交叉參考：本申請案要求2014年10月3日申請的美國臨時申請案第62/059,821號和2014年10月3日申請的第62/059,824號在35u.s.c§119(e)下的優(yōu)先權(quán)，其公開內(nèi)容以全文引用的方式并入本文中以用于所有目的。在本申請中，引用各種公開案、專利案和/或?qū)＠暾埌?。所述公開案、專利案和/或?qū)＠暾埌傅墓_內(nèi)容在此以全文引用的方式并入本申請案中以便更充分地描述本發(fā)明所涉及的目前最先進的水平。本傳授內(nèi)容涉及經(jīng)化學修飾的寡核苷酸序列引物組合物以及用于dna測序和片段分析的方法。教示內(nèi)容還涉及用于制備、片段分析和核酸(如cdna和dna)測序的組合物。具體來說，描述用于擴增含有多個目標序列的樣品內(nèi)的一個或多個目標序列的方法、組合物、系統(tǒng)、設(shè)備和試劑盒。任選地，在單次擴增反應(yīng)內(nèi)擴增多個目標序列，例如至少10、50、100、500或1000個。在一些實施例中，本發(fā)明大體上涉及用于擴增來自單一來源(如基因組dna或福馬林固定的鏈烷烴嵌入(ffpe)型dna)的一個或多個目標序列的方法、組合物、系統(tǒng)、設(shè)備和試劑盒。本發(fā)明中描述擴增和測序的方法以及其組合物和試劑盒，其可用于通過桑格測序(sangersequencing)(與通過ngs方法進行的測序組合/依序進行或在其之后進行)來驗證來自單一來源的一個或多個目標序列的核苷酸序列。技術(shù)實現(xiàn)要素：在本發(fā)明的一個方面中，提供用于測序至少一個擴增子的方法，其包括以下步驟：提供至少一個擴增子，其中所述至少一個擴增子包含相關(guān)序列和從第一激活序列并入的相對于相關(guān)序列位于5′的前導(dǎo)序列；使所述至少一個擴增子在第一反應(yīng)混合物中擴增，所述第一反應(yīng)混合物包括多種核酸酶敏感性擴增引物以形成經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物；使含有經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物的第一反應(yīng)混合物與包含核酸酶和至少一種化學增強型引物的第二反應(yīng)混合物接觸，所述至少一種化學增強型引物引起多種核酸酶敏感性擴增引物由核酸酶降解；使核酸酶失活；在測序反應(yīng)中用至少一種化學增強型引物激活經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物；以及制備至少一種化學增強型引物的延伸產(chǎn)物。在一些實施例中，延伸產(chǎn)物可以經(jīng)熒光標記。在各種實施例中，可使用第一激活序列產(chǎn)生擴增子。在各種實施例中，第一激活序列可包括至少一個可裂解部分。在一些實施例中，前導(dǎo)序列可以是第一激活序列的一部分。在所述方法的各種實施例中，可在相同反應(yīng)器中進行使第一反應(yīng)混合物與第二反應(yīng)混合物接觸、使核酸酶失活以及制備化學增強型引物的延伸產(chǎn)物的步驟。在各種實施例中，可在不存在中間純化步驟的情況下進行使至少一個擴增子擴增、使第一反應(yīng)混合物與第二反應(yīng)混合物接觸、使核酸酶失活以及制備化學增強型引物的延伸產(chǎn)物的步驟。在所述方法的各種實施例中，所述至少一個擴增子進一步包括相對于相關(guān)序列位于3′的接續(xù)序列，其中接續(xù)序列與用于產(chǎn)生至少一個擴增子的第二激活序列互補。至少一個擴增子可具有約100個核苷酸到約400個核苷酸的長度。至少一個擴增子的相關(guān)序列可具有約100個核苷酸到約300個核苷酸的長度。在其它實施例中，至少一個擴增子的相關(guān)序列可具有約125個核苷酸到約275或約250個核苷酸的長度。所述至少一個擴增子可以是多個擴增子。在一些實施例中，多個擴增子可包括至少兩個不同擴增子，第一個具有作為主要變異序列的相關(guān)序列，并且第二個擴增子具有來自樣品核酸的相同區(qū)域的次要變異序列。在一些實施例中，所述方法進一步包括以下步驟：基于測序反應(yīng)獲得測序結(jié)果；以及基于所述結(jié)果測定至少相關(guān)序列的核苷酸堿基序列。測序結(jié)果可通過基于遷移率的分離方法獲得。在一些實施例中，基于遷移率的分離方法可以是毛細電泳法。在一些實施例中，可比較所測定的至少序列相關(guān)的核苷酸堿基序列與從ngs測序方法獲得的至少相關(guān)序列的第二核苷酸堿基序列。ngs測序方法可包括大規(guī)模平行測序技術(shù)，例如使用熒光團或半導(dǎo)體檢測的合成測序和焦磷酸測序。在一些實施例中，ngs測序方法可以是半導(dǎo)體測序。在各種實施例中，擴增dna可包括聚合酶鏈反應(yīng)擴增。在所選擇的實施例中，測序反應(yīng)可包括循環(huán)測序。在各種實施例中，第一反應(yīng)混合物還可以包括聚合酶。聚合酶可以是熱穩(wěn)定聚合酶。在一些實施例中，聚合酶可以是taq聚合酶。第一反應(yīng)混合物可進一步包括脫氧核苷酸三磷酸酯。在各種實施例中，第二反應(yīng)混合物進一步包含聚合酶、脫氧核苷酸三磷酸酯和經(jīng)染料標記的雙脫氧核苷酸三磷酸酯。第二反應(yīng)混合物的聚合酶可以是熱穩(wěn)定聚合酶。在一些實施例中，聚合酶是taq聚合酶。在用于測序至少一個擴增子的方法的各種實施例中，核酸酶可選自外切核酸酶i、exoiii、pfu和dnapoli。在用于測序至少一個擴增子的方法的各種實施例中，化學增強型引物可包括寡核苷酸序列、ncm以及沒有或至少一個核酸酶抗性鍵。在一些實施例中，化學增強型引物可包括位于末端3′端的一個核酸酶抗性鍵?；瘜W增強型引物可包括位于末端5′端或化學增強型引物的寡核苷酸序列內(nèi)的多個ncm。在一些實施例中，多個ncm可位于末端5′端。在各種實施例中，ncm可以是(cn)間隔基，其中n是1到9的任何整數(shù)。ncm可包括多個(cn)間隔基。在各種實施例中，化學增強型引物可具有下式的結(jié)構(gòu)：(cn)x-oligo，其中(cn)x具有下式的結(jié)構(gòu)：其中n的每個實例可以獨立地是1到9的整數(shù)；并且x可以是1到約30的整數(shù)；oligo具有下式的結(jié)構(gòu)：其中b是核堿基；k是s或o；m是0或1；z是3到約100的整數(shù)；w是oh、f、ome或h；并且nt是具有下式的部分：在一些實施例中，化學增強型引物可具有如本發(fā)明中所描述的任何結(jié)構(gòu)。在用于測序至少一個擴增子的方法的各種實施例中，多個核酸酶敏感性擴增引物中的每一個可經(jīng)配置以激活特定疾病病況的相關(guān)序列。在一些實施例中，多個核酸酶敏感性擴增引物可激活與特定疾病病況有關(guān)的一組序列。在本發(fā)明的另一個方面中，提供用于確定dna序列的方法，其包括以下步驟：使用至少第一激活序列擴增包含核酸的樣品以提供多個擴增子，其中所述多個擴增子中的每一個包括相關(guān)序列和從第一激活序列并入的相對于相關(guān)序列位于5′的前導(dǎo)序列；在包括多個核酸酶敏感性擴增引物的第一反應(yīng)混合物中擴增所述多個擴增子的第一等分試樣以形成經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物；使含有經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物的第一反應(yīng)混合物與包括核酸酶和至少一個化學增強型引物的第二反應(yīng)混合物接觸，其中通過使核酸酶與第一反應(yīng)混合物接觸，核酸酶敏感性擴增引物由核酸酶降解；使核酸酶失活；在測序反應(yīng)中用至少一種化學增強型引物激活經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物；以及制備化學增強型引物的延伸產(chǎn)物。在一些實施例中，延伸產(chǎn)物可以經(jīng)熒光標記。在各種實施例中，可使用第一激活序列產(chǎn)生擴增子。第一激活序列可包括至少一個可裂解部分。在一些實施例中，前導(dǎo)序列可以是第一激活序列的一部分。在所述方法的各種實施例中，可在相同反應(yīng)器中進行使第一反應(yīng)混合物與第二反應(yīng)混合物接觸、使核酸酶失活以及制備化學增強型引物的延伸產(chǎn)物的步驟。在各種實施例中，可在不存在中間純化步驟的情況下進行使多個擴增子擴增、使第一反應(yīng)混合物與第二反應(yīng)混合物接觸、使核酸酶失活以及制備化學增強型引物的延伸產(chǎn)物的步驟。在所述方法的各種實施例中，多個擴增子中的每一個進一步包括相對于相關(guān)序列位于3′的接續(xù)序列，其中接續(xù)序列與用于產(chǎn)生擴增子的第二激活序列互補。多個擴增子中的每一個可具有約100個核苷酸到約400個核苷酸的長度。多個擴增子中的每一個的相關(guān)序列可具有約100個核苷酸到約300個核苷酸的長度。在其它實施例中，多個擴增子中的每一個的相關(guān)序列可具有約125個核苷酸到約275或約250個核苷酸的長度。在一些實施例中，多個擴增子可包括至少兩個不同擴增子，第一個具有作為主要變異序列的相關(guān)序列，并且第二個擴增子具有來自樣品核酸的相同區(qū)域的次要變異序列。在一些實施例中，所述方法更包括以下步驟：基于測序反應(yīng)獲得測序結(jié)果；以及基于所述結(jié)果測定至少相關(guān)序列的核苷酸堿基序列。測序結(jié)果可通過基于遷移率的分離方法獲得。在一些實施例中，基于遷移率的分離方法可以是毛細電泳法。在一些實施例中，可比較至少相關(guān)序列的所測定的核苷酸堿基序列與從對多個擴增子的第二等分試樣進行ngs測序方法獲得的至少相關(guān)序列的第二核苷酸堿基序列。ngs測序方法可包括大規(guī)模平行測序技術(shù)，例如使用熒光團或半導(dǎo)體檢測的合成測序和焦磷酸測序。在一些實施例中，ngs測序方法可以是半導(dǎo)體測序。在各種實施例中，擴增dna可包括聚合酶鏈反應(yīng)擴增。在所選擇的實施例中，測序反應(yīng)可包括循環(huán)測序。在各種實施例中，第一反應(yīng)混合物還可以包括聚合酶。聚合酶可以是熱穩(wěn)定聚合酶。在一些實施例中，聚合酶可以是taq聚合酶。第一反應(yīng)混合物可進一步包括脫氧核苷酸三磷酸酯。在各種實施例中，第二反應(yīng)混合物進一步包含聚合酶、脫氧核苷酸三磷酸酯和經(jīng)染料標記的雙脫氧核苷酸三磷酸酯。第二反應(yīng)混合物的聚合酶可以是熱穩(wěn)定聚合酶。在一些實施例中，聚合酶是taq聚合酶。在用于確定dna序列的方法的各種實施例中，核酸酶可選自外切核酸酶i、exoiii、pfu和dnapoli。在用于確定dna序列的方法的各種實施例中，化學增強型引物可包括寡核苷酸序列、ncm和沒有或至少一個核酸酶抗性鍵。在一些實施例中，化學增強型引物可包括位于末端3′端的一個核酸酶抗性鍵。化學增強型引物可包括位于末端5′端或化學增強型引物的寡核苷酸序列內(nèi)的多個ncm。在一些實施例中，多個ncm可位于末端5′端。在各種實施例中，ncm可以是(cn)間隔基，其中n是1到9的任何整數(shù)。ncm可包括多個(cn)間隔基。在各種實施例中，化學增強型引物可具有下式的結(jié)構(gòu)：(cn)x-oligo，其中(cn)x具有下式的結(jié)構(gòu)：其中n的每個實例可獨立地是1到9的整數(shù)；并且x可以是1到約30的整數(shù)；oligo具有下式的結(jié)構(gòu)：其中b是核堿基；k是s或o；m是0或1；z是3到約100的整數(shù)；w是oh、f、ome或h；并且nt是具有下式的部分：在一些實施例中，化學增強型引物可具有如本發(fā)明中所描述的任何結(jié)構(gòu)。在用于確定dna序列的方法的各種實施例中，多個核酸酶敏感性擴增引物中的每一個可經(jīng)配置以激活特定疾病病況的相關(guān)序列。在一些實施例中，多個核酸酶敏感性擴增引物可激活與特定疾病病況有關(guān)的一組序列。在本發(fā)明的另一個方面中，提供用于準備dna測序的方法，其包括以下步驟：使用至少第一激活序列擴增包含核酸的樣品以提供多個擴增子，其中多個擴增子中的每一個包括相關(guān)序列和從第一激活序列并入的相對于相關(guān)序列位于5′的前導(dǎo)序列；在第一反應(yīng)混合物中使多個擴增子的等分試樣擴增以形成經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物，所述第一反應(yīng)混合物包括核酸酶敏感性擴增引物；使含有經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物的第一反應(yīng)混合物與包含核酸酶和化學增強型引物的第二反應(yīng)混合物接觸，從而使核酸酶敏感性擴增引物由核酸酶降解；使核酸酶失活；在測序反應(yīng)中用化學增強型引物激活經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物；以及制備化學增強型引物的延伸產(chǎn)物。在本發(fā)明的另一方面中，提供用于測序和檢驗相關(guān)變異型核酸序列的方法，其包括以下步驟：使用至少第一激活序列使包括核酸的樣品擴增以提供多個擴增子，其中多個擴增子中的每一個包括相關(guān)序列和從第一激活序列并入的相對于相關(guān)序列位于5′的前導(dǎo)序列；將多個擴增子拆分成第一等分試樣和第二等分試樣；在第一反應(yīng)混合物中使多個擴增子的第一等分試樣擴增以形成第一經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物，所述第一反應(yīng)混合物包括核酸酶敏感性擴增引物；使含有第一經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物的第一反應(yīng)混合物與包括核酸酶和化學增強型引物的第二反應(yīng)混合物接觸，其中通過使核酸酶與第一反應(yīng)混合物接觸，核酸酶敏感性擴增引物由核酸酶降解；使核酸酶；在測序反應(yīng)中用化學增強型引物激活第一經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物；制備化學增強型引物的延伸產(chǎn)物；使用遷移率依賴性分離獲得經(jīng)延伸的化學增強型引物的至少相關(guān)序列的測序結(jié)果；以及測定經(jīng)延伸的化學增強型引物的至少相關(guān)序列的核苷酸堿基序列；使擴增子的第二等分試樣擴增以形成第二dna產(chǎn)物；使用ngs測序方法獲得第二dna產(chǎn)物的至少相關(guān)序列的測序結(jié)果；以及通過比較其與經(jīng)延伸的化學增強型引物的至少相關(guān)序列的核苷酸堿基序列來檢驗第二dna產(chǎn)物的核苷酸序列。在所述方法的各種實施例中，使多個擴增子的第二等分試樣擴增以形成第二dna產(chǎn)物的步驟進一步包含接合接附子、結(jié)合于珠粒和接合條形碼中的至少一個。在本發(fā)明的另一個方面中，提供用于核酸測序的組合物，其包括：pcr擴增反應(yīng)產(chǎn)物，其包含：從至少一個擴增子擴增的dna產(chǎn)物，其中擴增子包含相關(guān)序列和從第一激活序列并入的相對于相關(guān)序列位于5′的前導(dǎo)序列；非核酸酶抗性擴增引物；以及化學增強型引物，其中化學增強型引物包含寡核苷酸序列、ncm和沒有或至少一個核酸酶抗性鍵?；瘜W增強型引物可包括位于末端5′端或化學增強型引物的寡核苷酸序列內(nèi)的多個ncm。ncm可以是(cn)間隔基，其中n可以是1到9的任何整數(shù)。在各種實施例中，ncm包含多個(cn)間隔基。在各種實施例中，化學增強型引物可具有式i的結(jié)構(gòu)：其中b是核堿基；k是s或o；每個n獨立地是1到9的整數(shù)；m是0或1；x是1到約30的整數(shù)；z是3到約100的整數(shù)；w是oh、f、ome或h；并且nt是具有下式的部分：在本發(fā)明的組合物的一些實施例中，化學增強型引物可以是本發(fā)明中所描述的任何化學增強型引物。在各種實施例中，化學增強型引物的寡核苷酸部分可包括通用引物。通用引物可選自m13、us1、t7、sp6和t3。通用引物可以是m13。在一些實施例中，化學增強型引物可包括一個核酸酶抗性鍵。在本發(fā)明的組合物的一些實施例中，組合物可進一步包括核酸酶。在其它實施例中，組合物可進一步包括聚合酶、脫氧核苷酸三磷酸酯、雙脫氧核苷酸三磷酸酯和染料標記。在一些實施例中，雙脫氧核苷酸三磷酸酯可包括標記有染料標記的雙脫氧核苷酸三磷酸酯。經(jīng)染料標記的雙脫氧核苷酸三磷酸酯可包括經(jīng)熒光染料標記的雙脫氧核苷酸三磷酸酯。在一些實施例中，染料標記可連接到ncm或寡核苷酸序列。在本發(fā)明的組合物的一些實施例中，核酸酶可選自外切核酸酶i、exoiii、pfu和dnapoli。在一些實施例中，聚合酶可以是taq聚合酶。在一些實施例中，pcr擴增反應(yīng)產(chǎn)物進一步包括經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物，其中dna產(chǎn)物是多個擴增子的擴增產(chǎn)物。在本發(fā)明的另一個方面中，提供化學增強型引物，其包括寡核苷酸序列、至少一個ncm和沒有或至少一個核酸酶抗性鍵，并且其中至少10個位于化學增強型引物的3′端的核苷酸與至少10個位于擴增子的5′端的核苷酸互補，其中擴增子包括相關(guān)序列和從第一激活序列并入的相對于相關(guān)序列位于5′的前導(dǎo)序列。在一些實施例中，化學增強型引物包含位于末端3′端的一個核酸酶抗性鍵?；瘜W增強型引物可包括位于末端5′端或化學增強型引物的寡核苷酸序列內(nèi)的多個ncm。ncm可以是(cn)間隔基，其中n可以是1到9的任何整數(shù)。ncm可包括多個(cn)間隔基。在化學增強型引物的各種實施例中，化學增強型引物可具有下式的結(jié)構(gòu)：(cn)x-oligo，其中(cn)x具有下式的結(jié)構(gòu)：其中n的每個實例獨立地是1到9的整數(shù)；并且x是1到約30的整數(shù)；oligo具有下式的結(jié)構(gòu)：其中b是核堿基；k是s或o；m是0或1；z是3到約100的整數(shù)；w是oh、f、ome或h；并且nt是具有下式的部分：在本發(fā)明的另一個方面中，描述一種試劑盒，其包括：聚合酶、核酸酶、至少一種脫氧核苷酸三磷酸和雙脫氧核苷酸三磷酸酯。雙脫氧核苷酸三磷酸酯可以是標記有染料標記的雙脫氧核苷酸三磷酸酯。經(jīng)染料標記的雙脫氧核苷酸三磷酸酯可以是經(jīng)熒光染料標記的雙脫氧核苷酸三磷酸酯。在一些實施例中，核酸酶可選自外切核酸酶i、exoiii、pfu和dnapoli。在各種實施例中，試劑盒可包括如本發(fā)明中所描述的化學增強型引物。在其它實施例中，試劑盒可進一步包括多個核酸酶敏感性擴增引物。多個核酸酶敏感性擴增引物可經(jīng)配置以激活特定疾病病況的相關(guān)序列。試劑盒中的多個核酸酶敏感性擴增引物可經(jīng)配置以激活連接到特定疾病病況的一組序列。本文中參考多種專利案、專利申請案和其它公開案，其皆以全文引用的方式并入本文中。此外，以下標準參考著作以引用的方式并入本文中：《最新分子生物學實驗方法匯編(currentprotocolsinmolecularbiology)》，johnwiley&sons，n.y.，2007年10月版本；sambrook，russell和sambrook，《分子克隆實驗指南(molecularcloning：alaboratorymanual)》，第3版，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，2001。如果本說明書與以參考方式并入的任何文獻之間存在沖突，那么本說明書應(yīng)占主導(dǎo)地位，應(yīng)了解，判定是否存在沖突或不一致屬于本發(fā)明人的判斷范圍內(nèi)并且可以在任何時間進行。本發(fā)明教示內(nèi)容的其它特征和優(yōu)點將由以下說明顯示，并且將部分由所述說明顯而易見，或可通過實踐本發(fā)明教示內(nèi)容得知。應(yīng)理解，先前概述和以下詳細描述都僅是例示性和解釋性并且意圖提供本發(fā)明教示內(nèi)容的進一步說明而不限制本發(fā)明教示內(nèi)容。附圖說明隨附圖式(其并入本說明書中并且組成本說明書的一部分)舉例說明所披露的實施例，并且與說明書一起用于解釋和說明所揭示的實施例的原理。確切地說：圖1是用于使用預(yù)先擴增的樣品的小型等分試樣，通過毛細電泳法分離來檢驗變異型序列的工作流的圖形表示。這允許在ngs方法(例如(但不限于)ionampliseqtm半導(dǎo)體測序)以及通過有效正交毛細電泳法分析路徑進行的確認分析中使用尺寸有限的待分析的樣品。圖2是用于在本發(fā)明的方法中處理預(yù)先擴增的樣品的分析步驟的注釋說明。圖3是通過本發(fā)明的方法獲得的序列數(shù)據(jù)的資料分析的流程圖。圖4是測試樣品和資料類型的示意圖。ce表示毛細電泳法(桑格測序資料)并且pgmtm表示ionpersonalgenome(資料是半導(dǎo)體測序資料)。chpv2是來源于iontorrentampliseqtmcancerhotspotpanelv2的預(yù)先擴增物質(zhì)并且ocp是來自專屬iontorrentampliseqoncominetm的預(yù)先擴增物。圖5是通過桑格再測序并且具體說來，direct測序技術(shù)進行的校驗分析的特定目標的示意圖。chpv.2表明這些基因座是ionampliseqtmcancerhotspotpanelv.2的一部分并且ocp表明所指示的基因座是iononcominetm癌癥圖的一部分。圖6是對ionpgmtm(318晶片)使用ionampliseq方法，發(fā)現(xiàn)由三個樣品產(chǎn)生的變異體的示意圖。第二欄表示在特定樣品中發(fā)現(xiàn)的變異體的數(shù)目。對于特定基因座，右邊的其余欄表示所觀察的變異型序列的百分比。圖7是在使用本發(fā)明的方法通過桑格測序再測序時，從相同的三個樣品發(fā)現(xiàn)的變異型序列的示意圖。研究相同基因座并且確認變異體。圖8a-8b是圖5的chpv2pa的targetsangerce測試集a的qualitygrid的示意性圖示(如在appliedbiosystemsvariantreportertm軟體中所見)。圖8a的下部在圖8b中以更大的比例再現(xiàn)，并且說明對于由ampliseq到桑格測序的工作流獲得的四個極具限制性的初始樣品中的每一個，96個所得擴增子中的88個具有2x覆蓋度(正向/反向)，并且8個具有1x覆蓋度。不存在脫扣。向右的箭頭表示成功的正向延伸產(chǎn)物制備并且向左的箭頭表示成功的反向延伸產(chǎn)物制備。圖9a-9b是圖5的chpv2pa的targetsangerce測試集b的qualitygrid的示意性圖示(如在appliedbiosystemsvariantreportertm軟體中所見)。圖9a的下部在圖9b中以更大的比例再現(xiàn)，并且說明對于由ampliseq到桑格測序的工作流獲得的四個極具限制性的初始樣品中的每一個，96個所得擴增子中的93個具有2x覆蓋度(正向/反向)，并且3個具有1x覆蓋度。不存在脫扣。向右的箭頭表示成功的正向延伸產(chǎn)物制備并且向左的箭頭表示成功的反向延伸產(chǎn)物制備。圖10是電泳圖的圖形表示，其表明檢測樣品ffpe-5的alk-2中的次要變異體的測序結(jié)果。左圖(正向序列)和右圖(反向序列)中的箭頭明確展示在主要變異體信號峰下的大量次要變異體，其通過kbtm堿基識別可稱為混合堿基。可比較這一目測比率與使用iontorrentsuitetm軟體獲得的所提供的ampliseq衍生結(jié)果的比率以分析次要與主要的比率，其指配次要變異體的比率是26.8％。圖11是電泳圖的圖形表示，其表明檢測樣品na8020的egfr-6中的次要變異體的測序結(jié)果。左圖(正向序列)和右圖(反向序列)中的箭頭明確展示在主要變異體信號峰下的可檢測量的次要變異體，其通過kbtm堿基識別不可稱為混合堿基?？杀容^這一目測比率與使用iontorrentsuitetm軟體獲得的所提供的ampliseq衍生結(jié)果的比率以分析次要與主要的比率，其指配次要變異體的比率是9.6％。圖12是由對ionpgmtm(318晶片)使用ocpampliseqtm的三個樣品的測序發(fā)現(xiàn)的tp53突變的出現(xiàn)頻率的示意圖。圖13是圖12的再測序樣品的示意圖，使用本發(fā)明的方法驗證圖12中展示的tp53突變。圖14a-14b是四個樣品的來自ocpampliseqtm的24個tp53individual擴增子的qualitygrid的圖形表示(如在appliedbiosystemsvariantreportertm軟體中所見)。圖14a的下部在圖14b中以更大的比例再現(xiàn)，并且說明對于由ampliseqtm到桑格測序的工作流獲得的四個極具限制性的樣品中的每一個，96個擴增子中的94個具有完全2x覆蓋度(正向/反向)。不存在脫扣。向右的箭頭表示成功的正向延伸產(chǎn)物制備并且向左的箭頭表示成功的反向延伸產(chǎn)物制備。圖15是檢測樣品ffpe5的tp53中的次要變異體的測序結(jié)果的電泳圖的圖形表示。左圖(正向序列)和右圖(反向序列)中的箭頭明確展示在主要變異體信號峰下的可檢測量的次要變異體。使用iontorrentsuitetm軟體分析次要(c)與主要(t)的比率表明次要變異體的比率是17.9％。圖16是檢測圖15中展示的不同位置處tp53中的次要變異體的測序結(jié)果的電泳圖的圖形表示，例如ffpe5。左圖(正向序列)和右圖(反向序列)中的箭頭明確展示在主要變異體信號峰下的可檢測量的次要變異體。使用iontorrentsuitetm軟體分析次要(t)與主要(c)的比率表明次要變異體的比率是21.8％。圖17是檢測圖15中展示的第三位置處tp53中的次要變異體的測序結(jié)果的電泳圖的圖形表示，例如ffpe5。左圖(正向序列)和右圖(反向序列)中的箭頭明確展示在主要變異體信號峰下的可檢測量的次要變異體。使用iontorrentsuitetm軟體分析次要(c)與主要(g)的比率表明次要變異體的比率是20.2％。具體實施方式為了有助于對本發(fā)明教示內(nèi)容的理解，提供以下定義。應(yīng)理解，通常，未以其它方式定義的術(shù)語具有其在所屬領(lǐng)域中一般公認的的普通含義。如本文中所使用，“擴增”或“擴增反應(yīng)”和其派生詞通常指用于將核酸分子(稱為模板核酸分子)的至少一部分復(fù)寫或復(fù)制到至少一個其它核酸分子中的任何作用或過程。其它核酸分子任選地包括與模板核酸分子的至少某一部分實質(zhì)上一致或大體上互補的序列。模板核酸分子可以是單股或雙股并且另一個核酸分子可以獨立地是單股或雙股。在一些實施例中，擴增包括模板依賴性活體外酶催化反應(yīng)，其用于制備核酸分子的至少某一部分的至少一個復(fù)本或制備與核酸分子的至少某一部分互補的核酸序列的至少一個復(fù)本。擴增任選地包括核酸分子的線性或指數(shù)復(fù)制。在一些實施例中，使用等溫條件進行這類擴增；在其它實施例中，這類擴增可包括熱循環(huán)。在一些實施例中，擴增是多元擴增，其包括在單次擴增反應(yīng)中同時擴增多個目標序列。至少一些目標序列可單次擴增反應(yīng)中所包括的相同核酸分子或不同目標核酸分子上。在一些實施例中，“擴增”包括單獨或呈組合形式的基于dna和rna的核酸的至少某一部分的擴增。擴增反應(yīng)可包括單股或雙股核酸襯底并且可進一步包括所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的擴增方法中的任一種。在一些實施例中，擴增反應(yīng)包括聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)。如本文中所使用，“擴增條件”和其派生詞通常指適用于擴增一個或多個核酸序列的條件。這類擴增可以是線性或指數(shù)的。在一些實施例中，擴增條件可包括等溫條件或可包括熱循環(huán)條件，或等溫和熱循環(huán)條件的組合。在一些實施例中，適用于擴增一個或多個核酸序列的條件包括聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)條件。通常，擴增條件指足以擴增核酸(如一個或多個目標序列)或擴增接合到一個或多個銜接子的經(jīng)擴增的目標序列(例如銜接子接合的經(jīng)擴增的目標序列)的反應(yīng)混合物。通常，擴增條件包括用于擴增或用于核酸合成的催化劑，例如聚合酶；與待擴增的核酸具有一定程度的互補性的引物；以及核苷酸，諸如脫氧核糖核苷酸三磷酸酯(dntp)，以促進與核酸雜交之后引物的延伸。擴增條件需要引物與核酸的雜交或粘接，引物的延伸和變性步驟，其中經(jīng)延伸的引物與經(jīng)歷擴增的核酸序列分離。通常但未必，擴增條件可包括熱循環(huán)，在一些實施例中，擴增條件包括多個循環(huán)，其中重復(fù)粘接、延伸和分離步驟。通常，擴增條件包括陽離子，如mg++或mn++(例如mgcl2等)，并且還可以包括多種離子強度調(diào)節(jié)劑。如本文中所使用，“目標序列”或“相關(guān)序列”和其派生詞通常并且可互換地指可根據(jù)本發(fā)明擴增或合成的任何單股或雙股核酸序列，包括懷疑或預(yù)期樣品中存在的任何核酸序列。在一些實施例中，在添加目標特異性引物或附接銜接子之前，相關(guān)序列以雙股形式存在并且包括待擴增或合成的具體核苷酸序列的至少一部分或其補體。目標序列可包括可與適用于擴增或合成反應(yīng)的引物在聚合酶延伸之前雜交的核酸。在一些實施例中，所述術(shù)語指核酸序列。其序列一致性、核苷酸的次序或位置由本發(fā)明的方法中的一種或多種測定。如本文中所定義，“可裂解基團”通常指在并入核酸后可在適當條件下裂解的任何部分。舉例來說，可將可裂解基團并入樣品的引物、經(jīng)擴增的序列、銜接子或核酸分子中。在例示性實施例中，目標特異性引物可包括可裂解基團，其變成并入經(jīng)擴增的產(chǎn)物中并且接著在擴增之后裂解，從而從經(jīng)擴增的產(chǎn)物移除一部分或所有目標特異性引物?？闪呀饣鶊F可裂解或以其它方式通過任何可接受的手段從樣品的目標特異性引物、經(jīng)擴增的序列、銜接子或核酸分子移除。舉例來說，可通過酶促、熱學、光氧化或化學處理從樣品的目標特異性引物、經(jīng)擴增的序列、銜接子或核酸分子移除可裂解基團。在一個方面中，可裂解基團可包括非天然存在的核堿基。舉例來說，寡脫氧核苷酸可包括一個或多個rna核堿基，如可通過尿嘧啶糖基化酶移除的尿嘧啶。在一些實施例中，可裂解基團可包括一個或多個經(jīng)修飾的核堿基(如7-甲基鳥嘌呤、8-側(cè)氧基-鳥嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤、5，6-二氫尿嘧啶或5-甲基胞嘧啶)或一個或多個經(jīng)修飾的核苷(即，7-甲基鳥苷、8-側(cè)氧基-脫氧鳥苷、黃苷、肌苷、二氫尿苷或5-甲基胞啶)?？赏ㄟ^酶促、化學或熱學手段從核酸移除經(jīng)修飾的核堿基或核苷酸。在一個實施例中，可裂解基團可包括在暴露于紫外光(即，溴脫氧尿苷)時，可在擴增(或合成)之后從引物移除的部分。在另一實施例中，可裂解基團可包括甲基化胞嘧啶。通常，甲基化胞嘧啶可由引物裂解，例如在誘導(dǎo)擴增(或合成)之后、在亞硫酸氫鈉處理時。在一些實施例中，可裂解部分可包括限制位點。舉例來說，引物或目標序列可包括對一種或多種限制酶具有特異性的核酸序列，并且在擴增(或合成)之后，引物或目標序列可用一種或多種限制酶處理使得移除可裂解基團。通常，可在一個或多個位置包括一個或多個可裂解基團以及樣品的目標特異性引物、經(jīng)擴增的序列、銜接子或核酸分子。如本文所用，“裂解”和其派生詞一般是指可裂解基團從樣品的目標特異性引物、經(jīng)擴增的序列、銜接子或核酸分子裂解或以其它方式移除的任何過程。在一些實施例中，裂解步驟可以涉及化學、熱學、光氧化或消化過程。如本文中所使用，術(shù)語“互補”和“補體”以及其派生詞指可在反平行定向(如在雜交雙螺旋中)的兩個或更多個個別相應(yīng)位置經(jīng)歷累積堿基配對的任何兩個或更多個核酸序列(例如部分或全部模板核酸分子、目標序列及/或引物)。這類堿基配對可根據(jù)任何現(xiàn)有規(guī)則集合進行，例如根據(jù)沃森-克里克堿基配對規(guī)則(watson-crickbasepairingrules)或根據(jù)一些其它堿基配對范例。任選地，第一與第二核酸序列之間可以存在“完全”或“總體”互補性，其中第一核酸序列中的每個核苷酸可以經(jīng)歷與第二核酸序列上的相應(yīng)的反平行位置中的核苷酸的穩(wěn)定化堿基配對相互作用?！安糠帧被パa性描述一個核酸序列的至少20％但少于100％的殘基與另一個核酸序列殘基互補的核酸序列。在一些實施例中，一個核酸序列的至少50％但少于100％的殘基與另一個核酸序列中的殘基互補。在一些實施例中，一個核酸序列的至少70％、80％、90％、95％或98％但少于100％的殘基與另一個核酸序列中的殘基互補。當一個核酸序列的至少85％的殘基與另一個核酸序列中的殘基互補時，序列被稱為“基本上互補”。在一些實施例中，兩個互補或基本上互補序列能夠在標準或嚴格雜交條件下彼此雜交?！胺腔パa”描述其中一個核酸序列的少于20％的殘基與另一個核酸序列中的殘基互補的核酸序列。當一個核酸序列的少于15％的殘基與另一個核酸序列中的殘基互補時，序列被稱為“基本上非互補”。在一些實施例中，兩個非互補或基本上非互補序列無法在標準或嚴格雜交條件下彼此雜交?！板e配”存在于不互補的兩個相對核苷酸中的任何位置?；パa核苷酸包括在生理條件下在dna復(fù)制期間通過與彼此相對的dna聚合酶有效并入的核苷酸。在典型實施例中，在彼此位于反平行位置的核苷酸及/或聚核苷酸的核堿基之間，互補核苷酸可彼此形成堿基對，如通過特異性沃森-克里克型氫鍵形成的a-t/u和g-c堿基對，或通過某種其它類型的堿基配對范例形成的堿基對。其它人工堿基對的互補性可以是基于其它類型的氫鍵和/或堿基的疏水性和/或堿基之間的形狀互補性。如本文中所使用，“dna條碼”或“dna標記序列”和其派生詞通常是指可充當‘用于區(qū)分或分離樣品中多個經(jīng)擴增的目標序列′的銜接子內(nèi)的獨特短(6-14個核苷酸)核酸序列。出于本發(fā)明的目的，dna條形碼或dna標記序列可以并入銜接子的核苷酸序列中。如本文中所使用，當關(guān)于兩種或更多種組分使用時，“接觸”和其派生詞通常是指用于促進或?qū)崿F(xiàn)參考組分的接近、靠近、混合物或共混而未必需要這類組分的物理接觸的任何過程，并且包括含有所述參考組分中的任一種或多種的溶液的彼此混合。參考組分可以任何具體順序或組合接觸并且組分的引述順序不受限制。如本文中所使用，術(shù)語“測定核苷酸堿基序列”或術(shù)語“測定關(guān)于序列的信息”涵蓋“序列測定”并且也涵蓋其它程度的信息，如消除序列的一種或多種可能性。應(yīng)注意，進行聚核苷酸的序列測定通常產(chǎn)生關(guān)于完美互補(100％互補)聚核苷酸的序列的等效信息，并且因此等效于直接對完美互補聚核苷酸進行序列測定。如本文中所使用，當關(guān)于核酸分子(例如目標序列或經(jīng)擴增的目標序列)使用時，術(shù)語“末端”和其派生詞可包括核酸分子的末端30個核苷酸、末端20和甚至更通常末端15個核苷酸。包含一連串相鄰核苷酸的線形核酸分子通常包括至少兩個末端。在一些實施例中，核酸分子的一端可包括3′羥基或其等效物，并且可稱為“3′端”和其派生詞。任選地，3′端包括未連接到單核苷酸戊糖環(huán)的5′磷酸基的3′羥基。典型地，3′端包括經(jīng)定位與包括未連接的3′羥基的核苷酸相鄰的一個或多個5′連接的核苷酸，通常經(jīng)定位與3′羥基相鄰的30個核苷酸，通常末端20個并且甚至更通常末端15個核苷酸。通常，一個或多個連接的核苷酸可表示成寡核苷酸中存在的核苷酸的百分比，或可以與未連接的3′羥基相鄰的許多連接的核苷酸形式提供。舉例來說，3′端可占寡核苷酸的核苷酸長度的小于50％。在一些實施例中，3′末端不包括任何未連接的3′羥基，但可包括任何能夠充當核苷酸通過引物延伸和/或核苷酸聚合進行的連接的位點的部分。在一些實施例中，例如當參考目標特異性引物時，術(shù)語“3′端”可包括3′端處的末端10個核苷酸、末端5個核苷酸、末端4、3、2或更少個核苷酸。在一些實施例中，當參考目標特異性引物時，術(shù)語“3′端”可包括位于核苷酸位置10的核苷酸或更少的來自3′端的核苷酸。如本文中所使用，“5′端”和其派生詞通常指核酸分子(例如目標序列或經(jīng)擴增的目標序列)的末端，其包括自由5′磷酸基或其等效物。在一些實施例中，5′端包括未連接到相鄰單核苷酸戊糖環(huán)的3′羥基的5′磷酸基。通常，5′端包括經(jīng)定位與5′磷酸相鄰的一個或多個連接的核苷酸，通常經(jīng)定位與包括5′磷酸基的核苷酸相鄰的30個核苷酸，通常末端20個并且甚至更通常末端15個核苷酸。通常，一個或多個連接的核苷酸可表示成寡核苷酸中存在的核苷酸的百分比，或可以與5′磷酸相鄰的許多連接的核苷酸形式提供。舉例來說，5′端可小于寡核苷酸的核苷酸長度的50％。在另一個例示性實施例中，5′端可包括與包括末端5′磷酸的核苷酸相鄰的約15個核苷酸。在一些實施例中，5′端不包括任何未連接的5′磷酸基，但可包括任何能夠充當與3′羥基或另一個核酸分子的3′端的連接位點的部分。在一些實施例中，例如當參考目標特異性引物時，術(shù)語“5′端”可包括5′端處的末端10個核苷酸、末端5個核苷酸、末端4、3、2或更少個核苷酸。在一些實施例中，當參考目標特異性引物時，術(shù)語“5′端”可包括位于核苷酸位置10的核苷酸或更少的來自5′端的核苷酸。在一些實施例中，目標特異性引物的5′端可僅包括非可裂解核苷酸，例如不含如本文中所披露的一個或多個可裂解基團的核苷酸，或可由所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員容易地測定的可裂解核苷酸。如本文中所使用，術(shù)語“雜交”符合其在所屬領(lǐng)域中的用途，并且通常指用于使兩個核酸分子經(jīng)歷堿基配對相互作用的方法。當一個核酸分子的任何部分與另一個核酸分子的任何部分堿基配對時，兩個核酸分子分子稱為雜交；未必需要兩個核酸分子跨越其全部各別長度雜交并且在一些實施例中，至少一個核酸分子可包括不與另一個核酸分子雜交的部分。短語“在嚴格條件下雜交”和其派生詞通常指可在存在高雜交溫度和低離子強度的條件下進行目標特異性引物與目標序列的雜交的條件。在一個例示性實施例中，嚴格雜交條件包括在約60-68℃下含有約30mm硫酸鎂、約300mmtris-硫酸鹽(ph8.9)和約90mm硫酸銨的水性環(huán)境或其等效物。如本文中所使用，短語“標準雜交條件”和其派生詞通常指可在存在低雜交溫度和高離子強度的情況下進行引物與寡核苷酸(即，目標序列)的雜交的條件。在一個例示性實施例中，標準雜交條件包括在約50-55℃下含有約100mm硫酸鎂、約500mmtris-硫酸鹽(ph8.9)和約200mm硫酸銨的水性環(huán)境或其等效物。如本文中所使用，術(shù)語“接合”和其派生詞通常指用于將兩個或更多個分子共價連接在一起(例如使兩個或更多個核酸分子彼此共價連接)的動作或方法。在一些實施例中，接合包括核酸的相鄰核苷酸之間的結(jié)合口。在一些實施例中，接合包括形成第一核酸分子的末端與第二核酸分子的末端之間的共價鍵。在一些實施例中，例如其中待接合的核酸分子包括常規(guī)核苷酸殘基的實施例，接合可包括形成一個核酸的5′磷酸基與第二核酸的3′羥基之間的共價鍵，從而形成經(jīng)接合的核酸分子。在一些實施例中，可使用任何用于在相鄰核苷酸之間使5′磷酸與3′羥基接合或結(jié)合的方法。在例示性實施例中，可使用酶，如連接酶。通常，在本發(fā)明中，經(jīng)擴增的目標序列可與銜接子接合以產(chǎn)生銜接子接合的經(jīng)擴增的目標序列。如本文中所使用，“連接酶”和其派生詞通常指任何能夠催化兩個襯底分子的接合的試劑。在一些實施例中，連接酶包括能夠催化核酸的相鄰核苷酸之間的接口的接合的酶。在一些實施例中，連接酶包括能夠催化一個核酸分子的5′磷酸與另一個核酸分子的3′羥基之間形成共價鍵，從而形成經(jīng)接合的核酸分子的酶。適合的連接酶可包括(但不限于)t4dna連接酶、t4rna連接酶以及大腸桿菌(e.coli)dna連接酶。如本文中所使用，“鈍端接合”和其派生詞通常指兩個鈍端雙鏈核酸分子彼此接合?！扳g端”指其中核酸分子的一個股的末端中的基本上所有核苷酸與同一個核酸分子的另一個股中的相對核苷酸堿基配對的雙股核酸分子的末端。如果核酸分子具有包括長度超過兩個核苷酸的單股部分的末端(本文中稱為“懸垂物”)，那么其不是鈍端的。在一些實施例中，核酸分子的末端不包括任何單股部分，使得末端的一個股中的每個核苷酸與同一個核酸分子的另一個股中的相對核苷酸堿基配對。在一些實施例中，變成彼此接合的兩個鈍端核酸分子的末端不包括任何重疊、共有或互補序列。通常，鈍端接合不包括使用其它寡核苷酸銜接子幫助雙股經(jīng)擴增的目標序列與雙股銜接子的接合，如2010年5月27日公開的mitra和varley，us2010/0129874中所描述的補丁寡核苷酸。在一些實施例中，鈍端接合包括接口平移反應(yīng)以密封在接合過程期間產(chǎn)生的接口。如本文中所使用，術(shù)語“銜接子”或“銜接子和其補體”以及其派生詞通常指任何可與本發(fā)明的核酸分子接合的線形寡核苷酸。任選地，銜接子包括基本上不與樣品內(nèi)至少一個目標序列的3′端或5′端互補的核酸序列。在一些實施例中，銜接子基本上不與樣品中任何目標序列的3′端或5′端互補。在一些實施例中，銜接子包括任何基本上不與經(jīng)擴增的目標序列互補的單股或雙股線形寡核苷酸。在一些實施例中，銜接子基本上不與樣品的至少一個、一些或全部核酸分子互補。在一些實施例中，適合的銜接子長度在約10-100個核苷酸、約12-60個核苷酸和約15-50個核苷酸長度范圍內(nèi)。通常，銜接子可包括核苷酸和/或核酸的任何組合。在一些方面中，銜接子可在一個或多個位置包括一個或多個可裂解基團。在另一個方面中，銜接子可包括與引物(例如通用引物)的至少一部分基本上一致或基本上互補的序列。在一些實施例中，銜接子可包括條碼或標簽以輔助下游編目、鑒別或測序。在一些實施例中，當與經(jīng)擴增的目標序列接合時，尤其在存在聚合酶和dntp的情況下在適合的溫度和ph值下，單股銜接子可充當用于擴增的襯底。如本文中所使用，術(shù)語“聚合酶鏈反應(yīng)”(“pcr”)指k.b.mullis，美國專利案第4,683,195號和第4,683,202號的方法，其以引用的方式并入本文中，其描述用于在不進行克隆或純化的情況下增加基因組dna的混合物中相關(guān)聚核苷酸的片段的濃度的方法。這種用于擴增相關(guān)聚核苷酸的過程由以下組成：將大量過量的兩種寡核苷酸引物引入含有所需相關(guān)聚核苷酸的dna混合物，接著是在dna聚合酶存在下熱循環(huán)的精確序列。兩種引物與相關(guān)雙股聚核苷酸的其相應(yīng)股互補。為了實現(xiàn)擴增，使混合物變性，并且然后將引物粘接到相關(guān)聚核苷酸分子內(nèi)的其互補序列。在粘接之后，用聚合酶使引物延伸以形成一對新互補股。變性、引物粘接和聚合酶延伸的步驟可以重復(fù)多次(即，變性、粘接和延伸構(gòu)成一個“循環(huán)”；可以存在眾多“循環(huán)”)以獲得所需相關(guān)聚核苷酸的高濃度的擴增的片段。所需相關(guān)聚核苷酸的擴增的片段(擴增子)的長度通過引物相對于彼此的相對位置測定，并且因此這一長度是可控制參數(shù)。借助于重復(fù)所述過程，所述方法被稱為“聚合酶鏈反應(yīng)”(在下文中“pcr”)。因為相關(guān)聚核苷酸的所需擴增的片段變?yōu)榛旌衔镏械闹饕怂嵝蛄?就濃度來說)，所以其被稱為“pcr擴增的”。如本文中所定義，包括多種目標核酸分子的樣品內(nèi)的目標核酸分子經(jīng)由pcr而擴增。在上文所論述的方法的一個改進中，目標核酸分子可以使用多種不同引物對、在一些情況下一種或多種引物對/相關(guān)標靶核酸分子而pcr擴增，由此形成多重pcr反應(yīng)。使用多重pcr，有可能同時從樣品擴增多種相關(guān)核酸分子以形成經(jīng)擴增的目標序列。還可能通過數(shù)種不同方法(例如，用生物分析儀或qpcr定量，用經(jīng)標記的探針雜交；并入生物素化的引物，接著進行抗生物素蛋白-酶結(jié)合物檢測；將經(jīng)32p標記的脫氧核苷酸三磷酸酯(例如dctp或datp)并入到經(jīng)擴增的目標序列中)檢測擴增的目標序列。任何寡核苷酸序列可用適合的引物集合擴增，從而實現(xiàn)目標核酸分子從基因組dna、cdna、福馬林固定的鏈烷烴嵌入型dna、細針穿刺活檢(fine-needlebiopsies)和多種其它來源的擴增。具體來說，由如本文中所披露的多重pcr過程產(chǎn)生的經(jīng)擴增的目標序列本身是用于后續(xù)pcr擴增或多種下游分析或操作的有效襯底。如本文中所定義，“多重擴增”是指樣品內(nèi)的兩種或更多種目標序列使用至少一種目標特異性引物的選擇性并且非隨機的擴增。在一些實施例中，進行多重擴增，使得一些或全部目標序列在單一反應(yīng)容器內(nèi)擴增。既定多重擴增的“重數(shù)”或“重”通常是指在所述單一多重擴增期間擴增的不同目標特異性序列的數(shù)目。在一些實施例中，重數(shù)可以是約12重、24重、48重、96重、192重、384重、768重、1536重、3072重、6144重或更多重。如本文中所使用，“循環(huán)測序”指包括向目標核酸或其擴增產(chǎn)物中添加測序引物、脫氧核苷酸三磷酸酯(dntp)、經(jīng)染料標記的鏈封端核苷酸(例如雙脫氧核苷酸三磷酸酯(ddntp-染料))以及dna聚合酶，接著進行熱循環(huán)測序的過程。已明確標準循環(huán)測序程序。循環(huán)測序程序更詳細地描述于例如美國專利案第5,741,676號和美國專利案第5,756,285號，其各自以全文引用的方式并入本文中。在某些實施例中，“循環(huán)測序”包含如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的dntp、測序引物(經(jīng)標記或未經(jīng)標記)、ddntp(經(jīng)標記或未經(jīng)標記)和dna聚合酶。應(yīng)注意，經(jīng)標記的測序引物可提供目標核酸或其擴增產(chǎn)物的序列的片段分析信息和/或測定。如本文中所使用，術(shù)語“pcr/循環(huán)測序”指用于通過pcr擴增dna，接著重復(fù)(或循環(huán))若干次測序反應(yīng)來測定dna的核苷酸序列的方法。這一循環(huán)與pcr類似，因為允許在可進行聚合酶延伸的預(yù)先選擇的溫度進行測序反應(yīng)，即42℃-55℃，接著通過加熱到95℃來停止延伸，并且最終在42℃-55℃下再次開始循環(huán)。循環(huán)測序使用熱穩(wěn)定dna聚合酶。如本文中所使用，術(shù)語“硫代磷酸酯鍵”指糖磷酸酯主鏈的磷酸酯鍵內(nèi)包含代替非橋聯(lián)氧原子的硫原子的核苷酸間鍵。術(shù)語硫代磷酸酯鍵指硫代磷酸酯核苷酸間鍵和二硫代磷酸酯核苷酸間鍵?！澳┒?′端處的硫代磷酸酯鍵”指3′端處的硫代磷酸酯鍵，也就是說，3′端處糖磷酸酯主鏈的最后一個磷酸酯鍵。末端3′端處的硫代磷酸酯鍵說明于圖2中。如本文中所使用，術(shù)語“磷酸二酯鍵”可指鍵-po4-，其用于連接核苷酸單體，如在天然存在的dna中發(fā)現(xiàn)的核苷酸間鍵。此外，“磷酸二酯鍵”可指本發(fā)明的化學增強型引物的ncm或ncm連接子的部分。如本文中所使用，術(shù)語“核酸酶抗性鍵”指對由核酸酶進行的3′到5′方向的消化具有抗性的寡核苷酸序列，如引物。硫代磷酸酯和硼磷酸酯鍵是核酸酶抗性鍵的兩個實例。實例不應(yīng)解釋為僅限于這些實例。如本文中所使用，術(shù)語“引物”和其派生物通常指可與相關(guān)目標序列雜交的任何聚核苷酸。在一些實施例中，引物也可以用于激活核酸合成。典型地，引物充當襯底，其上可由聚合酶聚合核苷酸；然而，在一些實施例中，引物可變得并入合成的核酸鏈中并且提供另一引物可雜交的位點以激活與所合成的核酸分子互補的新股的合成。引物可包含核苷酸或其類似物的任何組合，其可任選地連接以形成任何適合長度的線形聚合物。在一些實施例中，引物是單股寡核苷酸或聚核苷酸。(在本發(fā)明中，術(shù)語“聚核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互換地使用并且未必指示兩個核苷酸之間長度的任何差異)。在一些實施例中，引物是單股，但其也可以是雙股。引物任選地天然產(chǎn)生，如在純化的限制消化中，或可以合成方式產(chǎn)生。在一些實施例中，當暴露于擴增或合成條件時，引物充當用于擴增或合成的起始點；這類擴增或合成可以模板依賴性方式進行并且任選地形成與至少一部分目標序列互補的引物延伸產(chǎn)物。例示性擴增或合成條件可包括使引物與聚核苷酸模板(例如包括目標序列的模板)、核苷酸和誘導(dǎo)劑(如聚合酶)在適合的溫度和ph值下接觸，以誘導(dǎo)目標特異性引物的末端上核苷酸的聚合。如果是雙股，在用于制備引物延伸產(chǎn)物之前，引物可任選地經(jīng)處理以分離其各股。在一些實施例中，引物是寡脫氧核苷酸或寡核糖核苷酸。在一些實施例中，引物可包括一個或多個核苷酸類似物。目標特異性引物的確切長度和/或組成(包括序列)可影響許多特性，包括熔融溫度(tm)、gc含量、次要結(jié)構(gòu)的形成、重復(fù)核苷酸主結(jié)構(gòu)、所預(yù)測的引物延伸產(chǎn)物的長度、跨越相關(guān)核酸分子的覆蓋度的程度、單次擴增或合成反應(yīng)中的引物數(shù)目、引物內(nèi)是否存在核苷酸類似物或經(jīng)修飾的核苷酸等。在一些實施例中，引物可在擴增或合成反應(yīng)內(nèi)與相容的引物配對以形成由正向引物和反向引物組成的引物對。在一些實施例中，引物對的正向引物包括基本上與核酸分子的一個股的至少一部分互補的序列，并且引物對中引物的反向引物包括基本上與所述股線的至少一部分一致的序列。在一些實施例中，正向引物和反向引物能夠與核酸雙螺旋的相對股雜交。任選地，正向引物激活第一核酸鏈的合成，并且反向引物激活第二核酸鏈的合成，其中第一和第二股基本上彼此互補，或可雜交以形成雙股核酸分子。在一些實施例中，擴增或合成產(chǎn)物的一端由正向引物定義并且擴增或合成產(chǎn)物的另一端由反向引物定義。在一些實施例中，當需要擴增或合成冗長引物延伸產(chǎn)物(如擴增外顯子、編碼區(qū)或基因)時，可產(chǎn)生若干引物對而非跨越所需長度以實現(xiàn)所述區(qū)域的足夠擴增。在一些實施例中，引物可包括一個或多個可裂解基團。在一些實施例中，引物長度在約10到約60個核苷酸、約12到約50個核苷酸和約15到約40個核苷酸長度范圍內(nèi)。典型地，當在存在dntp和聚合酶的情況下暴露于擴增條件時，引物能夠與相應(yīng)的目標序列雜交并且進行引物延伸。在一些情況下，具體核苷酸序列或引物的一部分在擴增反應(yīng)開始時已知或可通過本文所披露的方法中的一種或多種測定。在一些實施例中，引物在引物內(nèi)的一個或多個位置包括一個或多個可裂解基團。如本文中所使用，“目標特異性引物”和其派生物通常指單鏈或雙股聚核苷酸，通常是寡核苷酸，其包括至少一個與包括目標序列的核酸分子的至少一部分至少50％互補，通常至少75％互補或至少85％互補，更通常至少90％互補，更通常至少95％互補，更通常至少98％或至少99％互補或一致的序列。在這類情況下，目標特異性引物和目標序列描述成彼此“相應(yīng)”。在一些實施例中，目標特異性引物能夠與其相應(yīng)目標序列的至少一部分(或目標序列的補體)雜交；這類雜交可任選地在標準雜交條件下或在嚴格雜交條件下進行。在一些實施例中，目標特異性引物不能與目標序列或其補體雜交，但能夠與包括目標序列的核酸鏈的一部分或其補體雜交。在一些實施例中，目標特異性引物包括至少一個與目標序列本身的至少一部分至少75％互補，通常至少85％互補，更通常至少90％互補，更通常至少95％互補，更通常至少98％互補或更通常至少99％互補的序列；在其它實施例中，目標特異性引物包括至少一個與除目標序列以外的核酸分子的至少一部分至少75％互補，通常至少85％互補，更通常至少90％互補，更通常至少95％互補，更通常至少98％互補或更通常至少99％互補的序列。在一些實施例中，目標特異性引物基本上不與樣品中的其它目標序列互補；任選地，目標特異性引物基本上不與樣品中的其它核酸分子互補。在一些實施例中，樣品中不包括或?qū)?yīng)于目標序列(或目標序列的補體)的核酸分子稱為“非特異性”序列或“非特異性核酸”。在一些實施例中，目標特異性引物經(jīng)設(shè)計以包括基本上與其相應(yīng)目標序列的至少一部分互補的核苷酸序列。在一些實施例中，目標特異性引物與包括其相應(yīng)目標序列的核酸分子的至少一部分至少95％互補或至少99％互補或一致(跨越其全部長度)。在一些實施例中，目標特異性引物可與其相應(yīng)目標序列的至少一部分至少90％、至少95％互補、至少98％互補或至少99％互補或一致(跨越其全部長度)。在一些實施例中，正向目標特異性引物和反向目標特異性引物定義靶特異性引物對，其可用于經(jīng)由模板依賴性引物延伸來擴增目標序列。通常，目標特異性引物對中的每個引物包括至少一個與包括相應(yīng)目標序列的核酸分子的至少一部分基本上互補，但與樣品中的至少一個其它目標序列小于50％互補的序列。在一些實施例中，擴增可在單次擴增反應(yīng)中使用多個目標特異性引物對進行，其中每個引物對包括正向目標特異性引物和反向目標特異性引物，各自包括至少一個與樣品中的相應(yīng)目標序列基本上互補或基本上一致的序列，并且每個引物對具有不同的相應(yīng)目標序列。在一些實施例中，目標特異性引物可在其3′端或其5′端與擴增反應(yīng)中的任何其它目標特異性引物是基本上非互補性。在一些實施例中，目標特異性引物可包括擴增反應(yīng)中與其它目標特異性引物的最小交叉雜交。在一些實施例中，目標特異性引物包括與擴增反應(yīng)混合物中非特異性序列的最小交叉雜交。在一些實施例中，目標特異性引物包括最小自身互補性。在一些實施例中，目標特異性引物可包括位于3′端的一個或多個可裂解基團。在一些實施例中，目標特異性引物可包括位于目標特異性引物的中心核苷酸附近或周圍的一個或多個可裂解基團。在一些實施例中，更多個目標特異性引物中的一個僅包括目標特異性引物的5′端處的非可裂解核苷酸。在一些實施例中，任選地在相同擴增反應(yīng)中，與一個或多個不同目標特異性引物相比，目標特異性引物包括引物的3′端或5′端處的最小核苷酸序列重疊。在一些實施例中，單一反應(yīng)混合物中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種目標特異性引物包括以上實施例中的一個或多個。在一些實施例中，單一反應(yīng)混合物中基本上所有的多種目標特異性引物包括以上實施例中的一個或多個。如本文中所使用，術(shù)語“化學增強型引物”指可在引物的末端5′端或引物內(nèi)具有帶負電部分的引物。引物還可以包括3′端處糖磷酸主鏈的最后一個磷酸鍵處的核酸酶抗性鍵。如本文中所使用，術(shù)語“測序引物”指用于起始對核酸進行的測序反應(yīng)的寡核苷酸引物。術(shù)語“測序引物”指正向測序引物和反向測序引物。如本文中所使用，術(shù)語“延伸引物”指寡核苷酸，其能夠粘接到與目標序列相鄰的核酸區(qū)域并且通過使用目標序列作為在所屬領(lǐng)域中眾所周知的合適的條件下的核苷酸延伸的互補模板來充當用于寡核苷酸的延伸的起始引物。通常，測序反應(yīng)使用至少一個延伸引物或一對延伸引物。配對將包括“上游”或“正向”引物和“下游”或“反向”引物，其待測序的核酸目標序列的區(qū)域。如本文中所使用，術(shù)語“擴增引物”指寡核苷酸，其能夠粘接到與目標序列相鄰的rna或dna區(qū)域，并且充當用于在所屬領(lǐng)域中眾所周知的合適的條件下的核酸合成的起始引物。通常，pcr反應(yīng)使用一對擴增引物，其包括“上游”或“正向”引物和“下游”或“反向”引物，其限定待擴增的rna或dna的區(qū)域。如本文中所使用，術(shù)語“帶尾引物”或“帶尾擴增引物”或“帶尾測序引物”指在3′端包括能夠粘接到與目標序列相鄰的rna或dna區(qū)域并且充當用于在所屬領(lǐng)域中眾所周知的合適的條件下的dna合成的起始引物的序列的引物。引物在其5′端包括不與目標序列互補的序列。如本文中所使用，當關(guān)于既定引物使用時，術(shù)語“延伸”和其派生詞包含涉及一個或多個核苷酸在現(xiàn)有核酸分子的末端上的聚合的既定聚合酶的任何體內(nèi)或體外酶促活性特征。典型地但未必，這類引物延伸以模板依賴性方式進行；在模板依賴性延伸期間，通過既定堿基配對規(guī)則進行堿基的排序和選擇，所述規(guī)則可包括沃森-克里克型堿基配對規(guī)則，或(并且尤其在涉及核苷酸類似物的延伸反應(yīng)的情況下)通過一些其它類型的堿基配對范例進行。在一個非限制性實例中，延伸通過聚合酶經(jīng)由核酸分子的3′oh端上核苷酸的聚合進行。如本文所使用，術(shù)語“核酸序列”可指核酸物質(zhì)本身，并且不限于以生物化學方式表征特異性核酸(例如dna或rna分子)的序列信息(即在五個基本字母a、c、g、t或u中選擇的字母串)。除非另有指示，否則本文中展示的核酸以5′→3′定向呈現(xiàn)。如本文所使用，術(shù)語“遷移率依賴性分離”可指由與片段相關(guān)的電荷和尺寸引起的核酸片段的分離。如本文所使用，術(shù)語“熒光染料”指吸收既定激發(fā)波長的光能并且發(fā)出不同波長的光能的部分。所選擇使用的熒光染料優(yōu)選是可以光譜方式解析的。如本文中所使用，“可以光譜方式解析”意指染料在操作條件下可基于其光譜特征(具體來說，熒光發(fā)射波長)而被區(qū)分。舉例來說，一個或多個末端核苷酸的一致性可與最大發(fā)光強度的不同波長或可能不同波長處的強度比率相關(guān)。如本文所使用，術(shù)語“核堿基”或“堿基”指能夠與互補核堿基或核堿基類似物(例如嘌呤、7-脫氮嘌呤或嘧啶)形成沃森-克里克型氫鍵的含氮雜環(huán)部分。典型核堿基是天然存在的核堿基腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、5mc、尿嘧啶、胸腺嘧啶以及天然存在的核堿基的類似物，例如7-脫氮腺嘌呤、7-脫氮-8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、7-脫氮-8-氮鳥嘌呤、n6-δ2異戊烯基-腺嘌呤(6ia)、n6-δ2-異戊烯基-2-甲基硫腺嘌呤(2ms6ia)、n2-二甲基-鳥嘌呤(dmg)、7-甲基鳥嘌呤(7mg)、肌苷、水粉蕈素、硝基吡咯、硝基吲哚、2-氨基-嘌呤、2，6-二氨基-嘌呤、次黃嘌呤、假尿苷、假胞啶、假異胞苷、5-丙炔基-胞嘧啶核苷、異胞啶、異鳥嘌呤、2-硫代嘧啶、6-硫鳥嘌呤、4-硫胸腺嘧啶、4-硫尿嘧啶、o6-甲基鳥嘌呤、n6-甲基-腺嘌呤、o4-甲基胸腺嘧啶、5，6-二氫胸腺嘧啶、5，6-二氫尿嘧啶、4-甲基吲哚、吡唑并[3，4-d]嘧啶(參見例如美國專利案第6,143,877號和第6,127,121號以及pct公開申請案wo01/38584)和亞乙烯基腺嘌呤。核苷酸堿基的非限制性實例可見于例如fasman，《生物化學和分子生物學實踐手冊(practicalhandbookofbiochemistryandmolecularbiology)》，第385-394頁，crcpress，bocaraton，fla.(1989)中。如本文中使用，術(shù)語“核苷酸”和其派生詞包含任何可選擇性結(jié)合于聚合酶或可通過聚合酶聚合的化合物，包括(但不限于)任何天然存在的核苷酸或其類似物。典型地但未必，核苷酸與聚合酶的選擇性結(jié)合后面是核苷酸通過聚合酶向核酸鏈中的聚合；然而偶爾，核苷酸可以從聚合酶解離而不變得并入到核酸鏈中，這是在本文中被稱為“非生產(chǎn)性”事件的事件。這類核苷酸不僅包括天然存在的核苷酸，而且包括可以與聚合酶選擇性結(jié)合或可以通過聚合酶聚合的任何類似物(與其結(jié)構(gòu)無關(guān))。雖然天然存在的核苷酸典型地包含堿基、糖和磷酸酯部分，但本發(fā)明的核苷酸可以包括不具有這類部分中的任一個、一些或全部的化合物。在一些實施例中，核苷酸可以任選地包括包含三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個磷原子的磷原子鏈。在一些實施例中，磷鏈可以連接到糖環(huán)的任何碳，例如5′碳。磷鏈可以用介入o或s鍵聯(lián)到糖。在一個實施例中，鏈中的一個或多個磷原子可以是具有p和o的磷酸酯基的一部分。在另一實施例中，鏈中的磷原子可以用介入o、nh、s、亞甲基、經(jīng)取代亞甲基、亞乙基、經(jīng)取代亞乙基、cnh2、c(o)、c(ch2)、ch2ch2或c(oh)ch2r(其中r可以是4-吡啶或1-咪唑)鍵聯(lián)在一起。在一個實施例中，鏈中的磷原子可以具備具有o、bh3或s的側(cè)基。在磷鏈中，具有除o以外的側(cè)基的磷原子可以經(jīng)磷酸酯基取代。在磷鏈中，具有除o以外的介入原子的磷原子可以是經(jīng)取代的磷酸酯基。核苷酸類似物的一些實例描述于xu的美國專利第7,405,281號中。在一些實施例中，核苷酸包含標記并且在本文中稱為“經(jīng)標記的核苷酸”；經(jīng)標記的核苷酸的標記在本文中稱為“核苷酸標記”。在一些實施例中，標記可呈連接到末端磷酸基(即距離糖最遠的磷酸基)的熒光染料形式?？梢杂糜谒_的方法和組合物中的核苷酸的一些實例包括(但不限于)核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、經(jīng)修飾的核糖核苷酸、經(jīng)修飾的脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸聚磷酸酯、脫氧核糖核苷酸聚磷酸酯、經(jīng)修飾的核糖核苷酸聚磷酸酯、經(jīng)修飾的脫氧核糖核苷酸聚磷酸酯、肽核苷酸、金屬核苷酸、膦酸酯核苷和經(jīng)修飾的磷酸酯-糖主鏈核苷酸，前述化合物的類似物、衍生物或變異體等。在一些實施例中，核苷酸可以包含非氧部分(如硫基或硼烷部分)代替氧部分，所述氧部分橋接核苷酸的α磷酸酯與糖、或核苷酸的α與β磷酸酯、或核苷酸的β與γ磷酸酯、或核苷酸的任何其它兩種磷酸酯之間、或其任何組合。“核苷酸5′-三磷酸”指在5′位置具有三磷酸酯基并且有時表示為“ntp”或“dntp”和“ddntp”以具體指出核糖的結(jié)構(gòu)特征的核苷酸。三磷酸酯基可包括多個氧的硫取代，例如α-硫基-核苷酸5′-三磷酸酯。關(guān)于核酸化學的綜述，參見：shabarova，z.和bogdanov，a.，《核酸的高級有機化學(advancedorganicchemistryofnucleicacids)》，vch，newyork，1994。如本文中所使用，術(shù)語“聚核苷酸”、“核酸”或“寡核苷酸”指通過核苷間鍵接合的核苷(包括脫氧核糖核苷、核糖核苷或其類似物)的線形聚合物。每當聚核苷酸(如寡核苷酸)由一連串字母，如“atgcctg”表示時，應(yīng)理解，除非另外指出，否則核苷酸按從左到右的5′→3′順序并且“a”表示脫氧腺苷，“c”表示脫氧胞苷，“g”表示脫氧鳥苷，并且“t”表示脫氧胸苷。如在所屬領(lǐng)域中標準的，字母a、c、g和t可用于指堿基本身、核苷或包含堿基的核苷酸。在天然存在的聚核苷酸中，核苷間鍵通常是磷酸二酯鍵，并且子單元稱為“核苷酸”。在教示內(nèi)容的某些實施例中，使用包含其它核苷間鍵的寡核苷酸引物，如硫代磷酸酯鍵。應(yīng)了解，與非磷酸二酯鍵組成這類寡核苷酸引物的子單元中的一個或多個可不包含磷酸基。這類核苷酸的類似物視為屬于如本文中所使用的術(shù)語“核苷酸”的范疇內(nèi)并且包含一個或多個不是磷酸二酯鍵的核苷間鍵的核酸仍稱為“聚核苷酸”、“寡核苷酸”等。如本文中使用，“聚合酶”和其派生詞通常指可催化核苷酸(包括其類似物)聚合成核酸鏈的任何酶。典型地但未必，這類核苷酸聚合可以模板依賴性方式進行。這類聚合酶可以包括(但不限于)天然存在的聚合酶和其任何子單元和截斷、突變聚合酶、變異聚合酶、重組、融合或以其它方式工程改造的聚合酶、經(jīng)化學修飾的聚合酶、合成分子或組件以及保留催化這類聚合的能力的任何類似物、衍生物或其片段。任選地，聚合酶可以是包含一個或多個突變的突變型聚合酶，所述突變涉及用其它氨基酸替換一個或多個氨基酸，來自聚合酶的一個或多個氨基酸的插入或缺失或兩個或更多個聚合酶的部分的連接。典型地，聚合酶包含可以進行核苷酸結(jié)合和/或核苷酸聚合催化的一個或多個活性位點。一些例示性聚合酶包括(但不限于)dna聚合酶和rna聚合酶。如本文中所使用，術(shù)語“聚合酶”和其變化形式也指包含至少兩個彼此連接的部分的融合蛋白，其中第一部分包含可以催化核苷酸聚合成核酸鏈的肽并且所述第一部分連接到包含第二多肽的第二部分。在一些實施例中，第二多肽可以包括報導(dǎo)子酶或增強持續(xù)合成能力的結(jié)構(gòu)域。任選地，聚合酶可具有5′外切核酸酶活性或末端轉(zhuǎn)移酶活性。在一些實施例中，聚合酶可任選地再活化，例如通過使用熱、化學物質(zhì)或?qū)⑿碌牧康木酆厦冈偬砑拥椒磻?yīng)混合物中。在一些實施例中，聚合酶可包括可任選地再活化的熱起始聚合酶或基于適體的聚合酶。如本文中所定義，“樣品”和其派生詞以其最廣泛含義使用并且包括任何懷疑包括目標的樣本、培養(yǎng)物等。在一些實施例中，樣品包含dna、rna、pna、lna、嵌合、雜交或多重形式的核酸。樣品可包括任何含有一個或多個核酸的基于生物、臨床、手術(shù)、農(nóng)業(yè)、大氣壓或水生的樣本。所述術(shù)語還包括任何經(jīng)分離的核酸樣品，例如基因組dna、新鮮冷凍或福爾馬林(formalin)固定的石蠟包埋的核酸樣本。如本文所使用，“序列測定”、“測定核苷酸堿基序列”、“測序”和類似術(shù)語包括測定部分以及完全序列信息。也就是說，所述術(shù)語包括序列比較、指紋識別和關(guān)于目標多核苷酸的類似程度的信息，以及相關(guān)區(qū)域內(nèi)目標多核苷酸的每個核苷的表達鑒別和次序。在某些實施例中，“序列測定”包含鑒別單核苷酸，而在其它實施例中，鑒別超過一個核苷酸。核苷、核苷酸和/或堿基的鑒別在本文中視為等效的。應(yīng)注意，對聚核苷酸進行序列測定通常產(chǎn)生關(guān)于完美互補聚核苷酸的序列的等效信息，并且因此與對完美互補聚核苷酸直接進行序列測定等效。如本文中所用，術(shù)語“試劑盒”指用于傳遞物質(zhì)的任何傳遞系統(tǒng)。在反應(yīng)分析的情形下，這類傳遞系統(tǒng)包括允許從一個位置到另一個位置儲存、輸送或傳遞反應(yīng)試劑(例如適合的容器中的寡核苷酸、酶、引物集等)和/或支持材料(例如緩沖劑、進行分析的書面說明)的系統(tǒng)。舉例來說，試劑盒可包括一個或多個含有相關(guān)反應(yīng)試劑和/或支持物質(zhì)的外殼(例如盒子)。如本文所使用，術(shù)語“分部式試劑盒”指兩個或更多個單獨的容器的傳遞系統(tǒng)，每個單獨的容器含有完整試劑盒組分的子部分。容器可共同或單獨地購買和/或傳遞給既定接收方。舉例來說，第一個容器可含有用于分析的酶，而第二個容器含有寡核苷酸。實際上，在術(shù)語“分部式試劑盒”中包括任何包含兩個或更多個單獨的容器的傳遞系統(tǒng)，所述容器各自含有完整試劑盒組分的子部分。相比之下，“組合試劑盒”指在單個容器中(例如在收納各種所需組分的單個盒子中)含有反應(yīng)分析的所有組分的傳遞系統(tǒng)。術(shù)語“試劑盒”包括分部式和組合式試劑盒。如所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將了解，對模板、寡核苷酸、引物等的參考通常意指相關(guān)區(qū)域而非單一分子內(nèi)基本上一致的核酸分子的群體或集合。舉例來說，“模板”通常意指多個基本上一致的模板分子；“引物”通常意指多個基本上一致的引物分子等。如本文所用，術(shù)語“包含”、“包含著”、“包括”、“包括著”“具有”、“具有著”或其任何其它變化意圖涵蓋非排它性的包涵。舉例來說，包括一列特征的過程、方法、物品或裝置不一定僅限于那些特征，但可以包括沒有明確列出或所述過程、方法、物品或裝置所固有的其它特征。另外，除非有明確的相反陳述，否則“或”是指包容性的或，而非排他性的或。舉例來說，通過以下中的任一項來滿足條件a或b：a是真(或存在)且b是假(或不存在)，a是假(或不存在)且b是真(或存在)，以及a和b兩者都是真(或存在)。用于校驗ngs測序結(jié)果的方法。引入既定的ionampliseqtm圖以及其它用于檢測和表征在腫瘤組織中發(fā)生的可行突變的使用下一代測序(nextgenerationsequencing；ngs)技術(shù)的市售分析具有引起翻譯腫瘤學研究革命的潛力。這種技術(shù)進一步描述于2011年4月28日提交的美國申請案第61/479,952號；2011年9月6日提交的第61/531,583號；2011年9月6日提交的第61/531,574號；2011年9月22日提交的第61/538,079號；2011年11月29日提交的第61/564,763號；2011年12月20日提交的第61/578,192號；2012年2月2日提交的第61/594,160號；2012年2月14日提交的第61/598,881號；2012年2月14日提交的第61/598,892號；2012年4月17日提交的第61/625,596號；2012年4月26日提交的第61/639,017號；2012年4月27日提交的第13/458,739號；2012年10月29日提交的第13/663,334號；2012年11月16日提交的第13/679,706號；以及名稱為《目標核酸的檢測、鑒別、驗證和富集(detection，identification，validation，andenrichmentoftargetnucleicacids)》，代理人案號lt00974pro，同一日期提交中；并且每個公開案以全文引用的方式并入本文中。通過iontorrent獲得的ionampliseqtm癌癥熱點圖版本2(chpv2)包括50個基因中的207個可行突變目標，并且通過lifetechnologiescompendiabiosciencetm研究的更全面的iononcominetm癌癥圖(ocp)含有超過2000個突變。這些iontorrentampliseq癌癥圖的標志是需要少量的輸入dna，其在臨床樣本材料受到限制(如細針穿刺活檢、抽出物、lcm或ffpe樣品)時是重要的。通常，10ng從這些來源獲得的dna足以產(chǎn)生信息性測序資料。通常，與主要正常等位基因相比，在相對低等位基因頻率(例如10至20％)下檢測到致癌性或促癌性突變。需要新的方法來驗證這些通過直系同源方法(如傳統(tǒng)的用毛細電泳(ce)(如appliedbiosystems3500基因分析器)進行的染料-熒光桑格測序)獲得的低頻率突變的發(fā)現(xiàn)結(jié)果。本文中描述實現(xiàn)直接來自ampliseqtm文庫起始物質(zhì)的個別ionampliseq目標的擴增和桑格測序的工作流。這一工作流也可以與由大規(guī)模平行測序的其它下一代測序(ngs)方法產(chǎn)生的文庫起始物質(zhì)一起使用。所述方法需要1μl(約5％)原始ampliseqtm預(yù)擴增材料的保持器。使用這一等分試樣的稀釋物作為用于個別化pcr/測序反應(yīng)的模板源?？蓮淖畛跤?0ngffpedna制備的iontorrentampliseqtm文庫成功地擴增和桑格測序來自chpv2圖的48個目標的隨機選擇。此外，所有個別24個目標的成功桑格再測序涵蓋來自用oncomineampliseq圖處理和預(yù)先擴增的相同樣品的tp53外顯子。綜合而言，這一方法允許使用桑格ce測序進行來自材料局限性極高的樣本的相關(guān)潛在突變的反映測試。其提供用于檢驗和跟蹤通過桑格測序獲得的ngs結(jié)果的反映溶液，尤其對于具有極有限量的可供使用的dna的樣品，如從細針穿利活檢、抽出物、福馬林固定的鏈烷烴嵌入嵌入ffpe)和激光捕捉顯微切割(lcm)中的任一種獲得的樣品。此外，這一工作流與典型的桑格測序方案相比提供其它優(yōu)點，去除額外的操控和純化。這一流水線在操作數(shù)量有限的樣品時也是有利的。舉例來說，典型的pcr反應(yīng)使用過量的擴增引物，一些引物在pcr反應(yīng)完成時仍未并入。這必須在進行測序反應(yīng)之前移除過量引物，因為過量的擴增引物將干擾后續(xù)測序反應(yīng)，并且可能產(chǎn)生異常序列梯。pcr反應(yīng)進一步含有可干擾后續(xù)測序反應(yīng)的過量的dntp。在當前工作流中，在開始循環(huán)測序反應(yīng)之前向測序反應(yīng)混合物中添加核酸酶，所述核酸酶可以是(但不限于)外切核酸酶i，利用其水解特性使pcr混合物中的單股dna降解，因此使擴增產(chǎn)物(擴增子)更高效地用于后續(xù)測序反應(yīng)中。在過去，難以在電泳期間不犧牲輸送量滯留時間的情況下獲得測序引物附近的核酸序列的解析。遷移率系統(tǒng)的類型的調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)變性條件和溫度可改良解析，但始終以增加電泳時間為代價。在進行尺寸依賴性移動性分離時，移除未并入的反應(yīng)物的困難和長滯留時間促進核酸測序的低效率。存在可解決這些問題的經(jīng)改良的direct擴增/測序工作流的若干優(yōu)點。僅需要一次合成后凈化；其可在同一個反應(yīng)容器中極容易地進行。此外，化學增強型測序引物的性質(zhì)產(chǎn)生可在不存在污染和使來自過量試劑的信號復(fù)雜化的情況下更易于檢測的延伸產(chǎn)物，而不減緩電泳實驗。申請人意外發(fā)現(xiàn)ampliseqtm引物設(shè)計可運用于桑格ce測序中。使用bigdyedirect測序的高級化學方法，其使如本文中和交叉參考申請案中所描述的工作流流水線化，實現(xiàn)更簡單、耗時更短的測序分析，其也具有極高的5′解析。使用目標特異性核酸酶敏感性擴增引物的m13標簽允許使用m13化學增強型測序引物，其在開始序列片段制備之前現(xiàn)場經(jīng)受過量pcr擴增引物的核酸酶降解。此外，m13化學增強型測序引物的其它修飾允許在相關(guān)序列的堿基編號1處開始堿基判讀?；瘜W增強型測序引物的使用和桑格測序工作流的組合步驟的各種方面進一步描述于2008年2月4日提交的美國申請案第6i/026,085號；2009年2月3日提交的第12/365,140號；2010年10月28日提交的第61/407,899號；2010年10月29日提交的第61/408,553號；2011年10月28日提交的第13/284,839號；以及2012年2月15日提交的第13/397,626號中，其中每個公開案以全文引用的方式并入本文中。申請人還意外發(fā)現(xiàn)1ng基因組dna足以用于來自單個目標的序列的正向/反向?qū)?。此外，可稀釋來自低?fù)雜度ampliseqtm圖(即chpv2和ocp)的預(yù)擴增(pa)材料并且用作re-pcr和桑格測序的模板源。尚未嘗試將高復(fù)雜度ampliseqtm圖(ccp和完全外顯子組)用于re-pcr和測序，但可實現(xiàn)獲取。提供用于測序至少一個擴增子的方法，其包括以下步驟：提供至少一個擴增子，其中所述至少一個擴增子包含相關(guān)序列和從第一激活序列并入的相對于相關(guān)序列位于5′的前導(dǎo)序列；使所述至少一個擴增子在第一反應(yīng)混合物中擴增，所述第一反應(yīng)混合物包括多種核酸酶敏感性擴增引物以形成經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物；使含有經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物的第一反應(yīng)混合物與包含核酸酶和至少一種化學增強型引物的第二反應(yīng)混合物接觸，所述至少一種化學增強型引物引起多種核酸酶敏感性擴增引物由核酸酶降解；使核酸酶失活；在測序反應(yīng)中用至少一種化學增強型引物激活經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物；以及制備至少一種化學增強型引物的延伸產(chǎn)物。在一些實施例中，延伸產(chǎn)物可以經(jīng)熒光標記。在各種實施例中，可使用第一激活序列產(chǎn)生擴增子。在各種實施例中，第一激活序列可包括至少一個可裂解部分。在一些實施例中，前導(dǎo)序列可以是第一激活序列的一部分。在所述方法的各種實施例中，可在相同反應(yīng)器中進行使第一反應(yīng)混合物與第二反應(yīng)混合物接觸、使核酸酶失活以及制備化學增強型引物的延伸產(chǎn)物的步驟。在各種實施例中，可在不存在中間純化步驟的情況下進行使至少一個擴增子擴增、使第一反應(yīng)混合物與第二反應(yīng)混合物接觸、使核酸酶失活以及制備化學增強型引物的延伸產(chǎn)物的步驟。在所述方法的各種實施例中，所述至少一個擴增子進一步包括相對于相關(guān)序列位于3′的接續(xù)序列，其中接續(xù)序列與用于產(chǎn)生至少一個擴增子的第二激活序列互補。至少一個擴增子可具有約100個核苷酸到約400個核苷酸的長度。至少一個擴增子的相關(guān)序列可具有約100個核苷酸到約300個核苷酸的長度。在其它實施例中，至少一個擴增子的相關(guān)序列可具有約125個核苷酸到約275或約250個核苷酸的長度。所述至少一個擴增子可以是多個擴增子。在一些實施例中，多個擴增子可包括至少兩個不同擴增子，第一個具有作為主要變異序列的相關(guān)序列，并且第二個擴增子具有來自樣品核酸的相同區(qū)域的次要變異序列。在一些實施例中，所述方法進一步包括以下步驟：基于測序反應(yīng)獲得測序結(jié)果；以及基于所述結(jié)果測定至少相關(guān)序列的核苷酸堿基序列。測序結(jié)果可通過基于遷移率的分離方法獲得。在一些實施例中，基于遷移率的分離方法可以是毛細電泳法。在一些實施例中，可比較所測定的至少序列相關(guān)的核苷酸堿基序列與從ngs測序方法獲得的至少相關(guān)序列的第二核苷酸堿基序列。ngs測序方法可包括大規(guī)模平行測序技術(shù)，例如使用熒光團或半導(dǎo)體檢測的合成測序和焦磷酸測序。在一些實施例中，ngs測序方法可以是半導(dǎo)體測序。在各種實施例中，擴增dna可包括聚合酶鏈反應(yīng)擴增。在所選擇的實施例中，測序反應(yīng)可包括循環(huán)測序。在各種實施例中，第一反應(yīng)混合物還可以包括聚合酶。聚合酶可以是熱穩(wěn)定聚合酶。在一些實施例中，聚合酶可以是taq聚合酶。第一反應(yīng)混合物可進一步包括脫氧核苷酸三磷酸酯。在各種實施例中，第二反應(yīng)混合物進一步包含聚合酶、脫氧核苷酸三磷酸酯和經(jīng)染料標記的雙脫氧核苷酸三磷酸酯。第二反應(yīng)混合物的聚合酶可以是熱穩(wěn)定聚合酶。在一些實施例中，聚合酶是taq聚合酶。在用于測序至少一個擴增子的方法的各種實施例中，核酸酶可選自外切核酸酶i、exoiii、pfu和dnapoli。在用于測序至少一個擴增子的方法的各種實施例中，多個核酸酶敏感性擴增引物中的每一個可經(jīng)配置以激活特定疾病病況的相關(guān)序列。在一些實施例中，多個核酸酶敏感性擴增引物可激活與特定疾病病況有關(guān)的一組序列。描述用于確定dna序列的另一種方法，其包括以下步驟：使用至少第一激活序列使包含核酸的樣品擴增以提供多個擴增子，其中多個擴增子中的每一個包括相關(guān)序列和相對于從第一激活序列并入的相關(guān)序列位于5′的前導(dǎo)序列；使在包括多個核酸酶敏感性擴增引物的第一反應(yīng)混合物中使所述多個擴增子的第一等分試樣擴增，以形成經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物；使含有經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物的第一反應(yīng)混合物與包括核酸酶和至少一種化學增強型引物的第二反應(yīng)混合物接觸，其中通過使核酸酶與第一反應(yīng)混合物接觸，核酸酶敏感性擴增引物由核酸酶降解；使核酸酶失活；在測序反應(yīng)中用至少一種化學增強型引物激活經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物；以及制備化學增強型引物的延伸產(chǎn)物。在一些實施例中，延伸產(chǎn)物可以經(jīng)熒光標記。在各種實施例中，可使用第一激活序列產(chǎn)生擴增子。第一激活序列可包括至少一個可裂解部分。在一些實施例中，前導(dǎo)序列可以是第一激活序列的一部分。在所述方法的各種實施例中，可在相同反應(yīng)器中進行使第一反應(yīng)混合物與第二反應(yīng)混合物接觸、使核酸酶失活以及制備化學增強型引物的延伸產(chǎn)物的步驟。在各種實施例中，可在不存在中間純化步驟的情況下進行使多個擴增子擴增、使第一反應(yīng)混合物與第二反應(yīng)混合物接觸、使核酸酶失活以及制備化學增強型引物的延伸產(chǎn)物的步驟。在所述方法的各種實施例中，多個擴增子中的每一個進一步包括相對于相關(guān)序列位于3′的接續(xù)序列，其中接續(xù)序列與用于產(chǎn)生擴增子的第二激活序列互補。多個擴增子中的每一個可具有約100個核苷酸到約400個核苷酸的長度。多個擴增子中的每一個的相關(guān)序列可具有約100個核苷酸到約300個核苷酸的長度。在其它實施例中，多個擴增子中的每一個的相關(guān)序列可具有約125個核苷酸到約275或約250個核苷酸的長度。在一些實施例中，多個擴增子可包括至少兩個不同擴增子，第一個具有作為主要變異序列的相關(guān)序列，并且第二個擴增子具有來自樣品核酸的相同區(qū)域的次要變異序列。在一些實施例中，所述方法進一步包括以下步驟：基于測序反應(yīng)獲得測序結(jié)果；以及基于所述結(jié)果測定至少相關(guān)序列的核苷酸堿基序列。測序結(jié)果可通過基于遷移率的分離方法獲得。在一些實施例中，基于遷移率的分離方法可以是毛細電泳法。在一些實施例中，可比較至少相關(guān)序列的所測定的核苷酸堿基序列與從對多個擴增子的第二等分試樣進行ngs測序方法獲得的至少相關(guān)序列的第二核苷酸堿基序列。ngs測序方法可包括大規(guī)模平行測序技術(shù)，例如使用熒光團或半導(dǎo)體檢測的合成測序和焦磷酸測序。在一些實施例中，ngs測序方法可以是半導(dǎo)體測序。在各種實施例中，擴增dna可包括聚合酶鏈反應(yīng)擴增。在所選擇的實施例中，測序反應(yīng)可包括循環(huán)測序。在各種實施例中，第一反應(yīng)混合物還可以包括聚合酶。聚合酶可以是熱穩(wěn)定聚合酶。在一些實施例中，聚合酶可以是taq聚合酶。第一反應(yīng)混合物可進一步包括脫氧核苷酸三磷酸酯。在各種實施例中，第二反應(yīng)混合物進一步包含聚合酶、脫氧核苷酸三磷酸酯和經(jīng)染料標記的雙脫氧核苷酸三磷酸酯。第二反應(yīng)混合物的聚合酶可以是熱穩(wěn)定聚合酶。在一些實施例中，聚合酶是taq聚合酶。在用于確定dna序列的方法的各種實施例中，核酸酶可選自外切核酸酶i、exoiii、pfu和dnapoli。在用于確定dna序列的方法的各種實施例中，多個核酸酶敏感性擴增引物中的每一個可經(jīng)配置以激活特定疾病病況的相關(guān)序列。在一些實施例中，多個核酸酶敏感性擴增引物可激活與特定疾病病況有關(guān)的一組序列。提供用于準備dna測序的另一種方法，其包括以下步驟：使用至少第一激活序列擴增包含核酸的樣品以提供多個擴增子，其中多個擴增子中的每一個包括相關(guān)序列和從第一激活序列并入的相對于相關(guān)序列位于5′的前導(dǎo)序列；在第一反應(yīng)混合物中使多個擴增子的等分試樣擴增以形成經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物，所述第一反應(yīng)混合物包括核酸酶敏感性擴增引物；使含有經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物的第一反應(yīng)混合物與包含核酸酶和化學增強型引物的第二反應(yīng)混合物接觸，其中通過使核酸酶與第一反應(yīng)混合物接觸，核酸酶敏感性擴增引物由核酸酶降解；使核酸酶失活；在測序反應(yīng)中用化學增強型引物激活經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物；以及制備化學增強型引物的延伸產(chǎn)物。描述用于測序和檢驗相關(guān)變異型核酸序列的另一種方法，其包括以下步驟：使用至少第一激活序列使包括核酸的樣品擴增以提供多個擴增子，其中多個擴增子中的每一個包括相關(guān)序列和相對于從第一激活序列并入的相關(guān)序列位于5′的前導(dǎo)序列；將多個擴增子拆分成第一等分試樣和第二等分試樣；在包括核酸酶敏感性擴增引物的第一反應(yīng)混合物中使多個擴增子的第一等分試樣擴增以形成第一經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物；使含有第一經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物的第一反應(yīng)混合物與包括核酸酶和化學增強型引物的第二反應(yīng)混合物接觸，其中通過使核酸酶與第一反應(yīng)混合物接觸，核酸酶敏感性擴增引物由核酸酶降解；使核酸酶失活；在測序反應(yīng)中用化學增強型引物激活第一經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物；制備化學增強型引物的延伸產(chǎn)物；使用遷移率依賴性分離獲得經(jīng)延伸的化學增強型引物的至少相關(guān)序列的測序結(jié)果；以及測定經(jīng)延伸的化學增強型引物的至少相關(guān)序列的核苷酸堿基序列；使擴增子的第二等分試樣擴增以形成第二dna產(chǎn)物；使用ngs測序方法獲得第二dna產(chǎn)物的至少相關(guān)序列的測序結(jié)果；以及通過比較其與經(jīng)延伸的化學增強型引物的至少相關(guān)序列的核苷酸堿基序列來檢驗第二dna產(chǎn)物的核苷酸序列。在所述方法的各種實施例中，使多個擴增子的第二等分試樣擴增以形成第二dna產(chǎn)物的步驟進一步包含接合接附子、結(jié)合于珠粒和接合條形碼中的至少一個。對于上文所描述的方法中的任一種并且遍及本發(fā)明，核酸還可以使用其它方法擴增，如多股置換擴增、解螺旋酶移位擴增、接口平移、qβ復(fù)制酶擴增、滾環(huán)擴增和其它等溫擴增方法。待擴增的核酸可包含例如rna、dna、cdna、基因組dna、病毒dna、質(zhì)體dna、重組dna、擴增子dna、合成dna等。對于上文所描述的方法中的任一種并且遍及本發(fā)明，待測序的模板可在乳液的個別水性隔室(也稱為“反應(yīng)器”)中通過pcr合成。在一些實施例中，隔室可各自含有粒狀負載物，如珠粒(其具有與其附接的適合的第一擴增引物)、模板的第一復(fù)本、第二擴增引物以及pcr反應(yīng)所需的組分(例如核苷酸、聚合酶、輔因子等)。用于制備乳液的方法描述于例如美國專利案第6,489,103b1號、美國專利案第5,830,663號和美國專利申請公開案第us2004/0253731號中。用于在乳液的個別隔室內(nèi)進行pcr以產(chǎn)生連接到微米粒子的模板的群體的方法描述于例如dressman，d.等人，《美國國家科學院院刊(proc.natl.acad.sci.)》，100(15)：8817-8822,2003和pct公開案wo2005010145中。本文中所描述的所有專利案、申請案、公開案和文獻以全文引用的方式并入本文中。根據(jù)各種實施例，擴增引物可包含帶尾引物。帶尾引物可用于例如產(chǎn)生目標特異性擴增子，其合并有能夠粘接到通用引物或基因特異性引物的核酸序列。對于上文所描述的方法中的任一種并且遍及本發(fā)明，與雙股聚核苷酸相比，適用于標的方法的核酸酶優(yōu)先降解單股聚核苷酸，因此破壞過量的引物同時留下可用于后續(xù)步驟中的測序的完整的雙股擴增子。在各種實施例中，核酸酶可包含例如外切核酸酶i。外切核酸酶i可從許多商業(yè)供應(yīng)商獲得，例如usbcorp.，cleveland，ohio。適合的反應(yīng)條件可包括例如最佳時間、溫度和緩沖液參數(shù)以實現(xiàn)核酸酶活性。在一些實施例中，舉例來說，可通過向擴增反應(yīng)產(chǎn)物中添加外切核酸酶i并且在約37℃下培育約10到約30分鐘來降解過量的擴增引物。外切核酸酶i可按3′→5′方向水解單股dna。外切核酸酶i可對熱失活敏感并且可通過加熱來基本上100％失活，例如在約80℃下加熱約15分鐘?？捎糜跇说姆椒ê徒M合物中的其它熱失活核酸酶包括(但不限于)exoiii、pfu或dnapoli。在各種實施例中，核酸酶的失活可在囊泡內(nèi)和與測序反應(yīng)相同的反應(yīng)步驟中進行。在過量擴增引物可由核酸酶降解的反應(yīng)條件下，化學增強型測序引物可基本上不由包含核酸酶(例如外切核酸酶i)的反應(yīng)混合物降解?！盎旧喜唤到狻币庵富瘜W增強型測序引物進行的任何降解都不是可顯著干擾后續(xù)測序反應(yīng)或片段分析反應(yīng)中用于產(chǎn)生測序和/或片段分析資料的過程的程度。在一些實施例中，化學增強型測序引物可包含更多個核酸酶抗性核苷酸間鍵中的一個。舉例來說，核苷酸間鍵可以是硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，化學增強型測序引物可在末端3′端、末端5′端和/或一個或多個內(nèi)部鍵位點處包含核酸酶抗性核苷酸間鍵。在一些實施例中，核酸酶抗性核苷酸間鍵是至少一個硫代磷酸酯鍵。合成在末端3′端上具有一個或兩個硫代磷酸酯鍵的化學增強型測序引物以保護化學增強型測序引物避免外切核酸酶i消化。sp立體異構(gòu)體可保護引物避免外切核酸酶i消化，但發(fā)現(xiàn)rp立體異構(gòu)體不提供保護避免外切核酸酶i消化(資料未圖示)。對于上文所描述的方法中的任一種并且遍及本發(fā)明，遷移率依賴性分離選自由電荷進行的分離和由尺寸進行的分離，其中由尺寸加電荷進行的分離選自凝膠電泳和毛細電泳并且由尺寸進行的分離是通過液體梯度和變性梯度培養(yǎng)基進行。測序反應(yīng)產(chǎn)物可在篩分或非篩分培養(yǎng)基上分析。在這些教示內(nèi)容的一些實施例中，舉例來說，pcr產(chǎn)物可以通過電泳來分析；例如毛細電泳，如以下文獻中所描述：h.wenz等人，(1998)，《基因組研究(genomeres.)》8：69-80(還參見e.buel等人，(1998)，《法醫(yī)科學雜志(j.forensicsci.)》43：(1)，第164-170頁))，或平板凝膠電泳，如以下文獻中所描述：m.christensen等人，(1999)，《臨床實驗研究(scand.j.clin.lab.invest.)》59(3)：167-177，或變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(參見例如j.sambrook等人，(1989)，《分子克?。簩嶒炇沂謨?molecularcloning：alaboratorymanual)》，第二版，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.，第13.45-13.57頁)。電泳中dna片段的分離主要基于不同的片段尺寸。測序反應(yīng)產(chǎn)物也可以通過色譜分析；例如通過尺寸排阻色譜(sec)。類似地，可以類似方式進行片段分析，如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知。對于上文所描述的方法中的任一種并且遍及本發(fā)明，ddntp中的每一個可用不同的熒光染料(ddntp-染料)標記。舉例來說，ddntp可包含ddntp，可從appliedbiosystems，fostercity，california購得。在一些實施例中，化學增強型引物可用熒光染料標記。標記可連接到寡核苷酸序列和/或化學增強型引物的ncm區(qū)域。對于上文所描述的方法中的任一種并且遍及本發(fā)明，化學增強型引物可包括寡核苷酸序列、ncm并且不存在或至少一個核酸酶抗性鍵。在一些實施例中，化學增強型引物可包括位于末端3′端的一個核酸酶抗性鍵?；瘜W增強型引物可包括位于末端5′端或化學增強型引物的寡核苷酸序列內(nèi)的多個ncm。在一些實施例中，多個ncm可位于末端5′端。在各種實施例中，ncm可以是(cn)間隔基，其中n是1到9的任何整數(shù)。ncm可包括多個(cn)間隔基。在各種實施例中，化學增強型引物可具有下式的結(jié)構(gòu)：(cn)x-oligo，其中(cn)x具有下式的結(jié)構(gòu)：其中n的每個實例可獨立地是1到9的整數(shù)；并且x可以是1到約30的整數(shù)；oligo具有下式的結(jié)構(gòu)：其中b是核堿基；k是s或o；m是0或1；z是3到約100的整數(shù)；w是oh、f、ome或h；并且nt是具有下式的部分：在一些實施例中，化學增強型引物可具有如本發(fā)明中所描述的任何結(jié)構(gòu)?？稍诒景l(fā)明教示的范圍內(nèi)使用其它類型的化學增強型引物。舉例來說，核酸酶抗性測序引物可包含烷基膦酸酯單體，ro-p(＝o)(-me)(-or)，如da-me-氨基膦酸酯和/或三酯單體，ro-p(＝o)(-or′)(-or)，如da-me-氨基磷酸酯(可從glenresearch，sterling，va購得)，和/或鎖核酸單體(可從exiqon，woburn，ma購得)，和/或硼烷磷酸酯單體，ro-p(-bh3)(＝o)(-or)，如由以下文獻描述：shaw，barbararamsey等人，《含硼adp和gdp類似物的合成：核苷5′-(p-硼烷二磷酸酯)(synthesisofboron-containingadpandgdpanalogues：nucleoside5′-(p-boranodisphosphates))》，《核苷和核酸化學中的觀點(perspectivesinnucleosideandnucleicacidchemistry)》，第125-130，(2000)頁等，在另一方法中，一種或多種化學增強型引物可用于接合延伸反應(yīng)。在一些實施例中，用于接合延伸反應(yīng)的化學增強型引物經(jīng)熒光標記。在一些實施例中，接合延伸化學增強型引物在3′端經(jīng)熒光標記。適用于方法中的聚合酶。本文所描述的方法中可使用多種核酸聚合酶。舉例來說，核酸聚合酶可以是熱穩(wěn)定聚合酶或熱可降解聚合酶。適合的熱穩(wěn)定聚合酶包括(但不限于)從水生棲熱菌(thermusaquaticus)、嗜熱棲熱菌(thermusthermophilus)、沃氏火球菌(pyrococcuswoesei)、激烈火球菌(pyrococcusfuriosus)、海濱嗜熱球菌(thermococcuslitoralis)和海棲熱袍菌(thermotogamaritima)分離的聚合酶。適合的熱可降解聚合酶包括(但不限于)大腸桿菌dna聚合酶i、大腸桿菌dna聚合酶i的克列諾片段(klenowfragment)、t4dna聚合酶、t5dna聚合酶、t7dna聚合酶等?？捎糜诒疚乃枋龅姆椒ㄖ械钠渌酆厦傅膶嵗╰7、t3、sp6rna聚合酶以及amv、m-mlv和hiv逆轉(zhuǎn)錄酶?？捎糜诒疚乃枋龅姆椒ㄖ械氖惺劬酆厦傅姆窍拗菩詫嵗?但不限于)cs(appliedbiosystems)、amplitaqfs(appliedbiosystems)、amplitaqgold(appliedbiosystems)、kentaq1(abpeptide，st.louis，missouri)、taquenase(scientechcorp.，st.louis，missouri)、thermosequenase(amersham)、bst聚合酶、ventr(胞外-)dna聚合酶、readertmtaqdna聚合酶、venttmdna聚合酶(newenglandbiolabs)、deepventtmdna聚合酶(newenglandbiolabs)、pfuturbotmdna聚合酶(stratagene)、tthdna聚合酶、klentaq-1聚合酶、sequenasetm1.0dna聚合酶(amershambiosciences)和sequenase2.0dna聚合酶(unitedstatesbiochemicals)。方法的用途。任選地，所述方法進一步包括檢測和/或鑒別經(jīng)由經(jīng)擴增的目標序列的核酸測序鑒別的樣品中的突變。在一些實施例中，針對與癌癥相關(guān)的突變引導(dǎo)目標序列或經(jīng)擴增的目標序列。在一些實施例中，針對與選自由以下組成的群組的一種或多種癌癥相關(guān)的突變引導(dǎo)目標序列或經(jīng)擴增的目標序列：頭頸癌、腦癌、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、膽囊癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌、睪丸癌、肝癌、肺癌、腎臟(腎細胞)癌、食道癌、胰臟癌、甲狀腺癌、膽管癌、垂體腫瘤、威爾姆斯腫瘤(wilmstumor)、卡堡氏肉瘤(kaposisarcoma)、骨肉瘤、胸腺癌、皮膚癌、心臟癌、口腔和咽喉癌癥、白血病、神經(jīng)母細胞瘤和非霍奇金式淋巴瘤(non-hodgkinlymphoma)。在一個實施例中，突變可包括取代、插入、反轉(zhuǎn)、點突變、缺失、錯配和易位。在一個實施例中，突變可包括復(fù)本數(shù)的變化。在一個實施例中，突變可包括生殖系或體細胞突變。在一個實施例中，與癌癥相關(guān)的突變位于美國專利公開案20120295819的表1或4中所提供或美國申請案第61/598,881號的表7中所提供的基因中的至少一種中，各自以全文引用的方式并入本文中。在一些實施例中，突變可以是美國專利公開案20120295819的表5中所提供或美國申請案61/598,881的表7中所提供的基因組座標中的任一個，各自以全文引用的方式并入本文中。在一些實施例中，針對與癌癥相關(guān)的突變的目標序列可包括美國專利公開案20120295819的表10中提供的突變中的任一個或多個，其以全文引用的方式并入本文中。在一些實施例中，可在美國專利公開案20120295819的表16或表18中提供的基因組座標中的任一個或多個內(nèi)發(fā)現(xiàn)突變，其以全文引用的方式并入本文中。在一些實施例中，與癌癥相關(guān)的突變位于選自以下的基因中的至少一個中：abi1；abl1；abl2；acsl3；acsl6；aff1；aff3；aff4；akap9；akt1；akt2；alk；apc；arhgap26；arhgef12；arid1a；arnt；aspscr1；asxl1；atf1；atic；atm；axin2；bap1；bard1；bcar3；bcl10；bcl11a；bcl11b；bcl2；bcl3；bcl6；bcl7a；bcl9；bcr；birc3；blm；bmpr1a；braf；brca1；brca2；brd3；brd4；brip1；bub1b；card11；cars；casc5；cbfa2t3；cbfb；cbl；cblb；cblc；ccdc6；ccnb1ip1；ccnd1；ccnd2；cd74；cd79a；cdc73；cdh1；cdh11；cdk4；cdk6；cdkn2a；cdkn2b；cdkn2c；cdx2；cebpa；cep110；chek1；chek2；chic2；chn1；cic；ciita；clp1；cltc；cltcl1；col1a1；creb1；creb3l2；crebbp；crtc1；crtc3；csf1r；ctnnb1；cxcr7；cyld；cytsb；dclk3；ddb2；ddit3；ddr2；ddx10；ddx5；ddx6；dek；dgkg；dicer1；dnmt3a；egfr；eif4a2；elf4；ell；eln；eml4；ep300；eps15；erbb2；erbb4；erc1；ercc2；ercc3；ercc4；ercc5；erg；etv1；etv4；etv5；etv6；ewsr1；ext1；ext2；ezh2；fam123b；fanca；fancc；fancd2；fance；fancf；fancg；fas；fbxw7；fcrl4；fgfr1；fgfr1op；fgfr2；fgfr3；fh；fip1l1；flcn；fli1；flt1；flt3；fnbp1；foxl2；foxo1；foxo3；foxo4；foxp1；fus；gas7；gata1；gata2；gata3；gmps；gnaq；gnas；golga5；gopc；gpc3；gphngpr124；hip1；hist1h4i；hlf；hnf1a；hnrnpa2b1；hook3；hoxa11；hoxa13；hoxa9；hoxc11；hoxc13；hoxd13；hras；hsp90aa1；hsp90ab1；idh1；idh2；ikzf1；il2；il21r；il6st；irf4；itga10；itga9；itk；jak1；jak2；jak3；kdm5a；kdm5c；kdm6a；kdr；kdsr；kiaa1549；kit；klf6；klk2；kras；ktn1；laspl；lck；lcp1；lhfp；lifr；lmo2；lpp；maf；malt1；maml2；map2k1；map2k4；mdm2；mdm4；mecom；men1；met；mitf；mkl1；mlh1；mll；mllt1；mllt10；mllt3；mllt4；mllt6；mn1；mpl；mre11a；msh2；msh6；msi2；msn；mtcp1；mtor；muc1；myb；myc；mycl1；mycn；myh11；myh9；myst3；myst4；naca；nbn；ncoa1；ncoa2；ncoa4；nek9；nf1；nf2；nfe2l2；nfkb2；nin；nkx2-1；nlrp1；nono；notch1；notch2；npm1；nr4a3；nras；nsd1；ntrk1；ntrk3；numa1；nup214；nup98；olig2；omd；pafah1b2；palb2；patz1；pax3；pax5；pax7；pax8；pbrm1；pbx1；pcm1；pde4dip；pdgfb；pdgfra；pdgfrb；per1；phox2b；picalm；pik3ca；pik3r1；pim1；plag1；pml；pms1；pms2；pou2af1；pou5f1；pparg；ppp2r1a；prcc；prdm16；prf1；prkar1a；prrxl；psipl；ptch1；pten；ptpn11；rabep1；rad50；rad51l1；raf1；ranbp17；rap1gds1；rara；rb1；rbm15；recql4；rel；ret；rhoh；rnf213；ros1；rpn1；rps6ka2；runx1；runx1t1；sbds；sdhaf2；sdhb；setd2；sfpq；sfrs3；sh3gl1；slc45a3；smad4；smarca4；smarcb1；smo；socs1；src；srgap3；ss18；ss18l1；stil；stk11；stk36；sufu；syk；taf15；taf1l；tal1；tal2；tcf12；tcf3；tcl1a；tet1；tet2；tex14；tfe3；tfeb；tfg；tfrc；thrap3；tlx1；tlx3；tmprss2；tnfaip3；top1；tp53；tpm3；tpm4；tpr；trim27；trim33；trip11；tsc1；tsc2；tshr；usp6；vhl；was；whscll1；wrn；wt1；xpa；xpc；zbtb16；zmym2；znf331；znf384；和znf521。在一些實施例中，與癌癥相關(guān)的突變位于選自以下的基因中的至少一個中：abl1；akt1；alk；apc；atm；braf；cdh1；cdkn2a；csf1r；ctnnb1；egfr；erbb2；erbb4；fbxw7；fgfr1；fgfr2；fgfr3；flt3；gnas；hnf1a；hras；idh1；jak2；jak3；kdr；kit；kras；met；mlh1；mpl；notch1；npm1；nras；pdgfra；pik3ca；pten；ptpn11；rb1；ret；smad4；smarcb1；smo；src；stk11；tp53；和vhl。在一些實施例中，經(jīng)擴增的目標序列針對美國專利公開案20120295819的表5、7或18中提供的基因組座標中的任一個或多個，所述文獻以全文引用的方式并入本文中。在一些實施例中，美國專利公開案20120295819的表2、3、6或17中提供的癌癥目標特異性引物中的任一種或多種(所述文獻以全文引用的方式并入本文中)可用于擴增樣品中的目標序列，如本文所描述的方法所披露。在一些實施例中，來自美國專利公開案20120295819的表2、3、6或17的癌癥目標特異性引物(其以全文引用的方式并入本文中)可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、40、60、80、100、150、200、400、500、800、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000或更多個目標特異性引物。在一些實施例中，經(jīng)擴增的目標序列可包括在美國專利公開案20120295819的表5、7、10或18中提供的基因組座標(使用擴增子id目標特異性引物)處產(chǎn)生的經(jīng)擴增的目標序列中的任一個或多個，所述文獻以全文引用的方式并入本文中。在一些實施例中，與癌癥相關(guān)的目標特異性引物中的至少一個與至少一個選自美國專利公開案20120295819的seqidno：1-103、143的核酸序列至少90％一致，所述文獻以全文引用的方式并入本文中。在一些實施例中，與癌癥相關(guān)的目標特異性引物中的至少一個跨越其全部長度與樣品中的至少一個目標序列互補。在一些實施例中，與癌癥相關(guān)的目標特異性引物中的至少一個包括3′端處的非可裂解核苷酸。在一些實施例中，3′端處的非可裂解核苷酸包括末端3′核苷酸。在一個實施例中，經(jīng)擴增的目標序列針對具有與癌癥相關(guān)的突變的個別外顯子。在一些實施例中，本發(fā)明大體上涉及樣品中超過一個目標序列的選擇性擴增和與癌癥相關(guān)的突變的檢測和/或鑒別。在一些實施例中，經(jīng)擴增的目標序列包括兩個或更多個美國專利公開案20120295819的表2中提供的核苷酸序列，其以全文引用的方式并入本文中。在一些實施例中，經(jīng)擴增的目標序列可包括使用美國專利公開案20120295819的表5中所提供或美國申請案61/598,881的表7中所提供的擴增子id目標特異性引物在基因組座標處產(chǎn)生的任一個或多個經(jīng)擴增的目標序列，所述文獻中的每一個以全文引用的方式并入本文中。在一個實施例中，經(jīng)擴增的目標序列包括100、200、500、1000、2000、3000、6000、8000、10,000、12,000個或更多個來自美國專利公開案20120295819的表1-5或美國申請案61/598,881的表6和7的擴增子，所述文獻以全文引用的方式并入本文中。在一些實施例中，本發(fā)明大體上涉及臨床上可行突變的檢測和任選的鑒別。如本文中所定義，術(shù)語“臨床上可行突變”包括已知的或可由所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員與(但不限于)癌癥治療的預(yù)后相關(guān)聯(lián)的突變。在一個實施例中，癌癥治療的預(yù)后包括與癌癥對藥物、藥物組合或治療方案起反應(yīng)或不起反應(yīng)相關(guān)的突變的鑒別。在一個實施例中，本發(fā)明大體上涉及多個目標序列從與癌癥的發(fā)作、進展或緩解有關(guān)或相關(guān)的核酸分子群體的擴增。在一些實施例中，使用本文所披露的引物準則設(shè)計目標特異性引物。在一些實施例中，目標特異性引物是使用本文所披露的引物準則設(shè)計并且針對與乳癌相關(guān)的一種或多種基因。在一些實施例中，與乳癌相關(guān)的目標特異性引物包括選自一種或多種基因的至少一種目標特異性引物，所述一種或多種基因選自由以下組成的群組：aim1、ar、atm、bard1、bcas1、brip1、ccnd1、ccnd2、ccne1、cdh1、cdk3，cdk4，cdkn2a、cdkn2b、camk1d、chek2、diras3、egfr、erbb2、epha3、erbb4、etv6、gnrh1、kctd9、cdca2、ebf2、emsy、bnip3l、pnma2、dpysl2、adra1a、stmn4、trim35、pak1、aqp11、clsn1a、rsf1、kctd14、thrsp、ndufc2、alg8、kctd21、usp35、gab2、dnah9、znf18、myocd、stk11、tp53、jak1、jak2、met、pdgfra、pml、pten、ret、tmprss2、wnk1、fgfr1、igf1r、ppp1r12b、ptprt、gstm1、ipo8、myc、znf703、mdm1、mdm2、mdm4，mkk4、p14kb、ncor1、nbn、palb2、rad50、rad51、pak1，rsf1、ints4、zmiz1、sephs1、foxm1、sdccag1、igf1r、tshz2、rpsk6k1、ppp2r2a、mtap、map2k4、aurkb、bcl2、bub1、cdca3、cdca4、cdc20、cdc45、chek1、foxm1、hdac2、igf1r、kif2c、kifc1、kras、rb1、smad4、ncor1、utx、mthdfd1l、rad51ap1、ttk和ube2c。在一些實施例中，本發(fā)明大體上涉及針對與先天性或遺傳性疾病相關(guān)的突變的目標序列的擴增。在一些實施例中，本發(fā)明可包括體細胞或胚系突變的目標序列的擴增。在一些實施例中，突變可以是常染色體顯性或常染色體隱性。在一個實施例中，與先天性或遺傳性疾病相關(guān)的突變位于美國專利公開案20120295819的表4中提供的基因或疾病中的至少一種中，所述文獻以全文引用的方式并入本文中。在一些實施例中，本發(fā)明涉及與選自由以下組成的群組的一種或多種遺傳性疾病相關(guān)的樣品中目標序列的擴增：腺苷氨基水解酶不足(ada)；無γ球蛋白血癥，x連鎖，1型；阿氏綜合癥(alagillesyndrome)；所有肥大和擴張型心肌癥；普禿癥(alunc)；亞爾培氏綜合癥(alperssyndrome)；α-1-抗胰蛋白酶不足；α-東南亞地中海貧血(alpha-thalassemia-southeastasia)；肌肉萎縮性側(cè)索硬化-葛雷克氏癥(amyotrophiclateralsclerosis-lougehrig′sdisease)；男性荷爾蒙不敏感綜合癥；無虹膜；強直性脊柱炎；apc相關(guān)息肉病狀；精氨基琥珀酸裂解酶不足；右心室發(fā)育不良/心肌??；伴有2型動眼運用不能的共濟失調(diào)；伴有維生素e不足的共濟失調(diào)；共濟失調(diào)-毛細血管擴張癥；自體免疫性多內(nèi)分泌綜合癥；β-羥基異丁?；鵦oa脫酰酶不足(hibch不足)；生物素酶不足；瞼裂狹小-上瞼下垂-倒轉(zhuǎn)型內(nèi)眥贅皮；疙瘡綜合癥；短指；短指-高血壓綜合癥；b1型短指；腮耳腎譜系障礙；brca1；軀干發(fā)育不良；卡納萬氏病(canavan)；腦腱性黃瘤癥；蠟樣質(zhì)-褐質(zhì)病-巴通氏病(ceroid-lipofuscinoses-batton)；2b型腓骨肌萎縮癥；1b型恰克-馬利-杜斯神經(jīng)病(charcot-marie-toothneuropathytype1b)；2a2型恰克-馬利-杜斯神經(jīng)?。徊焓暇C合癥(chargesyndrome)；頜骨增大；無脈絡(luò)膜；希特林蛋白缺乏癥(citrindeficiency)；i型瓜氨酸血癥；科菲-洛雷綜合癥(coffin-lowrysyndrome)；柯亨綜合癥(cohensyndrome)；膠原蛋白4a5；常見可變免疫缺陷；先天性腎上腺增生；先天性白內(nèi)障、面部畸形和神經(jīng)??；1a型糖基化的先天性病癥；先天性重肌無力綜合癥；科妮莉亞蘭格綜合癥(corneliadelangesyndrome)；囊腫性纖維化；胱氨酸癥；毛囊角化病；結(jié)蛋白沉積性肌病；dfna2非綜合型聽力損失；戴-布二氏貧血(diamond-blackfananemia)；雙皮層綜合癥；杜恩氏綜合癥(duanesyndrome)；杜興氏/貝克爾肌肉萎縮癥(duchenne/beckermusculardystrophy)；遠端型肌病；先天性角化不良；早發(fā)型家族性阿爾茨海默病(early-onsetfamilialalzheimerdisease)；早發(fā)型原發(fā)性肌肉張力不足(dyt1)；埃戴二氏病(ehlersdanlos)；埃戴二氏綜合癥，傳統(tǒng)型；埃戴二氏綜合癥，運動過度型；埃戴二氏綜合癥，脊柱后側(cè)凸形式；x連鎖型艾-德二氏肌肉萎縮癥(emery-dreifussmusculardystrophyxlinked)；單純性大皰性表皮松懈；法布里病(fabrydisease)；面肩胛臂肌肉萎縮癥；家族性自主神經(jīng)失調(diào)(hsaniii)；家族性胰島素過多(fhi)；家族性肥大心肌??；家族性甲狀腺素運載蛋白淀粉樣變性；范康尼氏貧血(fanconianemia)；脆性x；弗里德賴希共濟失調(diào)(friedreichataxia)；frmd7相關(guān)嬰兒眼球震顫；法尼斯綜合癥(frynssyndrome)；半乳糖血癥；戈謝疾病(gaucherdisease)；甘氨酸腦??；vi型糖原儲積病；噬血細胞性淋巴組織細胞增生癥；a型血友?。籦型血友?。话橛忻庖呷毕莸母戊o脈-閉塞疾?。贿z傳性出血性毛細血管擴張癥；伴有壓力麻痹的遺傳性神經(jīng)??；遺傳性非息肉病性結(jié)腸癌；己糖胺酶a不足；hfe相關(guān)遺傳性血色沉著?。换魻柼?奧拉姆綜合癥(holt-oramsyndrome)；亨延頓氏病(huntingtondisease)；羥甲基膽素合成酶(hmbs)不足；低堿性磷酸酯酶癥；包涵體肌病2；色素失禁癥；青少年息肉病綜合癥；卡爾曼綜合癥(kallmannsyndrome)；雷伯氏先天性黑蒙(lebercongenitalamaurosis)；雷伯氏先天性黑蒙10；李-法梅尼綜合癥(li-fraumenisyndrome)；2a型臂-腰部肌肉萎縮癥遠端肌??；lis1相關(guān)無腦回；長qt綜合癥；洛維綜合癥(lowesyndrome)；惡性高溫敏感；楓糖漿尿?。籱apt相關(guān)病癥；麥克西克-考夫曼綜合癥(mckusick-kaufmansyndrome)；mecp2-瑞特綜合癥(mecp2-rettsyndrome)；門克斯氏病(menkes)；異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良；甲基丙二酸酸血癥；ii型粘脂儲積癥；1型多重內(nèi)分泌贅瘤形成；2型多重內(nèi)分泌贅瘤形成；先天性肌強直；1型強直性肌營養(yǎng)不良；2型強直性肌營養(yǎng)不良；指甲-髕骨綜合癥；線狀體肌病；1型神經(jīng)纖維瘤；2型神經(jīng)纖維瘤；努南綜合癥(noonansyndrome)；眼白化病，x連鎖；1型眼皮膚白化??；2型眼皮膚白化病；眼咽型肌營養(yǎng)不良；1型眼萎縮；鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶不足；成骨不全；帕金森病(parkinsondisease)；潘瑞德綜合癥(pendredsyndrome)；過氧化體生體合成，齊薇格型(zellweger)；苯丙酮尿癥；多囊性腎??；龐貝病-gsdii(pompedisease-gsdii)；原發(fā)性睫運動困難；色素性視網(wǎng)膜炎；成視網(wǎng)膜細胞瘤；西斯瑞-科增綜合癥(saethre-chotzensyndrome)；scn9a相關(guān)遺傳性紅斑性肢痛；shox相關(guān)單倍劑量不足；鐮狀細胞病；史密斯-來姆尼-奧皮茲綜合癥(smith-lemli-opitzsyndrome)；史密斯-瑪格尼斯綜合癥(smith-magenissyndrome)；索多斯綜合癥(sotossyndrome)；3a型痙攣性截癱；7型痙攣性截癱；8型痙攣性截癱；1型痙攣性截癱；4型痙攣性截癱；脊髓性肌萎縮；2型脊髓小腦失調(diào)；3型脊髓小腦失調(diào)；7型脊髓小腦失調(diào)；1型脊髓小腦失調(diào)；斯蒂克勒綜合癥(sticklersyndrome)；致死性骨發(fā)育不良；胸科主動脈動脈瘤和主動脈解剖；特雷徹柯林斯綜合征(treachercollinssyndrome)；三甲基胺尿癥；復(fù)雜結(jié)節(jié)性硬化癥；尤迪氏末端肌病(udddistalmyopathy)；1型尤塞氏綜合癥(ushersyndrometype1)；超長鏈?；?輔酶a去氫酶不足；馮希派爾-林道氏病(vonhippel-lindau)；沃登博格綜合癥(waardenburgsyndrome)，1型；沃爾納綜合癥(wernersyndrome)；威爾姆斯腫瘤(wilmstumor)；威爾遜病(wilsondisease)；韋斯考特-奧德里奇氏病(wiskott-aldrich)；先天性x連鎖腎上腺發(fā)育不全；x連鎖腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良；x連鎖肌肉張力不足-帕金森氏癥；x連鎖青少年視網(wǎng)膜分層剝離；x連鎖肌管性肌病；x連鎖scids；以及齊薇格式綜合癥(zellwegersyndrome)。在一個實施例中，與先天性或遺傳性疾病相關(guān)的突變可包括取代、插入、反轉(zhuǎn)、點突變、缺失、錯配和易位。在一些實施例中，與遺傳性或先天性疾病相關(guān)的突變包括復(fù)本數(shù)變化。在一些實施例中，本發(fā)明大體上涉及至少一個目標序列的選擇性擴增和與遺傳性疾病相關(guān)的突變的檢測和/或鑒別。在一些實施例中，與先天性或遺傳性疾病相關(guān)的突變可位于選自由以下組成的群組的基因中的一個或多個中：abca4；abcc8；abcd1；acadvl；acta2；actc；actc1；acvrl1；ada；aipl1；aire；alk1；alpl；amt；apc；app；aptx；ar；arl6；arsa；asl；aspa；ass；ass1；atl；atm；atp2a2；atp7a；atp7b；atxn1；atxn2；atxn3；atxn7；bbs6；bckdha；bckdhb；best1；bmpr1a；brca1；brca2；brip1；btd；btk；c2orf25；ca4；calr3；capn3；cav3；ccdc39；ccdc40；cdh23；cep290；cerkl；cftr；chat；chd7；chek2；chm；chrna1；chrnb1；chrnd；chrne；clcn1；cnbp；cngb1；coh1；col11a1；col11a2；col1a1；col1a2；col2a1；col3a1；col4a5；col5a1；col5a2；col7a1；col9a1；crb1；crx；ctdp1；ctns；cyp21a2；cyp27a1；dax1；dbt；dcx；des；dhcr7；dj1；dkc1；dld；dmd；dmpk；dnaaf1；dnaaf2；dnah11；dnah5；dnai1；dnai2；dnal1；dnm2；dok7；dsc2；dsg2；dsp；dysf；dyt1；emd；eng；eya1；eys；f8；f9；fanca；fancc；fancf；fancg；fancj；fandc2；fbn1；fbxo7；fgfr1；fgfr3；fmo3；fmr1；foxl2；frg1；frmd7；fscn2；fxn；gaa；galt；gba；gbe1；gcsh；gdf5；gjb2；gjb3；gjb6；gla；gldc；gne；gnptab；gpc3；gpr143；gucy2d；hba1；hba2；hbb；hd；herg；hexa；hfe；hhf；hibch；hla-b27；hmbs；hplh1；hprp3；hr；htnb；htt；ikbkap；ikbkg；il2rg；impdh1；itgb4；jag1；jph3；kcne1；kcne2；kcnh2；kcnq1；kcnq4；kiaa0196；klhl7；kras；krt14；krt5；l1cam；lamb3；lamp2；ldb3；lmna；lmx18；lrat；lrrk2；mapt；mc1r；mecp2；med12；men1；mertk；mfn2；mkks；mlh1；mmaa；mmab；mmachc；mmadhc；mpz；msh2；mtm1；mtnd5；mttg；mtti；mttk；mttl1；mttq；mut；mybpc3；myh11；myh6；myh7；myl2；myl3；mylk2；myo7a；nd5；nd6；nemo；nf1；nf2；nipbl；nr0b1；nr2e3；nras；nsd1；oca2；ocrl；opa1；otc；pabpn1；pafah1b1；pah；park2；park7；parkin；pax3；pax6；pcdh15；pexl；pex2；pex10；pex13；pex14；pex19；pex26；pex3；pex5；pink1；pkd1；pkd2；pkd3；pkhd1；pkp2；plec1；plod1；pmm2；pmp22；polg；ppt1；prcd；prkag2；prnp；prom1；prpf3；prpf8；prph2；prpn；psen1；psen2；ptch1；ptpn11；rab7a；raf1；rai1；rapsn；rb1；rdh12；rds；recql3；ret；rho；ror2；rp1；rp2；rp9；rpe65；rpgr；rpgrip1；rpl11；rpl35a；rps10；rps17；rps19；rps24；rps26；rps6ka3；rps7；rpsl5；rs1；rsph4a；rsph9；ryr1；ryr2；sall4；sca3；scn5a；scn9a；sema4a；serpina1；serping1；sgcd；sh3bp2；shox；six1；six5；slc25a13；slc25a4；slc26a4；smad4；smn1；snca；snrnp200；sod1；sos1；sox9；sp110；spast；spata7；spg3a；spg4；spg7；taf1；tbx5；tcof1；tgfbr1；tgfbr2；tnfrsc13c；tnnc1；tnni3；tnnt1；tnnt2；tnxb；topors；tor1a；tp53；tpm1；trng；trni；trnk；trnl1；trnq；tsc1；tsc2；ttn；ttpa；ttr；tulp1；twist1；txndc3；tyr；ush1c；ush1h；ush2a；vcl；vhl；vps13b；was；wrn；wt1；和znf9。用作校驗方法的輸入的擴增子。本發(fā)明的校驗和測序方法中使用的經(jīng)預(yù)先擴增的核酸可從許多來源獲得。擴增子可通過尺寸有限樣品的pcr擴增產(chǎn)生，包括(但不限于)本文中稱為ampliseq圖或分析的預(yù)先擴增方法。擴增子也可以通過橋聯(lián)擴增產(chǎn)生，如可用于測序的合成測序方法中。擴增子可經(jīng)由乳液pcr產(chǎn)生，同時連接到珠?；虮砻?。擴增子可通過可增加尺寸有限樣品的量的任何形式的擴增產(chǎn)生，所述擴增實現(xiàn)經(jīng)由大規(guī)模平行過程進行的測序以及允許保留待用于本發(fā)明的重測序和校驗方法中的經(jīng)預(yù)先擴增的樣品的等分試樣。因為可通過許多方法產(chǎn)生擴增子，其結(jié)構(gòu)的性質(zhì)可變化。擴增子具有至少一個相關(guān)序列和相對于相關(guān)序列位于5′的前導(dǎo)序列。這一前導(dǎo)序列在用于預(yù)先擴增尺寸有限樣品的過程期間引入。同樣，5′前導(dǎo)序列本身可包括兩個不同區(qū)域；包括5′前導(dǎo)序列的所有或一部分5′部分的過程衍生序列部分和包括5′前導(dǎo)序列的所有或一部分3′部分的序列特異性區(qū)域。5′前導(dǎo)序列的5′過程衍生序列區(qū)域可具有多種序列類型。具體序列取決于用于預(yù)先擴增的方法。這一5′過程衍生序列區(qū)域可以是“通用”引物序列、條碼序列、拔出序列和銜接子，一種用于固定用于預(yù)先擴增有限樣品的前驅(qū)體序列的序列，或某種組合。5′過程衍生序列可通過前驅(qū)體物質(zhì)的聚合酶延伸或另一類型的合并(包括(但不限于)接合)來并入。這些過程衍生序列中的每一個可用于選擇性更高地重新序列，確認或驗證初始測序分析。5′前導(dǎo)序列的3′序列特異性區(qū)域可以是實際激活引物物質(zhì)的特異性延伸并且因此提供尺寸有限樣品的擴增的引物的部分。3′部分可用于聚集針對測序方法(例如ampliseqtmcancerhotspotpanelv.2)中待研究的預(yù)先選擇的基因座集合的預(yù)先擴增的輸出?；蛘?，5′前導(dǎo)序列可僅具有一個序列特異性區(qū)域，其包括完整的5′前導(dǎo)序列。舉例來說，通過具有目標序列特異性寡核苷酸序列的引物的延伸產(chǎn)生的擴增子將不具有過程衍生序列部分，其全部長度僅是一個目標序列特異性寡核苷酸序列?；瘜W增強型引物。根據(jù)本發(fā)明教示的各種實施例，提供一種化學增強型引物，其包含寡核苷酸序列、帶負電部分(ncm)和至少一個核酸酶抗性鍵。在一些實施例中，至少一個核酸酶抗性鍵包括(但不限于)至少一個硫代磷酸酯鍵(ps)或至少一個硼磷酸酯鍵。在其它實施例中，化學增強型引物中不存在核酸酶抗性鍵。在其它實施例中，化學增強型引物可包含寡核苷酸序列、帶負電部分(ncm)，其中寡核苷酸核苷酸鍵由磷酸二酯間核苷酸鍵組成。引物可用于激活測序反應(yīng)中的目標核酸，本文中稱為化學增強型測序引物，或?qū)τ谄畏治?，本文中稱為化學增強型延伸引物。寡核苷酸序列可以是通用引物或基因特異性核苷酸序列。通用引物的實例包括(但不限于)m13(p/n402071和402072，appliedbiosystems)、us1(uniseq，plosmedicine3(10)e431(2006))、t7(p/n402126，但不含染料，appliedbiosystems)、sp6(p/n402128，但不含染料，appliedbiosystems)和t3(p/n402127，但不含染料，appliedbiosystems)。m13、t7、sp6和t3的序列展示于表1中。表1正向m135′tgtaaaacgacggccagt3′(seqidno：1)反向m135′caggaaacagctatgacc3′(seqidno：2)t75′taatacgactcactataggg3′(seqidno：3)sp65′atttaggtgacactatag3′(seqidno：4)t35′attaaccctcactaaaggga3′(seqidno：5)寡核苷酸序列還可以含有染料標記，如熒光標記。在本發(fā)明教示的各種實施例中，ncm可位于寡核苷酸序列的末端5′端處或寡核苷酸序列內(nèi)。ncm的實例包括(但不限于)具有式結(jié)構(gòu)的磷酸二酯部分(其通過使氨基磷酸酯(可從glenresearch購得)與含有寡核苷酸的適合的反應(yīng)搭配物反應(yīng)而引入化學增強型引物)，本文中(c)n間隔基，其中n可以是1-12，氨基酸天冬氨酸和谷氨酸以及核苷酸和核苷酸類似物(datp、dctp、dgtp和dttp)。ncm可含有僅一個帶負電單體或多個帶負電部分，例如至少五個、十個、12個、15個、18個、20個、24個或更多個間隔基((cn))的重復(fù)單元，其中x是1與至少11、至少12、至少15、至少18、至少20、至少24或30個cn間隔基之間的任何整數(shù)，其中“n”是3或6，例如直鏈配置或分支鏈配置中的c3間隔基、c6間隔基或c3與c6間隔基的組合。個別或呈組合形式的c3和c6間隔基也可以通過形成雙重物或三重物來形成分支鏈ncm，所述雙重物或三重物是例如(c3)3-treb-m13或[(c3)2-treb]-treb-m13，其中ncm由(c3)3-treb或[(c3)2-treb]-treb表示，并且m13表示寡核苷酸序列，如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知。ncm還可以含有染料標記，如熒光標記。在各種實施例中，至少沒有、至少一個、至少兩個或更多個硫代磷酸酯鍵可位于寡核苷酸序列的末端3′端。存在至少一個核酸酶抗性鍵可提供對由3′-5′核酸酶(如外切核酸酶i(p/nm0293s，newenglandbiolabs，ipswich，ma)、exoiii(p/nm0206s，newenglandbiolabs，ipswich，ma)、pfu(promega，p/nm7741，madison，wi)和dnapoli(p/nm0209s，newenglandbiolabs，ipswich，ma))進行的消化的抗性?；瘜W增強型引物對核酸酶消化的抗性提供去除pcr測序方案中pcr凈化步驟的優(yōu)勢?？稍跍y序反應(yīng)混合物中實現(xiàn)移除pcr步驟中殘留的額外非核酸酶抗性擴增引物。pcr擴增反應(yīng)對測序反應(yīng)混合物內(nèi)核酸酶的短暫暴露使非核酸酶抗性擴增引物降解，接著進行核酸酶的失活?；瘜W增強型引物仍可用于測序反應(yīng)，同時非核酸酶抗性擴增引物和核酸酶已分別被移除和失活。在一些實施例中，化學增強型引物具有式i的結(jié)構(gòu)：其中b是核堿基；k是s或o；每個n獨立地是1到12的整數(shù)；m是0或1；x是1到約50的整數(shù)；z是3到約100的整數(shù)；w是oh、f、ome或h；并且nt是具有下式的部分：對于具有式i的結(jié)構(gòu)的化學增強型引物，oligo表示包含寡核苷酸的式i的化學增強型引物中的部分。寡核苷酸中的每個核苷酸包含核堿基b部分和核糖部分：式i的化學增強型引物可包含一個或多個b，其中b是天然存在的核堿基。在其它實施例中，式i的化學增強型引物可包含一個或多個b，其中b是核堿基類似物。式i的化學增強型引物可僅具有一個硫代磷酸酯鍵，其中m是0，其具有式i-a的結(jié)構(gòu)：式i的化學增強型引物可經(jīng)染料標記，包括熒光染料。式i的化學增強型引物可包括一個或多個經(jīng)染料標記的b，并且表示為bf。在一些實施例中，化學增強型引物的3′末端核苷酸具有經(jīng)熒光標記的b。化學增強型引物可含有3′經(jīng)熒光標記的末端核苷酸，其中3′末端核苷酸的b是核堿基類似物?；蛘撸瘜W增強型引物可含有5′末端核苷酸，其具有經(jīng)熒光標記的b，其可表示為bf。在一些實施例中，其中化學增強型引物含有5′末端核苷酸(其含有經(jīng)熒光標記的核堿基bf)，經(jīng)標記的核堿基是核堿基類似物。在其它實施例中，化學增強型引物可含有直接或間接連接到多個ncm中的一個和/或針對引物的5′末端核苷酸的連接子部分的經(jīng)熒光標記的ncm。此外，式i的化學增強型引物可在位于寡核苷酸的內(nèi)部位置的核苷酸的核堿基上經(jīng)熒光標記，并且可選擇經(jīng)內(nèi)部熒光標記的核苷酸位于寡核苷酸的非末端部分的任何位置。當式i的化學增強型引物含有熒光標記時，化學增強型引物可具有以下各式中的一個的結(jié)構(gòu)：其中fl是染料標記并且bf是經(jīng)染料標記的核堿基。fl和bf可各自表示熒光染料標記。對于式i的化學增強型引物，每個n可以獨立地是1到12的整數(shù)。在一些實施例中，n是1、2、3、4、5、6、7、8或9。在一些實施例中，n是3。在其它實施例中，n是4?；蛘?，n可以是6。在式i的化學增強型引物的一些實施例中，當x大于2時，選擇n的第一實例是3并且選擇n的第二實例是6。在式i的化學增強型引物的其它實施例中，當x大于2時，選擇n的超過一個實例是3，并且選擇n的超過一個實例是6。在其它實施例中，當x大于5時，選擇多個n是3，并且選擇第二多個n是6。式i的化學增強型引物可具有m＝1或m＝0。在一些實施例中，式i的化學增強型引物具有m＝0。式i的化學增強型引物可具有x，其中x是1到約50的整數(shù)。在式i的化學增強型引物的一些實施例中，x是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在其它實施例中，x是10、15、18、20或24。在一些實施例中，x是5、8、9、10或15。在其它實施例中，x是11、12、13、14、17或20。在其它實施例中，x是30。在其它實施例中，x是至少5、至少6、至少8、至少9、至少10、至少15、至少18、至少20或至少24。在一些實施例中，x是15。在其它實施例中，x是8或9。在一些實施例中，化學增強型引物包含部分的第二多個y，其中y是1-20的整數(shù)。在一些實施例中，當n的第一多個x具有第一整數(shù)的值時，那么n的第二多個y是1到20的整數(shù)。在一些實施例中，化學增強型引物可具有第一多個n，其中n是3并且x是15，和第二多個n，其中n是6并且x是5。預(yù)期n、x和y的所有組合可用于式i的化學增強型引物中。在式i的化學增強型引物中，z是3到約100的整數(shù)。在一些實施例中，z是5到50、5到40或5到約30的整數(shù)。在其它實施例中，z是5到25或5到20的整數(shù)。在式i的化學增強型引物的一些實施例中，k是s。在其它實施例中，k是o。在式i的化學增強型引物的一些實施例中，w是h或oh。式i、i-b、i-c、i-e、i-f或i-g的化學增強型引物可具有上文所披露的范圍和選擇的b、bf、fl、k、m、n、w、x和z的任何組合。式i-d的化學增強型引物可具有上文所披露的范圍和選擇的b、fl、k、m、n、w、x和z的任何組合。式i-a、i-h、i-j或i-k的化學增強型引物可具有上文所披露的范圍和選擇的b、bf、fl、k、m、n、w、x和z的任何組合。在其它實施例中，化學增強型引物是具有式ii的結(jié)構(gòu)的化合物：其中b是核堿基；k是s或o；每個n獨立地是1到12的整數(shù)；m是0或1；x是1到約50的整數(shù)；z是3到約100的整數(shù)；w是oh、f、ome或h；并且nt是具有下式的部分：式ii的化學增強型引物可稱為雙重物，并且表示ncm部分的分支鏈配置。式ii的化學增強型引物可包含一個或多個b，其中b是天然存在的核堿基。在其它實施例中，式ii的化學增強型引物可包含一個或多個b，其中b是核堿基類似物。式ii的化學增強型引物可僅具有一個硫代磷酸酯鍵，其中m是0。在一些實施例中，式ii的化學增強型引物可用染料標記，包括熒光染料。式ii的化學增強型引物可包括一個或多個經(jīng)染料標記的b，并且表示為bf。在一些實施例中，化學增強型引物的3′末端核苷酸具有經(jīng)熒光標記的b?；瘜W增強型引物可含有3′經(jīng)熒光標記的末端核苷酸，其中3′末端核苷酸的b是核堿基類似物?；蛘撸瘜W增強型引物可含有5′末端核苷酸，其具有經(jīng)熒光標記的b，其可表示為bf。在一些實施例中，其中化學增強型引物含有5′末端核苷酸(其含有經(jīng)熒光標記的核堿基bf)，經(jīng)標記的核堿基是核堿基類似物。在其它實施例中，化學增強型引物可含有直接或間接連接到多個ncm中的一個和/或針對引物的5′末端核苷酸的連接子部分的經(jīng)熒光標記的ncm。此外，式ii的化學增強型引物可在位于寡核苷酸的內(nèi)部位置的核苷酸的核堿基上經(jīng)熒光標記，并且可選擇經(jīng)內(nèi)部熒光標記的核苷酸位于寡核苷酸的非末端部分的任何位置。對于式ii的化學增強型引物，n可以是1到9的整數(shù)。在一些實施例中，n是1、2、3、4、5、6、7、8或9。在一些實施例中，n是3。在其它實施例中，n是4?；蛘?，n可以是6。在式ii的化學增強型引物的一些實施例中，當x大于2時，選擇n的第一實例是3并且選擇n的第二實例是6。在式ii的化學增強型引物的其它實施例中，當x大于2時，選擇n的超過一個實例是3，并且選擇n的超過一個實例是6。在其它實施例中，當x大于5時，選擇多個n是3，并且選擇第二多個n是6。式ii的化學增強型引物可具有m＝1或m＝0。在一些實施例中，式ii的化學增強型引物具有m＝0。式ii的化學增強型引物可具有x，其中x是1到約50的整數(shù)。在式ii的化學增強型引物的一些實施例中，x是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在其它實施例中，x是10、15、18、20或24。在一些實施例中，x是5、8、9、10或15。在其它實施例中，x是11、12、13、14、17或20。在其它實施例中，x是30。在其它實施例中，x是至少5、至少6、至少8、至少9、至少10、至少15、至少18、至少20或至少24。在一些實施例中，x是15。在其它實施例中，x是8或9。在一些實施例中，化學增強型引物包含部分的第二多個y，其中y是1-20的整數(shù)。在一些實施例中，當n的第一多個x具有第一整數(shù)的值時，那么n的第二多個y是1到20的整數(shù)。在一些實施例中，化學增強型引物可具有第一多個n，其中n是3并且x是15，和第二多個n，其中n是6并且x是5。預(yù)期n、x和y的所有組合可用于式ii的化學增強型引物中。在式ii的化學增強型引物中，z是3到約100的整數(shù)。在一些實施例中，z是5到50、5到40或5到約30的整數(shù)。在其它實施例中，z是5到25或5到20的整數(shù)。在式ii的化學增強型引物的一些實施例中，k是s。在其它實施例中，k是o。在式ii的化學增強型引物的一些實施例中，w是h或oh。式ii的化學增強型引物可具有上文所披露的范圍和選擇的b、k、m、n、w、x和z的任何組合。在其它實施例中，化學增強型引物是具有式iii的結(jié)構(gòu)的化合物：其中b是核堿基；k是s或o；每個n獨立地是1到12的整數(shù)；m是0或1；x是1到約50的整數(shù)；z是3到約100的整數(shù)；w是oh、f、ome或h；并且nt是具有下式的部分：式iii的化學增強型引物可稱為三重物，并且表示ncm部分的分支鏈配置。式iii的化學增強型引物可包含一個或多個b，其中b是天然存在的核堿基。在其它實施例中，式iii的化學增強型引物可包含一個或多個b，其中b是核堿基類似物。式iii的化學增強型引物可僅具有一個硫代磷酸酯鍵，其中m是0。式iii的化學增強型引物可經(jīng)染料標記，包括熒光染料。式iii的化學增強型引物可包括一個或多個經(jīng)染料標記的b，并且表示為bf。在一些實施例中，化學增強型引物的3′末端核苷酸具有經(jīng)熒光標記的b?；瘜W增強型引物可含有3′經(jīng)熒光標記的末端核苷酸，其中3′末端核苷酸的b是核堿基類似物?；蛘撸瘜W增強型引物可含有5′末端核苷酸，其具有經(jīng)熒光標記的b，其可表示為bf。在一些實施例中，其中化學增強型引物含有5′末端核苷酸(其含有經(jīng)熒光標記的核堿基bf)，經(jīng)標記的核堿基是核堿基類似物。在其它實施例中，化學增強型引物可含有直接或間接連接到多個ncm中的一個和/或針對引物的5′末端核苷酸的連接子部分的經(jīng)熒光標記的ncm。此外，式ii的化學增強型引物可在位于寡核苷酸的內(nèi)部位置的核苷酸的核堿基上經(jīng)熒光標記，并且可選擇經(jīng)內(nèi)部熒光標記的核苷酸位于寡核苷酸的非末端部分的任何位置。對于式iii的化學增強型引物，n可以是1到9的整數(shù)。在一些實施例中，n是1、2、3、4、5、6、7、8或9。在一些實施例中，n是3。在其它實施例中，n是4?；蛘撸琻可以是6。在式iii的化學增強型引物的一些實施例中，當x大于2時，選擇n的第一實例是3并且選擇n的第二實例是6。在式iii的化學增強型引物的其它實施例中，當x大于2時，選擇n的超過一個實例是3，并且選擇n的超過一個實例是6。在其它實施例中，當x大于5時，選擇多個n是3，并且選擇第二多個n是6。式iii的化學增強型引物可具有m＝1或m＝0。在一些實施例中，式iii的化學增強型引物具有m＝0。式iii的化學增強型引物可具有x，其中x是1到約30的整數(shù)。在式ii的化學增強型引物的一些實施例中，x是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在其它實施例中，x是10、15、18、20或24。在一些實施例中，x是5、8、9、10或15。在其它實施例中，x是11、12、13、14、17或20。在其它實施例中，x是30。在其它實施例中，x是至少5、至少6、至少8、至少9、至少10、至少15、至少18、至少20或至少24。在一些實施例中，x是15。在其它實施例中，x是8或9。在式iii的化學增強型引物中，z是3到約100的整數(shù)。在一些實施例中，z是5到50、5到40或5到約30的整數(shù)。在其它實施例中，z是5到25或5到20的整數(shù)。在一些實施例中，化學增強型引物包含部分的第二多個y，其中y是1-20的整數(shù)。在一些實施例中，當n的第一多個x具有第一整數(shù)的值時，那么n的第二多個y是1到20的整數(shù)。在一些實施例中，化學增強型引物可具有第一多個n，其中n是3并且x是15，和第二多個n，其中n是6并且x是5。預(yù)期n、x和y的所有組合可用于式iii的化學增強型引物中。在式iii的化學增強型引物的一些實施例中，k是s。在其它實施例中，k是o。在式iii的化學增強型引物的一些實施例中，w是h或oh。式iii的化學增強型引物可具有上文所披露的范圍和選擇的b、k、m、n、w、x和z的任何組合?；瘜W增強型引物的其它實施例由式iv表示：其中n的每個實例獨立地是1到12的整數(shù)；x是1到50的整數(shù)；v是1到9的整數(shù)；t是0或1；linker包含3-100個原子；oligo具有下式的結(jié)構(gòu)：其中b是核堿基；k是s或o；m是0或l；z是3到約100的整數(shù)；w是oh、f、ome或h；并且nt是具有下式的部分：式iv的化學增強型引物可包含一個或多個b，其中b是天然存在的核堿基。在其它實施例中，式iv的化學增強型引物可包含一個或多個b，其中b是核堿基類似物。式iv的化學增強型引物可經(jīng)染料標記，包括熒光染料。具有式(cn)x-oligo的化學增強型引物可包括一個或多個經(jīng)染料標記的b，并且表示為bf。在一些實施例中，當化學增強型引物具有至少一個經(jīng)染料標記的b時，b可以是核堿基類似物。在一些實施例中，化學增強型引物的3′末端核苷酸具有經(jīng)熒光標記的b，其可表示為bf。或者，化學增強型引物可含有5′末端核苷酸，其具有經(jīng)熒光標記的b，其可表示為bf。此外，具有式(cn)x-oligo的化學增強型引物可在位于寡核苷酸的內(nèi)部位置的核苷酸的核堿基上經(jīng)熒光標記，并且可選擇經(jīng)內(nèi)部熒光標記的核苷酸位于寡核苷酸的非末端部分的任何位置。在其它實施例中，化學增強型引物可含有直接或間接連接到多個ncm中的一個和/或與引物的5′末端核苷酸形成共價連接的ncm連接子部分的經(jīng)熒光標記的ncm。linker是ncm連接子并且可包含3-100個原子，并且包括醚、酰胺、磷酸二酯和酯部分以形成ncm與寡核苷酸之間的共價鍵。linker可在寡核苷酸的5′端連接到核苷酸的核糖的5′碳。在一些實施例中，存在linker。在其它實施例中，ncm磷酸二酯部分直接連接到oligo。對于式iv的化學增強型引物，v可以是1到9的整數(shù)。在一些實施例中，v是1。在其它實施例中，v是2。在其它實施例中，v是3。對于式iv的化學增強型引物，v可以是1到12的整數(shù)。在一些實施例中，n是1、2、3、4、5、6、7、8或9。在其它實施例中，n是1到9的整數(shù)。在一些實施例中，n是3。在其它實施例中，n是4?；蛘?，n可以是6。式iv的化學增強型引物具有x，其中x是1到約30的整數(shù)。在式iv的化學增強型引物的一些實施例中，x是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在其它實施例中，x是10、15、18、20或24。在一些實施例中，x是5、8、9、10或15。在其它實施例中，x是11、12、13、14、17或20。在其它實施例中，x是至少5、至少6、至少8、至少9、至少10、至少15、至少18、至少20或至少24。在一些實施例中，x是15。在其它實施例中，x是8或9。在式iv的化學增強型引物的一些實施例中，當x大于2時，選擇n的第一實例是3并且選擇n的第二實例是6。在式iv的化學增強型引物的其它實施例中，當x大于2時，選擇n的超過一個實例是3，并且選擇n的超過一個實例是6。在其它實施例中，當x大于5時，選擇多個n是3，并且選擇第二多個n是6。在一些實施例中，化學增強型引物包含部分的第二多個y，其中y是1-20的整數(shù)。在一些實施例中，當n的第一多個x具有第一整數(shù)的值時，那么n的第二多個y是1到20的整數(shù)。在一些實施例中，化學增強型引物可具有第一多個n，其中n是3并且x是15，和第二多個n，其中n是6并且x是5。預(yù)期n、x和y的所有組合可用于式iv的化學增強型引物中。具有式iv的化學式的化學增強型引物具有m＝1或m＝0。在一些實施例中，式iv的化學增強型引物具有m＝0。具有式iv的化學式的化學增強型引物具有z，其中z是3到約100的整數(shù)。在一些實施例中，z是5到50、5到40或5到約30的整數(shù)。在其它實施例中，z是5到25或5到20的整數(shù)。在式iv的化學增強型引物的一些實施例中，k是s。在其它實施例中，k是o。在式iv的化學增強型引物的一些實施例中，w是h或oh。式iv的化學增強型引物可具有上文所披露的范圍和選擇的b、n、t、v、x、m、y、z、k或w的任何組合。在一些實施例中，式iv的化學增強型引物是化學增強型引物(cn)x-oligo，其中(cn)x具有下式的結(jié)構(gòu)：其中n的每個實例獨立地是1到12的整數(shù)；并且x是1到約30的整數(shù)；并且oligo具有下式的結(jié)構(gòu)：其中b、k、m、z、y、nt和w如上文關(guān)于式iv所定義。對于具有式(cn)x-oligo的化學增強型引物，v是1，t是0，不存在linker，并且ncm部分的鏈直接連接到oligo。具有式(cn)x-oligo的化學增強型引物可具有上文關(guān)于式iv所披露的范圍和選擇的b、n、x、m、z、k或w的任何組合。在其它實施例中，化學增強型引物由下式表示：(cn)x-oligo*，其中(cn)x具有下式的結(jié)構(gòu)：其中n的每個實例獨立地是1到12的整數(shù)；并且x是1到約30的整數(shù)；oligo*具有下式的結(jié)構(gòu)：其中b、k、m、z、y、nt和w如上文關(guān)于式iv所定義。對于具有式(cn)x-oligo*的化學增強型引物，v是1，t是0，不存在linker，并且ncm部分的鏈直接連接到oligo*。具有式(cn)x-oligo*的化學增強型引物可具有上文關(guān)于式iv所披露的范圍和選擇的b、n、x、m、z、k或w的任何組合。具有(cn)x式vi-a1的化學式的化學增強型引物包括(但不限于)：(cn)x-us1，其中n是1到9并且x是1到約30。在一些實施例中，(cn)x-us1是(c3)1-us1、(c3)2-us1、(c3)3-us1、(c3)4-us1、(c3)5-us1、(c3)6-us1、(c3)7-us1、(c3)8-us1、(c3)9-us1、(c3)10-us1、(c3)11-us1、(c3)12-us1、(c3)13-us1、(c3)14-us1、(c3)15-us1、(c3)16-us1、(c3)17-us1、(c3)18-us1、(c3)21-us1、(c3)24-us1、(c3)27-us1或(c3)30-us1。在一些實施例中，(cn)x-us1是正向引物并且可具有如上文所描述的任何x。在其它實施例中，(cn)x-us1是反向引物并且可具有如上文所描述的任何x。(cn)x-m13-正向，其中n是1到9并且x是1到約30。在一些實施例中，(cn)x-m13-正向是(c3)1-m13-正向、(c3)2-m13-正向、(c3)3-m13-正向、(c3)4-m13-正向、(c3)5-m13-正向、(c3)6-m13-正向、(c3)7-m13-正向、(c3)8-m13-正向、(c3)9-m13-正向、(c3)10-m13-正向、(c3)11-m13-正向、(c3)12-m13-正向、(c3)13-m13-正向、(c3)14-m13-正向、(c3)15-m13-正向、(c3)16-m13-正向、(c3)17-m13-正向、(c3)18-m13-正向、(c3)21-m13-正向、(c3)24-m13-正向、(c3)27-m13-正向或(c3)30-m13-正向。(cn)x-m13-反向，其中n是1到9并且x是1到約30。在一些實施例中，(cn)x-m13-反向是(c3)1-m13-反向、(c3)2-m13-反向、(c3)3-m13-反向、(c3)4-m13-反向、(c3)5-m13-反向、(c3)6-m13-反向、(c3)7-m13-反向、(c3)8-m13-反向、(c3)9-m13-反向、(c3)10-m13-反向、(c3)11-m13-反向、(c3)12-m13-反向、(c3)13-m13-反向、(c3)14-m13-反向、(c3)15-m13-反向、(c3)16-m13-反向、(c3)17-m13-反向、(c3)18-m13-反向、(c3)21-m13-反向、(c3)24-m13-反向、(c3)27-m13-反向或(c3)30-m13-反向。(cn)x-t7，其中n是1到9并且x是1到約30。在一些實施例中，(cn)x-t7是(c3)1-t7、(c3)2-t7、(c3)3-t7、(c3)4-t7、(c3)5-t7、(c3)6-t7、(c3)7-t7、(c3)8-t7、(c3)9-t7、(c3)10-t7、(c3)11-t7、(c3)12-t7、(c3)13-t7、(c3)14-t7、(c3)15-t7、(c3)16-t7、(c3)17-t7、(c3)18-t7、(c3)21-t7、(c3)24-t7、(c3)27-t7或(c3)30-t7。在一些實施例中，(cn)x-t7是正向引物并且可具有如上文所描述的任何x。在其它實施例中，(cn)x-t7是反向引物并且可具有如上文所描述的任何x。(cn)x-sp6，其中n是1到9并且x是1到約30。在一些實施例中，(cn)x-sp6是(c3)1-sp6、(c3)2-sp6、(c3)3-sp6、(c3)4-sp6、(c3)5-sp6、(c3)6-sp6、(c3)7-sp6、(c3)8-sp6、(c3)9-sp6、(c3)10-sp6、(c3)11-sp6、(c3)12-sp6、(c3)13-sp6、(c3)14-sp6、(c3)15-sp6、(c3)16-sp6、(c3)17-sp6、(c3)18-sp6、(c3)21-sp6、(c3)24-sp6、(c3)27-sp6或(c3)30-sp6。在一些實施例中，(cn)x-sp6是正向引物并且可具有如上文所描述的任何x。在其它實施例中，(cn)x-sp6是反向引物并且可具有如上文所描述的任何x。(cn)x-t3，其中n是1到9并且x是1到約30。在一些實施例中，(cn)xt3是(c3)1-t3、(c3)2-t3、(c3)3-t3、(c3)4-t3、(c3)5-t3、(c3)6-t3、(c3)7-t3、(c3)8-t3、(c3)9-t3、(c3)10-t3、(c3)11-t3、(c3)12-t3、(c3)13-t3、(c3)14-t3、(c3)15-t3、(c3)16-t3、(c3)17-t3、(c3)18-t3、(c3)21-t3、(c3)24-t3、(c3)27-t3或(c3)30-t3。在一些實施例中，(cn)x-t3是正向引物并且可具有如上文所描述的任何x。在其它實施例中，(cn)x-t3是反向引物并且可具有如上文所描述的任何x。(cn)x-gso，其中n是1到9，x是1到約30，并且gso是基因特異性寡核苷酸序列，其中基因特異性寡核苷酸包含50個或更少的核苷酸。在一些實施例中，(cn)xgso是(c3)1-gso、(c3)2-gso、(c3)3-gso、(c3)4-gso、(c3)5-gso、(c3)6-gso、(c3)7-gso、(c3)8-gso、(c3)9-gso、(c3)10-gso、(c3)11-gso、(c3)12-gso、(c3)13-gso、(c3)14-gso、(c3)15-gso、(c3)16-gso、(c3)17-gso、(c3)18-gso、(c3)21-gso、(c3)24-gso、(c3)27-gso或(c3)30-gso。在一些實施例中，(cn)x-gso是正向引物并且可具有如上文所描述的任何x。在其它實施例中，(cn)x-gso是反向引物并且可具有如上文所描述的任何x。具有式(cn)x-oligo*的化學增強型引物包括(但不限于)：(cn)x-us1*，其中n是1到9并且x是1到約30。在一些實施例中，(cn)x-us1*是(c3)1-us1*、(c3)2-us1*、(c3)3-us1*、(c3)4-us1*、(c3)5-us1*、(c3)6-us1*、(c3)7-us1*、(c3)8-us1*、(c3)9-us1*、(c3)10-us1*、(c3)11-us1*、(c3)12-us1*、(c3)13-us1*、(c3)14-us1v、(c3)15-us1*、(c3)16-us1*、(c3)17-us1*、(c3)18-us1*、(c3)21-us1*、(c3)24-us1*、(c3)27-us1*或(c3)30-us1*。在一些實施例中，(cn)x-us1*是正向引物并且可具有如上文所描述的任何x。在其它實施例中，(cn)x-us1*是反向引物并且可具有如上文所描述的任何x。(cn)x-m13*-正向，其中n是1到9并且x是1到約30。在一些實施例中，(cn)x-m13*-正向是(c3)1-m13*-正向、(c3)2-m13*-正向、(c3)3-m13*-正向、(c3)4-m13*-正向、(c3)5-m13*-正向、(c3)6-m13*-正向、(c3)7-m13*-正向、(c3)8-m13*-正向、(c3)9-m13*-正向、(c3)10-m13*-正向、(c3)11-m13*-正向、(c3)12-m13*-正向、(c3)13-m13*-正向、(c3)14-m13*-正向、(c3)15-m13*正向、(c3)16-m13*-正向、(c3)17-m13*-正向、(c3)18-m13*-正向、(c3)21-m13*-正向、(c3)24-m13*-正向、(c3)27-m13*-正向或(c3)30-m13*-正向。(cn)x-m13*-反向，其中n是1到9并且x是1到約30。在一些實施例中，(cn)x-m13*-反向是(c3)1-m13*-反向、(c3)2-m13*-反向、(c3)3-m13*-反向、(c3)4-m13*-反向、(c3)5-m13*-反向、(c3)6-m13*-反向、(c3)7-m13*-反向、(c3)8-m13*-反向、(c3)9-m13*-反向、(c3)10-m13*-反向、(c3)11-m13*-反向、(c3)12-m13*-反向、(c3)13-m13*-反向、(c3)14-m13*-反向、(c3)15-m13*-反向、(c3)16-m13*-反向、(c3)17-m13*-反向、(c3)18-m13*-反向、(c3)21-m13*-反向、(c3)24-m13*-反向、(c3)27-m13*-反向或(c3)30-m13*-反向。(cn)x-t7*，其中n是1到9并且x是1到約30。在一些實施例中，(cn)x-t7*是(c3)1-t7*、(c3)2-t7*、(c3)3-t7*、(c3)4-t7*、(c3)5-t7*、(c3)6-t7*、(c3)7-t7*、(c3)8-t7*、(c3)9-t7*、(c3)10-t7*、(c3)11-t7*、(c3)12-t7*、(c3)13-t7*、(c3)14-t7*、(c3)15-t7*、(c3)16-t7*、(c3)17-t7*、(c3)18-t7*、(c3)21-t7*、(c3)24-t7*、(c3)27-t7*或(c3)30-t7*。在一些實施例中，(cn)x-t7*是正向引物并且可具有如上文所描述的任何x。在其它實施例中，(cn)x-t7*是反向引物并且可具有如上文所描述的任何x。(cn)x-sp6*，其中n是1到9并且x是1到約30。在一些實施例中，(cn)x-sp6*是(c3)1-sp6*、(c3)2-sp6*、(c3)3-sp6*、(c3)4-sp6*、(c3)5-sp6*、(c3)6-sp6*、(c3)7-sp6*、(c3)8-sp6*、(c3)9-sp6*、(c3)10-sp6*、(c3)11-sp6*、(c3)12-sp6*、(c3)13-sp6*、(c3)14-sp6*、(c3)15-sp6*、(c3)16-sp6*、(c3)17-sp6*、(c3)18-sp6*、(c3)21-sp6*、(c3)24-sp6*、(c3)27-sp6*或(c3)30-sp6*。在一些實施例中，(cn)x-sp6*是正向引物并且可具有如上文所描述的任何x。在其它實施例中，(cn)x-sp6*是反向引物并且可具有如上文所描述的任何x。(cn)x-t3*，其中n是1到9并且x是1到約30。在一些實施例中，(cn)xt3*是(c3)1-t3*、(c3)2-t3*、(c3)3-t3*、(c3)4-t3*、(c3)5-t3*、(c3)6-t3*、(c3)7-t3*、(c3)8-t3*、(c3)9-t3*、(c3)10-t3*、(c3)11-t3*、(c3)12-t3*、(c3)13-t3*、(c3)14-t3*、(c3)15-t3*、(c3)16-t3*、(c3)17-t3*、(c3)18-t3*、(c3)21-t3*、(c3)24-t3*、(c3)27-t3*或(c3)30-t3*。在一些實施例中，(cn)x-t3*是正向引物并且可具有如上文所描述的任何x。在其它實施例中，(cn)x-t3*是反向引物并且可具有如上文所描述的任何x。(cn)x-gso*，其中n是1到9，x是1到約30，并且gso*是基因特異性寡核苷酸序列，其中基因特異性寡核苷酸包含50個或更少的核苷酸。在一些實施例中，(cn)xgso*是(c3)1-gso*、(c3)2-gso*、(c3)3-gso*、(c3)4-gso*、(c3)5-gso*、(c3)6-gso*、(c3)7-gso*、(c3)8-gso*、(c3)9-gso*、(c3)10-gso*、(c3)11-gso*、(c3)12-gso*、(c3)13-gso*、(c3)14-gso*、(c3)15-gso*、(c3)16-gso*、(c3)17-gso*、(c3)18-gso*、(c3)21-gso*、(c3)24-gso*、(c3)27-gso*或(c3)30-gso*。在一些實施例中，(cn)x-gso*是正向引物并且可具有如上文所描述的任何x。在其它實施例中，(cn)x-gso*是反向引物并且可具有如上文所描述的任何x?；瘜W增強型引物在其3′端包括預(yù)定數(shù)目的核苷酸，其與相等數(shù)目的相對于擴增子的相關(guān)序列位于5′的前導(dǎo)序列的核苷酸至少部分互補，所述核苷酸可接著在測序反應(yīng)期間雜交以產(chǎn)生化學增強型引物的延伸產(chǎn)物。在一些實施例中，化學增強型引物的3′預(yù)定數(shù)目的核苷酸與擴增子的前導(dǎo)序列的5′端處的基因特異性序列至少部分互補。在一些實施例中，擴增子的前導(dǎo)序列的5′核苷酸(其與化學增強型引物的3′預(yù)定數(shù)目的核苷酸雜交)不是基因特異性。當擴增子的前導(dǎo)序列的5′核苷酸不是基因特異性序列時，前導(dǎo)序列的5′核苷酸可以是任何適合的標簽、尾區(qū)、通用序列、條碼或接合產(chǎn)物。使用化學增強型測序引物，已發(fā)現(xiàn)對于在3130、3730或3500毛細電泳平臺(appliedbiosystems，fostercity，ca)中的任一個上使用pop7tm聚合物的測序結(jié)果工作流的pcr，可在整體上短約50％的時間內(nèi)獲得高質(zhì)量和高精確度核酸序列結(jié)果。具體來說，通過使用化學增強型引物來提供5′序列解析的改良，其使得可闡明來自化學增強型測序引物的堿基1。增加輸送量以及通過去除在開始測序反應(yīng)之前的單獨的pcr凈化步驟來減少處理時間。(圖1a和圖1b)?？偟膩碚f，可發(fā)現(xiàn)使用不同方面的化學增強型引物，擴增、pcr凈化和測序檢測步驟可各自提供運行時間的節(jié)省?；瘜W增強型引物的核酸酶抗性方面可提供減少的擴增和pcr凈化時間要求，并且與標準測序引物可提供的相比，引物的ncm方面可實現(xiàn)更短操作時間內(nèi)的有效分離?；瘜W增強型測序引物和經(jīng)改良的工作流可改良多形現(xiàn)象檢測并且將等位基因特異性測序引物更高效地用于異型接合模糊度解析。用途的各種方面和化學增強型測序引物的合成進一步描述于2008年2月4日提交的美國申請案第61/026,085號；2009年2月3日提交的第12/365,140號；2010年10月28日提交的第61/407,899號；2010年10月29日提交的第61/408,553號；2011年10月28日提交的第13/284,839號；以及2012年2月15日提交的第13/397,626號中，并且其中每個的披露內(nèi)容以全文引用的方式并入本文中。組合物。描述用于核酸測序的組合物，其包括：pcr擴增反應(yīng)產(chǎn)物，其包含：從至少一個擴增子擴增的dna產(chǎn)物，其中擴增子包含相關(guān)序列和從第一激活序列并入的相對于相關(guān)序列位于5′的前導(dǎo)序列；非核酸酶抗性擴增引物；以及化學增強型引物，其中化學增強型引物包含寡核苷酸序列、ncm和沒有或至少一個核酸酶抗性鍵。化學增強型引物可包括位于末端5′端或化學增強型引物的寡核苷酸序列內(nèi)的多個ncm。ncm可以是(cn)間隔基，其中n可以是1到9的任何整數(shù)。在各種實施例中，ncm包含多個(cn)間隔基。在各種實施例中，化學增強型引物可具有式i的結(jié)構(gòu)：其中b是核堿基；k是s或o；每個n獨立地是1到9的整數(shù)；m是0或1；x是1到約30的整數(shù)；z是3到約100的整數(shù)；w是oh、f、ome或h；并且nt是具有下式的部分：在本發(fā)明的組合物的一些實施例中，化學增強型引物可以是本發(fā)明中所描述的任何化學增強型引物。在各種實施例中，化學增強型引物的寡核苷酸部分可包括通用引物。通用引物可選自m13、us1、t7、sp6和t3。通用引物可以是m13。在一些實施例中，化學增強型引物可包括一個核酸酶抗性鍵。在本發(fā)明的組合物的一些實施例中，組合物可進一步包括核酸酶。在其它實施例中，組合物可進一步包括聚合酶、脫氧核苷酸三磷酸酯、雙脫氧核苷酸三磷酸酯和染料標記。在一些實施例中，雙脫氧核苷酸三磷酸酯可包括標記有染料標記的雙脫氧核苷酸三磷酸酯。經(jīng)染料標記的雙脫氧核苷酸三磷酸酯可包括經(jīng)熒光染料標記的雙脫氧核苷酸三磷酸酯。在一些實施例中，染料標記可連接到ncm或寡核苷酸序列。在本發(fā)明的組合物的一些實施例中，核酸酶可選自外切核酸酶i、exoiii、pfu和dnapoli。在一些實施例中，聚合酶可以是taq聚合酶。在一些實施例中，pcr擴增反應(yīng)產(chǎn)物進一步包括經(jīng)擴增的dna產(chǎn)物，其中dna產(chǎn)物是多個擴增子的擴增產(chǎn)物。在一些實施例中，用于核酸測序的組合物可進一步包含超過一種化學增強型測序引物。在一些實施例中，聚合酶可包含taq聚合酶，例如amplitaqgold聚合酶。在一些實施例中，核酸酶可包含外切核酸酶i。在一些實施例中，化學增強型測序引物可包含至少一個硫代磷酸酯鍵。在其它實施例中，化學增強型測序引物可包含末端3′端硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，化學增強型測序引物可包含染料，例如經(jīng)熒光染料標記的寡核苷酸和/或ncm化合物內(nèi)至少一個經(jīng)熒光染料標記的ncm部分。根據(jù)各種實施例用于核酸測序的組合物可包含約0.01單位到約20單位(例如約0.1單位到約1.0單位，或約0.8單位)的量的聚合酶，例如dna聚合酶。組合物可包含具有約10單位到約20單位的上限和約0.01單位到約0.05單位的下限的范圍內(nèi)的量的聚合酶。根據(jù)各種實施例組合物可包含約1單位到約40單位(例如約2單位到約15單位，或約10單位)的量的核酸酶，例如外切核酸酶i。組合物可包含具有約10單位到約40單位的上限和約1單位到約2單位的下限的范圍內(nèi)的量的核酸酶。根據(jù)各種實施例，用于核酸測序的組合物可包含約0.1μm到約20μm(例如約1.0μm)的量的化學增強型測序引物。組合物可包含具有約10μm到約20μm的上限和約0.05μm到約0.1μm的下限的范圍內(nèi)的量的化學增強型測序引物。根據(jù)各種實施例，組合物可包含約20μm到約5000μm(例如約500μm)的量的dntp。組合物可包含具有約2000μm到約5000μm的上限和約20μm到約50μm的下限的范圍內(nèi)的量的dntp。根據(jù)各種實施例組合物可包含約0.03μm到約10μm(例如約3μm)的量的ddntp。組合物可包含具有約5μm到約10μm的上限和約0.01μm到約0.05μm的下限的范圍內(nèi)的量的ddntp。所有摩爾量都是以最終體積的最終濃度計。根據(jù)各種實施例，組合物可包含各約0.1μm到約20μm(例如約0.01μm或1.0μm)的量的一個或多個非核酸酶抗性擴增引物。組合物可包含具有各自從約10μm到約20μm的上限和各自從約0.05μm到約0.1μm的下限的范圍內(nèi)的量的一個或多個非核酸酶抗性擴增引物。所有摩爾量都是以最終體積的最終濃度計。根據(jù)各種實施例用于核酸測序的組合物可進一步包含pcr擴增產(chǎn)物。在一些實施例中，pcr擴增產(chǎn)物可包含經(jīng)擴增的dna目標序列。在一些實施例中，pcr擴增產(chǎn)物可包含非核酸酶抗性擴增引物。非核酸酶抗性擴增引物可包含例如對由外切核酸酶進行的降解敏感的磷酸二酯鍵。在一些實施例中，pcr擴增產(chǎn)物可包含目標特異性擴增子，其合并有能夠粘接到通用引物的核酸序列。試劑盒。本發(fā)明教示還涉及使用上述化學增強型引物組合物和方法的試劑盒。在一些實施例中，基本試劑盒可包含容器，其具有一種或多種如本發(fā)明中所描述的化學增強型引物。試劑盒還可以任選地包含使用說明書。所描述的試劑盒包括：聚合酶、核酸酶、至少一種脫氧核苷酸三磷酸酯和雙脫氧核苷酸三磷酸酯。雙脫氧核苷酸三磷酸酯可以是標記有染料標記的雙脫氧核苷酸三磷酸酯。經(jīng)染料標記的雙脫氧核苷酸三磷酸酯可以是經(jīng)熒光染料標記的雙脫氧核苷酸三磷酸酯。在一些實施例中，核酸酶可選自外切核酸酶i、exoiii、pfu和dnapoli。在各種實施例中，試劑盒可包括如本發(fā)明中所描述的化學增強型引物。在其它實施例中，試劑盒可進一步包括多個核酸酶敏感性擴增引物。多個核酸酶敏感性擴增引物可經(jīng)配置以激活特定疾病病況的相關(guān)序列。試劑盒中的多個核酸酶敏感性擴增引物可經(jīng)配置以激活連接到特定疾病病況的一組序列。試劑盒還可以包含其它任選的試劑盒組分，如以下中的一種或多種：核酸酶、用于測序或片段分析的足夠量的酶、用于促進測序反應(yīng)或片段分析反應(yīng)的緩沖液、dntp、經(jīng)修飾的dntp、用于測序反應(yīng)或片段分析反應(yīng)期間的股延伸的dntp類似物和7-脫氮-dgtp、ddntp、染料標記、用于制備電泳用于測序或片段分析材料的負載溶液、作為模板對照物的基因組dna、用于確保材料在分離培養(yǎng)基中按預(yù)期遷移的尺寸標記物以及教導(dǎo)用戶和限制使用錯誤的方案和手冊。試劑盒中的各種試劑的量也可以取決于多種因素改變，例如最佳方法靈敏度。提供與自動檢測器或分析器一起使用的用于手動應(yīng)用的試劑盒或測試試劑盒屬于這些教示內(nèi)容的范圍內(nèi)。試劑盒可具有超過一種化學增強型引物，并且每種化學增強型引物中的ncm部分的數(shù)目可不同。用于質(zhì)體測序的試劑盒可具有上文所列的組分中的任一種，但不包括核酸酶。實例。下文展示本發(fā)明教示內(nèi)容的組合物和方法的實例。這些實例不限制本發(fā)明的教示內(nèi)容，并且所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將識別到反應(yīng)中使用的組分可容易地用所屬領(lǐng)域中已知的等效試劑替代。實例1間隔基+寡核苷酸序列合成，無硫代磷酸酯基團：使用標準胺基磷酸酯化學方法在abi型394dna合成器上制備在5′位置經(jīng)一個或多個c6間隔基標記的18堿基型寡核苷酸。從chemgenescorp.(p/nclp-1120，wilmington，ma)獲得c6間隔基胺基磷酸酯。用來自一個微摩爾管柱的完整三苯甲基制備經(jīng)標記的18聚體。在合成完成時，寡核苷酸由nh4oh從支撐物裂解并且使用1.5ml/min的流動速率和0.1m乙酸三乙銨-水ph7.0和乙腈的溶劑梯度，使用abirp-300(c-8)管柱(4.6×220mm)通過hplc純化，移除三苯甲基并且通過乙醇沉淀來分離產(chǎn)物。c3間隔基+寡核苷酸序列合成，無硫代磷酸酯基團：使用標準胺基磷酸酯化學方法在abi型394dna合成器上制備在5′位置經(jīng)一個或多個c3間隔基(p/n10-1913-90，glenresearch)標記的18堿基型寡核苷酸。用來自一個微摩爾管柱的完整三苯甲基制備經(jīng)標記的18聚體。在合成完成時，寡核苷酸由nh4oh從支撐物裂解并且使用1.5ml/min的流動速率和0.1m乙酸三乙銨-水ph7.0和乙腈的溶劑梯度，使用abirp-300(c-8)管柱(4.6×220mm)通過hplc純化，移除三苯甲基并且通過乙醇沉淀來分離產(chǎn)物。經(jīng)含有3′硫代磷酸酯鍵的一個或多個c-3間隔基標記的寡聚物的方案：使用標準胺基磷酸酯化學方法在abi型394dna合成器上制備在5′位置經(jīng)一個或多個c-3間隔基標記的18堿基型寡核苷酸。用硫化劑(tetdp/n401267(appliedbiosystems，fostercity，ca)，使用標準方法產(chǎn)生3′硫代磷酸酯鍵。由glenre研究(p/n10-1913-90)獲得c3間隔基氨基磷酸酯。用來自一個微摩爾合成管柱的完整三苯甲基制備經(jīng)標記的18聚體。在合成完成后，寡核苷酸由nh4oh從支撐物裂解并且使用1.5ml/min的流動速率和0.1m乙酸三乙銨-水ph7.0和乙腈的溶劑梯度，使用abirp-300(c-18)管柱(4.6×220mm)通過hplc純化，移除三苯甲基并且通過乙醇沉淀來分離產(chǎn)物。注意事項：為了合成超過一個硫代磷酸酯鍵或?qū)⑦@個鍵置放于18聚體寡核苷酸鏈中的任何地方，使用硫化劑在這些位置進行氧化。實例2使用(也稱為)傳統(tǒng)的熒光染料終止子測序，使用來自ionampliseq全面癌癥圖v2(chpv2)和iononcomine癌癥圖(ocp)的初始經(jīng)預(yù)先擴增的材料的次要部份(例如5％)進行后續(xù)(確認)分析。通過自動毛細電泳(ce)(如appliedbiosystems3500xl基因分析器)進行桑格測序和檢測。腫瘤樣品中基因突變(變異體)的分子分析變得越來越多地用于腫瘤表征和癌癥患者的診斷和治療性管理。通常，僅極有限量的腫瘤樣品最初(即手術(shù)前)可供使用，例如通過福馬林固定鏈烷烴嵌入型(ffpe)制劑中可疑的腫瘤組織或異常細胞叢集的細針穿刺活檢。ionampliseqtm癌癥圖經(jīng)設(shè)計以擴增來自少量輸入dna(10ng)的許多致癌相關(guān)目標基因，以用于基于晶片的平臺(例如iontorrentpgmtm儀器)上的后續(xù)測序。ionampliseqtmchpv2圖涵蓋207個基因座并且ocp圖涵蓋超過2000個目標。這些與基因座選擇、擴增子尺寸和引物研究相關(guān)的圖和披露內(nèi)容進一步描述于2011年4月28日提交的美國申請案第61/479,952號；2011年9月6日提交的第61/531,583號；2011年9月6日提交的第61/531,574號；2011年9月22目提交的第61/538,079號；2011年11月29日提交的第61/564,763號；2011年12月20日提交的第61/578,192號；2012年2月2日提交的第61/594,160號；2012年2月14日提交的第61/598,881號；2012年2月14日提交的第61/598,892號；2012年4月17日提交的第61/625,596號；2012年4月26日提交的第61/639,017號；2012年4月27日提交的第13/458,739號；2012年10月29日提交的第13/663,334號；2012年11月16日提交的第13/679,706號；以及在同一日期提交的代理人案號lt00974pro的名稱為《目標核酸的檢測、鑒別、驗證和富集(detection，identification，validation，andenrichmentoftargetnucleicacids)》的申請案中；并且所有披露內(nèi)容以全文引用的方式并入本文中。偶爾，需要用正交方法(如傳統(tǒng)桑格測序)確認由下一代測序(ngs)平臺獲得的測序結(jié)果。如果按孟德爾方式(mendelianfashion)遺傳，當次要變異體(即編碼或功能相關(guān)核苷酸變異體)不以如所預(yù)期的50％頻率，而是以更低的頻率(即5-25％之間，其通常在體細胞突變時發(fā)生，即自發(fā)發(fā)生或致病或促使癌發(fā)生的突變事件)產(chǎn)生時指示這類反映測試。對于單個目標的一對正向和反向桑格測序反應(yīng)，通常需要5ng基因組dna，其可快速耗盡可從臨床樣本獲得的量。因此，需要由ampliseq反應(yīng)進行目標序列的富集、預(yù)先擴增、合并以用于桑格式再測序。通常設(shè)置以20μl的反應(yīng)體積進行ampliseqtm預(yù)先擴增反應(yīng)。在引物微調(diào)步驟(參見圖1)之前移除1μl(即5％)這一材料的等分試樣作為用于通過桑格測序進行的反映測試的潛在保留物不會對ngs測序文庫制備過程中的后續(xù)步驟造成不利。或者，用戶可設(shè)置具有21-22μl體積的初始ampliseqtm反應(yīng)并且接著在預(yù)先擴增移除1μl之后。用于ampliseqtm反應(yīng)的人類dna的典型輸入量是10ng，其等效于3000個基因體復(fù)本或1500個細胞。預(yù)先擴增條件是：表2.dna類型chpv2ocp1和2經(jīng)純化的gdna17個循環(huán)15個循環(huán)ffpedna20個循環(huán)18個循環(huán)表1：用于ampliseq圖的預(yù)先擴增環(huán)的次數(shù)和使用的材料。循環(huán)條件是：對于表1中展示的循環(huán)的數(shù)目，99℃2分鐘(1×)，接著[99℃，15秒，60℃4分鐘]預(yù)先擴增材料來源于3個dna來源：80：20是2種corielldna的混合物(80％：20％)ffpe1(從ffpe樣品本“1”提取的dna)ffpe5(從ffpe樣本“5”提取的dna)預(yù)先擴增材料的1μl等分試樣(pa)在1mlte緩沖液中以1∶1000稀釋。假設(shè)預(yù)先擴增pcr反應(yīng)中的100％功效，可計算用于桑格測序的后續(xù)pcr反應(yīng)(bddpcr)的目標數(shù)目表3.由于預(yù)先擴增反應(yīng)，存在足夠的可用于反映測試的目標材料。先前目標有限樣品不再受限制。除桑格測序以外，也可能可以使用其它檢測方法，包括(但不限于)數(shù)字pcr、cast-pcr或其它等位基因特異性pcr方法、單個堿基延伸化學方法和檢測(通過ce或質(zhì)譜進行)。此外，可設(shè)計信息性或可行目標(例如tp53、kras、braf、egfr等)的圖，其可通過作為后續(xù)普通測序之前的第一步驟桑格測序分析或通過桑格測序(或另一方法)獨占地使用。所使用的pcr引物：針對單一pcr的一般適合性來評估chpv2圖的擴增子和引物序列。由這一列表，總共48個目標(包括18個“困難”目標，其具有g(shù)c富集區(qū)域、短擴增子區(qū)域、均聚物a或均聚物t延伸)和其相應(yīng)的pcr引物對，并且將m13正向序列(tgtaaaacgacggccagt)添加到ampliseq正向引物的5′端和將m13反向序列(caggaaacagctatgacc)添加到ampliseq反向引物的5′端。這些是用于本發(fā)明中所描述的方法中的核酸酶敏感性擴增引物。引物資料列舉于本章節(jié)后的表8中。傳遞引物以100μm的濃度再懸浮于水中。通過組合10μl每個相應(yīng)的(正向和反向)引物對并且接著用80μl低te稀釋到100μl使得配對中的引物達到10μm的濃度來產(chǎn)生引物對(pp)主培養(yǎng)盤。主培養(yǎng)盤上引物對的定向如下：培養(yǎng)盤上的引物布局表4.由pp主培養(yǎng)盤，通過將10μm儲備引物對在低te中進一步稀釋到1μm并且將10μl稀釋物按以下組成涂布到兩組96孔盤(chpv2a和b)中來產(chǎn)生測試培養(yǎng)盤：表5.因此每個盤含有24個一致引物對的4個部分，使得可處理4個樣品，其通常是：i)ceph-1347基因組dna(在te中稀釋到1ng/μl的來自bigdyedirect測序試劑盒的對照性dna)；這一樣品通常位于管柱1-3中ii)na80：20材料(在chpv2或ocp(1和2)中預(yù)先擴增)始終位于管柱4-6中。iii)ffpe1材料(在chpv2或ocp(1和2)預(yù)先擴增)位于管柱7-9中iv)ffpe5材料(在chpv2或ocp(1和2)中預(yù)先擴增)位于管柱10-12中引物在盤上現(xiàn)場干燥并且接著在2周內(nèi)用于使用直接測序試劑盒進行的pcr測序?qū)嶒灒浒ㄓ糜趐cr擴增的試劑和后續(xù)循環(huán)測序化學物質(zhì)。直接測序試劑盒使用經(jīng)m13標記的pcr引物。這因為在后續(xù)測序反應(yīng)中使用化學增強型引物(如上文章節(jié)中所描述)作為測序引物并且具有m13正向或反向序列而是有利的。這允許幾乎在pcr擴增子的5′端立即進行序列讀取。這最大化重要的序列信息，因為ampliseq引物由于大量分段ffpedna的短性質(zhì)而被設(shè)計成極短(125-175nt)。在pcr之后，將直接測序試劑與化學增強型測序引物一起現(xiàn)場添加到擴增混合物中的擴增反應(yīng)產(chǎn)物中。這種試劑不僅含有循環(huán)測序所需的典型試劑(聚合酶、dntp和經(jīng)染料標記的ddntp)，而且還含有核酸酶以通過現(xiàn)場移除過量擴增引物來去除對其它純化操作的需要。表6.pcr和測序條件向測試盤(含有經(jīng)排列的干燥引物對)中的3個管柱a-h(24個孔)中的每個孔中添加13μlveritifast熱循環(huán)儀中的pcr：i：94℃10min(1x)ii：95℃3sec，60℃15sec，68℃45sec(8個循環(huán))iii：95℃3sec，70℃50sec(28個循環(huán))制備2種測序混合物：f(正向)和r(反向)表7.向新制的fastpcr盤中的每個孔中添加2μl正向測序混合物添加6.3μl來自pcr盤的pcr材料：正向seq向pcr盤(剩余約6.3μlpcr材料)的其余部分添加2μl反向測序混合物：反向seqveritifast熱循環(huán)儀中的pcr：37℃20min(1x)80℃2min(1x)95℃1min(1x)95℃3sec；50℃5sec；60℃45sec(27個循環(huán))通過添加55μlxterminator珠粒溶液混合物，接著劇烈渦旋30分鐘以移除較小的分子污染物來純化測序反應(yīng)物。在珠粒旋轉(zhuǎn)到孔的底部之后，將培養(yǎng)盤置放于appliedbiosystems3500xlgenetic分析器中以用于毛細電泳和序列堿基識別。用appliedbiosystemssequencescanner軟件評估所得.ab1測序檔案的質(zhì)量并且接著使用appliedbiosystemsvariantreporter軟件進一步分析以進行變異體的檢測。圖1展示通過桑格再測序和在具體直接測序技術(shù)中進行的校驗分析的特定目標。chpv.2表明這些基因座是ionampliseqtmcancerhotspotpanelv.2的一部分并且ocp表明所指示的基因座是iononcominetm癌癥圖的一部分。圖1展示對ionpgmtm(318個晶片)使用ionampliseq方法，所發(fā)現(xiàn)的由三個樣品產(chǎn)生的變異體。第二欄表示在特定樣品中發(fā)現(xiàn)的變異體的數(shù)目。對于特定基因座，右邊的其余欄表示所觀察的變異型序列的百分比。圖1展示在使用本發(fā)明的方法經(jīng)由桑格測序進行再測序時，由與圖6相同的三個樣品發(fā)現(xiàn)的變異型序列的校驗。研究相同基因座并且確認變異體。圖8a-8b是圖5的chpv2pa的targetsangerce測試集a的qualitygrid的示意性圖示(如在appliedbiosystemsvariantreportertm軟體中所見)。圖8a的下部在圖8b中以更大的比例再現(xiàn)，并且說明對于由ampliseq到桑格測序的工作流獲得的四個極具限制性的初始樣品中的每一個，96個所得擴增子中的88個具有2x覆蓋度(正向/反向)，并且8個具有1x覆蓋度。不存在脫扣。向右的箭頭表示成功的正向延伸產(chǎn)物制備并且向左的箭頭表示成功的反向延伸產(chǎn)物制備。圖8a-8b是圖5的chpv2pa的targetsangerce測試集b的qualitygrid的示意性圖示(如在appliedbiosystemsvariantreportertm軟體中所見)。圖8a的下部在圖9b中以更大的比例再現(xiàn)，并且說明對于由ampliseq到桑格測序的工作流獲得的四個極具限制性的初始樣品中的每一個，96個所得擴增子中的93個具有2x覆蓋度(正向/反向)，并且3個具有1x覆蓋度。不存在脫扣。向右的箭頭表示成功的正向延伸產(chǎn)物制備并且向左的箭頭表示成功的反向延伸產(chǎn)物制備。圖1展示電泳圖，其說明檢測樣品ffpe-5的alk-2中的次要變異體的測序結(jié)果。左圖(正向序列)和右圖(反向序列)中的箭頭明確展示在主要變異體信號峰下的大量次要變異體，其通過kbtm堿基識別可稱為混合堿基?？杀容^這一目測比率與使用iontorrentsuitetm軟體獲得的所提供的ampliseq衍生結(jié)果的比率以分析次要與主要的比率，其指配次要變異體的比率是26.8％。圖1展示電泳圖，其說明檢測樣品na8020的egfr-6中的次要變異體的測序結(jié)果。左圖(正向序列)和右圖(反向序列)中的箭頭明確展示在主要變異體信號峰下的可檢測量的次要變異體，其通過kbtm堿基識別不可稱為混合堿基?？杀容^這一目測比率與使用iontorrentsuitetm軟體獲得的所提供的ampliseq衍生結(jié)果的比率以分析次要與主要的比率，其指配次要變異體的比率是9.6％。圖1是由對ionpgmtm(318晶片)使用ocpampliseqtm的三個樣品的測序發(fā)現(xiàn)的tp53突變的出現(xiàn)頻率的示意圖。圖1是圖12的再測序樣品的示意圖，使用本發(fā)明的方法驗證圖12中展示的tp53突變。圖8a-8b展示四個樣品的來自ocpampliseqtm的24個tp53個別擴增子的qualitygrid(如在appliedbiosystemsvariantreportertm軟件中所見)。圖8a的下部在圖14b中以更大的比例再現(xiàn)，并且說明對于由ampliseqtm到桑格測序的工作流獲得的四個極具限制性的樣品中的每一個，96個擴增子中的94個具有完全2x覆蓋度(正向/反向)。不存在脫扣。向右的箭頭表示成功的正向延伸產(chǎn)物制備并且向左的箭頭表示成功的反向延伸產(chǎn)物制備。圖1展示檢測樣品ffpe5的tp53中次要變異體的測序結(jié)果的電泳圖.左圖(正向序列)和右圖(反向序列)中的箭頭明確展示在主要變異體信號峰下的可檢測量的次要變異體?？杀容^這一目測比率與使用iontorrentsuitetm軟體獲得的所提供的ampliseq衍生結(jié)果的比率以分析次要(c)與主要(t)的比率，其指配次要變異體的比率是17.9％。圖1展示在與圖15中所展示不同的位置檢測tp53中的次要變異體的測序結(jié)果的電泳圖，例如ffpe5。左圖(正向序列)和右圖(反向序列)中的箭頭明確展示在主要變異體信號峰下的可檢測量的次要變異體。可比較這一目測比率與使用iontorrentsuitetm軟體獲得的所提供的ampliseq衍生結(jié)果的比率以分析次要(c)與主要(t)的比率，其指配次要變異體的比率是21.8％。圖1展示在與圖15中所展示不同的第三位置檢測tp53中的次要變異體的測序結(jié)果的電泳圖，例如ffpe5。左圖(正向序列)和右圖(反向序列)中的箭頭明確展示在主要變異體信號峰下的可檢測量的次要變異體?？杀容^這一目測比率與使用iontorrentsuitetm軟體獲得的所提供的ampliseq衍生結(jié)果的比率以分析次要(c)與主要(g)的比率，其指配次要變異體的比率是20.2％。實例3毛細電泳樣品制備和檢測通過如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的解析核堿基序列的方法來分析經(jīng)擴增的樣品。舉例來說，可以遵循儀器制造商的指導(dǎo)使用毛細管電泳。bigdyexterminator純化試劑盒(appliedbiosystems，p/n4376486)可用于循環(huán)測序清理以防止未合并的經(jīng)染料標記的終止子、dntp和鹽與經(jīng)染料標記的延伸產(chǎn)物共同注射到毛細電泳dna分析器中。簡單來說，13μl測序反應(yīng)混合物與45μlsam溶液和10μlxterminator溶液組合。在樣品盤在1800rpm下渦旋20分鐘之后，樣品盤在1000xg下旋轉(zhuǎn)2分鐘。向每個孔中添加30μl70％乙醇并且盤在1650xg下離心15分鐘。通過將盤倒置在紙巾上并且在180xg下離心1分鐘來移除溶液。接著沉淀的測序反應(yīng)溶解于10μl50μmedta中并且裝載到配備有50em毛細管陣列的ab3500xl基因分析器(appliedbiosystems，fostercity，california)上。實例4毛細電泳方法和分析使用如儀器用戶指南所描述的染料集合z，用現(xiàn)有appliedbiosystems儀器，例如appliedbiosystems3500x1基因分析器進行毛細電泳(ce)。存在shortreadseq_bdx_pop7、rapidseq_bdx_pop7、fastseq_bdx_pop7、stdseq_bdx_pop7操作模塊。舉例來說，bdxfastseq50_pop7xl_1參數(shù)是：烘箱溫度：60℃，在60℃的操作溫度下，在效能最佳化聚合物(pop-7tm聚合物)中，樣品注射在1.6kv下進行5秒并且電泳在13.4kv下進行2520秒。其它ce儀器(如3500或3730xl基因分析器)的儀器參數(shù)(例如注射條件)的變化不同。使用對不同儀器具有特異性的版本的appliedbiosystems資料收集軟件(如3500資料收集軟件v1.0)來收集資料。用kb_3500_pop7_bdtv3direct.bcc和kb_3500_pop7_bdtv3direct.mob，通過appliedbiosystemskbtm堿基識別軟件v1.4.1分析序列軌跡以測定正確的堿基識別。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員了解，所使用的檢測技術(shù)通常不是限制性的。實際上，各種檢測手段都在所公開的方法和試劑盒的范圍內(nèi)，其限制條件為它們允許有待測定的擴增子的存在或不存在。雖然已經(jīng)結(jié)合特定實施例描述了本發(fā)明的原理，但是應(yīng)明確了解，這些描述僅僅是為了舉例并且并不打算限制本發(fā)明的范圍。已經(jīng)出于說明和描述的目的提供了本文中已經(jīng)公開的內(nèi)容。這并不打算是窮盡性的或?qū)⒈景l(fā)明限制為所述的精確形式。許多修改以及變化對于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將是顯而易見的。選擇并描述所公開的內(nèi)容以便最佳地解釋所述領(lǐng)域所公開的實施例的原理和實際應(yīng)用，由此使得所屬領(lǐng)域的其它技術(shù)人員能夠了解適合于所涵蓋的具體用途的各個實施例和各種修改。公開內(nèi)容的范圍打算由以下權(quán)利要求書和其等效物限定。表8.當前第1頁12