一種桔小實(shí)蠅抗菌肽及其衍生物和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種桔小實(shí)蠅抗菌肽及其衍生物和應(yīng)用。該抗菌肽的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。其衍生物為經(jīng)過修飾得到的具有抗菌效果的活性衍生物，或經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的具有抗菌功能的桔小實(shí)蠅抗菌肽衍生物。本發(fā)明獲得的桔小實(shí)蠅抗菌肽BH-AMP003具有生物活性，具有廣泛的抗菌作用。因此，本發(fā)明的桔小實(shí)蠅抗菌肽BH-AMP003可應(yīng)用于制備抗病菌類產(chǎn)品，抗病菌類產(chǎn)品包括飼料添加劑、獸藥、防腐劑、醫(yī)藥產(chǎn)品如抗菌藥物等。
【專利說明】一種桔小實(shí)蠅抗菌肽及其衍生物和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種桔小實(shí)蠅抗菌肽及其衍生物和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 昆蟲是非常龐大的生物種群之一，據(jù)估計(jì)，世界上昆蟲的種類大約有800萬，占整 個(gè)動(dòng)物數(shù)量的95%以上，其個(gè)體數(shù)量超過千百種，昆蟲的分布相當(dāng)廣泛，幾乎所有生態(tài)環(huán)境 都有昆蟲的蹤跡，這些特殊環(huán)境都表明了昆蟲本身具有極強(qiáng)的適應(yīng)生存能力和防御外界能 力，昆蟲本身的防御系統(tǒng)并不同于脊椎動(dòng)物，其沒有完善的B淋巴系統(tǒng)和T淋巴系統(tǒng)，也沒 有完善的免疫球蛋白和補(bǔ)體存在，大量研究結(jié)果表明，在昆蟲感染病原菌或可能導(dǎo)致病原 菌感染的情況下，昆蟲自身都能快速合成大量的具有殺菌作用的抗菌肽，迅速殺滅已侵入 機(jī)體的病原菌，并阻止病原菌的繼續(xù)侵染，此特殊的防御系統(tǒng)使得昆蟲抗菌肽成為人類生 命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，因此，研制高效的、新一代的，并且對(duì)人類和動(dòng)物及環(huán)境都具有安 全保障的抗菌制劑，已經(jīng)成為當(dāng)今科學(xué)研究領(lǐng)域的新課題。
[0003] 二十世紀(jì)七十年代，瑞典科學(xué)家Boman等首先發(fā)現(xiàn)了以天蠶素命名的昆蟲抗菌 肽，以惜古比天蠶為實(shí)驗(yàn)材料，注射錯(cuò)狀芽抱桿菌誘導(dǎo)其產(chǎn)生 cecropin。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前科學(xué)研究者己經(jīng)相繼從家蠅、家蠶、作蠶、菌麻蠶、煙草天蛾、肉蠅 及多種昆蟲中分離得到200多種昆蟲抗菌肽。根據(jù)其氨基酸組成結(jié)構(gòu)和生物特性，可將昆 蟲抗菌肽大致分為以下四類：形成兩親性a-螺旋的線狀抗菌肽；具有二硫鍵的環(huán)狀或末 端開放的抗菌肽；富含脯氨酸的抗菌肽（Proline-rich peptides);富含甘氨酸的抗菌肽 (Glycine-rich peptides)。
[0004] 由于昆蟲種類巨大，還有很多新的昆蟲抗菌肽未被鑒定發(fā)現(xiàn)。桔小實(shí)蠅 ifectrocera Hendel是果蔬的重要害蟲，屬雙翅目Diptera、實(shí)妮科Trypetidae、 寡毛實(shí)蠅亞科Dacinae，在廣東省目前也是導(dǎo)致柑橘、枇杷等果樹掛果時(shí)為害特別嚴(yán)重的害 蟲之一。作為雙翅目昆蟲的桔小實(shí)蠅，在它的基因組內(nèi)，理論上應(yīng)該有抗菌肽基因，黨向麗 等（2012)從桔小實(shí)蠅中分離出抗菌肽Bactrocerin-2,除此之外，相關(guān)研究鮮有報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種桔小實(shí)蠅抗菌肽及其衍生物。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述桔小實(shí)蠅抗菌肽及其衍生物在制備抗菌產(chǎn)品中 的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種桔小實(shí)蠅抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0008] -種桔小實(shí)蠅抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0009] -種桔小實(shí)蠅抗菌肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示或其反向互補(bǔ)序列。
[0010] 一種桔小實(shí)蠅抗菌肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示或其反向互補(bǔ)序列。
[0011] 一種桔小實(shí)蠅抗菌肽衍生物，該衍生物為SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示氨基 酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的具有與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2功能相同的氨基酸序列。
[0012] 一種桔小實(shí)蠅抗菌肽衍生物，該衍生物為SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示氨基 酸序列的化學(xué)修飾物。
[0013] 進(jìn)一步的，上述化學(xué)修飾包括乙?；?、氨基化、甲基化、磷酸化、糖基化、脂基化、泛 素化、生物素標(biāo)記、熒光蛋白標(biāo)記。
[0014] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明提供了一種桔小實(shí)蠅抗菌肽，無溶血活性，具有生物安全性，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)多 種細(xì)菌，如革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌具有抑菌活性，可用于抗病原微生物感染的 生物技術(shù)產(chǎn)品研發(fā)。以桔小實(shí)蠅抗菌肽BH-AMP003氨基酸序列或基因序列為基礎(chǔ)，通過基 因工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程、轉(zhuǎn)基因和其它生物技術(shù)手段，可以大規(guī)模獲得桔小實(shí)蠅抗 菌肽蛋白，用于抗病原微生物感染的生物技術(shù)產(chǎn)品研發(fā)。
[0015] 本發(fā)明獲得的桔小實(shí)蠅抗菌肽BH-AMP003具有生物活性，具有抗菌作用。分離純 化的桔小實(shí)蠅抗菌肽BH-AMP003對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為5l^g/mL。因此，本發(fā)明的桔小 實(shí)蠅抗菌肽BH-AMP003可應(yīng)用于制備抗病菌類產(chǎn)品，抗病菌類產(chǎn)品包括飼料添加劑、獸藥、 防腐劑、醫(yī)藥產(chǎn)品如抗菌藥物等。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1為經(jīng)誘導(dǎo)后的桔小實(shí)蠅幼蟲cDNA文庫重組質(zhì)粒的酶切鑒定電泳圖譜； 圖2為質(zhì)粒載體pPIC3. 5K的物理圖譜； 圖3為重組質(zhì)粒載體的PCR鑒定，圖中：M為DNA Marker DL2000 ;1為以空載體 pPIC3. 5K質(zhì)粒為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物；2、3、4、5為轉(zhuǎn)化子的擴(kuò)增產(chǎn)物； 圖4為含抗菌肽的重組載體的構(gòu)建流程圖； 圖5為重組酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定，M為DNA Marker DL2000 ;1為陰性對(duì)照；2、3為酵 母重組菌株的菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 圖6為重組酵母菌株誘導(dǎo)抗菌肽表達(dá)，經(jīng)過分離純化后SDS-PAGE電泳檢測(cè)，M為 Protein Marker, 1為純化后的抗菌肽； 圖7為桔小實(shí)蠅抗菌肽BH-AMP003對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性：孔1 :加入100ML的 對(duì)照溶液(不含抗菌肽);孔2 :加入100ML的2. 5 Mmol/L桔小實(shí)蠅抗菌肽BH-AMP003 ;孔3 : 加入100ML的5. 0 Mmol/L桔小實(shí)蠅抗菌肽BH-AMP003 ;孔4 :加入100ML的10 ? OMmol/L桔 小實(shí)蠅抗菌肽BH-AMP003 ;孔5 :加入100ML的20. 0 Mmol/L桔小實(shí)蠅抗菌肽BH-AMP003 ; 圖8為桔小實(shí)蠅抗菌肽BH-AMP003對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌K12D31、沙門氏菌、尿腸 球菌、動(dòng)物致病大腸桿菌的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，孔1加入氨芐青霉素；孔2加入陰性對(duì)照CldH2O ; 孔3、4、5加入的為本發(fā)明制備的畢赤酵母工程菌表達(dá)的桔小實(shí)蠅抗菌肽； 圖9為桔小實(shí)蠅抗菌肽BH-AMP003抗菌活性的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果分析； 圖10為桔小實(shí)蠅抗菌肽BH-AMP003抗菌活性的耐酸穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果分析。

【具體實(shí)施方式】
[0017] 本發(fā)明通過ScanProsite對(duì)桔小實(shí)蠅抗菌肽BH-AMP003蛋白功能的預(yù)測(cè)結(jié)果得出 該蛋白是一個(gè)富含半胱氨酸的抗菌肽，主要存在于節(jié)肢動(dòng)物（昆蟲、虱、蜘蛛、蝎），雙殼軟 體動(dòng)物和真菌體內(nèi)。這六個(gè)保守的半胱氨酸都含有鏈內(nèi)二硫鍵，并組成三對(duì)二硫橋結(jié)構(gòu)(第 38位與第65位氨基酸，第51位與第71位氨基酸，第55位與第73位氨基酸)，其抗菌譜以 抗革蘭式陽性菌為主。
[0018] 桔小實(shí)蠅抗菌肽BH-AMP003的序列來自下文實(shí)施例1中桔小實(shí)蠅誘導(dǎo)幼蟲cDNA 文庫中所克隆到的5條高度同源的EST序列，對(duì)該序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析顯示其cDNA序 列長(zhǎng)度為225bp (不包含終止密碼子，核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示)，編碼75個(gè)氨基酸 殘基的前體肽如(氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示)。進(jìn)一步分析顯示，該前體肽的第1-21 位氨基酸殘基為其信號(hào)肽區(qū)域，將前體肽的前導(dǎo)肽和成熟肽部分分開，故確定BH-AMP003 成熟肽的氨基酸序列為AGCIKNGGRCVASGGPPYCCSNYCYRQVGWAHRYCKNR，即序列表中SEQ ID NO : 1所示的氨基酸序列。該成熟肽含有6個(gè)半胱氨酸，這6個(gè)半胱氨酸在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的昆蟲 防御素中高度保守，并形成三對(duì)二硫鍵，且后續(xù)的實(shí)驗(yàn)證明其具有抗菌活性，故桔小實(shí)蠅抗 菌肽BH-AMP003為新的昆蟲抗菌肽成員。
[0019] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0020] 實(shí)施例1混合菌誘導(dǎo)桔小實(shí)蠅幼蟲cDNA文庫的構(gòu)建及EST序列分析 采用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌K12D31混合菌針刺桔小實(shí)蠅幼蟲，誘導(dǎo)24小時(shí)后， 參照invitrogen TRIzol Reagent RNA提取試劑盒的使用說明書提取桔小實(shí)蠅幼蟲的 總RNA，觀察到18S和28S特征條帶整齊清晰，亮度比接近1:2,同時(shí)經(jīng)過紫外分光光度 計(jì)測(cè)定0D 26(i/0D28(i=1. 82,說明總RNA的質(zhì)量較好。文庫構(gòu)建采用Clontech公司Smart cDNA Library Construction Kit試劑盒，并利用試劑盒本身附帶的引物、載體、限制 性內(nèi)切酶等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取1呢桔小實(shí)蠅幼蟲的總RNA，以SMART III寡聚核苷酸片斷 (5 ' AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3，）和 CDSIII/3 ' PCR 引物（5 ' -AITCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d (T) 3(|沁#-3 '）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈，得到 5 ii L cDNA 第一鏈產(chǎn)物。取 2uL第一鏈產(chǎn)物以 5' PCR 引物（5'-AAGCAGTGGTATAAC GCAGAGT-3'）、 CDSIII/3' 引物（5, - ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd (TLN-iN-S，）進(jìn)行 LD-PCR (long-distance PCR)擴(kuò)增，將cDNA雙鏈經(jīng)蛋白酶K消化并純化后用限制性內(nèi)切酶S//I進(jìn) 行酶切處理，用Chroma SPIN-400將cDNA按分子大小分部，除去小于400bp的片段，將分部 好的cDNA用T4 DNA連接酶連接到以相同限制性內(nèi)切酶S/7I酶切處理過的文庫構(gòu)建載體 質(zhì)粒上。轉(zhuǎn)化Iu L連接產(chǎn)物，取200 UL轉(zhuǎn)化液稀釋到合適濃度后涂板。隨機(jī)挑取單克隆， 搖菌、保種、提取質(zhì)粒(重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果如圖1所示)、17引物單向測(cè)序，結(jié)果顯示， 重組率超過95%，插入片段長(zhǎng)度為500-3000bp，去除載體后平均大小為Ikb左右，手工使用 BLAST N和BLAST X在線同源比對(duì)，SEQT00L、ClustalX 1. 83程序分析測(cè)序結(jié)果。
[0021] 經(jīng)過抗性篩選與菌落PCR篩選得到的陽性克隆測(cè)序與GenBank數(shù)據(jù)庫Blastn分 析，得到5條EST編碼的桔小實(shí)蠅抗菌肽，將其中一條命名為BH-AMP003,該抗菌肽由42個(gè) 氨基酸殘基組成(氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示)，分子量為4.31 kDa，等電點(diǎn)為8. 90,呈 堿性，編碼該42個(gè)氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示。桔小實(shí)蠅BH-AMP003具有典 型的抗菌肽一級(jí)結(jié)構(gòu)特征和物理化學(xué)特性。
[0022] 我們通過ProtParam分析桔小實(shí)蠅抗菌肽BH-AMP003完整的編碼蛋白由75個(gè) 氨基酸組成(氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示)，它的分子質(zhì)量單位為8. 06 KD，檢測(cè)其等 電點(diǎn)理論值為8. 90,該蛋白的酸性氨基酸總數(shù)（Asp+Glu)共為1個(gè)，它的堿性氨基酸總數(shù) (Arg+Lys)共為6個(gè)，編碼該42個(gè)氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示。為了排除信 號(hào)肽對(duì)蛋白抗原表位篩選的干擾，我們采用Signal P程序預(yù)測(cè)該抗菌肽序列中的信號(hào)肽結(jié) 構(gòu)，結(jié)果表明，桔小實(shí)蠅抗菌肽BH-AMP003含有一個(gè)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)為1-21位氨基酸殘基的信 號(hào)肽，成熟肽部分位于第34-75位氨基酸殘基，其氨基酸序列為：KRAT⑶LLSKTGVGLSLCAAH CVLRGNRGGYCQGAGVCVCRI〇
[0023] 實(shí)施例2桔小實(shí)蠅抗菌肽BH-AMP003的重組表達(dá) 本實(shí)驗(yàn)采用組氨酸缺陷型畢赤酵母GSl 15作為宿主菌，采用胞內(nèi)表達(dá)載體pPIC3. 5K構(gòu) 建重組表達(dá)系統(tǒng)。選擇Sac I內(nèi)切酶線性化重組載體pPIC3.5K，然后將通過分子克隆手段 使之帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的桔小實(shí)蠅抗菌肽BH-AMP003基因（SEQ ID N0:3所示)通過T4 DNA 連接酶與線性化載體連接，再將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a中，利用氨芐青霉素抗性的LB平 板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。挑單菌落接種培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證和測(cè)序。整個(gè)實(shí)驗(yàn)的詳細(xì) 方法參見Sam brook J.編著的《分子克隆試驗(yàn)室手冊(cè)》。進(jìn)一步將重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母 GS115感受態(tài)細(xì)胞，篩選重組子，誘導(dǎo)表達(dá)，并且對(duì)重組工程菌株進(jìn)行高密度發(fā)酵，檢測(cè)桔小 實(shí)蠅抗菌肽BH-AMP003的抑菌活性和抗菌譜。
[0024] 1.桔小實(shí)蠅抗菌肽BH-AMP003的合成 以經(jīng)過測(cè)序的含有桔小實(shí)蠅抗菌肽基因BH-AMP003 (SEQ ID N0:3所示）的文庫質(zhì)粒 為模板，分別設(shè)計(jì)和合成Primerl及Primer2兩段引物，經(jīng)過PCR擴(kuò)增合成桔小實(shí)蠅抗菌肽 BH-AMP003 基因。
[0025] 引物 1 :5, -CGGGATCCACCATGAAACGCGCCACCTGCGAT-3' ； 引物 2 :5' -CGGAATTCTCATTAGATGCGGCAGACGCAGAC~3,； 反應(yīng)條件：

【權(quán)利要求】
1. 一種桔小實(shí)蠅抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. -種桔小實(shí)蠅抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
3. -種桔小實(shí)蠅抗菌肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示或其反向互補(bǔ)序列。
4. 一種桔小實(shí)蠅抗菌肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示或其反向互補(bǔ)序列。
5. -種桔小實(shí)蠅抗菌肽衍生物，其特征在于：該衍生物為SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的具有與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2功能相同的氨基酸序列。
6. -種桔小實(shí)蠅抗菌肽衍生物，其特征在于：該衍生物為SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的化學(xué)修飾物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種桔小實(shí)蠅抗菌肽衍生物，其特征在于：所述化學(xué)修飾包 括乙酰化、氨基化、甲基化、磷酸化、糖基化、脂基化、泛素化、生物素標(biāo)記、熒光蛋白標(biāo)記。
8. -種桔小實(shí)蠅抗菌肽及其衍生物在制備抗菌產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述抗菌肽為權(quán)利要求 1?4任一所述的桔小實(shí)蠅抗菌肽，所述抗菌肽衍生物為權(quán)利要求5?7任一所述的桔小實(shí) 蠅抗菌肽衍生物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于：所述抗菌產(chǎn)品包括飼料添加劑、防腐劑、 保健品、藥。
【文檔編號(hào)】C07K14/435GK104356215SQ201410524612
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年10月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月8日
【發(fā)明者】李莉, 李本濤 申請(qǐng)人:廣州格拉姆生物科技有限公司