專利名稱：一種從生物催化轉(zhuǎn)化液中分離尿苷酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本方法涉及一種尿苷酸的生產(chǎn)工藝，具體涉及一種從生物催化轉(zhuǎn)化液中分離尿苷
酸的方法。
背景技術(shù)：
核苷酸是一種重要的生物化工原料，可用于食品添加劑、醫(yī)藥中間體、飼料的添加 劑以及植物的促生長劑等方面，尿苷酸(UMP)是一種基礎(chǔ)核苷酸，是核苷酸中最重要的一 種，市場需求量非常大，但是，尿苷酸生產(chǎn)困難，導(dǎo)致價格昂貴，我國核苷酸生產(chǎn)大多數(shù)在用 酶解法生產(chǎn)，生產(chǎn)周期長，工藝繁瑣，分離難度高，導(dǎo)致生產(chǎn)成本高，質(zhì)量差，收率低，純度無 法達(dá)到下游醫(yī)藥等生產(chǎn)要求。生物催化法生產(chǎn)核苷酸技術(shù)是生產(chǎn)核苷酸的新技術(shù)，具有高 效、高選擇性、條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)點，縮短了生產(chǎn)周期，也可以大大增加了核苷酸的產(chǎn) 量[200910025981. 4,200910030838. 4]。但是，如何從生物催化轉(zhuǎn)化液中分離尿苷酸也就成 了急需解決的難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種從生物催化轉(zhuǎn)化液中分離尿苷酸的方法，進(jìn) 而開發(fā)出一套過程簡單，成本低廉，易于產(chǎn)業(yè)化的UMP分離純化工藝，填補國內(nèi)在催化生產(chǎn) 核苷酸方面的空白。 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下 —種從生物催化轉(zhuǎn)化液中分離尿苷酸的方法，包括如下步驟 (1)將生物催化轉(zhuǎn)化液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1. 0 3. 0后，經(jīng)離心去除固體雜質(zhì)； (2)將步驟(1)得到的離心清液經(jīng)超濾處理，收集超濾透過液； (3)將步驟(2)得到的超濾透過液經(jīng)納濾處理，收集納濾濃縮液； (4)將步驟(3)得到的納濾濃縮液稀釋到尿苷酸濃度為5 20g/L，調(diào)節(jié)pH值至
1. 0 6. 0 ;進(jìn)入陰離子交換柱吸附，吸附流速為1. 2 3. 6BV/h，陰離子交換柱高徑比為
8 12 : 1;再用去離子水進(jìn)行洗雜，去離子水體積為1 5BV;最后用無機(jī)鹽溶液進(jìn)行洗
脫，無機(jī)鹽濃度為0. 05 0. 5mol/L，洗脫流速為1. 2 3. 6BV/h ; (5)洗脫液經(jīng)納濾處理除鹽濃縮、結(jié)晶、干燥后得到尿苷酸二鈉晶體。 步驟(2)中，所述的超濾處理使用的超濾膜為聚酰胺膜、聚醚砜膜、醋酸纖維素膜
和聚乙烯醇膜中的任意一種，超濾膜截留分子量為1000 8000，超濾膜工作壓力為0. 5
1. 5MPa，超濾溫度為25 45°C ，超濾pH值為3. 0 8. 0。優(yōu)選地，所述的超濾處理使用的
超濾膜為聚酰胺膜，超濾膜截留分子量為3000 5000，超濾膜工作壓力為1 1. 2MPa，超
濾溫度為30°C ，超濾pH值為5. 0 7. 0。 步驟(3)和(5)中，所述的納濾處理使用的納濾膜為聚酰胺膜、聚醚砜膜、醋酸纖 維素膜和聚乙烯醇膜中的任意一種，納濾膜截留分子量為100 300，納濾膜工作壓力為 0. 5 1. 5MPa，納濾溫度為25 45°C ，納濾pH值為2. 0 6. 0，納濾濃縮至UMP濃度為納濾初始液中的3 10倍。 一般在納濾過程中會加入納濾初始液體積的2 5倍去離子水 反復(fù)進(jìn)行。優(yōu)選地，所述的納濾處理使用的納濾膜為聚酰胺膜，納濾膜截留分子量為150 200，納濾膜工作壓力為0. 8 lMPa，納濾溫度為35°C，納濾pH值為2. 5 4. 5，納濾濃縮至 UMP濃度為納濾初始液中的5 6倍。 步驟(4)中，所述的陰離子交換柱中充填有陰離子交換樹脂，該樹脂以聚苯乙烯 或聚丙烯酸為骨架，以伯胺基、仲胺基或叔胺基為功能基團(tuán)。優(yōu)選地，所述的樹脂粒徑為 0. 9 1. 2mm，含水量為60 70%，最大膨脹《30。 步驟(4)中，優(yōu)選為，將步驟(3)得到的納濾濃縮液稀釋到尿苷酸濃度為10 15g/L，調(diào)節(jié)pH值至2. 0 4. 0 ;進(jìn)入陰離子交換柱吸附，吸附流速為1. 5 2. 5BV/h，陰離 子交換柱高徑比為8 12 : 1 ;再用去離子水進(jìn)行洗雜，去離子水體積為3 4BV;最后用 無機(jī)鹽溶液進(jìn)行洗脫，無機(jī)鹽濃度為0. 05 0. 5mol/L，洗脫流速為1. 5 2. 5BV/h。
步驟(4)中，用無機(jī)鹽溶液進(jìn)行洗脫，所述的無機(jī)鹽為CaCl2、NaCl、NH4Cl和KC1中 的任意一種或幾種。優(yōu)選地，所述的無機(jī)鹽為NaCl。 步驟(4)中，無機(jī)鹽溶液中優(yōu)選加入乙醇，可以提高尿苷酸洗脫純度，乙醇加入量 為無機(jī)鹽溶液體積的1 10%，優(yōu)選2 5%。 步驟(5)中，所述的結(jié)晶，結(jié)晶母液中UMP濃度為50 150g/L，結(jié)晶溫度為10
40°C ，攪拌速率為30 200r/min，流加乙醇體積為結(jié)晶母液的1 5倍。優(yōu)選地，結(jié)晶母液
中UMP濃度為120 150g/L，結(jié)晶溫度為25 35。C，攪拌速率為80 100r/min，流加乙醇
體積為結(jié)晶母液的2 4倍。 采用上述技術(shù)方案的原理如下 —、預(yù)處理。 生物催化轉(zhuǎn)化液成分復(fù)雜，除了含有要分離得到的UMP夕卜，還包含蛋白、磷酸鹽、 乳清酸、檸檬酸、多糖、無機(jī)鹽、尿苷、UTP、 UDP、多肽及色素等等，為了使離子交換達(dá)到最大 效率，必須對轉(zhuǎn)化液進(jìn)行前期處理，除去大部分雜質(zhì)。生物催化轉(zhuǎn)化液大量的蛋白，可以用 酸沉淀法除去大部分蛋白，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至l 3，使蛋白沉淀后離心去除。用截留分子 量為1000 8000的超濾膜去除溶液中剩余的蛋白質(zhì)和大部分色素。經(jīng)過前面的這些處理 后，轉(zhuǎn)化液中還含有各種無機(jī)鹽及小分子物質(zhì)，用截留分子量為100 300的納濾濾膜進(jìn)行 納濾，加入2 5的去離子水反復(fù)進(jìn)行，去除大部分的無機(jī)鹽、小分子物質(zhì)及色素，同時達(dá)到 了濃縮的目的，可濃縮3 10倍。
二、離子交換。 目前大多數(shù)工業(yè)規(guī)模的離子交換過程中都使用固定床操作方式。由于固定床離子 交換設(shè)備結(jié)構(gòu)簡單，不需要樹脂傳輸設(shè)備，操作方便，樹脂磨損小，所以本方法也是采用這 種離子交換工藝。經(jīng)過交換、吸附完畢后，用去離子水進(jìn)行洗雜，然后用無機(jī)鹽溶液作為洗 脫液，按常規(guī)方法進(jìn)行洗脫至終點，用分光光度計檢測，到達(dá)終點停止洗脫。洗脫完后，樹脂 按照常規(guī)方法進(jìn)行再生處理，洗脫液稀釋500倍后，用分光光度計檢測，OD值小于0. 015的 時候停止洗脫。為了增加洗脫能力，在洗脫用的鹽溶液中還可以加入少量醇，優(yōu)選乙醇，乙 醇加入量為無機(jī)鹽溶液體積的1 10%，優(yōu)選2 5%。
三、結(jié)晶。 收集的洗脫液用截留分子量為100-200的納濾濾膜進(jìn)行納濾，達(dá)到濃縮和脫鹽的目的，將處理完的洗脫液進(jìn)行結(jié)晶。
有益效果本發(fā)明方法與已有技術(shù)相比有以下的優(yōu)點 (1)傳統(tǒng)的核苷酸生產(chǎn)是核酸酶解法，得到4種核苷酸混合物，導(dǎo)致分離純化4種 核苷酸的難度大，生產(chǎn)周期長，提取工藝繁瑣，特別是尿苷酸產(chǎn)量低，而尿苷酸是核苷酸產(chǎn) 品中最重要的一種，市場需求量大。CN1408719A和CN101363016A采用的就是核酸酶解法生 產(chǎn)核苷酸，得到4種核苷酸產(chǎn)品，生物催化法生產(chǎn)核苷酸國內(nèi)還沒有大規(guī)模生產(chǎn)。本方法就 是從生物催化轉(zhuǎn)化液中提取尿苷酸，微生物催化轉(zhuǎn)化合成尿苷酸，是利用微生物作為酶源， 催化尿苷酸的前體物質(zhì)乳清酸轉(zhuǎn)化為尿苷酸，所以它具有高效、高選擇性，本方法是分離尿 苷酸，制備工藝相對簡單，得率高，規(guī)模生產(chǎn)成本低，為高純度尿苷酸大規(guī)模生產(chǎn)提供了可 能，從而進(jìn)一步為核苷酸下游醫(yī)藥開發(fā)和廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 (2)本發(fā)明方法利用在酸性條件下，陰離子交換樹脂對目標(biāo)物質(zhì)尿苷酸的親和力 與UDP、UTP、色素等雜質(zhì)親和力的差異，不同濃度的無機(jī)鹽洗脫劑對吸附在樹脂上的尿苷 酸和其他雜質(zhì)的洗脫能力不同，使尿苷酸與其他雜質(zhì)高效分離，本方法中，無機(jī)鹽只將尿苷 酸從樹脂上洗脫下來，UDP、 UTP等雜質(zhì)留在樹脂上，因此洗脫液中尿苷酸的純度較高，達(dá)到 95%以上，結(jié)晶后得到高純度的尿苷酸產(chǎn)品。 (3)通過本發(fā)明方法，可獲得高純度的尿苷酸二鈉晶體，尿苷酸的收率可達(dá)到 90%以上，尿苷酸二鈉晶體純度在98%以上。
具體實施例方式
根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限 制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
以下實施例所使用的生物催化轉(zhuǎn)化液按如下方法制備 在容量為15L的反應(yīng)槽中調(diào)制由乳清酸100g，葡萄糖1500g，釀酒酵母3000g，氯化 銨lg，氯化鎂1. 5g，磷酸二氫鈉24g，吩嗪甲基硫酸鹽250g，蘋果酸1. 5g，月桂酰*肌氨酸鹽 15g和水組成的反應(yīng)液IOL，用氫氧化鈉調(diào)pH至6. 5，于37t:條件下低速攪拌反應(yīng)8h，反應(yīng) 結(jié)束后，用高氯酸沉淀，用HPLC對UMP進(jìn)行定量分析。 以下實施例所使用的陰離子交換樹脂為凝膠型樹脂，以聚苯乙烯或聚丙烯酸為骨 架，功能基團(tuán)為伯胺基(_nh2)、仲胺基(=nh)或叔胺基(e n)，其粒徑為0. 9 1. 2mm，含 水量為60 70%，最大膨脹《30。
實施例1 : 按照上述生物催化轉(zhuǎn)換液制備方法，制備10L轉(zhuǎn)化液，其中UMP的含量為8. 4g/L。
處理工藝如下 (1)將生物催化轉(zhuǎn)化液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2. O后，經(jīng)10000rpm、20min離心后去除
固體雜質(zhì)。 (2)將步驟(1)得到的離心清液經(jīng)超濾處理，收集超濾透過液；所述的超濾膜為聚 酰胺膜，超濾膜截留分子量為8000，超濾膜工作壓力為lMPa，超濾溫度為30°C ，超濾pH值為 5. 0。
(3)將步驟(2)得到的超濾透過液經(jīng)納濾處理，收集納濾濃縮液；所述的納濾膜為
6聚醚砜膜，納濾膜截留分子量為200，納濾膜工作壓力為lMPa，納濾溫度為3(TC，納濾pH值 為2. 5，加入3倍去離子水反復(fù)進(jìn)行，納濾濃縮至UMP濃度為納濾初始液中的3倍，UMP的收 率為92. 4%。 (4)將步驟(3)得到的納濾濃縮液稀釋到尿苷酸濃度為10g/L，調(diào)節(jié)pH值至2. 0 ; 進(jìn)入充填有陰離子交換樹脂(以聚苯乙烯為骨架，以伯胺基為主要功能基團(tuán))的陰離子交 換柱吸附，吸附流速為1. 5BV/h，陰離子交換柱高徑比為8 : l，加入樹脂量為1000g，當(dāng)吸附 流出液中尿苷酸的濃度達(dá)到進(jìn)樣濃度的10%時，認(rèn)為到達(dá)穿透點，停止進(jìn)樣；再用去離子 水進(jìn)行洗雜，去離子水體積為3BV，洗至流出液0D〈0.010，洗液可以回收濃縮繼續(xù)上柱；最 后用添加了乙醇的NaCl水溶液進(jìn)行洗脫，無機(jī)鹽濃度為0. 05mol/L，乙醇加入量為NaCl水 溶液體積的2%，洗脫流速為1. 5BV/h，洗脫完畢，測得上柱過程尿苷酸的收率為93. 1%，純 度為93.6%。 (5)洗脫液經(jīng)納濾處理除鹽濃縮，納濾膜為聚醚砜膜，納濾膜截留分子量為200， 納濾膜工作壓力為lMPa，納濾溫度為3(TC，納濾pH值為2. 5 ;納濾濃縮液經(jīng)結(jié)晶、干燥后 得到尿苷酸二鈉晶體，結(jié)晶母液中UMP濃度為120g/L，結(jié)晶溫度為25t:，攪拌速率為100r/ min，流加酒精體積為結(jié)晶母液的2倍，當(dāng)有晶體出現(xiàn)的時候，停止流加lh，再繼續(xù)流加酒精 直至流加完畢。所得的尿苷酸二鈉晶體為61. 36g(含25%的結(jié)晶水)，純度98. 2% ，結(jié)晶收 率為93. 3%，整體工藝純化總收率80. 2% 。
實施例2: 照上述生物催化轉(zhuǎn)換液制備方法，制備IOL轉(zhuǎn)化液，其中UMP的含量為9. lg/L。
處理工藝如下 (1)將生物催化轉(zhuǎn)化液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2. O后，經(jīng)10000rpm、20min離心后去除 固體雜質(zhì)； (2)將步驟(1)得到的離心清液經(jīng)超濾處理，收集超濾透過液；所述的超濾膜為聚 酰胺膜，超濾膜截留分子量為5000，超濾膜工作壓力為lMPa，超濾溫度為30°C ，超濾pH值為 6. 0。 (3)將步驟(2)得到的超濾透過液經(jīng)納濾處理，收集納濾濃縮液；所述的納濾膜為 聚酰胺膜，納濾膜截留分子量為150，納濾膜工作壓力為lMPa，納濾溫度為3(TC，納濾pH值 為2. 5，加入3倍去離子水反復(fù)進(jìn)行，納濾濃縮至UMP濃度為納濾初始液中的3倍，UMP的收 率為94. 9%。 (4)將步驟(3)得到的納濾濃縮液稀釋到尿苷酸濃度為12g/L，調(diào)節(jié)pH值至2. 0 ; 進(jìn)入充填有陰離子交換樹脂(以聚苯乙烯為骨架，以叔胺基為主要功能基團(tuán))的陰離子交 換柱吸附，吸附流速為1. 5BV/h，陰離子交換柱高徑比為10 : l，加入樹脂量為1000g，當(dāng)吸 附流出液中尿苷酸的濃度達(dá)到進(jìn)樣濃度的10%時，認(rèn)為到達(dá)穿透點，停止進(jìn)樣；再用去離 子水進(jìn)行洗雜，去離子水體積為2BV，洗至流出液0D < 0. OIO，洗液可以回收濃縮繼續(xù)上柱； 最后用添加了乙醇的KCl水溶液進(jìn)行洗脫，無機(jī)鹽濃度為O. 2mol/L，乙醇加入量為KC1水溶 液體積的3%，洗脫流速為1. 5BV/h，洗脫完畢，測得上柱過程尿苷酸的收率為95. 2%，純度 為93. 6%。 (5)洗脫液經(jīng)納濾處理除鹽濃縮，納濾膜為聚酰胺膜，納濾膜截留分子量為150， 納濾膜工作壓力為lMPa，納濾溫度為3(TC，納濾pH值為2. 5 ;納濾濃縮液經(jīng)結(jié)晶、干燥后得到尿苷酸二鈉晶體，結(jié)晶母液中UMP濃度為130g/L，結(jié)晶溫度為3(TC，攪拌速率為100r/ min，流加酒精體積為結(jié)晶母液的3倍，當(dāng)有晶體出現(xiàn)的時候，停止流加lh，再繼續(xù)流加酒精 直至流加完畢。所得的尿苷酸二鈉晶體為63. 8g(含25%的結(jié)晶水)，純度98. 1%，結(jié)晶收 率為93.9%，整體工藝純化總收率84. 8 % 。
實施例3 : 照上述生物催化轉(zhuǎn)換液制備方法，制備IOL轉(zhuǎn)化液，其中UMP的含量為8. lg/L。
處理工藝如下 (1)將生物催化轉(zhuǎn)化液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3. O后，經(jīng)10000rpm、20min離心后去除 固體雜質(zhì)； (2)將步驟(1)得到的離心清液經(jīng)超濾處理，收集超濾透過液；所述的超濾膜為聚 酰胺膜，超濾膜截留分子量為3000，超濾膜工作壓力為lMPa，超濾溫度為30°C ，超濾pH值為 7. 0。 (3)將步驟(2)得到的超濾透過液經(jīng)納濾處理，收集納濾濃縮液；所述的納濾膜為 聚酰胺膜，納濾膜截留分子量為200，納濾膜工作壓力為lMPa，納濾溫度為3(TC，納濾pH值 為4. 5，加入3倍去離子水反復(fù)進(jìn)行，納濾濃縮至UMP濃度為納濾初始液中的3倍，UMP的收 率為93. 2%。 (4)將步驟(3)得到的納濾濃縮液稀釋到尿苷酸濃度為15g/L，調(diào)節(jié)pH值至4. 0 ; 進(jìn)入充填有陰離子交換樹脂(以聚丙烯酸為骨架，以仲胺基為主要功能基團(tuán))的陰離子交 換柱吸附，吸附流速為2. OBV/h，陰離子交換柱高徑比為12 : l，加入樹脂量為1000g，當(dāng)吸 附流出液中尿苷酸的濃度達(dá)到進(jìn)樣濃度的10%時，認(rèn)為到達(dá)穿透點，停止進(jìn)樣；再用去離 子水進(jìn)行洗雜，去離子水體積為4BV，洗至流出液0D < 0. OIO，洗液可以回收濃縮繼續(xù)上柱； 最后用添加了乙醇的NH4C1水溶液進(jìn)行洗脫，無機(jī)鹽濃度為0. 2mol/L，乙醇加入量為NH4C1 水溶液體積的4%，洗脫流速為2. OBV/h，洗脫完畢，測得上柱過程尿苷酸的收率為97. 6%， 純度為94. 8%。 (5)洗脫液經(jīng)納濾處理除鹽濃縮，納濾膜為聚酰胺膜，納濾膜截留分子量為200， 納濾膜工作壓力為lMPa，納濾溫度為30°C ，納濾pH值為4. 5，納濾濃縮液經(jīng)結(jié)晶、干燥后得 到尿苷酸二鈉晶體，結(jié)晶母液中UMP濃度為140g/L，結(jié)晶溫度為3(TC，攪拌速率為100r/ min，流加酒精體積為結(jié)晶母液的4倍，當(dāng)有晶體出現(xiàn)的時候，停止流加lh，再繼續(xù)流加酒精 直至流加完畢。所得的尿苷酸二鈉晶體為64. 5g(含25%的結(jié)晶水)，純度98. 3%，結(jié)晶收 率為93. 5%，整體工藝純化總收率85. 1%。
實施例4 : 照上述生物催化轉(zhuǎn)換液制備方法，制備IOL轉(zhuǎn)化液，其中UMP的含量為10. 2g/L。
處理工藝如下 (1)將生物催化轉(zhuǎn)化液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3. O后，經(jīng)10000rpm、20min離心后去除 固體雜質(zhì)； (2)將步驟(1)得到的離心清液經(jīng)超濾處理，收集超濾透過液；所述的超濾膜為聚 酰胺膜，超濾膜截留分子量為3000，超濾膜工作壓力為lMPa，超濾溫度為30°C ，超濾pH值為 6. 0。
(3)將步驟(2)得到的超濾透過液經(jīng)納濾處理，收集納濾濃縮液；所述的納濾膜為醋酸纖維膜，納濾膜截留分子量為150，納濾膜工作壓力為1MPa，納濾溫度為3(TC，納濾pH 值為3. 0，加入3倍去離子水反復(fù)進(jìn)行，納濾濃縮至UMP濃度為納濾初始液中的3倍，UMP的 收率為96. 5% 。 (4)將步驟(3)得到的納濾濃縮液稀釋到尿苷酸濃度為10g/L，調(diào)節(jié)pH值至3. 0 ; 進(jìn)入充填有陰離子交換樹脂(以聚丙烯酸為骨架，以伯胺、仲胺和叔胺基為功能基團(tuán))的 陰離子交換柱吸附，吸附流速為2.5BV/h，陰離子交換柱高徑比為10 : l，加入樹脂量為 1000g，當(dāng)吸附流出液中尿苷酸的濃度達(dá)到進(jìn)樣濃度的10%時，認(rèn)為到達(dá)穿透點，停止進(jìn)樣； 再用去離子水進(jìn)行洗雜，去離子水體積為3BV，洗至流出液0D < O.OIO，洗液可以回收濃縮 繼續(xù)上柱；最后用添加了乙醇的KC1水溶液進(jìn)行洗脫，無機(jī)鹽濃度為0. 25mol/L，乙醇加入 量為KC1水溶液體積的5%，洗脫流速為2. 5BV/h，洗脫完畢，測得上柱過程尿苷酸的收率為
97. 1%，純度為97. 1%。 (5)洗脫液經(jīng)納濾處理除鹽濃縮，納濾膜為醋酸纖維膜，納濾膜截留分子量為 150，納濾膜工作壓力為lMPa，納濾溫度為3(TC，納濾pH值為3. 0，納濾濃縮液經(jīng)結(jié)晶、干 燥后得到尿苷酸二鈉晶體，結(jié)晶母液中UMP濃度為150g/L，結(jié)晶溫度為3(TC，攪拌速率為 100r/min，流加酒精體積為結(jié)晶母液的3倍，當(dāng)有晶體出現(xiàn)的時候，停止流加lh，再繼續(xù)流 加酒精直至流加完畢。所得的尿苷酸二鈉晶體為66. 9g(含25%的結(jié)晶水)，純度98. 3%， 結(jié)晶收率為94. 3%，整體工藝純化總收率88. 3% 。
實施例5 : 照上述生物催化轉(zhuǎn)換液制備方法，制備10L轉(zhuǎn)化液，其中UMP的含量為8. 2g/L
處理工藝如下 (1)將生物催化轉(zhuǎn)化液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3. O后，經(jīng)10000rpm、20min離心后去除 固體雜質(zhì)； (2)將步驟(1)得到的離心清液經(jīng)超濾處理，收集超濾透過液；所述的超濾膜為聚 酰胺膜，超濾膜截留分子量為3000，超濾膜工作壓力為lMPa，超濾溫度為30°C ，超濾pH值為 7. 0。 (3)將步驟(2)得到的超濾透過液經(jīng)納濾處理，收集納濾濃縮液；所述的納濾膜為 聚酰胺膜，納濾膜截留分子量為150，納濾膜工作壓力為lMPa，納濾溫度為3(TC，納濾pH值 為3. 0，加入3倍去離子水反復(fù)進(jìn)行，納濾濃縮至UMP濃度為納濾初始液中的3倍，UMP的收 率為98. 7%。 (4)將步驟(3)得到的納濾濃縮液稀釋到尿苷酸濃度為12g/L，調(diào)節(jié)pH值至3.0 ; 進(jìn)入充填有陰離子交換樹脂(以聚丙烯酸為骨架，以伯胺、仲胺和叔胺基為功能基團(tuán))的陰 離子交換柱吸附，吸附流速為2BV/h，陰離子交換柱高徑比為12 : l，加入樹脂量為1000g， 當(dāng)吸附流出液中尿苷酸的濃度達(dá)到進(jìn)樣濃度的10%時，認(rèn)為到達(dá)穿透點，停止進(jìn)樣；再用 去離子水進(jìn)行洗雜，去離子水體積為3BV，洗至流出液0D < O.OIO，洗液可以回收濃縮繼續(xù) 上柱；最后用添加了乙醇的NaCl水溶液進(jìn)行洗脫，無機(jī)鹽濃度為0. 15mol/L，乙醇加入量 為NaCl水溶液體積的5%，洗脫流速為2BV/h，洗脫完畢，測得上柱過程尿苷酸的收率為
98. 5%，純度為96. 9%。 (5)洗脫液經(jīng)納濾處理除鹽濃縮，納濾膜為聚酰胺膜，納濾膜截留分子量為150， 納濾膜工作壓力為lMPa，納濾溫度為30°C ，納濾pH值為3. 0，納濾濃縮液經(jīng)結(jié)晶、干燥后得
9到尿苷酸二鈉晶體，結(jié)晶母液中UMP濃度為150g/L，結(jié)晶溫度為3(TC，攪拌速率為100r/ min，流加酒精體積為結(jié)晶母液的3倍，當(dāng)有晶體出現(xiàn)的時候，停止流加lh，再繼續(xù)流加酒精 直至流加完畢。所得的尿苷酸二鈉晶體為67. lg(含25%的結(jié)晶水)，純度98. 1%，轉(zhuǎn)換液 沒有全部上柱，結(jié)晶收率為95. 3%，整體工藝純化總收率92. 7%。
權(quán)利要求
一種從生物催化轉(zhuǎn)化液中分離尿苷酸的方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)將生物催化轉(zhuǎn)化液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1.0～3.0后，經(jīng)離心去除固體雜質(zhì)；(2)將步驟(1)得到的離心清液經(jīng)超濾處理，收集超濾透過液；(3)將步驟(2)得到的超濾透過液經(jīng)納濾處理，收集納濾濃縮液；(4)將步驟(3)得到的納濾濃縮液稀釋到尿苷酸濃度為5～20g/L，調(diào)節(jié)pH值至1.0～6.0；進(jìn)入陰離子交換柱吸附，吸附流速為1.2～3.6BV/h，陰離子交換柱高徑比為2～20∶1；再用去離子水進(jìn)行洗雜，去離子水體積為1～5BV；最后用無機(jī)鹽溶液進(jìn)行洗脫，無機(jī)鹽濃度為0.01～1mol/L，洗脫流速為1.2～3.6BV/h；(5)洗脫液經(jīng)納濾處理除鹽濃縮、結(jié)晶、干燥后得到尿苷酸二鈉晶體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從生物催化轉(zhuǎn)化液中分離尿苷酸的方法，其特征在于步驟 (2)中，所述的超濾處理使用的超濾膜為聚酰胺膜、聚醚砜膜、醋酸纖維素膜和聚乙烯醇膜 中的任意一種，超濾膜截留分子量為1000 8000，超濾膜工作壓力為0. 5 1. 5MPa，超濾 溫度為25 45°C ，超濾pH值為3. 0 8. 0。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的從生物催化轉(zhuǎn)化液中分離尿苷酸的方法，其特征在于步驟(2) 中，所述的超濾處理使用的超濾膜為聚酰胺膜，超濾膜截留分子量為3000 5000，超濾 膜工作壓力為1 1. 2MPa，超濾溫度為3(TC，超濾pH值為5. 0 7. 0。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從生物催化轉(zhuǎn)化液中分離尿苷酸的方法，其特征在于步驟(3) 和(5)中，所述的納濾處理使用的納濾膜為聚酰胺膜、聚醚砜膜、醋酸纖維素膜和聚乙 烯醇膜中的任意一種，納濾膜截留分子量為100 300，納濾膜工作壓力為0. 5 1. 5MPa， 納濾溫度為25 45t:，納濾pH值為2. 0 6. O，納濾濃縮至UMP濃度為納濾初始液中的 3 10倍。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的從生物催化轉(zhuǎn)化液中分離尿苷酸的方法，其特征在于步驟(3) 和(5)中，所述的納濾處理使用的納濾膜為聚酰胺膜，納濾膜截留分子量為150 200， 納濾膜工作壓力為0. 8 lMPa，納濾溫度為35°C ，納濾pH值為2. 5 4. 5，納濾濃縮至UMP 濃度為納濾初始液中的5 6倍。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從生物催化轉(zhuǎn)化液中分離尿苷酸的方法，其特征在于步驟(4) 中，所述的陰離子交換柱中充填有陰離子交換樹脂，該樹脂以聚苯乙烯或聚丙烯酸為骨 架，以伯胺基、仲胺基或叔胺基為功能基團(tuán)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從生物催化轉(zhuǎn)化液中分離尿苷酸的方法，其特征在于步驟 (4)中，將步驟(3)得到的納濾濃縮液稀釋到尿苷酸濃度為10 15g/L，調(diào)節(jié)pH值至2. 0 4. 0 ;進(jìn)入陰離子交換柱吸附，吸附流速為1. 5 2. 5BV/h，陰離子交換柱高徑比為8 12 : 1 ;再用去離子水進(jìn)行洗雜，去離子水體積為3 4BV;最后用無機(jī)鹽溶液進(jìn)行洗脫，無 機(jī)鹽濃度為0. 05 0. 5mol/L，洗脫流速為1. 5 2. 5BV/h。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的從生物催化轉(zhuǎn)化液中分離尿苷酸的方法，其特征在于步 驟(4)中，用無機(jī)鹽溶液進(jìn)行洗脫，所述的無機(jī)鹽為CaCl2、 NaCl、 NH4C1和KC1中的任意一 種或幾種。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的從生物催化轉(zhuǎn)化液中分離尿苷酸的方法，其特征在于步 驟(4)中，無機(jī)鹽溶液中加入了乙醇，可以提高UMP的純度，乙醇加入量為無機(jī)鹽溶液體積 的1 10%。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的從生物催化轉(zhuǎn)化液中分離尿苷酸的方法，其特征在于步 驟(5)中，所述的結(jié)晶，結(jié)晶母液中UMP濃度為50 150g/L，結(jié)晶溫度為10 4(TC，攪拌 速率為30 200r/min，流加乙醇體積為結(jié)晶母液的1 5倍。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從生物催化轉(zhuǎn)化液中分離尿苷酸(UMP)的方法，該方法將生物催化轉(zhuǎn)化液經(jīng)離心、超濾、納濾處理后，進(jìn)入陰離子交換柱進(jìn)行吸附，去離子水洗雜，無機(jī)鹽溶液洗脫，洗脫液經(jīng)納濾處理除鹽濃縮、結(jié)晶、干燥后得到高收率、高純度的尿苷酸二鈉晶體。分離總收率最高可達(dá)90％以上，純度達(dá)98％。該方法具有樹脂用量少、成本低、收率高、分離效果好、所得產(chǎn)品純度高、可以適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)等優(yōu)點。
文檔編號C07H19/10GK101781346SQ20101012124
公開日2010年7月21日 申請日期2010年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月10日
發(fā)明者周熙群, 應(yīng)漢杰, 柏建新, 沈素芹, 熊健, 苑巍, 金乃純 申請人:南京工業(yè)大學(xué);南京同凱兆業(yè)生物技術(shù)有限責(zé)任公司