專(zhuān)利名稱(chēng)：胸腺肽結(jié)腸控釋膠囊制劑及胸腺肽的提取分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胸腺肽結(jié)腸控釋膠囊制劑，它是一種從哺乳動(dòng)物胸腺組織中提取的多肽蛋白質(zhì)類(lèi)激素——胸腺肽的口服制劑，特別是能控制在結(jié)腸部位崩解與釋藥的口服膠囊制劑，屬免疫(增強(qiáng))類(lèi)藥物，本發(fā)明還涉及作為原料用于該制劑的胸腺肽的提取及分離方法。
胸腺肽是從哺乳類(lèi)動(dòng)物的胸腺組織中提取的一種多肽類(lèi)免疫激素，故又名胸腺素，其可誘導(dǎo)與促進(jìn)骨髓、胸腺內(nèi)T細(xì)胞系統(tǒng)分化、發(fā)育及至成熟過(guò)程。臨床上主要適用于原發(fā)及各種繼發(fā)性免疫缺陷、自身免疫病、抗腫瘤、抗各種感染性疾病(如病毒性肝炎)的免疫治療，以及其它免疫低下癥。還可延緩和預(yù)防中老年人胸腺生理性退變，有抗衰、防衰的功效。1965年Goldstein從小牛胸腺的無(wú)細(xì)胞濾出液經(jīng)過(guò)初步純化，得到一個(gè)制劑，并第一次命名為胸腺素(Thymosin)。1975年Goldstein又提出了進(jìn)一步的純化方法，制備了胸腺素組分5(Thymosin F5)，其分子量在1000—15000 dolton(Da)范圍內(nèi)分布。據(jù)認(rèn)為，Goldstein的F5包括了可連續(xù)誘導(dǎo)、促進(jìn)T細(xì)胞分化與發(fā)育的胸腺前的骨髓、胸腺內(nèi)及胸腺后的周?chē)鶷細(xì)胞系統(tǒng)的三個(gè)不同發(fā)育階段及其不同發(fā)育環(huán)節(jié)所需的不可或缺的多肽組分。此后，許多國(guó)家開(kāi)展的關(guān)于胸腺激素的研究大多集中于對(duì)F5的基礎(chǔ)及臨床應(yīng)用研究。國(guó)內(nèi)外眾多實(shí)驗(yàn)室實(shí)際上已將F5視為胸腺制劑研究業(yè)已公認(rèn)的“參照品”。我國(guó)八十年代初正式生產(chǎn)的豬胸腺素注射劑也是參照了F5方法提取。但F5方法工藝復(fù)雜，步驟繁多，蛋白收率低，最后采用以10KDa分子量的超濾膜的常規(guī)超濾工藝，由于受目前超濾技術(shù)的局限，使10KDa以下的許多組分被丟失，不僅使收率更低，而且還大大影響生物活性。又由于胸腺肽制劑是作用于T細(xì)胞系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)藥物，療程在4—6周或更長(zhǎng)，如此較長(zhǎng)時(shí)期的注射治療給病人帶來(lái)不便和痛苦，使臨床應(yīng)用大為受限。因其系為有一定分子量的異性蛋白，長(zhǎng)期注射使用，日后可能引起目前免疫學(xué)上尚難預(yù)知的免疫繼發(fā)副反應(yīng)。制劑經(jīng)普通口服途徑，蛋白質(zhì)多肽往往在抵達(dá)回一盲部及結(jié)腸之前，就被胃酸及小腸的蛋白酶類(lèi)水解。目前國(guó)內(nèi)外胸腺肽口服制劑系為在小腸崩解的普通腸溶片劑或普通腸溶膠囊制劑，大部分胸腺肽在小腸段即已降解、失活，因此臨床服用劑量需加大(往往加大三倍)，不僅不經(jīng)濟(jì)，而且療效也不佳。因而，適于多肽類(lèi)腸吸收的口服制劑是人們欲努力尋求的新劑型。
本發(fā)明的目的是提供一種適于蛋白多肽類(lèi)吸收的結(jié)腸靶向給藥的口服新劑型——胸腺肽結(jié)腸控釋膠囊制劑，以避免胸腺肽被上消化道蛋白酶類(lèi)所酶解，而可控制制劑在預(yù)定的結(jié)腸或至少在回盲部位釋藥，使蛋白多肽在此處大部分能以整個(gè)分子形式被吸收，確保療效。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供胸腺肽的提取、分離方法，它可進(jìn)行組分與分子量控制、“捕捉”到與胸腺素F5組分及分子量分布范圍相似的多組分肽，既有高活性，又有高收。
本發(fā)明胸腺肽結(jié)腸控釋膠囊制劑采用結(jié)腸溶膠囊殼，內(nèi)裝有由粘合劑粘結(jié)成微粒的下列組合物胸腺肽原粉、微晶纖維素(MCC)、干淀粉(Dry starch)、糊精和羧甲基淀粉鈉，其中，胸腺肽蛋白質(zhì)∶微晶纖維素∶干淀粉∶糊精∶羧甲基淀粉鈉各組分的重量比為1∶5～6．5∶17～18．5∶2～3∶1．5～2．5，胸腺肽蛋白的分子量在1000～12500dolton范圍內(nèi)；所說(shuō)的粘合劑是以濃度為90％(重量)的乙醇溶液為溶劑的聚丙烯酸樹(shù)脂(即Ⅲ樹(shù)脂)，其中添加有Tween80，添加量為7～8ml Tween80／100g聚丙烯酸樹(shù)脂。
本發(fā)明提取、分離胸腺肽的方法，以哺乳類(lèi)動(dòng)物的胸腺組織為原料，按下列步驟制備(1)原料預(yù)處理將哺乳類(lèi)動(dòng)物胸腺組織剔除筋膜，漂洗后加1～2倍雙蒸水，高速搗碎制成勻漿；—20℃下貯存48小時(shí)以上，反復(fù)凍融2～3次。
(2)蛋白質(zhì)抽提勻漿中加入3～5N(當(dāng)量濃度)的HCl，調(diào)pH至1．5～3．5，抽提4小時(shí)，離心，取上清液。此步驟使大部分核酸沉淀除去，所得上清液為蛋白質(zhì)粗提液。本步驟也可在加入HCl之前，先在勻漿中按0．30～0．65％濃度(重量)加入NaCl，攪拌溶解。此低濃度離子強(qiáng)度的單價(jià)鈉鹽有保護(hù)蛋白質(zhì)及助沉劑的作用。(3)調(diào)胸腺肽等電點(diǎn)在上述蛋白質(zhì)提取粗提液后的濾渣中，加入0．5倍的的雙蒸水，2小時(shí)后離心，在上清液中加入3～5N的NaOH，調(diào)pH值至胸腺肽的等電點(diǎn)5．03～5．48，靜置1～3小時(shí)，離心，將沉淀物傾入蛋白質(zhì)粗提液中，攪拌，用3～5N的NaOH調(diào)pH 6．0～6．5。(4)熱變性除雜蛋白上述上清液在70～85℃下保持10～15分鐘，其中部分非胸腺肽雜蛋白及對(duì)熱不穩(wěn)定的蛋白胸腺肽沉淀，離心除去沉淀物，得上清液。此步驟使胸腺肽進(jìn)一步提純，并提高胸腺肽制劑的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)保存期限；(5)丙酮分級(jí)沉淀胸腺肽①上述上清液中加HCl，調(diào)pH至5．0～5．5，冷卻至4～0℃，加入—10～—20℃的0．5～2．0倍(體積)冷丙酮，—10～—20℃的低溫環(huán)境中0．5～1小時(shí)，迅速離心棄去沉淀物，收集上清液；②以上所得的上清液中加入—10～—20℃的2～6倍(體積)冷丙酮，置—10～—20℃的低溫環(huán)境中3～4小時(shí)，入8000轉(zhuǎn)／分的離心機(jī)，離心30分鐘，所得沉淀物經(jīng)丙酮—乙醚、乙醚分次脫水、脫脂，真空干燥后得黃色顆粒狀胸腺肽原粉。
經(jīng)崩解時(shí)限及釋放／溶出試驗(yàn)證實(shí)，將本發(fā)明胸腺肽膠囊制劑分別置于pH1．2的人工胃液中2小時(shí)、pH6．8的人工小腸液中3小時(shí)后，以上兩種介質(zhì)中均未有蛋白檢出；而在pH7．8的介質(zhì)中30分鐘也未能檢出蛋白，但在pH7．8介質(zhì)中達(dá)45分鐘時(shí)，檢出平行四個(gè)試驗(yàn)溶出杯中，平均溶出率為78．5％。表明本制劑在胃和小腸生理?xiàng)l件下均不會(huì)崩解，而當(dāng)進(jìn)入定位的結(jié)腸處即可崩解，制劑的內(nèi)容物在pH＜7．6介質(zhì)中均不會(huì)有蛋白釋出。可見(jiàn)，本制劑在胃和小腸的生理?xiàng)l件下，乃至在回盲部之前的任何腸段，其內(nèi)部的藥劑均不會(huì)釋出，只有在進(jìn)入定位的釋藥部位結(jié)腸處后，才可完成崩解與釋藥過(guò)程，蛋白才溶出并可被吸收，因此達(dá)到了結(jié)腸靶向給藥的目的。本制劑中還含有腸吸收促進(jìn)劑Tween80，可促進(jìn)多肽蛋白被腸壁吸收。經(jīng)先進(jìn)的流式細(xì)胞光度術(shù)測(cè)定，日服本制劑有效劑量為15mg，此即為注射劑的劑量范圍，說(shuō)明本品與注射劑的臨床效果相當(dāng)；而目前市售的胸腺肽腸溶片臨床日服量至少為本制劑的3倍以上。歐洲專(zhuān)利局1988年公布的TLT片劑臨床日服量為本發(fā)明劑量的10倍，Tymus Mulli片劑日服量為本發(fā)明制劑的10～15倍?？梢?jiàn)本發(fā)明胸腺肽膠囊制劑不僅服用方便，而且腸道使用藥效高。
本發(fā)明提取、分離胸腺肽的方法中，采用了丙酮分級(jí)沉淀的優(yōu)化組合方案，因而可有效地“捕捉”到與胸腺素F5組分及分子量分布范圍均為相似的多肽組分，這是常規(guī)的超濾—凍干法所無(wú)法達(dá)到的。本發(fā)明提取的胸腺肽具有較高的生物學(xué)活性，根據(jù)體外測(cè)定活性的體外玫瑰花結(jié)試驗(yàn)(E—RFC％)顯示，能表現(xiàn)活性的最低蛋白含量(濃度)愈低，表示其活力愈高，本發(fā)明制劑的該最低蛋白含量為0．01μg／ml，比胸腺肽注射劑的”質(zhì)標(biāo)”中規(guī)定所需蛋白含量2．5μg／ml低得多，二者相差250倍，可見(jiàn)本發(fā)明方法制得的胸腺肽具有的高活性。另外從3H—TdR摻入的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)表明，本發(fā)明制備的胸腺肽僅0．039～0．312μg／ml的低濃度下即有促進(jìn)ConA誘導(dǎo)BALB／c小鼠脾(T)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的作用，也可見(jiàn)其生物活性之高。與F5在此濃度范圍內(nèi)的濃度依賴(lài)性與量效關(guān)系曲線(xiàn)比較，二者有可比的“迭加”現(xiàn)象。本發(fā)明提取胸腺肽的方法簡(jiǎn)便，蛋白收率高。據(jù)報(bào)導(dǎo)，采用F5方法實(shí)驗(yàn)室制備，每公斤胸腺組織提取最后純化所得僅為150mg蛋白含量；而目前生產(chǎn)使用的常規(guī)工藝，最后采取的超濾—凍干法，產(chǎn)率≯3000mg蛋白含量／kg胸腺組織；而本發(fā)明方法可達(dá)5500mg蛋白含量／kg胸腺組織，可見(jiàn)本發(fā)明收率之高。此外，本發(fā)明采用丙酮分級(jí)沉淀所制取的多肽物質(zhì)吸濕性較小，結(jié)合本膠囊制劑的輔料配伍，能有效地克服多肽蛋白本身極易引濕的難題，使本口服制劑的貯存有效期限大大延長(zhǎng)。


圖1是用本發(fā)明方法提取的胸腺肽樣品的紫外線(xiàn)吸收掃描曲線(xiàn)圖。
圖2是本發(fā)明方法提取的胸腺肽樣品HPLC分子篩層析圖譜。
圖1中，橫座標(biāo)為對(duì)胸腺肽樣品進(jìn)行紫外光吸收掃描的波長(zhǎng)(nm)，縱座標(biāo)為吸收光即光密度值(0D)。分別在215、260、280nm處及二波峰(212．8、275．0)和一波谷(253．9)處，測(cè)知其吸光度值。圖示可見(jiàn)，在215nm處左右的212．8處有一最大吸收峰，在280nm處左右的275nm處也可見(jiàn)有一較為平緩的吸收波峰。212．8nm為胸腺肽的肽鍵的吸收峰，275nm為其蛋白質(zhì)的吸收峰。從紫外吸收鑒別可確認(rèn)，此圖符合典型的多肽—蛋白質(zhì)的紫外吸收特征。并可算出OD215／OD260、OD215／OD280之比值，表明本發(fā)明所提取、分離的胸腺肽樣品中主要為多肽。
圖2中，橫座標(biāo)為分子篩(凝膠)層析柱樣品中肽組分的出峰時(shí)間(分，min)，縱座標(biāo)為柱的峰高(mAU)、出峰時(shí)間與分子量有關(guān)，峰高與組分濃度度有關(guān)。在作胸腺肽樣品的HPLC(高效液相色譜分析)之同時(shí)，作標(biāo)準(zhǔn)蛋白胰島素(分子量mw5700)，細(xì)胞色素C(mw12300)及牛血清白蛋白(mw67000)的HPLC圖譜，遂以其分子量對(duì)出峰時(shí)間作半對(duì)數(shù)圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，可查知圖2中樣品的諸肽組分的分子量，圖示7個(gè)峰廓表明主要為7個(gè)組分，在主成分前后的中心區(qū)域，分子量分布趨于連續(xù)出峰時(shí)間為17．597min的組分峰高3．01749，峰寬1．580，面積為367．0668，占樣品的百分比為13．6％，該組分的分子量為12．2KDa(千道爾頓)；分子量從1～12．2KDa的肽組分占66．9％；制品中其余小于1KDa的組分占19．5％。以上分析數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明方法所得的胸腺肽組分及分子量分布與Goldstein的F5相似(F5的分子量分布1000～15000Da)。
下面提供本發(fā)明的實(shí)施例。
實(shí)施例一 胸腺肽的提取和分離①制備勻漿取小牛胸腺組織10kg，剔除筋膜漂洗后得7．5kg，加入11．5kg雙蒸水，入高速搗碎機(jī)制得勻漿18500ml，—20℃保持48小時(shí)，快速反復(fù)凍—融三次。②蛋白質(zhì)抽提勻漿中加入NaCl 83．2g，配成0．45％(重量)濃度；加入5N(當(dāng)量濃度)的HCl溶液320ml，調(diào)pH 2．78的酸性條件下抽提4小時(shí)，離心20分鐘(3500轉(zhuǎn)／分)，得上清液即蛋白質(zhì)粗提液13500ml。③調(diào)等電點(diǎn)粗提后的濾渣4500ml中，加入2200ml雙蒸水，調(diào)pH3．0，浸提2小時(shí)，4000轉(zhuǎn)／分的離心機(jī)離心30分，在上清液中加入濃度為5N的NaOH150ml，調(diào)pH為5．2，靜置1．5小時(shí)后離心30分鐘(4000轉(zhuǎn)／分)，沉淀物傾入步驟②的蛋白質(zhì)粗提液13000ml中，加入NaOH40ml，調(diào)pH至6．3。④熱變性除雜蛋白將上述蛋白質(zhì)溶液水浴加溫至76℃，保溫13分鐘，離心30分鐘(4000轉(zhuǎn)／分)，除去沉淀的非胸腺肽雜蛋白和對(duì)熱不穩(wěn)定的胸腺肽蛋白，得胸腺肽溶液12000ml。⑤蛋白質(zhì)分離上述胸腺肽溶液中加入—20℃的丙酮6000ml，—20℃下保存1小時(shí)，大分子量的多肽蛋白首先沉淀析出，離心分離，除去沉淀，得胸腺肽丙酮溶液。在該溶液中加入—20℃丙酮36000ml，—20℃下保持4小時(shí)，其間不斷攪拌，隨后離心30分鐘(8000轉(zhuǎn)／分)，收集沉淀物，依次經(jīng)3倍分析純—20℃冷丙酮—乙醚(各50％)1小時(shí)，3倍分析純室溫丙酮1小時(shí)，3倍分析純室溫乙醚1小時(shí)脫水、脫脂后，真空干燥得黃色胸腺肽蛋白質(zhì)原粉119000mg，用Lowry法Folin酚試劑測(cè)得其蛋白質(zhì)實(shí)際含量為42．86％。
本實(shí)施例制得的胸腺肽原粉的高效液相色譜分析結(jié)果見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)蛋白組分從1000～12200dolton(Da)范圍內(nèi)分布，其中12．2KDa組分占13．6％，1～12．2KDa組分占66．9％，其余小于1KDa的小肽組分為19．5％，顯示多肽組分及分子量分布貼近國(guó)內(nèi)外所公認(rèn)的Goldstein的胸腺素F5。平均分子量低于10000，采用“雙縮脲”反應(yīng)確認(rèn)樣品由蘭變?yōu)樽仙?，提示分子中有肽鍵；經(jīng)紫外吸收鑒別確認(rèn)，蛋白質(zhì)的肽鍵在210～250nm范圍內(nèi)有強(qiáng)的紫外光吸收，紫外吸收掃描曲線(xiàn)(見(jiàn)圖1)符合多肽—蛋白質(zhì)的紫外吸收特征。并從OD215／OD260、OD215／OD280比值分別為8．25和6．18表明該品中主要為多肽，核酸及其降解物含量低。
實(shí)施例二 結(jié)腸控釋膠囊制劑的制備按每粒膠囊含5mg蛋白計(jì)，根據(jù)實(shí)施例一所得胸腺肽原粉的蛋白質(zhì)實(shí)際含量為42．86％，則制備1000粒膠囊需取用實(shí)施例一的胸腺肽原粉12．8g，將其與微晶纖維素33．5g、干淀粉99．4g、糊精14．6g、羧甲基淀粉鈉12．2g混勻，過(guò)80目篩待用；取聚丙烯酸樹(shù)脂3．88g、Tween80 0．29ml，加入濃度為90％的乙醇溶液中，配制成粘合劑97ml，加入上述混合料中，粘結(jié)制成軟材，過(guò)26目篩制粒，37℃真空干燥24小時(shí)，20目篩整粒后用2號(hào)結(jié)腸溶性膠囊殼灌裝成1000粒胸腺肽結(jié)腸控釋膠囊制劑。
權(quán)利要求
1．胸腺肽結(jié)腸控釋膠囊制劑，其特征是結(jié)腸溶性膠囊殼內(nèi)裝有由粘合劑粘結(jié)成微粒的胸腺肽原粉、微晶纖維素、干淀粉、糊精和羧甲基淀粉鈉組合物，其中，胸腺肽∶微晶纖維素∶干淀粉∶糊精∶羧甲基淀粉鈉各組分的重量比為1∶5～6．5∶17～18．5∶2～3∶1．5～2．5，胸腺肽蛋白的分子量在1000～12500dolton范圍內(nèi)；所說(shuō)的粘合劑是以濃度為90％(重量)的乙醇溶液為溶劑的聚丙烯酸樹(shù)脂，其中添加有Tween80，添加量為7～8ml Tween80／100g聚丙烯酸樹(shù)脂。
2．胸腺肽的提取分離方法，以哺乳動(dòng)物的胸腺組織為原料，其特征是按下列步驟制備(1)原料預(yù)處理將哺乳類(lèi)動(dòng)物胸腺組織剔除筋膜，漂洗后加1～2倍雙蒸水，高速搗碎制成勻漿；—20℃下貯存48小時(shí)以上，反復(fù)凍融2～3次；(2)蛋白質(zhì)抽提勻漿中加入3～5N的HCl，調(diào)pH至1．5～3．5，抽提4小時(shí)，離心，取得上清液為蛋白質(zhì)粗提液；(3)調(diào)胸腺肽等電點(diǎn)在上述蛋白質(zhì)提取粗提液后的濾渣中，加入0．5倍的雙蒸水，2小時(shí)后離心，在上清液中加入3～5N的NaOH，調(diào)pH值至胸腺肽的等電點(diǎn)5．03～5．48，靜置1～3小時(shí)，離心，將沉淀物傾入蛋白質(zhì)粗提液中，攪拌，用3～5N的NaOH調(diào)pH6．0～6．5；(4)熱變性除雜蛋白上述上清液在70～85℃下保持10～15分鐘，離心除去沉淀物，得上清液；(5)丙酮分級(jí)沉淀胸腺肽①上述上清液中加HCl，調(diào)pH至5．0～5．5，冷卻至4～0℃，加入—10～—20℃的0．5～2．0倍(體積)冷丙酮，置—10～—20℃的環(huán)境中0．5～1小時(shí)，離心棄去沉淀物，收集上清液；②以上所得的上清液中加入—10～—20℃的2～6倍(體積)冷丙酮，置—10～—20℃的低溫環(huán)境中3～4小時(shí)，入8000轉(zhuǎn)／分的離心機(jī)，離心30分鐘，所得沉淀物經(jīng)丙酮—乙醚、乙醚分次脫水、脫脂，真空干燥后得胸腺肽原粉。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的胸腺肽的提取分離方法，其特征是步驟(2)中，在加入HCl之前，先在勻漿中按0．30～0．65％(重量)加入NaCl，攪拌溶解。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種胸腺肽結(jié)腸控釋膠囊制劑,膠囊內(nèi)容物以胸腺肽蛋白∶微晶纖維素∶干淀粉∶糊精∶羧甲基淀粉鈉按重量1∶5～6.5∶17～18.5∶2～3∶1.5～2.5配制,并粘結(jié)成微粒,粘合劑是以乙醇液為溶劑的添加有Tween80的聚丙烯酸樹(shù)脂。本制劑能在pH≥7.6的回盲及結(jié)腸部位釋藥而確保胸腺肽蛋白分子被最有效吸收。本發(fā)明還提供了用丙酮分級(jí)沉淀的優(yōu)化組合提取分離胸腺肽的方法,制得的胸腺肽分子量在1000—12500Da,生物活性及收率高。
文檔編號(hào)C07K1/14GK1279110SQ0011235
公開(kāi)日2001年1月10日 申請(qǐng)日期2000年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月21日
發(fā)明者錢(qián)林法, 許德義, 朱全芽, 何執(zhí)中 申請(qǐng)人:南京鐵道醫(yī)學(xué)院