一株抗百菌清單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】一株抗百菌清單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明的一株抗百菌清單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D號(hào)，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo.9304。通過(guò)百菌清完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過(guò)背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。將高效價(jià)IC50的小鼠的脾細(xì)胞通過(guò)PEG方法與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA篩選和三次亞克隆，得到一株雜交瘤細(xì)胞株D號(hào)。此細(xì)胞株D號(hào)分泌的單克隆抗體，對(duì)百菌清具有較好的特異性和檢測(cè)靈敏度（IC50值為1.5μg/L），可以用于食品安全中百菌清的殘留檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一株抗百菌清單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株抗百菌清單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]百菌清是一種廣譜有機(jī)氯殺菌劑，對(duì)各種農(nóng)作物及各種綠化草坪等的真菌病害具有預(yù)防作用。百菌清沒(méi)有內(nèi)吸傳導(dǎo)作用，但一但噴到植物體上之后，就能在其體表具有良好的黏著性，不易被雨水沖 刷掉，因此藥效期較長(zhǎng)，再加上其廣泛使用，因此，百菌清及其代謝產(chǎn)物在植物與土壤都有較大的殘留，甚至在北極地區(qū)都有檢測(cè)到。
[0003]目前檢測(cè)百菌清的方法主要是氣相色譜法(GC)，液相色譜法(HPLC)，分光光度法、導(dǎo)數(shù)同步熒光法、薄層層析-分光光度法、氣質(zhì)聯(lián)用法等紫外儀器方法，但是這些方法存在操作繁瑣，耗時(shí)，費(fèi)用比較貴等缺點(diǎn)，不能實(shí)現(xiàn)大量樣品的快速檢測(cè)，因此建立一種快速簡(jiǎn)便的百菌清檢測(cè)方法具有重要意義。酶聯(lián)免疫法(ELISA)是一種極為高效、敏感、快速的檢測(cè)方法，檢測(cè)時(shí)對(duì)樣本的純度要求不高而且操作簡(jiǎn)便，適用于大量樣本的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。然而得到高特異性和高特異性的單克隆單體是免疫學(xué)檢測(cè)的前提，其中人工抗原的合成是其中重要的一步。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一株百菌清具有較好特異性和檢測(cè)靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，其對(duì)百菌清具有較好特異性和檢測(cè)靈敏度，可以用來(lái)建立百菌清的免疫學(xué)檢測(cè)方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案，一株抗百菌清單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D號(hào)，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.9304。
[0006]所述的抗百菌清單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D號(hào)分泌的百菌清單克隆抗體，是通過(guò)抗百菌清單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D號(hào)分泌產(chǎn)生百菌清單克隆抗體。
[0007]所述百菌清單克隆抗體的應(yīng)用，將百菌清單克隆抗體應(yīng)用于百菌清的ELISA添加回收試驗(yàn)，測(cè)得其回收率。
[0008](I)半抗原的合成:稱(chēng)取百菌清原藥 500mg (1.9mmol), KOH 106.6mg (1.9mmol),
6-氨基己酸262mg(2mmol)，將這三種藥物溶于20mL乙醇，60°C反應(yīng)12h，再90°C反應(yīng)12h ；
將反應(yīng)物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，再用20mL水溶解，用鹽酸調(diào)pH至4-5，產(chǎn)生沉淀，將沉淀烘干即為百菌清半抗原CTNH ;用液質(zhì)連用技術(shù)進(jìn)行鑒定與分析；
(2)偶聯(lián)物CTNH-BSA的制備:稱(chēng)取步驟(1)制備的CTNH 35.8mg, EDC 56.9mg, NHS35.6mg,用ImL無(wú)水DMF溶解(稱(chēng)為A液)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)8h ;稱(chēng)取BSA 112mg溶于20mLpH7.2的0.01mol/L PBS中(稱(chēng)為B液)，在室溫條件，逐滴將A液加入到B液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜，即得偶聯(lián)物CTNH-BSA混合液，通過(guò)透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原，并通過(guò)紫外吸收掃描方法鑒定；(3)小鼠的免疫:百菌清完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過(guò)背部皮下注射免疫BALB/c 小鼠；
第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首免與加強(qiáng)免之間間隔一個(gè)月，加強(qiáng)免之間間隔21天。最后一次用百菌清完全抗原(不含佐劑)沖擊免疫；通過(guò)間接ELISA檢測(cè)血清效價(jià)和抑制；
(4)細(xì)胞融合與細(xì)胞株建立:通過(guò)聚乙二醇(PEG4000)法將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，通過(guò)HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用間接ELISA檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞孔，并進(jìn)一步利用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞孔的抑制效果，通過(guò)有限稀釋法對(duì)有最好抑制的陽(yáng)性細(xì)胞孔進(jìn)行三次亞克隆，最終篩選獲得雜交瘤細(xì)胞株D號(hào)；
5)雜交瘤細(xì)胞株性質(zhì)的鑒定:通過(guò)ELISA法測(cè)定靈敏度和特異性。
[0009]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明獲得的抗百菌清單克隆抗體細(xì)胞株D號(hào)，對(duì)百菌清有較好的檢測(cè)靈敏度和特異性(IC50值為1.5 μ g/L);本發(fā)明提供的一種新的半抗原合成的思路，通過(guò)衍生得到半抗原，在用異原包被進(jìn)行檢測(cè)，得到靈敏度很好的單克隆抗體細(xì)胞株。
[0010]生物材料樣品保藏:一株抗百菌清單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D號(hào)，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCCJia:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC N0.9304，保藏曰期為2014年5月28臼。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1是單克隆細(xì)胞株D號(hào)分泌的單克隆抗體的抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0012]本發(fā)明下面的實(shí)施例僅作為本
【發(fā)明內(nèi)容】
的進(jìn)一步說(shuō)明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0013]本發(fā)明通過(guò)將百菌清完全抗原免疫小鼠，通過(guò)細(xì)胞融合，HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過(guò)間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA篩選細(xì)胞上清，最終得到了對(duì)百菌清有較好特異性和靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D號(hào)。
[0014]以下實(shí)施例中溶液的配置:
碳酸鹽緩沖液(CBS):稱(chēng)取Na2CO3 1.59g, NaHCO3 2.93g，分別溶于少量雙蒸水后混合，加雙蒸水至約800mL混勻，調(diào)pH值至9.6，加雙蒸水定容至lOOOmL，4°C貯存?zhèn)溆茫?br> 磷酸鹽緩沖液(PBS):8.00 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.2 g KH2PO4, 2.9 g Na2HPO4.12 H2O,溶于800 mL純水中，用NaOH或HCl調(diào)pH到7.2~7.4，定容至1000 mL ；
PBST:含 0.05% 吐溫 20 的 PBS ；
TMB 顯色液:A 液=Na2HPO4.Iffi2O 18.43g，檸檬酸 9.33g，純水定容至 1000 mL ；B 液:60mg TMB溶于100 mL乙二醇中。A、B液按1: 5混合即為T(mén)MB顯色液，現(xiàn)用現(xiàn)混。
[0015]實(shí)施例1抗百菌清單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D號(hào)的制備
(I)完全抗原的合成:
稱(chēng)取百菌清原藥 500mg( 1.9mmol), KOH 106.6mg( 1.9mmol), 6-氛基己酸 262mg(2mmol )，將這三種藥物溶于20mL乙醇，60°C反應(yīng)12h，再90°C反應(yīng)12h。將反應(yīng)物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，再用20mL水溶解，用鹽酸調(diào)pH至4-5，產(chǎn)生沉淀，將沉淀烘干即為半抗原CTNH，用液質(zhì)連用技術(shù)進(jìn)行鑒定與分析。
[0016]稱(chēng)取35.8mg CTNH, EDC 56.9mg, NHS 35.6mg,用 ImL 無(wú)水 DMF 溶解(稱(chēng)為 A 液)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)8h。稱(chēng)取BSA 112mg溶于20mL pH7.2的0.01mol/L PBS中(稱(chēng)為B液)，在室溫條件，逐滴將A液加入到B液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜，即得偶聯(lián)物CTNH-BSA混合液，通過(guò)透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原，并通過(guò)紫外吸收掃描方法鑒定。
[0017](2)動(dòng)物免疫
選擇健康的6-8周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。取步驟(1)制備的百菌清完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過(guò)背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首免與加強(qiáng)免之間間隔一個(gè)月，加強(qiáng)免之間間隔21天。三免后7天采血，使用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定小鼠血清效價(jià)和抑制，選擇效價(jià)高抑制好的小鼠，在四免后18天沖擊免疫，不使用佐劑，腹腔注射。
[0018](3)細(xì)胞融合
在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)PEG (聚乙二醇，分子量為4000)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟如下: a、無(wú)菌取小鼠脾臟，研磨并通過(guò)200目細(xì)胞篩網(wǎng)得到脾細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
b、收集SP2/0細(xì)胞，懸浮于RPM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
C、將脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞按照1: 10的比例混合，離心后用體積濃度50%的PEG融合，時(shí)間lmin，之后按照從慢到快，加入RPM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20%胎牛血清，2%的50XHAT的RPM1-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37°C、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0019](4)細(xì)胞篩選與細(xì)胞株建立
在細(xì)胞融合的第3天對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行RPM1-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第5天進(jìn)行用含20%胎牛血清，1%的100XHT的RPM1-1640過(guò)渡培養(yǎng)液進(jìn)行全換液，在第7天取細(xì)胞上清進(jìn)行篩選。
[0020]篩選分兩步:第一步先用間接ELISA篩選出陽(yáng)性細(xì)胞孔，第二步選用百菌清為標(biāo)準(zhǔn)品，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行抑制效果測(cè)定。選擇對(duì)百菌清標(biāo)準(zhǔn)品均有較好抑制的細(xì)胞孔，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)。重復(fù)三次，獲得抗百菌清單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D號(hào)。
[0021]實(shí)施例2抗百菌清單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D號(hào)單克隆抗體的制備與鑒定
(I)單抗的制備:取8-10周齡BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油ImL ;7天后每只小鼠腹腔注射I X IO6雜交瘤細(xì)胞，從第七天開(kāi)始收集腹水，將腹水通過(guò)辛酸-硫酸銨法純化，獲得的單抗置于_20°C保存。
[0022](2)檢測(cè):使用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，測(cè)定單克隆抗體百菌清的IC5tl分別為:1.5μ g/L，說(shuō)明對(duì)百菌清有很好的靈敏度，可用于百菌清免疫分析檢測(cè)。
[0023]實(shí)施例3單克隆抗體的應(yīng)用
將實(shí)施例1抗百菌清單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D號(hào)通過(guò)體內(nèi)腹水制備的單克隆抗體應(yīng)用于百菌清的ELISA添加回收試驗(yàn)，具體步驟如下:
(I)包被:將包被原CTNH-OVA用0.05M pH9.6碳酸鹽緩沖液從2Pg/mL開(kāi)始倍比稀釋?zhuān)?00μL/ 孔，37°C反應(yīng) 2h ；
(2)洗滌:將板內(nèi)溶液傾去，甩干，并用洗滌液洗滌3次，每次3min；
(3)封閉:拍干后，加入200μL7孔封閉液，37°C反應(yīng)2h。洗滌后烘干備用；
(4)加樣:將抗血清從1:1000開(kāi)始倍比稀釋?zhuān)⒓尤氲礁飨♂尪鹊陌豢字校?00μL孔，37 °C反應(yīng)Ih ;充分洗滌后，加入1:3000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，100μL7孔，37°C反應(yīng)Ih ；
(5)顯色:將酶標(biāo)板取出，充分洗滌后，每孔加入100μL的TMB顯色液，37°C避光反應(yīng)15min ；
(6)終止和測(cè)定:每孔加入50μL終止液以終止反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD45tl
值；
(7)結(jié)果判讀:以O(shè)D45tl值大于或等于陰性對(duì)照孔的2.1倍(即Ρ/Ν≥2.1)所對(duì)應(yīng)的血清最高稀釋倍數(shù)即為血清的ELISA效價(jià)；
(8)添加回收及樣品前處理:稱(chēng)取Ig粉碎的黃瓜樣品置入IOOmL三角瓶中，分別添加IOPgUOPg 及 2.5Pg 百菌清。
[0024]向樣品加入IOmL丙酮震蕩均勻后，超聲提取15min，凈置后上清用N2吹干，再用甲醇溶解，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，其回收率分別為109%，109%, 110%。
[0025]綜上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用來(lái)限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。即凡依本發(fā)明申請(qǐng)專(zhuān)利范圍的內(nèi)容所作的等效變化與修飾，都應(yīng)為本發(fā)明的技術(shù)范疇。
[0026]表1 D號(hào)分泌的單克隆抗體的交叉反應(yīng)率
【權(quán)利要求】
1.一株抗百菌清單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D號(hào)，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.9304。
2.權(quán)利要求1所述的抗百菌清單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D號(hào)分泌的百菌清單克隆抗體，其特征在于:通過(guò)抗百菌清單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D號(hào)分泌產(chǎn)生百菌清單克隆抗體。
3.權(quán)利要求2所述百菌清單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于:將百菌清單克隆抗體應(yīng)用于百菌清的ELISA添 加回收試驗(yàn)，測(cè)得其回收率。
【文檔編號(hào)】C07K16/44GK104017774SQ201410291522
【公開(kāi)日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月26日
【發(fā)明者】匡華, 胥傳來(lái), 嚴(yán)會(huì)娟, 徐麗廣, 馬偉, 劉麗強(qiáng), 宋珊珊, 吳曉玲 申請(qǐng)人:江南大學(xué)