專利名稱：苯并咪唑化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及些苯并咪唑化合物，由于其具備抑制多聚ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.2.30)的作用，該酶已知可被稱為多聚(ADP-核糖)多聚酶，通常稱為ADPRT或PARP，因而它們至少是潛在的化療藥物。通常，后一個(gè)縮寫PARP將在本專利說明書中通篇使用。
至少在高等有機(jī)物中，已知多聚ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶是用來催化APD-核糖基團(tuán)從煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化形式NAD+向核受體蛋白轉(zhuǎn)化，以形成同(homo)ADP-核糖多聚體。這一過程涉及一系列細(xì)胞過程，如DNA損傷修復(fù)，細(xì)胞分化進(jìn)展，由致癌基因引起的細(xì)胞轉(zhuǎn)型及基因表達(dá)。這些過程中的一個(gè)共同特征是DNA鏈斷裂的形成和修復(fù)，涉及PARP酶的步驟似乎是DNA連接酶II-介導(dǎo)的鏈再接合。在大多數(shù)情況下，多聚ADP-核糖化作用已被PARP酶抑制劑的使用所包含，其引發(fā)了這樣一種聯(lián)想，由于這類抑制劑干擾細(xì)胞內(nèi)DNA修復(fù)機(jī)理，在它們應(yīng)該能夠改善治療阻力特性并加強(qiáng)或提高化療中細(xì)胞毒藥物作用或放療中照射作用的范圍內(nèi)，可以用作化療藥物，正如在許多抗腫瘤治療中，化療和放療的初級(jí)治療作用是引起靶細(xì)胞的DNA損傷。
在這方面，有幾類PARP抑制劑是已知的，包括苯甲酰胺和各種煙酰胺及苯甲酰胺同類物，特別是帶有小取代基(如3-氨基，3-羥基和3-甲氧基)的3-取代苯甲酰胺。一些N-取代的苯甲酰胺的PARP抑制活性在EP-A-0305008中已有報(bào)道，其中還建議在藥物中使用這些化合物，以提高放射或化療藥物的細(xì)胞毒作用。
關(guān)于苯甲酰胺化合物作為化療劑的這種用途，許多對(duì)這類已知顯示PARP抑制活性化合物的研究結(jié)果已證實(shí)它們可以在體外加強(qiáng)許多抗腫瘤劑(例如博來霉素和甲基化藥物)的細(xì)胞毒性。更多有限的數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明盡管所需的劑量很高(例如對(duì)于3-氨基苯甲酰胺，每劑量為0.5g/kg左右)，這類苯甲酰胺化合物也可以在體內(nèi)加強(qiáng)細(xì)胞毒藥物的活性，因此產(chǎn)生了制備滿意的藥物配方并避免毒性限制的問題。進(jìn)一步而言，許多已知的苯甲酰胺化合物已清楚地顯示出具有放射敏感劑的潛力，例如其可以在體外體內(nèi)增強(qiáng)電離放射誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡，人們已相信在許多情況下，這些化合物的這種作用與其作為PARP抑制劑發(fā)揮作用及干擾DNA修復(fù)有關(guān)。
然而，盡管現(xiàn)存的來自體外和體內(nèi)研究的數(shù)據(jù)支持PARP抑制劑具有相當(dāng)強(qiáng)的活性，可用作值得進(jìn)行進(jìn)一步臨床評(píng)價(jià)(例如在腫瘤治療的協(xié)同作用中)的化療劑，但現(xiàn)有已知的PARP抑制劑并不完全適合作為藥物的候選者，因此仍有需要尋找和發(fā)展更多的具有潛P(yáng)ARP抑制活性的化合物。
本發(fā)明涉及新的一組或多組化合物，該類化合物為PARP抑制劑，并因此可作為藥物使用，特別是在與一些細(xì)胞毒藥物或放療合用時(shí)，能增強(qiáng)后者的細(xì)胞毒作用。通常，本發(fā)明涉及的化合物包括一些苯并咪唑衍生物，特別是下面定義的苯并咪唑-4-羧酰胺化合物。由于其結(jié)構(gòu)特性，可以明顯地看出，許多此類化合物很適于與PARP酶的天然底物NAD+進(jìn)行競爭。
更具體地，本發(fā)明一方面涉及使用本文中定義的化合物來制備人用或獸用藥物，所述藥物用于抑制多聚(ADP-核糖)多聚酶或PARP(也叫ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶或ADPRT)的活性，此類酶的抑制作用構(gòu)成了治療的一個(gè)方面，其中所述的組合物提供活性PARP酶抑制劑，并包含具有通式I苯并咪唑-4-羧酰胺或其藥學(xué)上可接受的鹽和/或前藥形式。式I化合物的結(jié)構(gòu)特征如下R為選自氫，烷基，羥基烷基(如，CH2CH2OH)，?；?如，乙?；虮郊柞；?以及任意取代的芳基(如，苯基)或芳烷基(如，芐基或羧基芐基)基團(tuán)，并且，
R’為選自氫，烷基，羥基烷基(如，CH2CH2OH)，?；?如，乙?；虮郊柞；?以及任意取代的芳基(如，苯基)或芳烷基(如，芐基或羧基芐基)基團(tuán)。
本發(fā)明還提供了作為活性藥用物質(zhì)的具有通式I的苯并咪唑化合物(或其藥學(xué)上可接受的鹽和/或前藥形式)在治療方面的應(yīng)用、尤其但不唯一作為PARP抑制劑，
其中，取代基定義同上，例外的是R’不是任意取代的芳烷基，且R不是代表4’-甲磺酰氧基-2’-甲氧基-苯基。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了新的具有通式I的苯并咪唑化合物(或其藥學(xué)上可接受的鹽和/或前藥形式)，其中，取代基定義同上，例外的是R’不是任意取代的芳烷基，且R不代表4’-甲磺酰氧基-2’-甲氧基-苯基或一個(gè)未取代的芳基如苯基。
烷基在以其本身或在其它基團(tuán)中存在時(shí)，通常具有1-8個(gè)碳原子，優(yōu)選1-6個(gè)碳原子，更優(yōu)選1-4個(gè)碳原子。特別是當(dāng)R和/或R’是烷基時(shí)，它們通常是C1-6烷基，例如，甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，叔丁基或環(huán)己基。當(dāng)R和/或R‘是或是包括苯基時(shí)，它可以是被取代的，特別是在4(對(duì))位上取代，但是也可換在或另外在2-位或3-位上，例如，被各種取代基所取代，取代基包括羥基，烷氧基(例如甲氧基或乙氧基)，氰基，羧基，酰胺基，四唑基，氨基或取代的氨基，CW3(例如CF3)或W，其中W是鹵素。
當(dāng)R’是氫或烷基時(shí)，優(yōu)選通式I化合物包括這樣的化合物，其中R是苯基或芐基，且在苯環(huán)上具有至少一個(gè)選自下列基團(tuán)的取代基羥基，烷氧基，硝基，N3，NR5R6(R5和R6各自獨(dú)立地表示氫，烷基或烷氧基)，NHCOR3(R3是烷基或芳基)，CO2R4(R4是氫或烷基)，酰胺基(如，CONH2)，四唑基，烷基，羥基烷基，CW3或W(W是鹵素)，和CN。
更優(yōu)選，R表示具有式II的取代的苯基
R1，R2和R9可獨(dú)立地選自氫，羥基，烷氧基，硝基，N3，NR5R6(R5和R6各自獨(dú)立地表示氫，烷基或烷氧基)，NHCOR3(R3是烷基或芳基)，CO2R4(R4是氫或烷基)，酰胺基(如，CONH2)，四唑基，烷基，羥基烷基，CW3或W(W是鹵素)，和CN。
本發(fā)明還提供了一種制備上述定義的式I化合物的方法，其中R表示任意取代的具有式II的基團(tuán)，所述的方法包括將2，3-二氨基苯甲酸烷基酯與芳酰氯反應(yīng)，用乙酸在升高溫度下處理產(chǎn)物，生成苯并咪唑環(huán)，然后與液氨反應(yīng)生成酰胺衍生物。
其中，R′表示具有式III取代的苯基
R7，R8和R10可獨(dú)立地選自氫，羥基，烷氧基，硝基，N3，NR5R6(R5和R6各自獨(dú)立地表示氫，烷基或烷氧基)，NHCOR3(R3是烷基或芳基)，CO2R4(R4是氫或烷基)，酰胺基(如，CONH2)，四唑基，烷基，羥基烷基，CW3或W(W是鹵素)，和CN。
上述定義的具有氰基取代的芳香環(huán)的式I化合物可以是用于制備本發(fā)明中的其他化合物的特別有用的中間體，因?yàn)橐话銇碇v，可以用標(biāo)準(zhǔn)的方法將氰基轉(zhuǎn)化為各種其他的功能基團(tuán)，包括氨基，羧基，酰胺基和四咪基。
在本發(fā)明中公開的苯并咪唑化合物的范圍內(nèi)，特別感興趣的和可取的成員包括(a)2-甲基苯并咪唑-4-羧酰胺；(b)苯并咪唑-4-羧酰胺；(c)2-苯基苯并咪唑-4-羧酰胺；(d)2-(4′-甲氧基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(e)2-(4′-三氟甲基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(f)2-(4′-羥基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(g)2-三氟甲基苯并咪唑-4-羧酰胺；(h)2-(4′-甲氧基苯基)-N-甲基苯并咪唑-4-羧酰胺；(i)2-(4′-硝基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(j)2-(4′-氰基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(k)2-(3′-三氟甲基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(l)2-(3′-甲氧基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(m)2-(4′-甲氧基苯基)-1-N-苯甲?；讲⑦溥?4-羧酰胺；(n)2-(4′-氨基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(o)2-(2′-三氟甲基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(p)N-羧芐基-2-(4′-甲氧基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；
在本發(fā)明上述定義的化合物中，其中有一個(gè)電子-富有芳環(huán)，可以確信至少在一些情況下，羧酰胺基可以被定為一個(gè)固定的構(gòu)象，通過咪唑環(huán)上氮原子與羧酰胺基團(tuán)上氫原子之間的分子間氫鍵，使該化合物特別適合作為與PARP酶結(jié)合的NAD+的抑制劑。
正如已經(jīng)指出的那樣，本發(fā)明還包括或擴(kuò)展了上述定義化合物的制備方法(在一些情況下還包括中間體)，以及該類化合物在治療哺乳動(dòng)物疾病方面的用途。它包括其用于制備人用或獸用制品或藥物制劑的用途，在上述制品或藥物制劑中含有有效的PARP抑制量的活性化合物，將其與細(xì)胞毒藥物結(jié)合或與放療結(jié)合用于患者可增加后者的細(xì)胞毒效應(yīng)?？梢圆捎萌魏嗡帉W(xué)上已知的方法來制備適合任何給藥方式的制品或藥物制劑，例如，口服，非腸道途徑(包括皮下，肌肉和靜脈給藥)，或局部給藥。所用的給藥方式、制品或藥物制劑的劑型以及劑量通常是由合并使用的細(xì)胞毒藥物化學(xué)的細(xì)節(jié)或放療的情況來決定。
例如，在制備這種用于非腸道給藥的無菌液體劑型的藥物制劑時(shí)，可將預(yù)定的有治療效應(yīng)且無毒性的一定量的特定化合物溶解于磷酸鹽緩沖液的鹽水中，可將該制劑配成單位劑型，并灌封在安瓿中備用。通常，至少在水溶液中，優(yōu)選的濃度不大于200mg/ml，當(dāng)然為獲得最適宜的療效所需要的劑量和給藥途徑是可變化的，并且最終是由醫(yī)生或獸醫(yī)根據(jù)每一特定的病例來決定。當(dāng)該化合物是與細(xì)胞毒藥物合并使用時(shí)，在一些情況下可同時(shí)服用后者，并且也可方便地將后者制備于同一藥物制劑或組合物中。
如上說述，本發(fā)明化合物至少是潛在的PARP抑制劑，并且在后面所述的體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出陽性的藥理活性，從而可以相信它反映了在臨床體內(nèi)治療應(yīng)用時(shí)所將發(fā)現(xiàn)的活性。
應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明說明書中對(duì)式I化合物作說明時(shí)，也應(yīng)包括它們藥學(xué)上可接受的鹽以及其它藥學(xué)上可接受的生物前體(前藥形式)。術(shù)語“前藥”在本發(fā)明中是用來指藥理活性化合物的修飾形式或衍生物。在哺乳動(dòng)物的治療中，服用該前藥后，特別是經(jīng)口服或非腸道給藥后，它們?cè)隗w內(nèi)生物降解，并轉(zhuǎn)化為所述的活性化合物。由于此類前藥可以增加在水性溶媒中的溶解度，克服了制劑上的難題，故常被選用，此外，在一些情況下，其還可以減緩或控制活性藥物的釋放。
通常，滿意的前藥必須是水溶性的衍生物，它必須是無毒的且在生理pH值的溶液中是相對(duì)穩(wěn)定的，但在治療過程中給藥后，其可在所需的部位被生物降解成為或轉(zhuǎn)化成為活性化合物，例如通過酶降解或環(huán)境pH值的變化。對(duì)本發(fā)明的苯并咪唑化合物而言，其前藥形式可以是常規(guī)的氨基甲酸鹽(酯)或氨基酸衍生物，例如甘氨酸或其他氨基酸氨基甲酸鹽(酯)衍生物，或?yàn)榱姿猁}衍生物。磷酸鹽衍生物對(duì)在體內(nèi)由酶的去磷酸化反應(yīng)是敏感的，且在此是優(yōu)選，尤其優(yōu)選水溶性的銨或堿金屬磷酸鹽。這些鹽類一般可方便地由帶有至少一個(gè)羥基取代基的式I化合物(例如在R的芳香環(huán)部分)，與磷酸二芐酯反應(yīng)來制備，優(yōu)選在叔堿存在下反應(yīng)，例如N，N′-二異丙基乙基胺。
在R為苯基(芐基)及必要時(shí)帶有一個(gè)不是羥基的取代基，例如4′位上的硝基，羧基，氰基等，以獲得滿意的PARP抑制活性的情況下，可在芳香環(huán)的另一個(gè)位置上，例如3′位上，進(jìn)行羥基取代基的磷酸化或進(jìn)行其他方式的前藥修飾。
在所有目前所遇到的水溶性前藥形式中，磷酸鹽(酯)、氨基甲酸鹽(酯)或其他水溶性前藥片段將是結(jié)構(gòu)式I中R或R′的組成部分。
應(yīng)該明白的是，這里所指的任何化合物均可以以一種以上對(duì)映體的形式存在，所有這些形式和它們的混合物以及其制備和用途均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
下列制備各種優(yōu)選化合物所采用的合成路線步驟的實(shí)例和描述將進(jìn)一步說明本發(fā)明，但無論如何不應(yīng)限制本發(fā)明。
在第一個(gè)實(shí)例中(實(shí)例1)，描述了各種中間體化合物的制備方法，它們是制備本發(fā)明實(shí)例2-6中所述的苯并化合咪唑物時(shí)所需的中間體。實(shí)例1中間體化合物制備(a)3-硝基鄰氨甲酰苯甲酸在20分鐘內(nèi)，將3-硝基鄰苯二甲酸(10.0g，50mmol)分批加到濃氨水中(15ml)，混合物于30℃下繼續(xù)攪拌30分鐘。冷卻此灰黃色溶液，得到鄰氨甲酰苯甲酸銨的結(jié)晶物質(zhì)，收集并重新溶解于最少量的溫水中。攪拌下滴加濃鹽酸(4.5ml)，生成的膏狀物用水洗滌，真空干燥，得3-硝基鄰氨甲酰苯甲酸，其為細(xì)白色粉末(9.01g，83％)，m.p.217℃。實(shí)測(cè)值C，45.76；H，2.79；N，13.21理論值(C8H6N2O5)C，45.71；H，2.86；N，13.33％vmax/cm-13466.52，3321.84，1668.64，1604.98，and 1525.89 ；δH(d6-DMSO，200MHz)7.75(1H，brs，CONH)，7.8(1H，t，Ar-5H)，8.16(1H，brs，CONH)，8.2(1H，d，Ar-6H)，8.3(1H，d，Ar-4H)；δC(d6-DMSO)127.32，130.06，132.28，133.49，134.78，147.71，166.25，and 166.60；m/z(EI)192(M+-1)，177，149，103，75.
(b)2-氨基-3-硝基苯甲酸(3-硝基鄰氨基苯甲酸)0℃下，向攪拌著的氫氧化鉀(24.1g)的水溶液(110ml)中加入溴(2.46ml)，再加入3-硝基鄰氨甲酰苯甲酸(10g，47.62mmol)?；旌衔镉?0℃下攪拌3小時(shí)，冷卻至室溫，再攪拌12小時(shí)。濾集橙色沉淀，并重新溶解于最少量的水中，滴加濃鹽酸酸化。用熱水對(duì)生成的黃色固體重結(jié)晶，得3-硝基鄰氨基苯甲酸，其為黃色(6.42g，74％)，m.p.208-209℃。實(shí)測(cè)值C，45.83；H，3.07；N，15.21理論值(C7H6N2O4)C，46.15；H，3.29；N，15.38％vmax/cm-13476.17，3344.99，3094.21 and 1687.93；δH(d6-DMSO，200MHz)6.76-6.84(1H，t，Ar-5H)，8.29-8.41(2H，dd，Ar-4/6H)，8.60(2H，s，Ar-NH2)，13.4-14.0(1H，brs，Ar-CO2H)；δC(d6-DMSO)113.19，131.97，140.02(Ar-4/5/6CH)，115.02(Ar-C-NH2)，132.77(Ar-C-CO2H)，147.09(Ar-C-NO2)，168.95(Ar-CO2H)；m/z(EI)182(M+)，164.
(c)2-氨基-3-硝基苯甲酸甲酯0℃下，將氯化氫氣體導(dǎo)入2-氨基-3-硝基苯甲酸(0.5g，2.75mmol)的甲醇溶液(40ml)中15分鐘?；旌衔锛訜峄亓?小時(shí)，在12小時(shí)內(nèi)冷卻至室溫，得到2-氨基-3-硝基苯甲酸甲酯沉淀，其為黃色固體(417mg，77％)，m.p.95-96。實(shí)測(cè)值C，49.09；H，3.78；N，14.03理論值(C8H8N2O4)C，48.98；H，4.08；N，14.29％；vmax/cm-13452.5，3316.9，1702，and1253.7；δH)d6-DMSO，200 MHz)3.95(3H，s，OCHH3)，6.79-6.87(1H，t，Ar-5H)，8.28-8.33(1H，dd，Ar-4H)，8.41-8.46(1H，dd，Ar-6H)，8.45-8.46(2H，brs，Ar-NH2)； m/z(EI)196(M+)，164，118，90，63.
(d)2，3-二氨基苯甲酸將漿狀的Pd/C(10％Pd，約200mg)催化劑的甲醇溶液(10ml)小心地加到3-硝基鄰氨基苯甲酸(2.44g，13mmol)的甲醇(120ml)溶液中，混合物在氫氣下攪拌2小時(shí)，直至氣體吸收停止。經(jīng)硅藻土濾除催化劑，濾液在減壓下蒸發(fā)至干，得到粗產(chǎn)品。硅膠柱層析純化，以二氯甲烷∶甲醇(4∶1)洗脫，得到2，3-二氨基苯甲酸，其為紅色固體(1.34g，66％)。vmax/cm-13433.73，2882.02，2602.30 and 1658.99；δH(d6-DMSO，200 MHz)5.8-7.4(4H，brs，2xNH2)，6.45(1H，t，Ar-5H)，6.75(1H，d，Ar-4H)，7.20(1H，d，Ar-6H)；δC(d6-DMSO)110.31，115.45，118.33，120.55，135.03，140.36，170.68；m/z(EI)152(M+)，134，106，79.
(e)2，3-二氨基苯甲酸甲酯按上說述，用氯化氫飽和2，3-二氨基苯甲酸(0.2g，1.32mmol)的甲醇(40ml)溶液，隨后將混合物加熱回流2小時(shí)。將蒸除溶劑后得到的固體殘留物溶解于水中，用碳酸氫鈉將溶液的pH值調(diào)至7.0。用乙酸乙酯(2×30ml)提取后，合并有機(jī)相，并用MgSO4干燥，除去溶劑得到棕色油狀的2，3-二氨基苯甲酸甲酯，用石油醚(40/60)研制固化(121.6mg，56％)，m.p.62-63℃實(shí)測(cè)值C，58.35；H，5.80；N，16.69理論值(C8H10N2O2)C，57.83；H，6.02；N，16.87％；δH(d6-DMSO)，200MHz)3.87(3H，s，OCH3).4.90(2H，brs，Ar-2-NH2)，6.32(2H，brs，Ar-3-NH2)，6.46-6.54(1H，t，Ar-5H)，6.80-6.84(1H，dd，Ar-4H)，7.18-7.23(1H，dd，Ar-6H)；m/z(EI)166(M+)，134，106，79.
2，3-二氨基苯甲酸甲酯也可以從2-氨基-3-硝基苯甲酸按下列步驟還原制備將含有鈀碳催化劑(10％Pd，～50mg)的2-氨基-3-硝基苯甲酸甲酯(284mg，1，45mmol)的甲醇(40ml)溶液在氫氣下攪拌24小時(shí)，溶液經(jīng)硅藻土過濾，除去催化劑，蒸除溶劑得到棕色固體(180mg，75％)，經(jīng)鑒定同上述制備的2，3-二氨基苯甲酸甲酯。
(f)2-氨基-3-N-苯甲酰胺基苯甲酸甲酯將苯甲酰氯(38.4μl，0.331mmol)的四氫呋喃(5ml)溶液滴加至含有三乙胺(46μl)和4-甲基氨基吡啶(1.8mg，5mol％)的2，3-二氨基苯甲酸甲酯(50mg，0.301mmol)的干燥的四氫呋喃(5ml)溶液中。在45℃攪拌24小時(shí)后，蒸除溶劑，粗品用硅膠柱層析純化，石油醚(40/60)∶乙酸乙酯(3∶2)為洗脫劑，用乙酸乙酯-石油醚(40/60)重結(jié)晶，得到白色結(jié)晶狀標(biāo)題化合物。(60mg，74％)；δH(d6-DMSO，200MHz)3.95(3H，s，OCH3)，6.64(2H，brs，Ar-NH2)，6.69-6.77(1H，t，Ar-5H)，7.46-7.50(1H，d，Ar-4H)，7.59-7.70(3H，m，Ph-3andPh-3′4H)，7.81-7.85(1H，d，Ar-6H)，8.11-8.14(2H，d，Ph-2Hand Ph-2′H)，9.8-9.9(1H，br，s，Ar-NHCO)；m/z(EI)270(M+)，253，105.
(g)2-氨基-3-N-(4′-甲氧基苯甲酰基)氨基苯甲酸甲酯向2，3-二氨基苯甲酸甲酯(460mg，2.77mmol)的干燥的四氫呋喃(20ml)溶液中加入4-甲氧基苯甲酰氯(378μl，2.77mmol)，三乙胺(385.5μl，2.77mmol)和4-二甲基氨基吡啶(17mg，5mol％)。反應(yīng)溶液在室溫下攪拌過夜，用過濾收集所得的不溶解性沉淀。濾液經(jīng)減壓蒸餾，所得殘留物再溶解于沸騰的甲醇中，熱過濾除去不溶物。減壓蒸除溶劑，將固體殘留物與前面收集的沉淀合并，用無水甲醇重結(jié)晶，得到白色結(jié)晶狀標(biāo)題化合物。(513.2mg，62％)。mp 179-180℃；實(shí)測(cè)值C，64.26；H，5.31；N，9.17理論值(C16H16N2O4)C，64.0；H，5.33；N，9.33％；vmax/cm-13425.54，3341.54，3277.84，1699.24，1632.12，1251.11；δH(d6DMSO，200MHz)3.92(3H，s，OMe)，3.94(3H，s，OMe)，6.59(2H，s，Ar-NH2)，6.68-6.75(1H，t，Ar-5H)，7.13-7.17(2H，d，J＝8.8，Ph-3/3′H)，7.43-7.46(1H，d，Ar-4H)，7.79-7.83(1H，d，Ar-6H)，8.07-8.12(2H，d，J＝8.8，Ph-3.3′H)，9.7(1H，brs，-NHCO-)；δC(d6DMSO)51.98，55.76，110.62，113.79，114.67，125.0，126.84，129.12，130.14，133.20，147.36，162.21，165.74，168.33 ； m/z(EI)300(M+)，135，107，77.
(h)2-苯基苯并咪唑-4-羧酸甲酯將2-氨基-3-N-苯甲?；被郊姿峒柞?6.3mg，0.023mmol)冰醋酸(0.5ml)溶液在回流溫度下攪拌15分鐘。冷卻后，減壓蒸除溶劑，得到標(biāo)題化合物δH(d6-DMSO，200 MHz)4.09(3H，s，OCH3)，7.40-7.48(1H，t，Ar-5H)，7.64-7.70(3H，m，2-Ph-3H and3′-Ph-4H)，7.93-7.97(1H，d，Ar-4H)，8.06-8.10(1H，d，Ar-6H)，8.39-8.41(2H，d，2-Ph-2/2′H)，12.4-12.5(1H，br，s，Ar-NHCO).實(shí)例2苯并咪唑-4-羧酰胺(化合物NU1066)(a)第一步-制備苯并咪唑-4-羧酸(化合物NU1067)將溶于鹽酸(4M，10ml)的2，3-二氨基苯甲酸(0.5g，3.29mmol)和甲酸(405μl，9.87mmol)混合物加熱回流1小時(shí)，收集冷卻時(shí)產(chǎn)生的沉淀，將其溶于沸騰的甲醇中，用活性碳脫色，蒸除溶劑，得到白色結(jié)晶狀的苯并咪唑-4-羧酸(407.9mg，77％)；實(shí)測(cè)值C，46.11；H，3.63；N，13.27理論值(C8H6N2O2·HCL·0.5H2O)C，46.28；H，3.88；N，13.49％δH(d6-DMSO，200MHz)7.7-7.8(1H，t，Ar-5H)，8.2-8.3(2H，dd，Ar-4/6H)，9.65(1H，s，imidazole-2H).
(b)第二步-制備苯并咪唑-4-羧酰胺(化合物NU1066)
將苯并咪唑-4-羧酸(397.4mg，2.45mmol)的亞硫酰氯(10ml)混懸液加熱回流3.5小時(shí)，減壓蒸除亞硫酰氯。將殘留固體懸浮于干燥的四氫呋喃(10ml)中，在攪拌下，30分鐘內(nèi)，向其中滴加濃氨水(50ml)，減壓除去多余的溶劑，將殘留物溶于最小量的水中，用乙酸乙酯提取(2×20ml)。蒸餾合并的有機(jī)相，將所得的固體溶于鹽酸(0，1M，10ml)中。過濾除去不溶解的沉淀，小心地調(diào)節(jié)(1pH單位地增加)pH至9，在每一步中都用乙酸乙酯提取(10ml)。干燥合并的提取液(MgSO4)，蒸除溶劑。用乙酸乙酯重結(jié)晶，得到苯并咪唑-4-羧酰胺(50mg，13％)；實(shí)測(cè)值C，59.95；H，3.90；N，24.59理論值(C9H7N3O)C，59.63；H，4.35；N，26.09％uv/nm 210，270，291；vmax/cm-13321.84，3150.16，1747.73，1680.21；δH(d6-DMSO，200MHz)7.4(1H，t，Ar-5H)，7.8-8.0(3H，dd，Ar-4/6H)，8.5(1H，brs，imidazole-2H)，9.4(1H，brs，CONH)，13.1(1H，brs，CONH)；m/z(EI)161(M+)，141，116，99.實(shí)例32-甲基苯并咪唑-4-羧酰胺(化合物NU1064)(a)第一步-制備2-甲基苯并咪唑-4-羧酸將乙酸(0.23ml)加入至溶于鹽酸(4M，3.2ml)的2，3-二氨基苯甲酸(200mg，1.32mmol)中，該混合物加熱回流1小時(shí)，蒸除溶劑，將殘留固體溶于沸騰的甲醇(5ml)中，用活性碳脫色，蒸除溶劑，得到無定形白色固體狀的2-甲基苯并咪唑-4-羧酸(167.5mg，72％)；δH(d6-DMSO)2.9(3H，s，imidazole-2-CH3)，7.6-7.8(1H，t，Ar-5H)8.1(2H，d，Ar-4/6H)；m/z(EI 176(M+)，158，130.
(b)第二步-制備2-甲基苯并咪唑-4-羧酰胺、化合物NU1064)將2-甲基苯并咪唑-4-羧酸(500mg，2.84mmol)的亞硫酰氯(10ml)混懸液加熱回流2小時(shí)，減壓蒸除亞硫酰氯。將殘留固體懸浮于干燥的四氫呋喃中，在攪拌下，30分鐘內(nèi)，向其中滴加濃氨水(50ml)，減壓除去溶劑，將殘留固體溶于最小量的水中，過濾，用乙酸乙酯提取(2×30ml)。蒸除溶劑，得到一個(gè)棕色固體，用乙酸乙酯重結(jié)晶，得到白色的標(biāo)題化合物(70.1mg，14％)。實(shí)測(cè)值C，61.47；H，4.96；N，23.39理論值(C9H9N3O)C，61.71；H，5.14；N，24.0％uv/nm209，270；vmax/cm-13296.77，3071.07，1913.63，1859.62，1805.60；δH(d6-DMSO，200MHz)2.68(3H，s，imidazole-2-CH3)，7.30-7.38(1H，t，Ar-5H)，7.72--7.46(1H，d，Ar-4H)，7.86-7.90(1H，d，Ar-6H)，7.72-7.90(1H，brs，imidazole-NH)，9.4(1H，brs，CONH)，12.8(1H，brs，CONH)；m/z(EI)175(M+)，158，130.實(shí)例42-苯基苯并咪唑-4-羧酰胺(化合物NU1070)(a)第一步-制備2-苯基苯并咪唑-4-羧酸將2，3-二氨基苯甲酸(0.1g，0.66mmol)，苯甲酸(80.2mg，0.66mmol)和多聚磷酸(～5ml)的混合物于150-160℃加熱30分鐘，冷卻后，加入冰(～10g)。將不溶物從該黑色溶液中濾除，用乙酸乙酯提取濾液(2×20ml)，以除去未反應(yīng)的苯甲酸。水溶液用氫氧化鈉(10M)小心中和，過濾，用乙酸乙酯提取濾液(2×30ml)，干燥合并的提取液(MgSO4)，蒸除溶劑。用硅膠層析，二氯甲烷∶甲醇(85∶15)洗脫，得到標(biāo)題化合物(31.2mg，20％)；δH(d6-DMSO，200 MHz)7.4(1H，t，Ar-5H)，7.62(3H，brs，3-Ph-4H and 3′-Ph-4H)，7.91(1H，d，Ar-6H)，7.97(1H，d，Ar-4H)，8.39(2H，d，Ph-2H and Ph2′-H)；m/z(EI)238(M+)，220，192，77.
(b)第二步-制備2-苯基苯并咪唑-4-羧酰胺(化合物NU1070)將2-苯基苯并咪唑-4-羧酸(50mg，0.21mmol)溶于干燥的四氫呋喃(10ml)中，加入亞硫酰氯(16.8μl，0.231mmol)和DMF(0.05ML)，混合物在室溫下攪拌12小時(shí)，當(dāng)產(chǎn)生白色沉淀時(shí)，將該懸浮液在攪拌下，10分鐘內(nèi)滴加至氨水中，繼續(xù)攪拌30分鐘，用水稀釋(20ml)，用鹽酸(4M)中和，冷卻后析出白色固體，過濾收集，得到2-苯基苯并咪唑-4-羧酰胺(31mg，62％)；vmax/cm-13320，3180，1660 and 1600；δH(d6-DMSO，200MHz)7.45(1H，t，Ar-5H)，7.72(3H，d，3-Ph-4H)，7.87(1H，d，Ar-4H)，7.97(1H，brs，CONH)，7.99(2H，d，Ar-6H)，8.38(2H，d，Ph-2-H and Ph-2-H)，9.5(1H，brs，CONH)；m/z(EI)237(M+)，220，192，165，77.實(shí)例52-(4’-甲氧苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺(NU1076)(a)第一步-2-(4’-甲氧苯基)苯并咪唑-4-羧酸甲酯乙酸鹽的制備將2-氨基-3-N-(4’-甲氧苯甲?；?苯甲酸甲酯(480mg，1.6mmol)溶于冰乙酸(15ml)中，在120-130℃下加熱30分鐘。除去溶劑，固體殘?jiān)靡宜嵋阴?石油醚(40/60)重結(jié)晶，得到白色固體狀產(chǎn)品(409mg，75％)。mp141-142℃；實(shí)測(cè)值C，63.68；H，4.79；N，7.88理論值(C16H14N2O3.CH3CO2H)C，63.16；H，5.26；N，8.19％vmax/cm-13375.33，1718.46，1696.80，1282.81，1257.81，1257.34；δH(d6DMSO)，200MHz)2.02(3H，s，CH3CO2H)，3.97(3H，s，OMe)，4.09(3H，s，OMe)，7.21-7.25(2H，d，J＝8.6，Ph-3/3′H)，7.39-7.46(1H，t，Ar-5H)，7.90-7.93(1H，d，Ar-4H)，8.00-8.04(1H，d，Ar-6H)，8.36-8.40(2H，d，J＝8.6，Ph-2/2′H)，12.1(1H，s，Imz-H)，12.3-12.4(1H，br，s，CH3CO2H)；δC(d6DMSO)21.35，52.37，55.64，114.41，121.68，122.35，124.34，129.56，153.63，161.27，166.13，172.37；m/z(EI)282(M+-CH3CO2H)，250，222，77，60，43，32.
(b)第二步-2-(4’-甲氧苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺的制備(NU1076)將2-(4’-甲氧苯基)苯并咪唑-4-羧酸甲酯乙酸鹽溶于過量的液氨中，在100℃下，于一個(gè)40大氣壓的密封加壓容器中加熱過夜。蒸除氨，收集固體殘?jiān)⒂帽礈?3×5ml)。用水合甲醇重結(jié)晶，得到標(biāo)題化合物(226.4mg，80％)。mp261-263℃；實(shí)測(cè)值C，66.07；H，4.23；N，15.29理論值(C15H13N3O2.0.2CH3OH)C，66.70；H，5.08；N，15.35％vmax/cm-13321.47，3140.72，1656.23，1608.25，1421.43，1242.55；δH(d6DMSO，200MHz)3.96(3H，s，OMe)，7.23-7.27(2H，d，J＝8.6，Ph-3/3′H)，7.37-7.45(1H，t，Ar-5H)，7.78-7.82(1H，d，Ar-4H)，7.87(1H，brs，Imz-H)，7.93-7.96(1H，d，Ar-6H)，8.27-8.31(2H，d，J＝8.6，Ph-2/2′H)，9.4-9.5(1H，brs，-CONH)，13.3-13.4(1H，brs，-CONH)；m/z(EI)267(M+)，249，222，206，77，32.實(shí)例62-(4’-三氟甲基)苯并咪唑-4-羧酰胺(NU1077)
(a)第一步-2-氨基-3-N-(4’-三氟甲基苯甲?；?氨基苯甲酸甲酯的制備向2，3-二氨基苯甲酸甲酯(300mg，1.807mmol)溶液中加入4-三氟甲基苯甲酰氯(268.4ul，1.807mmol)，三乙胺(251.4ul，1.807mmol)及4-二甲基氨基吡啶(11mg，5mol％)，混合物于室溫下攪拌過夜。減壓蒸除反應(yīng)溶劑，生成的固體用乙酸乙酯洗滌，用甲醇-水重結(jié)晶兩次，得到白色固體狀標(biāo)題化合物(83.6mg，14％)。mp180-181℃；實(shí)測(cè)值C，56.75；H，3.50；N，8.28理論值(C16H13F3N2O3)C，56.80；H，3.85；N，8.28％uv/nm 222；δH(d6DMSO，200MHz)3.93(3H，s，OMe)，6.70-6.76(3H，m，Ar-5H，Ar-NH2)，7.46-7.49(1H，d，Ar-4H)，7.81-7.85(1H，d，Ar-6H)，7.99-8.03(2H，d)，8.29-8.33(2H，d)，10.05(1H，s，-NHCO-)；m/z(EI)338(M+)，321，289，145，32.
(b)第二步-2-(4’-三氟甲基苯基)苯并咪唑-4-羧酸甲酯乙酸鹽的制備將2-氨基-3-N-(4’-三氟甲基苯甲?；?氨基苯甲酸甲酯(75.7mg，0.224mmol)溶于冰乙酸(5ml)中，于125℃下攪拌0.5小時(shí)。蒸除反應(yīng)溶劑，殘余的白色固體用石油醚洗滌，得到標(biāo)題化合物(59.6mg，70％)。mp 138-140℃；實(shí)測(cè)值C，56.78；H，3.98；N，7.36理論值(C16H11F3N2O2CH3CO2H)C，56.84；H，3.94；N，7.37％uv/nm 206，319；δH(d6-DMSO，200MHz)2.01(3H，s，CH3CO2H)，7.44-7.52(1H，t，Ar-5H)，7.97-8.14(4H，m)，8.65-8.66(2H，d)，12.1(brs，Imidazole-NH)，12.7-12.8(1H，brs，CH3CO2H)；m/z(EI)320)M+-CH3CO2H)，301，288，260，145，60，43.
(c)第三步-2-(4’-三氟甲基)苯并咪唑-4-羧酰胺的制備(NU1077)將2-(4’-三氟甲基苯基)苯并咪唑-4-羧酸甲酯乙酸鹽溶于過量的液氨中，在100℃下，于一個(gè)40大氣壓的密封加壓容器中加熱12小時(shí)。蒸除氨，固體殘?jiān)帽礈?3×5ml)。用甲醇-水重結(jié)晶，得到細(xì)的白色針狀產(chǎn)品(19.1mg，48％)。mp 301-305℃；實(shí)測(cè)值C，56.45；H，3.50；N，12.41.理論值(C15H10F3N3O.CH3OH)C，56.97；H，4.18；N，12.46％δH(d6-DMSO，200MHz)7.45(1H，t，Ar-5H)，7.88-7.92(1H，d，Ar-4H)，7.99(1H，brs imidazole-NH)，8.03(1H，d，Ar-6H)；8.06-8.10(2H，d，J＝8.1)，8.55-8.59(2H，d，J＝8.1)，9.3-9.4(1H，brs，-CoNH)，13.7-13.8(1H，brs，-CONH)；m/z(EI)288(M+-NH3)，260，69.實(shí)例72-(4’-羥基苯基)-1-H-苯并咪唑-4-羧酰胺(化合物NU1085)氬氣下，將1M三溴化硼的二氯甲烷(3.8ml)溶液轉(zhuǎn)移至含有2-(4’-甲氧苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺(實(shí)例5中NU1076)(202.4mg，0.758mmol)的燒瓶中。生成的溶液用空氣冷凝器回流24小時(shí)。蒸除溶劑至干，固體殘?jiān)?0％NaOH(10ml)處理，再向其中滴加濃鹽酸至中性(pH＝7)。濾集白色沉淀，溶于乙酸乙酯(10ml)中。此有機(jī)溶劑用水(2×3ml)洗滌，MgSO4干燥，減壓除去溶劑得到產(chǎn)品(109.5mg，57％)。mp266-267℃；實(shí)測(cè)值C，63.27；H，4.37；N，15.67.理論值(C14H11N3O2.0.75 MeOH)C，63.04；H，4.69；N，15.76％vmax(cm-1)3424.01，3384.16，3309.20，3249.55，3155.62，1642.35，1618.02，1594.50，1577.74；δH7.03-7.07(2H，d，J＝8.5)，7.34-7.42(1H，t)，7.75-7.79(1H，d)，7.85(1H，brs)，7.90-7.94(1H，d)，8.15-8.19(2H，d，J＝8.5)，9.4-9.6(1H，brs)，10.0-10.4(1H，br s)，13.0-13.4(1H，br s)；m/z(EI)253(M+)，236，208，93.實(shí)例82-(4’-甲氧基苯基)-1-甲基苯并咪唑-4-羧酰胺(化合物NU1090)將2-(4’-甲氧苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺(實(shí)例5中NU1076)(105.3mg，0.394mmol)及氫氧化鉀粉末(22mg，0.394mmol)懸浮于丙酮(4ml)中，攪拌至所有固體溶解。加入碘化鉀(24.6ul，0.394mmol)，反應(yīng)物在室溫下攪拌過夜。減壓蒸除溶劑，柱層析純化白色固體殘?jiān)?，用二氯甲?甲醇95∶5洗脫，得到標(biāo)題化合物，其為細(xì)的白色結(jié)晶。(33.2mg，30％)mp289-292℃；實(shí)測(cè)值C，68.62；H，5.36；N，14.67.理論值(C16H15N3O2)C，68.33；H，5.34；N，14.95vmax(cm-1)3309.23，3141.44，1671.29，1605.30，1255.08，δH3.95(3H，s)，4.02(3H，s)，7.22-7.27(2H，d)，7.44-7.52(1H，t)，7.86-8.00(5H，m)，9.4(1H，brs，NH)；m/z(EI)281(M+)，264，250.實(shí)例92-(4’-甲氧基苯基)-1-苯甲?；讲⑦溥?4-羧酰胺(化合物NU1101)將2-(4’-甲氧基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺(實(shí)例5中化合物NU1076)(75.1mg，0.281mmol)和氫氧化鉀粉末(15.80mg，0.281mmol)溶解于丙酮(3ml)中，并攪拌至固體全部溶解。加入苯甲酰氯(32.6ul，0.281mmol)，并使該溶液在室溫下攪拌過夜，產(chǎn)生白色沉淀。減壓下除去溶劑，白色殘留物經(jīng)柱層析(二氯甲烷/甲醇95∶5洗脫)純化。所得固體用石油醚(40/60)/乙酸乙酯重結(jié)晶，得到純凈的產(chǎn)物(15.6mg，15％)，呈明亮的白色斜方晶型。mp 207-210℃；實(shí)測(cè)值C，70.45；H，4.60；N，10.99.理論值(C22H11N3O3·0.25CH3OH)C，70.45；H，4.47；N，11.08vmax(cm-1)3445.99，3318.55，2922.99，1689.79，1666.36；δH3.86(3H，s，OCH3)，7.02-7.06(2H，d)，7.50-7.65(4H，m)，7·72-7.82(3H，m)，7.88-7.92(2H，d)，8.08(1H，s，CONH)，8.10-8.14(1H，d)，9.1-9.2(1H，brs，CONH)；m/z(EI)371(M+)，105.進(jìn)一步的實(shí)例下列進(jìn)一步的實(shí)例，并包括一些已經(jīng)描述過的實(shí)例，采用了一些標(biāo)準(zhǔn)的方法。它們包括(1)2，3-二氨基苯甲酸甲酯與芳基酰氯反應(yīng)(標(biāo)準(zhǔn)方法A)(2)用酸催化的環(huán)合反應(yīng)形成苯并咪唑環(huán)(標(biāo)準(zhǔn)方法B)(3)用液氨反應(yīng)形成酰胺(標(biāo)準(zhǔn)方法C)這些標(biāo)準(zhǔn)方法的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)見下所述標(biāo)準(zhǔn)方法A制備2，3-二氨基苯甲酸甲酯(1當(dāng)量)，干燥的三乙胺(1-1.5當(dāng)量)和二甲基氨基吡啶(DMAP-5mol％)于一半所需量的干燥的四氫呋喃(THF)中的冰/鹽浴冷卻溶液。將所需的酰氯(1當(dāng)量)溶解于剩余的干燥的四氫呋喃(THF)中，并將其在攪拌下，30分鐘內(nèi)，加至冷卻的溶液中。將反應(yīng)緩慢升至室溫下進(jìn)行，并且攪拌過夜。、過濾溶液除去懸浮于乙酸乙酯中的沉淀，濾液用水洗滌兩遍，后用飽和鹽水洗，MgSO4干燥。將有機(jī)相加至反應(yīng)濾液中，減壓蒸除溶劑。將所得的固體殘留物溶于乙酸乙酯中，用水洗滌兩遍，后用飽和鹽水洗，MgSO4干燥。減壓蒸除溶劑。將所得的固體殘留物用柱層析和/或重結(jié)晶(用合適的溶劑)純化。標(biāo)準(zhǔn)方法B將起始物溶解于冰醋酸中，并置于預(yù)熱至120℃的油浴中。溶液在加熱下持續(xù)合適的時(shí)間，然后，將其冷卻至室溫。減壓蒸除冰醋酸，所得的固體殘留物用柱層析和/或重結(jié)晶(用合適的溶劑)純化。標(biāo)準(zhǔn)方法C將起始物溶解于新鮮濃縮的過量液氨中，將該混合物在封閉的容器中加熱至80℃，產(chǎn)生40個(gè)大氣壓，反應(yīng)24小時(shí)。蒸除氨，所得的固體殘留物用柱層析和/或重結(jié)晶(用合適的溶劑)純化。實(shí)例102-(4’-氰基苯基)-1-H-苯并咪唑-4-羧酰胺(化合物NU1092)(a)第一步-2-氨基-3-N-(4’-氰基苯甲?；?氨基苯甲酸甲酯的制備按標(biāo)準(zhǔn)方法A，將2，3-二氨基苯甲酸甲酯(300mg，1.81mmol)，三乙胺(251ul，1.81mmol)及DMAP(11mg)溶于THF(7.5ml)中并冷卻。向其中加入4-氰基苯甲酰氯(299mg，1.81mmol)的THF溶液(7.5ml)。所得產(chǎn)品用柱層析(二氯甲烷/甲醇99∶1)純化，隨后用沸甲醇重結(jié)晶。(196mg，37％)mp198-202℃；vmax(cm-1)3486.40，3374.02，3245.61，2231.25，1688.04，1646.65；δH3.93(3H，s，CO2CH3)，6.68-6.76(1H，t)，6.72(2H，brs，NH2)，7.45-7.49(1H，d)，7.81-7.86(1H，d)，8.11-8.15(2H，d，J＝8.4)，8.25-8.29(2H，d，J＝8.4)，10.01(1H，brs，NH)；m/z(EI)295(M+)，278，263，246，130，102。
(b)第二步-2-(4’-氰基苯基)-1-H-苯并咪唑-4-羧酸甲酯的制備按標(biāo)準(zhǔn)方法B，將得自第一步的2-氨基-3-N-(4’-氰基苯甲?；?氨基苯甲酸甲酯(301mg，1.02mmol)于冰乙酸(10ml)中加熱。所得產(chǎn)品用石油醚40/60/乙酸乙酯重結(jié)晶兩次。(203mg，72％)mp 195-198℃vmax(cm-1)3447.66，2228.84，1691.90，1288.11δH4.09(3H，s，CO2CH3)，7.44-7.53(1H，t)，7.97-8.01(1H，d)，8.10-8.13(2H，d，J＝8.4)，8.58-8.62(2H，d，J＝8.4)，12.8(1H，brs)；m/z(EI)277(M+)，245，217(c)第三步-2-(4’-氰基苯基)-1-H-苯并咪唑-4-羧酰胺(化合物NU1092)的制備按標(biāo)準(zhǔn)方法C，在壓力下，將2-(4’-氰基苯基)-1-H-苯并咪唑-4-羧酸甲酯(169.5mg，0.612mmol)用氨處理。粗產(chǎn)品用沸甲醇重結(jié)晶，得到標(biāo)題化合物，其為白色結(jié)晶。(116.5mg，73％)mp＞310℃；實(shí)測(cè)值C，67.81；H，3.89；N，20.87.理論值(C15H10N4O.0.2MeOH)C，67.95；H，4.05；N，20.85％vmax(cm-1)3332.27，3274.86，3177.98，2230.85，1658.54，1608.10；δH7.45-7.49(1H，t)； 7.87-7.91(1H，d)，7.91(1H，brs)，7.98-8.02(1H，d)； 8.13-8.17(2H，d，J＝8.3)，8.50-8.54(2H，d，J＝8.3)，9.2-9.4(1H，brs)，13.6-13.8(1H，brs)；m/z(EI)262(M+)，245，217，102.實(shí)例112-(4’-硝基苯基)-1-H-苯并咪唑-4-羧酰胺(化合物NU1091)
(a)第一步-2-氨基-3-N-(4’-硝基苯甲?；?氨基苯甲酸甲酯的制備按標(biāo)準(zhǔn)方法A，將2，3-二氨基苯甲酸甲酯(300mg，1.807mmol)，干燥三乙胺(276.6ul，1.988mmol)及DMAP(11mg)溶于THF(12ml)中。向其中加入4-硝基苯甲酰氯(335.2mg，1.807mmol)的干燥THF溶液(12ml)。所得產(chǎn)品用柱層析(二氯甲烷/甲醇99∶1)隨后用甲醇重結(jié)晶純化得到純產(chǎn)物。mp 196-197℃；實(shí)測(cè)值C，57.08；H，3.78；N，13.25.理論值(C15H13N3O5)C，57.14；H，4.12；N，13.33％vmax(cm-1)3382.31，3293.01，3256.56，1702.05，1657.83，1525.37；δH3.94(3H，s，CO2CH3)，6.70-6.78(1H，t)，6.66(2H，brs，NH2)，7.48-7.51(1H，d)，7.83-7.87(1H，d)，8.33-8.38(2H，d，J＝8.8)，8.46-8.51(2H，d，J＝8.8)，10.15(1H，brs，NH)；m/z(EI)315(M+)，297，265，165.
(b)第二步-2-(4’-硝基苯基)-1-H-苯并咪唑-4-羧酸甲酯的制備按標(biāo)準(zhǔn)方法B，將2-氨基-3-N-(4’-硝基苯甲?；?氨基苯甲酸甲酯(340.2mg，1.08mmol)于冰乙酸(1Oml)中加熱15分鐘。所得產(chǎn)品用甲醇重結(jié)晶純化。(208mg，65％)。mp208-210℃；實(shí)測(cè)值C，60.69；H，3.57；N，13.96理論值(C15H11N3O4)C，60.61；H，3.70；N，14.14％vmax(cm-1)3433.70，1720.14，1601.84，1513.07；δH4.21(3H，s，CO2CH3)，7.57-7.65(1H，t)，8.10-8.12(1H，d)，8.23-8.27(1H，d)，8.60-8.64(2H，d，J＝8.8)，8.78-8.82(2H，d，J＝8.8)，13.04(1H，brs，NH)；m/z(EI)297(M+)，265.
(c)第三步-2-(4’-硝基苯基)-1-H-苯并咪唑-4-羧酰胺(化合物NU1091)的制備按標(biāo)準(zhǔn)方法C，將2-(4’-硝基苯基)-1-H-苯并咪唑-4-羧酸甲酯溶于液氨中，并于壓力下于一定體積的容器中加熱。所得產(chǎn)品用柱層析(二氯甲烷/甲醇99∶1)及甲醇重結(jié)晶純化。mp＞310℃；δH7.48-7.56(1H，t)，7.90-7.94(1H，d)，8.00(1H，s，NH)，8.00-8.04(1H，d)，8.52-8.56(2H，d，J＝8.8)，8.60-8.64(2H，d，J＝8.8)，9.3-9.4(1H，brs，NH)，13.8-14.0(1H，brs，NH)實(shí)例122-(3′-三氟甲基苯基)-1-H-苯并咪唑-4-羧酰胺(化合物NU1093)(a)第一步-2-氨基-3-N-(3’-三氟甲基苯甲?；?氨基苯甲酸甲酯的制備按標(biāo)準(zhǔn)方法A，將2，3-二氨基苯甲酸甲酯(200mg，1.205mmol)，干燥三乙胺(704ul，5.06mmol)及二甲基氨基吡啶(DMAP，7.3mg)溶于THF(7.5ml)中。向其中加入3-三氟甲基苯甲酰氯(183ul，1.205mmol)的干燥THF溶液(7.5ml)。柱層析(二氯甲烷/甲醇99∶1)除去雜質(zhì)，極性更大的組分用二氯甲烷/甲醇97∶3洗脫。甲醇重結(jié)晶后得到白色固體產(chǎn)品。(160.4mg，26％)mp157-159℃；實(shí)測(cè)值C，57.14；H，3.57；N，8.10理論值(C16H13F3N2O3)C，56.80；H，3.85；N，8.28％vmax(cm-1)3368.48，3283.82，2953.87，1705.98，1650.77，1250.02；δH3.93(3H，s，CO2CH3)，6.69-6.77(1H，t)，6.73(2H，s，NH2)，7.45-7.49(1H，d)，7.82-7.92(2H，m)，8.06-8.10(1H，d)，8.40-8.44(1H，d)，8.48(1H，s，2′-H)，10.1(1H，s，NH)；m/z(EI)338(M+)，320，288，260，173，145.
(b)第二步-2-(3′-三氟甲基苯基)-1-H-苯并咪唑-4-羧酸甲酯乙酸鹽的制備按標(biāo)準(zhǔn)方法B，將2-氨基-3-N-(4’-三氟甲基苯甲酰基)氨基苯甲酸甲酯的冰乙酸(6ml)溶液加熱15分鐘。減壓除去溶劑，高真空下干燥，得到白色固體純品。(154.2mg，96％)。mp105-107℃；實(shí)測(cè)值C，56.93；H，3.78；N，7.32理論值(C16H11F3N2O2.CH3CO2H)C，56.84；H，3.95；N，7.37％vmax(cm-1)3438.30，3339.14，2959.13，1707.99，1328.24，1313.53；δH2.01(3H，s，CH3CO2H)，4.09(3H，s，CO2CH3)，7.44-7.51(1H，t)，7.79-8.13(4H，m)，8.71-8.75(1H，d)，8.82(1H，s)，11.8-12.2(1H，brs)，12.8-13.0(1H，brs)；m/z(EI)320(M+-CH3CO2H)，288，260.
(c)第三步-2-(3′-三氟甲基苯基)-1-H-苯并咪唑-4-羧酰胺(化合物NU1093)的制備按標(biāo)準(zhǔn)方法C，在一個(gè)密閉的容器中，將2-(3’-三氟甲基苯基)-1-H-苯并咪唑-4-羧酸甲酯乙酸鹽(134.8mg，0.358mmol)溶于過量的液氨中，所得產(chǎn)品用甲醇重結(jié)晶純化，得到一米色針狀物。(78mg，72％)mp 268-270℃；實(shí)測(cè)值C，57.68；H，3.82；N，12.96理論值(C15H10F3N3O.0.6CH3OH)C，57.74；H，3.82；N，12.95％vmax(cm-1)3488.83，3348.86，3176.45，1667.66，1600.93，1329.63；δH7.44-7.52(1H，t)，7.88-8.04(5H，m)，8.66-8.70(1H，d)，8.70(1H，s，2′H)，9.3(1H，brs，NH)，13.6(1H，brs，NH)；m/z(EI)305(M+)，288，260，145.實(shí)例132-(3，-甲氧基苯基)-1-H-苯并咪唑-4-羧酰胺(化合物NU1092)(a)第一步-2-氨基-3-N-(3’-甲氧基苯甲?；?氨基苯甲酸甲酯的制備按標(biāo)準(zhǔn)方法A，制2，3-二氨基苯甲酸甲酯(670.3mg，4.038mmol)，干燥三乙胺(2842.6ul，6.057mmol)及DMAP(25mg)于無水THF(20ml)中的溶液。向其中加入3-甲氧基苯甲酰氯(567ul，6.038mmol)的干燥THF溶液(20ml)。生成的固體殘?jiān)弥鶎游?二氯甲烷/甲醇99∶1)純化，產(chǎn)物用石油醚40/60乙酸乙酯重結(jié)晶兩次后得到純品。(282.6mg，23％)mp124-125℃；實(shí)測(cè)值C，63.90；H，5.11；N，9.24理論值(C16H16N2O4)C，64.0；H，5.33；N，9.33％vmax(cm-1)3386.19，3292.38，1697.97，1586.87，1520.79，1250.27；δH3.92(3H，s)，3.93(3H，s)，6.61(2H，s，NH2)，6.68-6.76(1H，t)，7.22-7.27(1H，d)，7.44-7.47(1H，d)，7.49-7.57(1H，t)，7.66(1H，s，2′-H)，7367-7.71(1H，d)，7.79-7.84(1H，d)，9.8(1H，s，NH)；m/z(EI)300(M+)，283，135，107.
(b)第二步-2-(3′-甲氧基苯基)-1-H-苯并咪唑-4-羧酸甲酯乙酸鹽的制備按標(biāo)準(zhǔn)方法B，將2-氨基-3-N-(3’-甲氧基苯甲?；?氨基苯甲酸甲酯(356.9mg，1.19mmol)在冰乙酸(12ml)溶液加熱。減壓除去溶劑，石油醚40/60/乙酸乙酯重結(jié)晶，得到標(biāo)題化合物純品。(235.6mg，58％)。mp93-94℃；實(shí)測(cè)值C，62.66；H，5.13；N，8.06理論值(C16H14N2O3·CH3CO2H)C，63.16；H，5.26；N，8.18％vmax(cm-1)3453.23，3375.10，1706.75，1257.40；δH1.99(3H，s，CH3CO2H)，3.96(3H，s)，4.06(3H，s)，7.15-7.21(1H，d)，7.38-7.46(1H，t)，7.51-7.59(1H，t)，7.91-8.00(3H，m)，8.04-8.08(1H，d)，12.0(1H，s)，12.5(1H，s)；m/z(EI)282(M+-CH3CO2H)，250.
(c)第三步-2-(3′-甲氧基苯基)-1-H-苯并咪唑-4-羧酰胺(化合物NU1093)的制備按標(biāo)準(zhǔn)方法C，將2-(3’-甲氧基苯基)-1-H-苯并咪唑-4-羧酸甲脂的液氨溶液(203mg，0.596mmol)在一個(gè)固定體積的容器中加熱。固體殘?jiān)眉状贾亟Y(jié)晶純化，得到純品。(73.5mg，46％)mp223-225℃；實(shí)測(cè)值C，67.52；H，4.91；N，15.62理論值(C15H13N3O2)C，67.42；H，4.87；N，15.73％vmax(cm-1)3408.59，3388.94，3168.65，1662.05，1625.86，1603.39；δH3.99(3H，s，OCH3)，7.22-7.27(1H，d)，7.43-7.51(1H，t)，7.58-7.66(1H，t)，7.85-8.01(5H，m)，9.4-9.5(1H，brs)，13.5(1H，brs)；m/z(EI)267(M+)，250.實(shí)例142-(2′-三氟甲基苯基)-1-H-苯并咪唑-4-羧酰胺(NU1104)(a)第一步-2-氨基-3-N-(2’-三氟甲基苯甲酰基)氨基苯甲酸甲酯的制備按標(biāo)準(zhǔn)方法A，將2，3-二氨基苯甲酸甲酯(564mg，3.4mmol)的THF溶液(20ml)與三乙胺(709μl，5.1mmol)及二甲基氨基吡啶(21mg)一起攪拌。向其中加入2-三氟甲基苯甲酰氯的THF溶液(20ml)。將生成的油性殘?jiān)接诠枘z上，柱層析(二氯甲烷/甲醇99∶1)純化。石油醚40/60/乙酸乙酯重結(jié)晶后得到純產(chǎn)品。(303mg，26％)mp163-166℃；實(shí)測(cè)值C，56.91；H，3.75；N，8.29理論值(C16H13F3N2O3)C，56.80；H，3.85；N，8.28％vmax(cm-1)3329.85，3243.90，2955.52，1696.66，1663.58，1312.69；δH3.94(3H，s，CO2CH3)，6.58(2H，s，NH2)，6.74-6.82(1H，t)，7.57-7.62(1H，d)，7.79-8.03(5H，m)，10.0(1H，s，NH)；m/z(EI)338(M+)，321，289，173，145.
(b)第二步和第三步-2-(2′-三氟甲基)-1-H-苯并咪唑-4-羧酰胺(NU1104)的制備按標(biāo)準(zhǔn)方法B和C，從第一步的產(chǎn)物按順序可得到標(biāo)題化合物。實(shí)例152-(4’-氨基苯基)-1-H-苯并咪唑-4-甲酰胺(化合物NU1103)(a)第一步-2-氨基-3-N-(4’-氨基苯甲?；?氨基苯甲酸甲酯的制備將2-氨基-3-N-(4’-硝基苯甲?；?氨基苯甲酸甲酯(來自實(shí)例11第一步)懸浮于甲醇(40ml)中，在氬氣中，攪拌下，將溶于甲醇(10ml)的10％的鈀碳(～50mg)催化劑加入至該溶液中，將該溶液于大氣壓下氫化2小時(shí)。用硅藻土(商品名“CELITE”)過濾，除去催化劑。減壓除去溶劑，所得的產(chǎn)物為白色固體，在高度真空下干燥。(204.1mg，92％)mp197-200℃；實(shí)測(cè)值C，62.95；H，5.30；N，14.39.理論值(C15H15N3O3)C，63.16；H，5.26；N，14.73；vmax(cm-1)3472.55，3374.96，3348.97，3283.31，1694.80，1613.91；δH3.94(3H，s，CO2CH3)，5.87(2H，s，NH2)，6.54(2H，s，NH2)，6.68-3.73(2H，d)，6.73-6.76(1H，t)，7.42-7.47(1H，d)，7.78-7.82(2H，d)，9.4(1H，s，NH)；m/z(EI)285(M+)，267，235，207，120，92.
(b)第二步-2-(4’-氨基苯基)-1-H-苯并咪唑-4-甲酸甲酯乙酸鹽的制備按標(biāo)準(zhǔn)方法B，用熱的冰乙酸(8ml)對(duì)2-氨基-3-N-(4’-氨基苯甲?；?氨基苯甲酸甲酯(186.5mg 0.654mmol)進(jìn)行處理30分鐘，石油醚40/60/乙酸乙酯重結(jié)晶得標(biāo)題化合物。(113.4mg 91％)mp162-164℃；實(shí)測(cè)值C，62.60；H，5.04；N，12.73理論值(C15H13N3O2·CH3CO2H)C，62.39；H，5.20；N，12.84vmax(cm-1)3450.66，3369.25，3254.20，1692.41，1607.56，1253.80；δH2.02(3H，s，CH3CO2H)，4.08(3H，s，CO2CH3)，5.81(2H，s，NH2)，6.75-6.80(2H，d，J＝8.6)，7.32-7.40(1H，t)，7.83-7.86(1H，d)，7.93-7.97(1H，d)，8.08-8.13(2H，d，J＝8.6)，11.9(1H，s)，12.1(1H，brs)；m/z(EI)267(M+-CH3CO2H)，235，207，92，60.
(c)第三步-2-(4’-氨基苯基)-1-H-苯并咪唑-4-甲酰胺(NU1103)制備按標(biāo)準(zhǔn)方法C，在壓力下，用液氨對(duì)2-(4’-氨基苯基)-1-H-苯并咪唑-4-甲酸甲酯乙酸鹽(113mg，0.346mmol)處理24小時(shí)，。所得粗產(chǎn)品用柱層析(二氯甲烷/甲醇90∶10)分離得到純標(biāo)題化合物(21.4mg，25％)。mp237-240℃；δH5.90(2H，s，NH2)，6.79-6.83(2H，d，J＝8.3)，7.31-7.39(1H，t)，7.71-7.75(1H，d)，7.84(1H，s，NH)，7.88-7.92(1H，d)，8.00-8.04(2H，d，J＝8.3)，9.5-9.6(1H，brs，NH)，13.0(1H，brs，NH).PARP抑制活性測(cè)定法用下列方法和材料作為PARP抑制劑的對(duì)本發(fā)明化合物，尤其是那些在前述實(shí)例中詳細(xì)描述的化合物進(jìn)行了體外活性測(cè)定。
原則上，所用的PARP測(cè)定法基于活化含有外源性〔32P〕-NAD+細(xì)胞內(nèi)的外源性PARP(如下文所描述的)，其是通過將細(xì)胞懸浮于〔32P〕-NAD+的溶液中，這些細(xì)胞在最初的預(yù)處理步驟中已經(jīng)滲透到〔32P〕-NAD+溶液中。通過酶合成的多聚(ADP-核糖)可以用三氯乙酸(TCA)來沉淀，在特定的實(shí)驗(yàn)條件下，例如，采用閃爍計(jì)數(shù)器，對(duì)引入其中的放射性標(biāo)記32P的量進(jìn)行測(cè)定，得到PARP活性測(cè)定的結(jié)果。按照相同的步驟，在同一條件下，且在每個(gè)受試化合物(觀察其使酶活性的降低)存在下做重復(fù)實(shí)驗(yàn)，受試化合物抑制作用的典型結(jié)果可以從TCA沉淀的聚(ADP-核糖)中〔32P〕量的降低來確定。
此測(cè)定結(jié)果可用一或多個(gè)不同濃度的受試化合物的抑制百分比或活性降低來表示，或者也可用使酶活性降低50％時(shí)所需受試化合物的濃度(即IC50值)來表示。因此從一定范圍內(nèi)不同化合物可以得到一組抑制活性的比較數(shù)值。
實(shí)際上，將L1210鼠性白血病細(xì)胞暴露于低滲緩沖液下并經(jīng)冷振蕩，使其中滲入外源性〔32p〕NDA，將其作為PARP酶的來源。在已發(fā)現(xiàn)能給出準(zhǔn)確性和復(fù)演性較好結(jié)果的實(shí)驗(yàn)技術(shù)中，將一定量的小分子合成低聚核苷酸，特別是具有回文順序CGGAATTCCG的單鏈低聚核苷酸引入細(xì)胞懸浮液中用于激活PARP酶。此低聚核苷酸序列自身很快恢復(fù)過來，形成一個(gè)帶有單一鈍端的雙鏈分子，并提供了激活PARP的有效底物。作為酶的強(qiáng)催化劑，其性能在所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中可以得到證實(shí)。
所采用的實(shí)驗(yàn)方案如下將上面提及的合成低聚核苷酸作為PARP的特異活化劑引入，其可以辨別PARP和細(xì)胞內(nèi)其它單ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶。因此，這類合成低聚核苷酸的引入，將使所引入的放射標(biāo)記物的活性提高5-6倍，且唯一地歸因于PARP的活性。
進(jìn)一步詳細(xì)的測(cè)定方法，如下所述。材料所用材料概括如下DTT(二硫蘇糖醇)制備100mM(15.4mg/ml)溶液(用作抗氧劑)，分成等分試樣，每份500μl，儲(chǔ)存于-20℃。低滲緩沖液9mM羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)(214mg/100ml)4.5％葡聚糖 (4，5g/100ml)4.5％MgCl2(92mg/100ml)將上述成分溶解于約80ml蒸餾水中，調(diào)pH值至7.8(NaOH/NaCl)，用蒸餾水稀釋至100ml儲(chǔ)存于冰箱中，使用前，加入DTT至5mM(50μl/ml)。等滲緩沖液40mM羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes) (1.9g/200ml)130mM KCl (1.9g/200ml)4％葡聚糖 (8g/200ml)2mM乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA) (152mg/200ml)2.3mM MgCl2(94mg/200ml)225mM蔗糖 (15.39g/200ml)將上述成分溶于約150ml蒸餾水中，調(diào)pH＝7.8(NaOH/NaCl)。用蒸餾水稀釋至200ml，儲(chǔ)存于冰箱中。使用前，加入DTT至2.5mM(25ul/ml)。NAD固體NAD以預(yù)先稱重的等分試樣于一20℃下儲(chǔ)存。在實(shí)施測(cè)定前，制備新鮮的濃度約為6mM(4-4.5mg/ml)的溶液。在260nM處測(cè)定光密度(OD)來測(cè)定摩爾濃度。用水稀釋此儲(chǔ)備溶液，至濃度為600μM，加入少量32p標(biāo)記的NAD(例如，2-5μl/ml)。低聚核苷酸對(duì)用常規(guī)方法合成的具有回文序列CGGAATTCCG的低聚核苷酸進(jìn)行真空干燥，并以小丸形式儲(chǔ)存于冰箱中。使用前將每個(gè)小丸完全溶解于50ml緩沖液中，制成200μg/ml的10mM Tris/HCl溶液，pH為7.8。溶液在60℃的水浴上加熱15分鐘，然后使之緩慢冷卻，以保證恰當(dāng)?shù)慕K止反應(yīng)。加入9.5ml緩沖液后，在260nm處通過測(cè)定稀釋樣品的光密度來檢查其濃度。將主溶液稀釋至濃度為200μl/ml，并以500μl為等分樣品，貯存于冰箱內(nèi)備用。TCA制備兩種濃度的TCA(三氯乙酸)溶液。10％TCA+10％焦磷酸鈉及1％TCA+1％焦磷酸鈉。細(xì)胞將用作PARP酶來源的L1210細(xì)胞以懸浮培養(yǎng)物的形式保存于RPMI介質(zhì)+10％胎兒牛血清+谷氨酰胺及抗菌素(青霉素和鏈霉素)中。加入HEPES和碳酸氫鈉，將細(xì)胞接種于100ml-200ml的培養(yǎng)基介質(zhì)上。使細(xì)胞濃度能夠在進(jìn)行測(cè)定時(shí)達(dá)到大約8×105/ml。方法受試化合物通常做成DMSO(二甲亞砜)的濃溶液形式?；衔锏娜芙舛瓤梢酝ㄟ^以下方法測(cè)定，將一定量的DMSO溶液，按實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)所需的最終比例加到一定量的等滲緩沖液中，間隔一會(huì)后，在顯微鏡下檢查有無任結(jié)晶形成的任何跡象。
通過血清細(xì)胞計(jì)計(jì)算細(xì)胞的需要量，然后離心(1500rpm用“Europa”型24M離心機(jī)離心5分鐘)，除去上清液，在4℃，1500rpm再次離心前，于4℃下，將形成的小丸再懸浮于20ml不含Ca++、Mg++的磷酸鹽緩沖液中(Dulbeco改良法A，簡稱為DulA)。再次除去上清液后，將細(xì)胞再懸浮于冷的低滲緩沖液中，濃度為3×107細(xì)胞/ml，使其置于冰上30分鐘。然后向其中加入9倍體積的冰冷等滲緩沖液。受到外源性NAD+滲透的細(xì)胞在未來1小時(shí)內(nèi)可用于進(jìn)行測(cè)定。細(xì)胞的可滲透性可以在這一階段進(jìn)行檢查。向相同體積的錐蟲藍(lán)中加入復(fù)份的細(xì)胞等分試樣，5分鐘后，用血細(xì)胞計(jì)計(jì)數(shù)。受到滲透的細(xì)胞將吸收錐蟲藍(lán)，并出現(xiàn)顏色。
為了方便起見，此測(cè)定法采用15ml塑料錐底測(cè)試管，被置于振蕩的26℃水浴上，該溫度對(duì)此酶最適宜。在典型的測(cè)定中，采用濃度為5μg/ml的低聚核苷酸溶液及濃度為2％的受試化合物的DMSO溶液，并一式四份進(jìn)行測(cè)定。在每個(gè)測(cè)定管中加入5μl低聚核苷酸溶液，50μl600μmNAD+〔32P〕-NAD溶液，8μl受試化合物/DMSO溶液及37μl水。在開始實(shí)驗(yàn)前，此“雞尾酒”在26℃下預(yù)熱7分鐘，細(xì)胞懸浮液也需經(jīng)同樣的處理。加入300μl細(xì)胞懸浮液開始反應(yīng)。然后加入2ml冰冷10％TCA+10％焦磷酸鈉溶液終止反應(yīng)。
除了以上所述外，建立6個(gè)空白測(cè)試管，它們含有上述相同的成分，但是在加入細(xì)胞懸浮液之前，要加入TCA溶液，防止發(fā)生任何反應(yīng)。其可用于修正標(biāo)記物質(zhì)與所用濾器(見下)發(fā)生任何非特異性的結(jié)合。
在一定的間隔下，向每個(gè)測(cè)試管中加入細(xì)胞懸浮液，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，5分鐘后，于4℃下，向該管中加入10％TCA+10％焦磷酸鈉溶液。然后將測(cè)試管從冰上移開，最短時(shí)間為1小時(shí)后，采用GF/C濾芯(粗面向上，用10％TCA潤濕)，經(jīng)抽濾過濾裝置的單獨(dú)過濾漏斗對(duì)每個(gè)測(cè)試管中的內(nèi)容物進(jìn)行過濾。每個(gè)管內(nèi)容物過濾后，漏斗用1％TCA+1％焦磷酸鈉溶液淋洗幾次，小心移去漏斗，干燥，然后置于單獨(dú)的閃爍小瓶中。另外準(zhǔn)備4個(gè)閃爍小瓶作為含有10μl600uM NAD+〔32P〕-NAD溶液的參比標(biāo)準(zhǔn)物，向每個(gè)小瓶中加入10ml閃爍體。用β計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)2分鐘，得到所存在的32P的測(cè)定結(jié)果，因此也就得到了多聚(ADP-核糖)的量及PARP酶的活性。體外PARP抑制研究結(jié)果除了將PARP酶測(cè)定用于上述根據(jù)本發(fā)明標(biāo)準(zhǔn)步驟制備的一定范圍化合物之外，為了達(dá)到比較的目的，也可將其應(yīng)用于某些苯甲酰胺類化合物，特別是苯甲酰胺，3-羥基苯甲酰胺及3-甲氧基苯甲酰胺。已知這些化合物具有某些PARP抑制活性。在本發(fā)明描述的結(jié)尾處，以表格形式給出了下文中已被制備和/或研究的某些典型化合物，以及用一或多種不同實(shí)驗(yàn)獲得的PARP抑制測(cè)定結(jié)果。當(dāng)用上文所述方法對(duì)這些化合物進(jìn)行測(cè)定時(shí)，其可用濃度10μM時(shí)的百分抑制數(shù)表示，或更通常地是用IC50值表示。
綜合評(píng)論這張表格可以看到，已知的PARP抑制劑苯甲酰胺，3-氨基苯甲酰胺以及3-甲氧基苯甲酰胺可用作參比物。盡管結(jié)果或多或少有一些變化，但總的來說，受試的本發(fā)明化合物顯示出相當(dāng)高程度的抑制活性。具有參考號(hào)碼NU1064，NU1066，NU1086，特別是NU1070，NU1076，NU1077，NU1085，NU1090，NU1091，NU1092，NU1093和NU1098的苯并咪唑羧酰胺類化合物引人注目，其中，NU1091和NU1092顯示出異常高的抑制活性。進(jìn)一步的生物學(xué)活性研究再次使用鼠性白血病L1210細(xì)胞系培養(yǎng)基進(jìn)行生長抑制實(shí)驗(yàn)，來評(píng)價(jià)化合物抑制細(xì)胞生長的作用，另外進(jìn)行克隆產(chǎn)生存活測(cè)定來評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性，尤其是有關(guān)化合物用作DNA損傷細(xì)胞毒劑(如細(xì)胞毒抗腫瘤藥物或γ照射)協(xié)同劑時(shí)的細(xì)胞毒性。在DNA鏈斷裂形成和修復(fù)過程中，DNA損傷及PARP抑制劑的作用也已用DNA鏈斷裂形成測(cè)定法進(jìn)行了評(píng)價(jià)，并按照已公開的技術(shù)，通過堿性洗脫監(jiān)控進(jìn)行了分析。
在生長抑制測(cè)定中，在24孔多碟中植入典型的L1210細(xì)胞，濃度為1×10/ml，一式三份。24小時(shí)后，以選擇的組合和濃度加入受試的化合物或藥物。此時(shí)用Coulter記數(shù)計(jì)對(duì)一組平行的樣品進(jìn)行記數(shù)(No)，48小時(shí)后，對(duì)其余的樣品進(jìn)行記數(shù)(N1)。由此可以評(píng)價(jià)藥物處理過樣品的百分生長抑制(％)。在探索細(xì)胞生長或克隆產(chǎn)生協(xié)同作用的藥物組合實(shí)驗(yàn)中，可將細(xì)胞毒藥物樣品(例如替莫唑胺(TM))單一的，固定的濃度作為對(duì)照值。體外細(xì)胞毒性測(cè)定的實(shí)例在采用化合物NU1064(2-甲基苯并咪唑-4-羧酰胺)體外細(xì)胞毒性測(cè)定的特殊實(shí)例中，在100μM甲基化劑替莫唑胺的存在或缺乏下，L1210鼠白血病細(xì)胞采用遞增濃度的NU1064，在最終濃度為1％的DMSO中，于36℃下孵育24小時(shí)。將細(xì)胞制成小丸，再懸浮于新鮮的介質(zhì)中，記數(shù)，接種以使在0.15％瓊脂糖的無藥物介質(zhì)中有細(xì)胞群體形成。1周后，能存活的細(xì)胞用MTT(1ml，0.5mg/ml)進(jìn)行染色并記數(shù)，將對(duì)照物(89％)和單獨(dú)的替莫唑胺(32％)的平皿接種效率規(guī)定為100％相對(duì)存活率，NU1064處理過細(xì)胞的平皿接種效率用這些值的百分?jǐn)?shù)來表示。
單獨(dú)的NU1064可引起適度的細(xì)胞存活下降，100μM和200μM濃度的NU1064所對(duì)應(yīng)的平皿接種效率分別為72％和54％。但當(dāng)NU1064濃度升高時(shí)，替莫唑胺細(xì)胞毒性有顯著升高(100μM和200μM濃度的NU1064所對(duì)應(yīng)的平皿接種效率分別為28％和2％)，表明了替莫唑胺細(xì)胞毒性增強(qiáng)與NU1064濃度有關(guān)。這些結(jié)果的說明見附

圖1中。
在其他的克隆產(chǎn)生存活測(cè)定法中，典型的做法是在記數(shù)和在無藥物介質(zhì)的0.12-0.15％瓊脂糖中進(jìn)行克隆形成而接種之前，將L1210細(xì)胞暴露于各種濃度的TM±固定濃度的PARP抑制劑中，固定時(shí)間為16小時(shí)。7-10天后，用0.5mg/ml的MTT對(duì)克隆進(jìn)行染色，在格柵光盒中用肉眼記數(shù)。由此能夠繪制存活曲線，并得到DEF10值。DEF10的定義是降低存活至10％時(shí)的TM濃度，除以有固定濃度PARP抑制劑存在下，使存活降低至10％時(shí)的TM濃度。
在進(jìn)一步的克隆產(chǎn)生存活測(cè)定法中，利用γ-射線照射來損傷細(xì)胞。典型的做法是，于4℃下，采用不同劑量的γ-射線，在終濃度為2％受試化合物的DMSO溶液存在或缺乏下，對(duì)L1210細(xì)胞(3ml，4×103/ml，于小巧的塑料瓶中)進(jìn)行照射。在進(jìn)行克隆形成而接種之前，于37℃下，繼續(xù)在PARP抑制劑存在或缺乏下，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行孵育2小時(shí)。
在允許細(xì)胞分裂發(fā)生之前，當(dāng)細(xì)胞保持固定相及隨后的致死性損傷(PLD)開始之時(shí)，便發(fā)生了PLD的修復(fù)。在進(jìn)一步的測(cè)試潛在的PARP抑制劑典型實(shí)驗(yàn)中，在有或無受試化合物存在下，允許L1210細(xì)胞對(duì)由γ-射線造成的潛在性致死損傷(PLD)進(jìn)行修復(fù)，方法如下將L1210細(xì)胞保存于培養(yǎng)基中，直到它們達(dá)到固定相(＞106細(xì)胞/ml)。在有條件限制的介質(zhì)中，將它們從固定相培養(yǎng)基稀釋至1.5×105/ml，以防止進(jìn)一步的細(xì)胞分裂。將復(fù)份2ml樣品置于小巧塑料瓶中，事先保留于冰上，然后立即進(jìn)行8戈瑞γ-射線照射。在來自固定相培養(yǎng)基的、有條件限制的介質(zhì)中制備1ml3x最終濃度受試化合物，隨后被加入，得到合適的最終濃度(例如，106細(xì)胞/ml的1％DMSO溶液±受試化合物)。在再次懸浮于無藥物介質(zhì)之前，將細(xì)胞在37℃下孵育0、2或4小時(shí)，然后接種，以利于克隆形成。未照射的固定相培養(yǎng)物在1％DMSO±同樣量受試化合物的條件下，在37℃下培養(yǎng)0、2或4小時(shí)，上述受試化合物提供了測(cè)定相關(guān)細(xì)胞存活的合適的對(duì)照物。在缺乏PARP抑制劑的情況下，細(xì)胞存活隨時(shí)間增加，允許發(fā)生PLD修復(fù)。例如，在一組實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)照射后立即接種(無修復(fù))時(shí)，僅有約0.2％的細(xì)胞存活，但經(jīng)4小時(shí)修復(fù)期后，細(xì)胞存活升至0.7％。一種有效的PARP抑制劑可以阻斷這種修復(fù)，因而，可以降低存活率。
關(guān)于在前述的DNA鏈斷裂測(cè)定法中，將L1210細(xì)胞的典型樣品用固定濃度(例如150uM)的替莫唑胺(除無對(duì)照物外)，且在濃度不斷增加的受試PARP抑制劑存在下，孵育一定時(shí)間，例如1小時(shí)。與單用替莫唑胺時(shí)相比較，抑制劑越有效，堿性洗脫率越大(一種股斷裂程度的衡量指標(biāo))。
通常，所進(jìn)行的研究全部支持下列觀點(diǎn)，即受試化合物的PARP抑制劑特性反映了這些化合物加強(qiáng)DNA損傷劑的細(xì)胞毒性的能力(例如，某些細(xì)胞毒性的抗腫瘤藥物和放療時(shí)用的照射)。因而，考慮到本發(fā)明化合物具有強(qiáng)烈的PARP抑制劑特性，可寄以希望，與這些細(xì)胞毒性藥物或放療合并使用時(shí)會(huì)特別有用，其用途是在先前指出的醫(yī)學(xué)治療中，用來增強(qiáng)后者的細(xì)胞毒性效應(yīng)。
盡管本發(fā)明應(yīng)被認(rèn)為是全面地包括每一個(gè)在此處所公開的新的特性或這些特性的組合，但是，本發(fā)明的主要部分，原則上不是唯一的，其廣泛地包括下列方面(i)本文中所定義的、新的式(I)化合物；(ii)帶有前文所定義的取代基的式(I)化合物(包括其前藥和鹽的形式)，該化合物可用于治療或在醫(yī)學(xué)上使用，以及用于藥品生產(chǎn)。例如，該類化合物可用作PARP抑制劑，與細(xì)胞毒性藥物合并服用或與放療合用，在腫瘤的治療中增強(qiáng)后者的療效；(iii)制備本文中所定義的新的式(I)化合物的方法，包括實(shí)施該方法時(shí)所生成的任何新的中間體化合物。
(iv)藥物制劑，其包括本文中所定義的新的式(I)化合物與藥學(xué)上可接受的載體；以及(v)制備上述(iv)中所定義的藥物制劑的方法，例如，用本文中所及的方法。
權(quán)利要求
1.本文中定義的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和/或前藥形式來制備人用或獸用藥物的用途，所述藥物在醫(yī)療方面可用于抑制多聚(ADP-核糖)多聚酶或PARP(也叫ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶或ADPRT)的活性，此類酶的抑制作用構(gòu)成了治療的一個(gè)方面，其中所述的化合物提供活性PARP酶抑制劑，并是具有通式I苯并咪唑-4-羧酰胺或其藥用鹽和/或其藥物前體，
式I化合物的結(jié)構(gòu)特征如下R是選自氫，烷基，羥基烷基(如，CH2CH2OH)，?；?如，乙?；虮郊柞；?或任意取代的芳基(如，苯基)或芳烷基(如，芐基或羧基芐基)基團(tuán)，并且，R’是選自氫，烷基，羥基烷基(如，CH2CH2OH)，?；?如，乙?；虮郊柞；?或任意取代的芳基(如，苯基)或芳烷基(如，芐基或羧基芐基)基團(tuán)。
2.權(quán)利要求1中所述化合物的用途，其中每一個(gè)存在的烷基或以在作為烷氧基或其它基團(tuán)中的一部分而存在的烷基含有1-6個(gè)碳原子。
3.權(quán)利要求1或2中所述化合物的用途，其中R表示具有式II的任意取代的苯基
其中R1，R2和R9可獨(dú)立地選自氫，羥基，烷氧基，硝基，N3，NR5R6(R5和R6各自獨(dú)立地表示氫，烷基或烷氧基)，NHCOR3(R3是烷基或芳基)，CO2R4(R4是氫或烷基)，酰胺基(如，CONH2)，四唑基，烷基，羥基烷基，CW3或W(W是鹵素)，和氰基。
4.權(quán)利要求3中所述化合物的用途，其中R1為一個(gè)不是氫的基團(tuán)且在4’位，并且R2和R9分別為氫。
5.前述任意一個(gè)權(quán)利要求中所述化合物的用途，其中R′表示具有式III的任意取代的苯基
其中R7，R8和R10可獨(dú)立地選自氫，羥基，烷氧基，硝基，N3，NR5R6(R5和R6各自獨(dú)立地表示氫，烷基或烷氧基)，NHCOR3(R3是烷基或芳基)，CO2R4(R4是氫或烷基)，酰胺基(如，CONH2)，四唑基，烷基，羥基烷基，CW3或W(W是鹵素)，和氰基。
6.權(quán)利要求5中所述化合物的用途，其中R7為一個(gè)不是氫的基團(tuán)且在4’位，并且R8和R10分別為氫。
7.權(quán)利要求1中所述化合物的用途，其中的R選自甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，叔丁基或環(huán)己基。
8.權(quán)利要求1中所述化合物的用途，其中R’為氫或烷基，且R為苯基或在苯環(huán)上至少帶有一個(gè)取代基的芐基，該取代基選自羥基，烷氧基，硝基，N3，NR5R6(R5和R6各自獨(dú)立地表示氫，烷基或烷氧基)，NHCOR3(R3是烷基或芳基)，CO2R4(R4是氫或烷基)，酰胺基(如，CONH2)，四唑基，烷基，羥基烷基，CW3或W(W是鹵素)，和氰基。
9.權(quán)利要求1中所述化合物的用途，其中的化合物為下列之一(a)2-甲基苯并咪唑-4-羧酰胺；(b)苯并咪唑-4-羧酰胺；(c)2-苯基苯并咪唑-4-羧酰胺；(d)2-(4′-甲氧基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(e)2-(4′-三氟甲基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(f)2-(4′-羥基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(g)2-三氟甲基苯并咪唑-4-羧酰胺；(h)2-(4′-甲氧基苯基)-N-甲基苯并咪唑-4-羧酰胺；(i)2-(4′-硝基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(j)2-(4′-氰基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(k)2-(3′-三氟甲基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(l)2-(3′-甲氧基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(m)2-(4′-甲氧基苯基)-1-N-苯甲?；讲⑦溥?4-羧酰胺；(n)2-(4′-氨基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(o)2-(2′-三氟甲基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(p)N-羧芐基-2-(4′-甲氧基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；
10.前述任意一個(gè)權(quán)利要求中所述化合物的用途，其中，其中的化合物以帶有選自磷酸鹽、氨甲酸鹽及氨基酸取代基團(tuán)的前藥形式存在。
11.權(quán)利要求10中所述化合物的用途，其中前藥形式為具有通式I的磷酸鹽衍生物。
12.權(quán)利要求11中所述化合物的用途，所述的以磷酸鹽前藥形式存在的化合物是由至少帶有一個(gè)羥基取代基的式I化合物衍生的水溶性銨或堿金屬磷酸鹽提供。
13.權(quán)利要求12中所述化合物的用途，其中式I化合物(磷酸鹽前藥由其衍生而來)具有可與膦酸二芐酯反應(yīng)的羥基基團(tuán)。
14.在治療中活性藥物物質(zhì)的具有通式I的苯并咪唑化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和/或前藥形式，
式I化合物的結(jié)構(gòu)特征如下R是選自氫，烷基，羥基烷基(如，CH2CH2OH)，?；?如，乙?；虮郊柞；?或任意取代的芳基(如，苯基)或芳烷基(如，芐基或羧基芐基)基團(tuán)，條件是R不是4’-甲磺酰氧基-2’-甲氧基-苯基，且R’是選自氫，烷基，羥基烷基(如，CH2CH2OH)，酰基(如，乙?；虮郊柞；?或任意取代的芳基(如，苯基)基團(tuán)。
15.具有通用式I的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽類。
其中R是選自氫，烷基，羥基烷基(如，CH2CH2OH)，酰基(如，乙酰基或苯甲?；?或任意取代的芳基(如，取代的苯基)或任意取代的芳烷基(如，芐基或羧基芐基)基團(tuán)，并且，R’是選自氫，烷基，羥基烷基(如，CH2CH2OH)，?；?如，乙?；虮郊柞；?或任意取代的芳基(如，苯基)基團(tuán)，條件是R不是4’-甲磺酰氧基-2’-甲氧基-苯基。
16.權(quán)利要求10或11中所述的化合物，其中每一個(gè)存在的烷基或以作為烷氧基或其它基團(tuán)中的一部分而存在的烷基含有1-6個(gè)碳原子。
17.權(quán)利要求14、15或16中所述的化合物，其中R表示具有式II的任意取代的苯基
其中R1，R2和R9可獨(dú)立地選自氫，羥基，烷氧基，硝基，N3，NR5R6(R5和R6各自獨(dú)立地表示氫，烷基或烷氧基)，NHCOR3(R3是烷基或芳基)，CO2R4(R4是氫或烷基)，酰胺基(如，CONH2)，四唑基，烷基，羥基烷基，CW3或W(W是鹵素)，和氰基。
18.權(quán)利要求17中所述的化合物，其中R1為一個(gè)不是氫的基團(tuán)且在4’位，并且R2和R9分別為氫。
19.權(quán)利要求14-18中任意一個(gè)中所述的化合物，其中R′表示具有式III任意取代的苯基
其中R7，R8和R10可獨(dú)立地選自氫，羥基，烷氧基，硝基，N3，NR5R6(R5和R6各自獨(dú)立地表示氫，烷基或烷氧基)，NHCOR3(R3是烷基或芳基)，CO2R4(R4是氫或烷基)，酰胺基(如，CONH2)，四唑基，烷基，羥基烷基，CW3或W(W是鹵素)，和氰基。
20.權(quán)利要求19中所述的化合物，其中R7為一個(gè)不是氫的基團(tuán)且在4’位，并且R8和R10分別為氫。
21.權(quán)利要求14或15中所述的化合物，其中的R選自甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，叔丁基或環(huán)己基。
22.權(quán)利要求14或15中所述的化合物，其中R’為氫，且R為苯基或在苯環(huán)上至少帶有一個(gè)取代基的芐基，該取代基選自羥基，烷氧基，硝基，N3，NR5R6(R5和R6各自獨(dú)立地表示氫，烷基或烷氧基)，NHCOR3(R3是烷基或芳基)，CO2R4(R4是氫或烷基)，酰胺基(如，CONH2)，四唑基，烷基，羥基烷基，CW3或W(W是鹵素)，和氰基。
23.權(quán)利要求14或15中所述的下列化合物之一(a)2-甲基苯并咪唑-4-羧酰胺；(b)苯并咪唑-4-羧酰胺；(c)2-(4′-甲氧基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(d)2-(4′-三氟甲基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(e)2-(4′-羥基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(f)2-三氟甲基苯并咪唑-4-羧酰胺；(g)2-(4′-甲氧基苯基)-N-甲基苯并咪唑-4-羧酰胺；(h)2-(4′-硝基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(i)2-(4′-氰基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(j)2-(3′-三氟甲基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(k)2-(3′-甲氧基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(l)2-(4′-甲氧基苯基)-1-N-苯甲?；讲⑦溥?4-羧酰胺；(m)2-(4′-氨基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(n)2-(2′-三氟甲基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；(o)N-羧芐基-2-(4′-甲氧基苯基)苯并咪唑-4-羧酰胺；
24.前述權(quán)利要求14-23中任意一個(gè)化合物，其中化合物適宜口服或靜脈治療給藥，并以帶有選自磷酸鹽、氨甲酸鹽及氨基酸取代基團(tuán)的前藥形式存在。
25.權(quán)利要求24中的化合物，其中的前藥形式為具有通式I的磷酸鹽衍生物。
26.權(quán)利要求25中所述的化合物，所述的以磷酸鹽前藥形式存在的化合物由帶有一個(gè)至少羥基取代基的式I化合物衍生的水溶性銨或堿金屬磷酸鹽提供。
27.權(quán)利要求26中所述的化合物，其中的結(jié)構(gòu)式I化合物(磷酸鹽前藥由其衍生而來)具有可與膦酸二芐酯反應(yīng)的羥基取代基團(tuán)。
28.制備權(quán)利要求17中所述的化合物的方法，其包括使2，3-二氨基苯甲酸烷基酯與芳酰氯進(jìn)行反應(yīng)，然后在升高的溫度下用乙酸處理產(chǎn)品，導(dǎo)致苯并咪唑環(huán)的形成，再使之與液氨反應(yīng)，形成酰胺衍生物。
29.權(quán)利要求14-17中任意一個(gè)化合物作為活性PARP-抑制物質(zhì)用于治療。
30.權(quán)利要求14-17中任意一個(gè)化合物用于制備用于治療哺乳動(dòng)物的人用或獸用制劑。
31.含有以單位劑量形式存在的權(quán)利要求29中所述的化合物的藥物配方或組合物，其可給予哺乳類動(dòng)物，使之在接受PARP-抑制劑的治療過程中獲益。
32.醫(yī)用的藥物配方或組合物，其包含有效PARP抑制劑量的權(quán)利要求14-27中任意一個(gè)化合物及藥學(xué)上可接受的載體。
33.權(quán)利要求31或32中的藥物配方或組合物與細(xì)胞毒劑或放療結(jié)合用于抗腫瘤治療中。
34.含有效PARP抑制劑量的權(quán)利要求29中所述化合物與用于抗腫瘤治療的治療有效劑量的細(xì)胞毒藥物相混合的藥物組合物。
35.對(duì)于哺乳動(dòng)物的治療方法，其中PARP酶的抑制活性被認(rèn)為是有益的。所述的方法包含給予所述的哺乳動(dòng)物有效PARP抑制劑量的權(quán)利要求14-27中任意一個(gè)化合物。
36.權(quán)利要求35中所述方法，其包括在抗腫瘤治療過程中與DNA-損傷細(xì)胞毒藥物或放療協(xié)同給藥治療。
全文摘要
本文公開了一系列苯并咪唑－4－羧酰胺化合物(Ⅰ),其可用作DNA修復(fù)酶多聚(ADP－核糖)多聚酶或PARP酶(EC2.4.2.30)的強(qiáng)抑制劑,因此其可以提供有用的、可與DNA－損傷細(xì)胞毒藥物或放療協(xié)同作用的治療化合物,以加強(qiáng)后者的作用。在式(Ⅰ)中,R和R’各自獨(dú)立為氫,烷基,羥基烷基(例如CH
文檔編號(hào)C07D235/08GK1195985SQ9619688
公開日1998年10月14日 申請(qǐng)日期1996年7月30日 優(yōu)先權(quán)日1995年8月2日
發(fā)明者R·J·格里菲, A·H·卡弗特, N·J·庫廷, D·R·紐威爾, B·T·古勒丁 申請(qǐng)人:鈕卡斯?fàn)柎髮W(xué)風(fēng)險(xiǎn)投資有限公司