫-20的緩沖液。
[0012] 進一步地，所述顯色劑A液為含有過氧化脲的溶液，顯色劑B液為含TMB的溶液。
[0013] 進一步地，所述陽性對照品為含TB-SA抗體陽性的血清溶液，陰性對照品為含 TB-SA抗體陰性的血清溶液。
[0014] 進一步地，所述終止液為含硫酸的溶液。
[0015] 結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗體酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒的制備方法，它包括以下步驟：
[0016]SI.TB-SA抗原包被板的制備：用磷酸鹽緩沖液將TB-SA抗原稀釋至包被濃度為 0. 01mg/ml，將包被液包被于微孔板上，35?40°C干燥后保存；
[0017]S2.樣品稀釋液的制備：用10倍濃縮的磷酸鹽緩沖液500ml，加入酪蛋白5. 00g， 加入純化水攪拌至酪蛋白充分溶解；再加入3ml的吐溫-20,混勻后加純化水至1000ml，充 分混勻，保存；
[0018]S3.酶標記液的制備：用pH為10倍濃縮的磷酸鹽緩沖液300ml，加純化水至 3000ml，將辣根過氧化物酶標的葡萄球菌蛋白A稀釋至1:4萬?1:6萬，保存；
[0019]S4.濃縮洗液的制備：稱取氯化鈉300g、磷酸氫二鈉85g加入1000ml純化水溶解 后，再加吐溫-20 15ml，用純化水加至1300ml，攪拌混勻后保存；
[0020] S5.對照品的制備
[0021] S51.陽性對照品的制備：用10倍濃縮的磷酸鹽緩沖液70ml，加入海藻糖0. 15g、 吐溫-20 0. 35ml，丙三醇35ml，溶解后加純化水至650ml，攪拌混勻后加入含TB-SA抗體陽 性的血清6. 5ml，混勻后保存；
[0022] S52.陰性對照品的制備：用10倍濃縮的磷酸鹽緩沖液70ml，加入海藻糖0. 15g、 吐溫-20 0. 35ml，丙三醇35ml，溶解后加純化水至650ml，攪拌混勻后加入含TB-SA抗體陰 性的血清6. 5ml，混勻后保存；
[0023]S6.顯色液的制備：
[0024]S61.顯色劑A液的制備：稱取檸檬酸0. 9g，過氧化脲0.lg，加純化水100ml溶解 后，加純化水至170ml，充分混勻后保存；
[0025] S62.顯色劑B液的制備：用100ml純化水將3g檸檬酸溶解后加入丙三醇17ml，混 勻后加入用3mlDMS0溶解的0. 04gTMB，加純化水至170ml，保存；
[0026]S7.終止液的制備：將純化水150ml和量取的硫酸18ml混勻后加純化水至180ml， 保存。
[0027] 本發(fā)明的結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗體酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒的檢測原理：
[0028] 本試劑盒在微孔板內(nèi)包被TB-SA抗原，若待測樣本中有TB-SA抗體即可與之結(jié)合， 再與酶標記抗體反應，形成"抗原-抗體-酶復合物"，酶催化顯色劑顯色，根據(jù)顯色程度可 判斷TB-SA抗體的有無。
[0029] 本試劑盒檢測樣本為血清，分離的樣本可在2_8°C保存下存儲7天，長期存儲應 置-20°C，避免反復凍融，冷藏或冷凍保存的樣本使用前應平衡至室溫，并充分混勻。
[0030] 本試劑盒的檢測方法為：
[0031] 1.試劑準備：將試劑盒平衡至室溫，用純化水將濃縮洗液作1:20稀釋，即配成洗 滌工作液備用。
[0032]2.加樣：將所需數(shù)量的TB-SA抗原包被板條固定于板架上，各孔加入100ill樣本 稀釋液，按序加入5yl待測樣本；每次實驗設(shè)空白對照（用雙波長檢測時可以不設(shè)空白對 照）、陰性對照、陽性對照各2孔，分別加入樣本稀釋液、陰性對照品、陽性對照品各100yl/ 孔；震蕩混勻，封板，37°C溫育10分鐘，用洗漆工作液洗板5次，拍干。
[0033] 3.加酶：每孔加入酶標記液100iil，震蕩混勻，封板，37°C溫育10分鐘，用洗滌工 作液洗板5次，拍干。
[0034] 4.顯色讀值：每孔加入顯色劑A、B液各50i