專利名稱：一種粘膜佐劑及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，尤其涉及ー種粘膜佐劑及其制備和應(yīng)用，特別是ー種殼寡糖遞送系統(tǒng)組裝的粘膜佐劑及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
當(dāng)前導(dǎo)致難以攻克的嚴(yán)重感染性疾病的病原體如人類免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、結(jié)核分枝桿菌等均通過粘膜表面(生殖道、呼吸道、胃腸道)入侵和感染機(jī)體，由于機(jī)體不能誘導(dǎo)有效的粘膜免疫應(yīng)答，不能在感染第一時間和地點清除粘膜感染病原體，使病原體迅速擴(kuò)散入血、進(jìn)而侵犯全身，造成機(jī)體損傷；同時發(fā)展為慢性感染，導(dǎo)致嚴(yán)重疾病。對于經(jīng)粘膜感染病原體，如能誘導(dǎo)粘膜局部(呼吸道、胃腸道、生殖道)的特異性粘膜免疫應(yīng)答，特別是SlgA的分泌，則可能在感染初期有效中和病毒或細(xì)菌，避免病原體入血而后感染全身器官，從而阻止嚴(yán)重疾病如病毒性心肌炎和慢性結(jié)核的發(fā)生。因此急需 可誘導(dǎo)粘膜SlgA分泌的粘膜疫苗的研制。已知常規(guī)疫苗如滅活、減毒疫苗、蛋白疫苗、DNA疫苗等等經(jīng)常規(guī)途徑(肌肉注射、皮下)免疫等通常不能誘導(dǎo)特異性粘膜免疫。無論疫苗的形式，通常靶抗原需要經(jīng)粘膜部位接種，才能被粘膜APC攝取提呈,激活粘膜相關(guān)免疫系統(tǒng)(Mucus-associated Iymphotissue, MALT)，誘導(dǎo)粘膜免疫。然而，粘膜部位接種抗原通常很難誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，由于粘膜局部纖毛的頻繁擺動、水解酶、DNA酶的大量存在，使得外來抗原迅速降解，不足以被粘膜APC提呈。因此需要通過粘膜遞送系統(tǒng)來對疫苗進(jìn)行組裝，而后行粘膜免疫。針對抗粘膜感染病原體粘膜疫苗研制的重要性，以及粘膜免疫的技術(shù)難點，粘膜疫苗首先必需安全和有效的粘膜遞送系統(tǒng)，來遞送靶抗原疫苗(如基因疫苗)。該系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)滿足安全無毒性、緩釋性、親粘膜性、通用性；其次必需添加粘膜佐劑，有效增強(qiáng)粘膜免疫的誘導(dǎo)?？滤_奇病毒性心肌炎主要由B3型柯薩奇病毒(CVB3)感染所致，青壯年發(fā)病較高，可導(dǎo)致約50%的人類急慢性心肌炎和25%擴(kuò)張性心肌病的發(fā)生，是ー常見、多發(fā)的心血管系統(tǒng)疾病。CVB3屬于腸道病毒，通過胃腸道入侵機(jī)體后，由于腸道SlgA不能在感染早期及時清除病毒，使病毒迅速擴(kuò)散入血、進(jìn)而侵犯心臟和胰腺等器官，導(dǎo)致病毒性心肌炎和胰腺炎；CVB3的持續(xù)性感染還可能導(dǎo)致致死性擴(kuò)張性心肌病的發(fā)生，危害嚴(yán)重。目前尚無有效的柯薩奇病毒性心肌炎預(yù)防和治療疫苗問世。我們前期的研究制備了ー種病毒性心肌炎基因疫苗pcDNA3. I-VPl (pVPl)，編碼CVB3主要結(jié)構(gòu)抗原VPl (852bp)，該疫苗經(jīng)肌注免疫，可有效誘導(dǎo)全身性的(脾臟和淋巴結(jié))的特異性T細(xì)胞應(yīng)答和血清IgG分泌，具有中等的免疫保護(hù)效果。直接將該基因疫苗進(jìn)行滴鼻免疫，發(fā)現(xiàn)僅能誘導(dǎo)較弱的粘膜免疫(腸道slgA)，原因與基因在粘膜局部很容易被降解，有效表達(dá)的抗原量過低有夫。因此我們前期研究以天然生物多糖-脫こ酰殼聚糖(chitosan)為粘膜遞送載體介質(zhì)，以特殊的殼聚糖溶液經(jīng)與特定濃度的基因疫苗DNA，經(jīng)共價復(fù)合，獲得chitosan-pVPl病毒性心肌炎粘膜基因疫苗。該申請已被授予國家發(fā)明專利(專利授權(quán)號ZL200710171416.X)。以該粘膜基因疫苗為研究出發(fā)點，為了更好地誘導(dǎo)特異性粘膜免疫，延長抗原在粘膜局部的潴留時間、增強(qiáng)粘膜局部對抗原的提呈，必須還要使用良好的粘膜佐劑。淋巴細(xì)胞趨化因子(lymphotactin，LTN)是C族趨化因子，由活化的⑶8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞和表皮內(nèi)γ δ T細(xì)胞分泌，在維持粘膜完整性和增強(qiáng)粘膜免疫中發(fā)揮重要作用。同時對CD8+T和NK細(xì)胞具有重要的趨化作用，因此對清除病毒感染至關(guān)重要。更為重要的是，LTN可激活粘膜及脾臟內(nèi)CD4+T細(xì)胞，促使其分泌大量Thl或Th2細(xì)胞因子，有效輔助T細(xì)胞或B細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此LTN通過激活CD4+T細(xì)胞，可同時促進(jìn)固有免疫與獲得性免疫的誘導(dǎo)，同時又由于共同粘膜免疫系統(tǒng)性質(zhì)，促進(jìn)粘膜免疫和全身免疫的誘導(dǎo)。已有研究顯示LTN與蛋白質(zhì)抗原聯(lián)合鼻內(nèi)注射后増加slgA分泌。因此，本發(fā)明選擇LTN作為粘膜佐劑，利用其趨引T細(xì)胞到達(dá)疫苗給予粘膜部位、促進(jìn)CD4+Th應(yīng)答等性質(zhì)，來增強(qiáng)特異性粘膜免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種粘膜佐劑及其制備和應(yīng)用，所述的這種粘膜佐劑配合其他疫苗進(jìn)行粘膜部位(滴鼻、ロ服、經(jīng)生殖道等)免疫，要解決現(xiàn)有技術(shù)中由于常規(guī)疫苗無法有效誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答的技術(shù)問題。本發(fā)明提供了ー種粘膜佐劑，由殼寡糖與編碼質(zhì)粒共聚交聯(lián)復(fù)合而成，所述的編碼質(zhì)粒由ー個載體構(gòu)成，在所述的載體中插入有小鼠來源的淋巴細(xì)胞趨化因子的全長基因，所述的淋巴細(xì)胞趨化因子的全長基因序列如SEQ ID N0:1所示。進(jìn)ー步的,所述的載體為真核表達(dá)質(zhì)粒,所述的真核表達(dá)質(zhì)粒選自pcDNA3. I質(zhì)?；騪VAXl質(zhì)粒中的任意ー種。進(jìn)ー步的，所述的小鼠來源的淋巴細(xì)胞趨化因子的氨基酸序列SEQ ID N0:2所示。進(jìn)ー步的，所述的殼寡糖的分子量在3000 6000之間，脫こ酰度在75% -85%之間。本發(fā)明還提供了上述的ー種粘膜佐劑的制備方法，包括以下步驟(I)構(gòu)建小鼠來源的淋巴細(xì)胞趨化因子編碼質(zhì)粒；(2) 一個制備濃度為O. I O. 4%,PH5. 2-5. 5的殼寡糖溶液的步驟；(3)將上述的殼寡糖溶液與濃度為18 25 μ g/ml、溶解在緩沖液中的編碼淋巴細(xì)胞趨化因子的質(zhì)粒DNA溶液在55-60°C下，以15000-17000rpm速度高速混旋，通過共聚交聯(lián)作用獲得粘膜佐劑，所述的粘膜佐劑的形狀為球形，直徑在250 350nm之間。進(jìn)ー步的，所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明還提供了ー種藥物組合物，含有有效量的上述的粘膜佐劑以及藥學(xué)上接受的載體或者賦形劑。本發(fā)明還提供了上述的ー種粘膜佐劑在制備預(yù)防或治療病毒性心肌炎、或者結(jié)核病的藥物或疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的疫苗可以以滴鼻、ロ服或經(jīng)生殖道方式實施粘膜部位接種。佐劑是配合疫苗聯(lián)合使用的非特異性免疫增強(qiáng)劑，通過以適當(dāng)?shù)姆椒ɑ旌匣蛘呗?lián)合使用，可有效增強(qiáng)疫苗的免疫效果。進(jìn)ー步的，所述的粘膜佐劑的粘膜免疫方法如下I)將殼寡糖-pLTN粘膜佐劑納米顆粒先行滴鼻或ロ服免疫，pLTN質(zhì)粒量為50 100 μ g02) 24小時后，將殼聚糖/殼寡糖-靶抗原納米顆粒在同一部位，以滴鼻或ロ服方式免疫。靶抗原質(zhì)粒量為50 100 μ g。3)間隔I 3周，重復(fù)I)+2)的組合免疫。4)經(jīng)3-4次I) +2)的組合免疫，靶抗原DNA總量約150 200 μ g，可有效誘導(dǎo)血清IgG和粘膜局部(腸道、呼吸道等)slgA的分泌。本發(fā)明采用的殼寡糖(oligo-chitosan),是甲殼類動物來源的天然生物多糖幾丁 質(zhì)(chitin)的脫こ酰衍生物。chitin (幾丁質(zhì)，N-こ酰氨基葡萄糖多聚體)是ー種廣泛存在于蝦、蟹外殼中的天然多糖。chitin與DNA復(fù)合可生成不溶于水的微米顆粒(microparticle),是ー種強(qiáng)效的巨噬細(xì)胞激活劑，井上調(diào)Thl型細(xì)胞免疫。脫こ酸殼多糖(chitosan,化學(xué)名為β _ (I — 4) _2_氛基_2_脫氧-D-匍聚糖)是幾丁質(zhì)(chitin)的脫こ酰衍生物，分子量從120000 400000，完全無毒，具有生物可容性和生物可降解性。chitosan天然帶正電荷,可與帶負(fù)電荷的粘膜或質(zhì)粒DNA通過靜電天然吸附，因此具有增強(qiáng)粘膜黏附吸收作用；此外還具有促進(jìn)胞間運輸、緩釋和生物可降解等多種良好特性，已被廣泛用于藥物賦形劑與緩釋劑。殼寡糖(oligo-chitosan)又名殼聚糖寡糖(chitosanoligosaccharide),由殼聚糖(chitosan)經(jīng)酶解或水解制得，成分為3 10個β - (I — 4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡聚糖寡糖。其最大的特點是具有水溶性，使容易被腸道吸收。此外，它具有激活巨噬細(xì)胞、T、NK細(xì)胞，誘導(dǎo)TNF-α、活性氮、氧中間體(R0I、RNI)產(chǎn)生的特性，因此具有增強(qiáng)Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答和抗胞內(nèi)病毒或細(xì)菌感染潛能。以合適分子量和脫こ酰度的殼寡糖與質(zhì)粒DNA在特定的濃度、溫度、pH值、振蕩速度條件下，可形成大小不一的共聚復(fù)合物。本發(fā)明以特定性質(zhì)的殼寡糖制備特定溶液，與特定的DNA溶液，以共凝聚方法成功制備了直徑在250-350nm的納米顆粒復(fù)合物。選擇0. 4%濃度、PH. 5. 5的殼寡糖(分子量約3000-6000，脫こ酰度75% 85% )溶液，與25 μ g/ml編碼靶抗原的質(zhì)粒DNA(pcDNA3. Ι-pLTN)溶液(IOmM PBS)，在55°C下，以15000rpm速度高速混旋，通過共聚交聯(lián)作用，制備了殼寡糖-粘膜佐劑DNA(pLTN)納米顆粒。經(jīng)冷凍干燥，置-70°C凍存?zhèn)溆?。使用時以無菌PBS溶解，使DNA濃度為lmg/ml。本發(fā)明中，將ο I i go-ch i tosan-pLTN粘膜基因疫苗免疫小鼠的方法采用滴鼻方式，以本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行以常規(guī)小鼠麻酔方法輕度麻酔小鼠，將小鼠鼻孔向上，以槍頭吸取< 20μ I液體直接逐滴滴入鼻腔內(nèi)，待液滴隨小鼠呼吸自主進(jìn)入呼吸道后，再滴下一滴液體?？山惶娴稳雰蓚€鼻孔。液體總體積不宣超過50 μ I。本發(fā)明中，所述的真核表達(dá)質(zhì)粒的載體，包括任何可以轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞的高效真核表達(dá)質(zhì)粒載體，包括但不限于pcDNA3. UpVAX以及常見和市售的真核質(zhì)粒載體。本發(fā)明中，“藥學(xué)上接受的”成分是適用于人和動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激、變態(tài)反應(yīng))、有合理效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。
本發(fā)明中，“藥學(xué)上接受的載體”成分是用于將具有活性的有效成分傳送給人或動物的藥學(xué)上可接受的溶劑、懸浮劑和賦形劑。所述的載體可以是液體、固體或半固體。載體包括但不限于水、PBS緩沖液、生理鹽水、葡萄糖、甘油、疊氮鈉及其組合。本發(fā)明的藥物組合物，含有上述有效成分和藥學(xué)上可接受的載體。通常將其配制于無毒、中性、惰性和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，pH值通常約5-8。綜上所述，本發(fā)明的一種殼寡糖遞送系統(tǒng)組裝的通用粘膜佐劑，具有以下三大特性I)其核心是ー種佐劑質(zhì)粒載體，編碼小鼠來源的淋巴細(xì)胞趨化因子(lymphotactin, LTN)基因。2)通過具有特定化學(xué)性質(zhì)的有市售的殼寡糖(oligo-chitosan),與上述pLTN質(zhì)粒DNA形成共聚復(fù)合物后，再通過粘膜途徑接種該粘膜佐劑，具有安全無毒性、緩釋性、親 粘膜性等多種優(yōu)勢，可促進(jìn)粘膜局部抗原提呈細(xì)胞和T細(xì)胞等的激活。3)該通用粘膜佐劑通過優(yōu)化免疫途徑、免疫程序、免疫劑量、間隔時間，與殼聚糖/殼寡糖系統(tǒng)遞送的靶抗原基因疫苗(如病毒性心肌炎基因疫苗chitosan-pVPl或者結(jié)核基因疫苗chitosan-pECANS)共同免疫后，能有效增強(qiáng)全身和粘膜部位的slgA抗體和T細(xì)胞應(yīng)答。申請人:以已獲得授權(quán)的基于殼聚糖(chitosan)的病毒性心肌炎基因疫苗(ー種病毒性心肌炎基因疫苗及其制備方法和應(yīng)用。專利授權(quán)號ZL200710171416.X)為基礎(chǔ)，
選擇淋巴細(xì)胞趨化因子(lymphotactin, LTN)為佐劑，以殼聚糖的衍生物------具有特定 性質(zhì)的天然多糖------殼寡糖(oligo-chitosan)作為新的粘膜佐劑遞送載體介質(zhì),通過
共聚沉淀的方法與LTN編碼質(zhì)粒形成殼寡糖-pLTN納米顆粒復(fù)合物，制備新型粘膜佐劑。實際應(yīng)用吋，將殼寡糖-粘膜佐劑復(fù)合物與殼聚糖/殼寡糖-靶抗原質(zhì)粒復(fù)合物疫苗(如chitosan-pVPl病毒性心肌炎基因疫苗)進(jìn)行共免疫，證實可顯著增強(qiáng)粘膜局部粘膜免疫應(yīng)答(slgA，T細(xì)胞免疫)的誘導(dǎo)，可顯著增強(qiáng)了以往發(fā)明的殼聚糖-基因疫苗的免疫保護(hù)效果。本發(fā)明和已有技術(shù)相比,其效果是積極和明顯的。本發(fā)明的oligo-chitosan-pLTN通用粘膜佐劑通過滴鼻免疫，并與chitosan-pVPl病毒性心肌炎基因疫苗共免疫后，可有效誘導(dǎo)針對VPl抗原特異性全身(脾臟和淋巴結(jié))特異性Thl性免疫應(yīng)答和抗體應(yīng)答；更重要的是，顯著增強(qiáng)了腸道粘膜局部分泌性slgA和分泌IFNy的Thl應(yīng)答，效果顯著優(yōu)于未給予粘膜佐劑的chitosan-pVPl基因疫苗，可使免疫小鼠更加有效抵抗CVB3感染，不發(fā)生病毒性心肌炎。


圖I是pVPl質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖㈧和pVPl質(zhì)粒的PCR及酶切鑒定電泳圖⑶；其中M為DNA marker ；1為pcDNA3_VPl經(jīng)Hindlll/BamHI雙酶切;2 5分別為PCR鑒定，2 T7u/T7d 引物；3 KV1/KV2 引物；4 T7-1/KV2 引物；5 KVl/T7-2 引物。圖2顯示了 pVPl質(zhì)粒的體外表達(dá)和趨化活性，顯示了 pVPl質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后表達(dá)產(chǎn)物的western Blot鑒定(33KD)。圖3顯示了 pLTN質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖(A)和pLTN質(zhì)粒的PCR及酶切鑒定電泳圖(B);其中 I =Marker, 2 =ConA 活化脾細(xì)胞 RT-PCR 擴(kuò)增 LTN, 3 pcDNA3. I-LTN PCR 擴(kuò)增 LTN,
4pcDNA3. I-LTN經(jīng)BamH I 和Xho I 雙酶切，5 pcDNA3. I-LTN-BamH I 單酶切，6 pcDNA3. I經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切鑒定。圖4顯示了 pLTN質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后表達(dá)產(chǎn)物的western Blot鑒定(14KD)。圖5顯示了 pLTN質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的體外趨化功能。圖6顯示了殼寡糖(oligo-chitosan)與pLTN質(zhì)粒形成的共聚復(fù)合物的示意圖。圖7是殼寡糖(oligo-chitosan)-pLTN納米顆粒的掃描電鏡照片。圖8是殼聚糖(chitosan)-pVPl納米顆粒的掃描電鏡照片。
圖9顯示了 chitosan-pVPl祀抗原納米顆粒聯(lián)合oligo-chitosan-pLTN粘膜佐劑滴鼻免疫誘生的CVB3特異性血清IgG。圖10顯示了 chitosan-pVPl祀抗原納米顆粒聯(lián)合oligo-chitosan-pLTN粘膜佐劑滴鼻免疫誘生的CVB3特異性腸道slgA。圖11顯示了 chitosan-pVPl祀抗原納米顆粒聯(lián)合oligo-chitosan-pLTN粘膜佐劑滴鼻免疫誘生的脾臟淋巴細(xì)胞CVB3特異性IFN Y +Thl細(xì)胞應(yīng)答。圖12顯示了 chitosan-pVPl祀抗原納米顆粒聯(lián)合oligo-chitosan-pLTN粘膜佐劑滴鼻免疫誘生的腸系膜淋巴結(jié)CVB3特異性IFN Y +Thl細(xì)胞應(yīng)答。圖13顯示了 3XLD50劑量CVB3感染小鼠7天后小鼠心肌組織的心肌炎病理情況，其中 A代表 chi-VPl+oligo-chitosan-LTN i. η ;Β 代表 chi-VPl+oligo-chitosan i. n ;C代表 pcDNA3-VPl i. n ；D 代表 pcDNA3. I i. η。
具體實施例方式以下是本發(fā)明的具體實施例，所述的實施例是用于描述本發(fā)明的使用和用途，而不是限制本發(fā)明。實施例中采用的質(zhì)粒、菌種、細(xì)胞、動物及試劑如下CVB3(Nancy株)由中山醫(yī)院衛(wèi)生部病毒性心臟病重點實驗室楊英珍教授惠贈。質(zhì)粒pcDNA3. l(-)、pVAX、宿主細(xì)菌DH5a (Invitrogen公司)。基因合成(上海賽百盛公司)。oligo-chitosan (分子量在3000 6000之間，脫こ酰度為75% -85% )購自合肥博美生物有限公司、小鼠IFN-Y ELISA檢測試劑盒購自R&D公司；HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG/IgA多克隆抗體(Southern Biothech公司);多肽委托上海吉爾公司合成、Lipofectamin-2000購自invitrogen公司。限制性核酸內(nèi)切酶HindIII、BamHI、Xho I、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、dNTP (TaKaRa公司);RNase A (Ameresco公司);LB培養(yǎng)基(英國0X0ID公司)，Tris(USB公司)，瓊脂糖膠回收試劑盒(上海華舜公司)，大量質(zhì)粒抽提試劑盒(Qiagen)。6-8周齡雄性BALB/c (H-2d)小鼠購自上海斯萊克實驗動物中心，清潔級飼養(yǎng)。動物飼養(yǎng)及操作符合國家相關(guān)規(guī)定。實施例I pcDNA3. Ι-pVPl靶抗原基因疫苗的構(gòu)建及體外表達(dá)I)自新鮮培養(yǎng)的CVB3中經(jīng)RT-PCR獲得CVB3 VPl基因。根據(jù)文獻(xiàn)報道的CVB3 Nancy 毒株 VPl cDNA 序列(Klump WM, et al. Complete nucleotide sequenceof infectious Coxsackievirus B3 cDNA J Virol, 1990,64(4) : 1573),設(shè)計 VPl 上下游引物KVl :5 ' -CCCAAGCTTGCCACCATGGGCCCAGTGGAAGACGCG-3 ' ；KV2 5 ' -CGGGATCCTTACTAAAATGCGCCCGTATTTGTC-3 '。并合成pcDNA3. I載體中克隆位點上下游引物T7-1 5' -CGATGAAGATCTCT-3' ；T7-2 5/ -CGATGAAGATCTCT-3'。按上海華舜生物公司 RNAexReagent&System Kit提取液相病毒RNA。按上海生エ生物公司2_N First Strand cDNASynthesis Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。隨后以KV1、KV2引物進(jìn)行特異PCR，產(chǎn)物即為VPl基因，長度為 852bp (圖 I)。以 Golden Beads DNA Gel Purification Kit 純化回收，回收DNA以HindIII、BamHI雙酶切，而后與經(jīng)同樣雙酶切的pcDNA3. I連接。分別經(jīng)PCR、酶切和DNA測序鑒定。以T7-1/T7-2為正反向引物獲得1067bp片段；以KV-1/KV-2為正反向引物PCR擴(kuò)增可得到884bp條帶。以Hind III和Bam HI對pcDNA3. I-VPl進(jìn)行雙酶切，可切出877bp條帶。最終由上海申友DNA測序服務(wù)中心進(jìn)行DNA測序鑒定，證實構(gòu)建正確。2)pcDNA3-VPl 的體外表達(dá)以 Lipofactamine -2000 輔助 pcDNA3_VPl 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞2ul Lipofectamine 與 45 μ I 1640 混勻室溫 5min，I μ g 質(zhì)粒 DNA 與 50 μ I1640 混勻室溫 5min，二者混勻，室溫 20min ;將 100 μ I DNA-Lipofectamine -2000 復(fù)合物逐滴加入細(xì)胞上。37°C 6% CO2培養(yǎng)。收集72小時細(xì)胞培養(yǎng)上清，經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白表達(dá)產(chǎn)物，轉(zhuǎn)膜，而后以抗VPl特異性抗體孵育并染色，結(jié)果顯示pcDNA3. Ι-pVPl質(zhì)?？稍隗w 外有效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物為33KD(圖2)。實施例2 pcDNA3. I-LTN粘膜佐劑質(zhì)粒的構(gòu)建和體外表達(dá)I)自ConA活化的小鼠脾細(xì)胞經(jīng)RT-PCR獲得LTN基因。取正常BALB/c小鼠脾臟
5X IO6個,抽提細(xì)胞總RNA。按上海生エ生物公司2_N First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)NCBI GeneBank中LTN的基因序列(NM_008510. I)，設(shè)計LTN上下游引物L(fēng)TN-1 5/ -5’ CGGGATCCGCCACCATGAGACTTCTCCTCCT-3> 其 5’ 端添加 BamH I 酶切位點；LTN-2 5' -CCGCTCGAGGGAGGCTGTTACCCAGT-3，其 3’端添加 Xho I 酶切位點。以上述引物行PCR，獲得趨化因子Ltn編碼基因(376bp)(圖3)。RT-PCR產(chǎn)物以Golden BeadsDNA Gel Purification Kit純化回收，以BamHI、Xho I雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的pcDNA3. I連接。以Ltn-l/Ltn-2引物可擴(kuò)增得到376bp條帶;以Xho I和Bam HI對pcDNA3. I-LTN進(jìn)行雙酶切，可切出369bp條帶；最終由上海申友DNA測序服務(wù)中心進(jìn)行DNA測序鑒定，證實構(gòu)建正確。2) pcDNA3-LTN 的體外表達(dá)以 Lipofactamine -2000 輔助轉(zhuǎn)染 pcDNA3_LTN 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞37°C 6% CO2培養(yǎng)。收集72小時細(xì)胞培養(yǎng)上清，經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白表達(dá)產(chǎn)物，轉(zhuǎn)膜，而后以抗LTN特異性抗體孵育并染色，結(jié)果顯示pcDNA3. l_pLTN質(zhì)?？稍袤w外有效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物為14KD(圖4)。實施例3 pcDNA3. I-LTN粘膜佐劑質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的體外趨化活性將穩(wěn)轉(zhuǎn)pcDNA3. I-LTN上清以PEG20000濃縮20-25倍，加入48孔趨化池(美國Neuro probe公司)中；5 μ m濾膜覆蓋在小室上，將45 μ I正常脾細(xì)胞懸液(2*106/ml)加入上室中孵育4小吋。取出濾膜，瑞氏姬姆薩染色，計數(shù)趨化細(xì)胞并計算趨化指數(shù)(Cl)。結(jié)果顯示pcDNA3. I-LTN穩(wěn)轉(zhuǎn)293T細(xì)胞上清可有效趨化脾細(xì)胞跨膜移動，Cl = 2. 875 ;而對照pcDNA3. I質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上清或正常細(xì)胞上清則無趨化活性，Cl < I。當(dāng)用抗LTN中和性抗體預(yù)先與轉(zhuǎn)染上清孵育后，趨化活性顯著被抑制，Cl = I. 05，提示LTN表達(dá)產(chǎn)物具有較好的特異性趨化脾臟免疫細(xì)胞活性(圖5)
實施例4殼寡糖(oligo-chitosan)-pLTN粘膜佐劑納米顆粒的制備I)質(zhì)粒DNA的大量制備依照QIAGEN Plasmid Mega Kit去除雜蛋白、細(xì)菌內(nèi)毒素，得到純化質(zhì)粒。2)分別制備oligo-chitosan溶液和pcDNA3. I-LTN溶液，方法如下首先制備0. 4% >pH5. 5 的 oligo-chitosan溶液，稱取 0. 4g 殼寡糖 oligo-chitosan (MW約 3000-6000,脫こ酰度75% -85% )，先以100ml IOmM的PBS將其緩慢溶解，37°C放置Ihr。0. 4 μ m的濾膜過濾而后保存?zhèn)溆?。pcDNA3. Ι-pLTN質(zhì)粒以IOmM PBS溶解，DNA濃度為25 μ g/ml，_20°C保存?zhèn)溆谩?)共沉淀法(共凝聚法)制備oligo-chitosan-DNA納米顆粒,方法如下在55で水浴中，將0. 4%、pH5. 5的oligo-chitosan溶液逐滴滴入25ug/ml質(zhì)粒DNA溶液中，同時15000rpm高速振蕩30秒，即可形成均一略帶混池的oligo-chitosan-DNA納米顆粒(圖6)。掃描電鏡證實該復(fù)合物顆粒的直徑約為250-350nm(圖7)。而后將該溶液冷凍干燥，繼而用無菌PBS溶解為lmg/ml的濃度，按50 μ gDNA/50ul的量滴鼻免疫小鼠。 實施例5殼聚糖(chitosan)-VPl納米顆粒的制備I)首先制備 0. 02%、ρΗ5· 7 的 chitosan 溶液，稱取 0. 02g chitosan(Fluka,MW =400000，脫こ酰度75% -85% )，先以500 μ I Iml I % HAc溶液將其緩慢溶解，37°C放置Ihr0而后稱取0. 042g NaAc，以80ml H2O溶解，加入上述已徹底溶解的chitosan溶液，混勻后，以 IN NaOH 調(diào)節(jié) pH 值至 5. 7 等，此即 0. 02%、ρΗ5· 7 的 chitosan 溶液。pcDNA3. I-VPl質(zhì)粒以5mM Na2SO4溶解，DNA濃度為lmg/ml，_20°C保存?zhèn)溆谩?)采用共沉淀法(共凝聚法)制備chitosan-DNA納米顆粒,方法如下在55で水浴中，將0. 02% >pH5. 7的chitosan溶液逐滴滴入400ug/ml質(zhì)粒DNA溶液中，同時15000rpm高速振蕩20秒，即可形成均一略帶混池的chitosan-DNA納米顆粒。3)以掃描電鏡觀察新鮮制備的chitosan-VPl共凝聚復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)新鮮制備的溶液均勻分布球型、形態(tài)均一的顆粒，直徑約為150 250nm(圖8)。實施例6殼寡糖-pLTN粘膜佐劑與殼聚糖-pVPl病毒性心肌炎粘膜基因疫苗共同滴鼻免疫BALB/c小鼠將6-8 周齡 BALB/c 雄鼠分為 4 組，分別為chitosan-pVPl+oligo_chitosan-pLTN、chitosan-pVPl+oligo-chitosan、pcDNA3. 1-pVPl (簡稱 pVPl)、pcDNA3. I 組，姆組 8 只小鼠。滴鼻免疫程序如下以0. 75%戊巴比妥鈉80-120 μ I經(jīng)腹腔注射小鼠，使輕微麻酔。以含有50 μ g質(zhì)粒DNA的復(fù)合物溶液逐滴滴入小鼠兩側(cè)鼻腔。先以oligo-chitosan-pLTN納米顆粒或oligo-chitosan溶液滴鼻免疫小鼠；24小時后，將含50 μ g質(zhì)粒DNA的chitosan-pVPl納米顆?；騪VPl質(zhì)粒滴鼻免疫小鼠。以該程序于O周、2周、4周、6周四次滴鼻免疫小鼠。隔周采集血液及糞便樣品。經(jīng)眼眶后眥靜脈采血，37°C靜置30min，4000rpmX IOmin,收集血清,分裝凍存于-70°C。隔周收集小鼠新鮮糞便，以100mg/ml濃度溶解于含5%脫脂牛奶、lug/mlaprotinin、lmM PMSF的PBS溶液中，室溫放置I 2hr，以15000rpm/min 離心 IOmin 后分裝 200 μ I/ 管，-70°C凍存。實施例7殼寡糖-pLTN粘膜佐劑與殼聚糖-pVPl病毒性心肌炎粘膜基因疫苗滴鼻免疫可增強(qiáng)特異性slgA抗體應(yīng)答I)間接ELISA法檢測免疫小鼠血清特異IgG水平。以10 μ g/ml CVB4VP123卜249多肽(O. 1% BSA，0· IM Na2CO3, ρΗ9· 6包被液)包被聚苯こ烯微孔板(costar)4°C過夜。以5%11^讓^^5封閉板，20(^1/孔，37で211。依次加I : 100 ;I 1000稀釋血清及糞便溶液原液、10(^1/孔，37で2h，洗板后加HRP-羊抗小鼠IgG、IgA 37°C lh，洗板后以TMB顯色15min，2N H2SO4終止反應(yīng)后測A45tl值。chitosan-VPl聯(lián)合oligo-chitosan-LTN組在4周即可誘生了較高水平的特異性IgG,第6周OD值達(dá)0. 82，且隨時間推移IgG水平逐漸升高，抗體水平在第10周時達(dá)I. 2。而單獨chitosan-VPl僅在第6周開始誘生血清IgG,且OD為0. 46,第10周IgG水平達(dá)0. 8,明顯低于前者。2)糞便中SlgA的分泌代表腸道局部粘膜分泌型抗體的誘導(dǎo)。發(fā)現(xiàn)僅有殼聚糖組裝的PVPl基因疫苗誘導(dǎo)了 slgA分泌。單獨chitosan-pVPl組第8周OD值，最高為0. 68 ； 而oligo-chitosan-pLTN粘膜佐劑共免疫誘導(dǎo)的slgA效價水平顯著增高,第10周達(dá)到0. 96，顯著高于其他組(圖9，P < 0. 05)?？傊?，殼寡糖-pLTN粘膜佐劑滴鼻免疫有助于粘膜疫苗誘導(dǎo)增強(qiáng)的特異性全身和粘膜抗體應(yīng)答。提示oligo-chitosan-LTN粘膜佐劑輔助chitosan-pVPl聯(lián)合免疫,不僅可誘生高水平血清IgG,還增強(qiáng)chitosan-VPl粘膜疫苗誘導(dǎo)的腸道slgA，可有效發(fā)揮粘膜佐劑效果(圖10)。實施例8殼寡糖-pLTN粘膜佐劑與殼聚糖-pVPl病毒性心肌炎粘膜基因疫苗滴鼻免疫可增強(qiáng)特異性粘膜局部(腸道)Thl免疫應(yīng)答取末次免疫后2周小鼠脾臟及腸系膜淋巴結(jié)(MLN)細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，體外以10 μ g/ml重組VPl蛋白刺激培養(yǎng)48h，行IFN-Y的ELISP0T檢測。如圖11、12所示chitosan對照組僅產(chǎn)生極少量的IFN- Y分泌T細(xì)胞；chi_pVPl組分別在脾臟和MLN淋巴細(xì)胞中產(chǎn)生了 260 和 148 個 IFN-Y 分泌 T 細(xì)胞(P < 0. 05) ；chi-pVPI +οIigo-chi-pLTN共免疫組IFN-Y生成T細(xì)胞數(shù)量最多，脾臟和腸系膜淋巴結(jié)中每IO6個淋巴細(xì)胞可形成354個和224個斑點，與其它組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P <0.05)。提示滴鼻給予粘膜佐劑oligo-chi-pLTN促進(jìn)了全身及粘膜部位Thl免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。實施例9 粘膜佐劑oligo-chitosan-LTN可顯著增強(qiáng)病毒性心肌炎粘膜疫苗chitosan-pVPl預(yù)防柯薩奇病毒性心肌炎的效果將上述各疫苗分別免疫20只BALB/c小鼠，末次疫苗免疫后2周，以致病毒性心肌炎感染劑量3xLD50活CVB3病毒IOOul經(jīng)腹腔感染小鼠，7天后取小鼠左心室，制備石蠟切片，HE染色后以普通光鏡觀察其組織病理學(xué)改變。心肌細(xì)胞HE染色顯示未免疫小鼠和chit0San-pcDNA3. I對照組小鼠心肌細(xì)胞呈嚴(yán)重的灶性壞死，伴彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤，顯示顯著的柯薩奇病毒性心肌炎。chitosan-VPl滴鼻小鼠的心肌細(xì)胞間質(zhì)偶爾見有水腫，心外膜有少量炎性浸潤，病毒性心肌炎發(fā)病率約為16% ;而chitosan-VPl聯(lián)合粘膜佐劑oligo-chitosan-LTN納米顆粒滴鼻免疫組僅5%小鼠發(fā)病，發(fā)病程度非常輕微，其余小鼠心肌幾乎和正常小鼠一祥，提示可95%有效預(yù)防病毒性心肌炎的發(fā)生(圖13)。
權(quán)利要求
1.ー種粘膜佐劑，其特征在干由殼寡糖與編碼質(zhì)粒共聚交聯(lián)復(fù)合而成，所述的編碼質(zhì)粒由ー個載體構(gòu)成，在所述的載體中插入有小鼠來源的淋巴細(xì)胞趨化因子的全長基因，所述的淋巴細(xì)胞趨化因子的全長基因序列如SEQ ID N0:1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種粘膜佐劑，其特征在于所述的載體為真核表達(dá)質(zhì)粒，所述的真核表達(dá)質(zhì)粒選自pcDNA3. I質(zhì)?；騪VAXl質(zhì)粒中的任意ー種。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種粘膜佐劑，其特征在于所述的小鼠來源的淋巴細(xì)胞趨化因子的氨基酸序列SEQ ID NO :2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種粘膜佐劑，其特征在于所述的殼寡糖的分子量在3000 6000之間，脫こ酰度在75% -85%之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種粘膜佐劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)一個構(gòu)建小鼠來源的淋巴細(xì)胞趨化因子編碼質(zhì)粒的步驟； (2)一個制備濃度為O. I O. 4%,PH5. 2-5. 5的殼寡糖溶液的步驟； (3)將上述的殼寡糖溶液與濃度為18 25μ g/ml、溶解在緩沖液中的編碼淋巴細(xì)胞趨化因子的質(zhì)粒DNA溶液在55-60°C，以15000-17000rpm速度高速混旋，通過共聚交聯(lián)作用獲得粘膜佐劑，所述的粘膜佐劑的形狀為球形，直徑在250 350nm之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的ー種粘膜佐劑的制備方法，其特征在于所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液。
7.—種藥物組合物，其特征在于含有有效量的權(quán)利要求I所述的粘膜佐劑以及藥學(xué)上接受的載體或者賦形劑。
8.權(quán)利要求I所述的ー種粘膜佐劑在制備預(yù)防或治療病毒性心肌炎、或者結(jié)核病的藥物或疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種粘膜佐劑，由殼寡糖與淋巴細(xì)胞趨化因子編碼質(zhì)粒共聚交聯(lián)復(fù)合而成。本發(fā)明還公開了這種粘膜佐劑的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的粘膜佐劑，當(dāng)與經(jīng)殼聚糖或殼寡糖組裝的基因疫苗共滴鼻免疫時，可誘導(dǎo)柯薩奇病毒特異性血清抗體和全身(脾臟和淋巴結(jié))Th1型免疫應(yīng)答；更重要的是，能誘導(dǎo)腸道粘膜局部增強(qiáng)的特異性分泌型sIgA和IFNγ+Th1應(yīng)答，效果顯著優(yōu)于裸露的基因疫苗，并可有效預(yù)防柯薩奇病毒性心肌炎的發(fā)生。因此具有作為新型粘膜疫苗佐劑的潛力。
文檔編號A61K47/36GK102688488SQ20111007278
公開日2012年9月26日 申請日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月24日
發(fā)明者岳艷, 徐薇, 熊思東 申請人:復(fù)旦大學(xué)