專利名稱：一種胸腺肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胸腺肽的制備方法，屬生物藥品制備技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
胸腺肽是胸腺組織分泌的具有生理活性的一組多肽，具有調(diào)節(jié)和增強(qiáng)人體細(xì) 胞免疫功能的作用。胸腺肽是采用生物化學(xué)的方法從動(dòng)物胸腺組織中提取。公開(kāi)號(hào)為 CN1721440A的中國(guó)專利公開(kāi)了一種制備胸腺肽的方法，其步驟為(1)將新鮮的胸腺組織 在20°C 23°C下用高速剪切機(jī)破碎得到勻漿液；(2)用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值在4. 5 4. 8之 間；(3)將勻漿液在20°C 23°C條件下放置3 4小時(shí)；(4)在60°C 65°C水浴中加熱 30min,自然冷卻至室溫；(5)過(guò)濾；(6)濾液用截留分子量為10000的中空纖維柱純化、除 菌得到胸腺肽產(chǎn)品。上述制備方法在高速勻漿時(shí)未加入緩沖液來(lái)抑制蛋白酶的活性，而蛋白酶會(huì)分解 或破壞胸腺肽，進(jìn)而降低胸腺肽的得率和活性；另外勻漿溫度為20°C 23°C，也不易保持 胸腺肽的活性。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述工藝的不足之處，本發(fā)明目的在于提供一種制備胸腺肽的方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案在于提供一種制備胸腺肽的方法，步驟 如下
1)取新鮮的胸腺，用PH3 3.5的緩沖液洗滌干凈；
2)加入pH3.5 4.0緩沖液，在8°C 10°C的條件下，用高速勻質(zhì)機(jī)勻漿，得到勻漿液;
3)將上述勻漿液先放置在0°C 4°C條件下，然后再放置到-18°C -25°C條件下；
4)將凍結(jié)后勻漿液在70 80°C的水浴鍋中加熱10 15min；
5)迅速將上述勻漿液放在低溫條件下至完全凍結(jié)，然后取出置室溫中融化，反復(fù)凍
融；
6)將上述反復(fù)凍融后的勻漿液，離心，取上清液，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值4.5 5，再次離 心，取上清，調(diào)節(jié)PH值至中性；
7)將上述中性上清液先經(jīng)紙漿板過(guò)濾，得到的濾液用截留分子量100000的中空纖維 超濾柱超濾，得到的濾液再用截留分子量10 000超濾膜超濾，得到的濾液最后經(jīng)過(guò)濾菌膜 過(guò)濾；
8)取除菌后的濾液測(cè)蛋白含量，凍干，得到胸腺肽成品。步驟3)中在0°C 4°C下放置時(shí)間為36h 48h，在_18°C _25°C下放置時(shí)間為 36h 48h。步驟5)中所述的低溫為-15°C -20°C。步驟6)中所述的離心溫度均為4°C。步驟7)中所述的濾菌膜的孔徑為0. 22 μ m。
本發(fā)明的有益效果1)采用pH3 3. 5的緩沖液進(jìn)行洗滌，有效地抑制了酶的活性。2)勻漿液在0°C 4°C條件下放置36h 48h后，然后在_18°C _25°C條件下放 置36h-48h，以防止胸腺肽突然進(jìn)入低溫而導(dǎo)致胸腺肽的活性下降。3)采用低溫勻漿和低溫離心，一方面有利于抑制酶的活性，另一方面保持胸腺肽 的活性。4)采用低pH值進(jìn)行勻漿，有利于胸腺細(xì)胞的完全破碎。5)用鹽酸將勻漿液的PH值調(diào)至為4. 5 5，可使雜蛋白沉淀，抑制酶對(duì)胸腺肽的 破壞，提高胸腺肽的活性。6)采用超濾膜能進(jìn)一步的除去雜質(zhì)和細(xì)菌，產(chǎn)品的合格率提高，胸腺肽的含量得 到提高。
具體實(shí)施例方式取Ikg新鮮的小牛胸腺，去除脂肪及結(jié)締組織，用pH3 3. 5的緩沖液洗滌干凈， 加入1000 mL的pH3. 5 4的緩沖液，在8°C 10°C下，用勻漿機(jī)以10000 rpm/min速度勻 漿10 min，直到變成乳白色液體；得到的勻漿液先在0°C 4°C條件下放置36h 48h，然后 在-18°C _25°C條件下放置36h 48h，將凍結(jié)的勻漿液放入70 80°C水浴鍋中，恒溫加 熱10 min 15min ；迅速取出勻漿液放在_15°C _20°C條件下至完全凍結(jié)，然后取出放室 溫融化，反復(fù)凍融3次；在4°C條件下，7000rpm/min離心20 min,取上清液，用稀鹽酸調(diào)pH 值至4. 5 5，再次在4°C條件下，7000rpm/min離心20 min，取上清液，用4 mol/ L NaOH 調(diào)節(jié)PH值至中性；取中性上清液經(jīng)紙漿板過(guò)濾，濾液用截留分子量100 000的中空纖維超 濾柱超濾，得到的濾液再經(jīng)過(guò)截留分子量10 000超濾膜超濾，得到的濾液經(jīng)過(guò)孔徑為0. 22 μ m濾菌膜過(guò)濾，取除菌后的濾液測(cè)蛋白含量，凍干，得到胸腺肽成品。測(cè)定胸腺肽含量為 16. 21mg/ml，胸腺肽α 1含量為3. 2%。體外玫瑰花結(jié)實(shí)驗(yàn)，樣品稀釋到0. 002mg/ml，活性增 加 37. 5%ο
權(quán)利要求
一種胸腺肽的制備方法，其特征在于所述的制備方法包括以下步驟1)取新鮮的胸腺，用pH3～3.5的緩沖液洗滌干凈；2)加入pH3.5～4.0緩沖液，在8℃～10℃的條件下，用勻質(zhì)機(jī)勻漿,得到勻漿液；3)將上述勻漿液先放置在0℃～4℃條件下，然后再放置到 18℃～ 25℃條件下；4)將凍結(jié)后勻漿液在70～80℃的水浴鍋中加熱10 min～15min； 5)迅速將上述勻漿液放在低溫條件下至完全凍結(jié)，然后取出置室溫中融化，反復(fù)凍融； 6)將上述反復(fù)凍融后的勻漿液，離心，取上清液，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值4.5～5，再次離心，取上清，調(diào)節(jié)pH值至中性；7)將上述中性上清液先經(jīng)紙漿板過(guò)濾，得到的濾液用截留分子量100 000的中空纖維超濾柱超濾，得到的濾液再經(jīng)過(guò)截留分子量10 000 超濾膜超濾，得到的濾液最后經(jīng)過(guò)濾菌膜過(guò)濾；8)取除菌后的濾液測(cè)蛋白含量，凍干，得到胸腺肽成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胸腺肽的制備方法，其特征在于步驟3)中在0°C 4°C下 放置時(shí)間為36h 48h，在-18°C _25°C下放置時(shí)間為36h 48h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胸腺肽的制備方法，其特征在于步驟5)中所述的低溫 為-15°C -20°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胸腺肽的制備方法，其特征在于步驟6)中所述的離心溫度 均為4°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胸腺肽的制備方法，其特征在于步驟7)中所述的濾菌膜的 孔徑為0. 22 μ m。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種胸腺肽的制備方法，其制備步驟為用pH3.5-4.0的緩沖液將胸腺洗滌干凈，再加入pH3.5～4.0的緩沖液低溫勻漿，制成胸腺勻漿液；得到的勻漿液經(jīng)過(guò)熱變性離心去除雜蛋白，然后用鹽酸調(diào)節(jié)上清液pH值至4.5-5，再次離心，調(diào)節(jié)上清液pH值至中性；得到的中性上清液經(jīng)過(guò)不同的濾膜過(guò)濾，除去雜質(zhì)和細(xì)菌，凍干，得到胸腺肽成品。本發(fā)明具有可提高胸腺肽的活性及得率，降低生產(chǎn)成本的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/34GK101921331SQ20101025543
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月17日
發(fā)明者吳紅云, 霍軍峰, 韓改會(huì) 申請(qǐng)人:鄭州后羿制藥有限公司