專利名稱：苯基取代的三唑及其作為選擇性alk5激酶抑制劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及苯基取代的三唑，該三唑為轉(zhuǎn)化生長因子(″TGF″)-β信號通道的抑制劑，特別是I型或活化素樣激酶(″ALK″)-5受體對smad2或smad3磷酸化的抑制劑，其制備方法，以及其醫(yī)學應用。
TGF-β1為包括TGF-β、活化素、抑制素、骨形成蛋白及Müllerian抑制物質(zhì)的細胞因子家族的原型成員，其信號經(jīng)由一族單層跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體轉(zhuǎn)導。這些受體可分為兩類，I型或活化素樣激酶(ALK)受體及II型受體。ALK受體與II型受體的區(qū)別在于ALK受體(a)缺乏富含絲氨酸/蘇氨酸的細胞內(nèi)尾部，(b)具有絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，I型受體之間該結(jié)構(gòu)域高度同源及(c)擁有稱為GS結(jié)構(gòu)域的共同基序，該序列由富含甘氨酸及絲氨酸殘基的區(qū)域組成。GS結(jié)構(gòu)域位于細胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域的氨基端，對由II型受體引起的激活非常關(guān)鍵。數(shù)項研究表明TGF-β的信號轉(zhuǎn)導同時需要ALK及II型受體。具體而言，II型受體在TGF-β的存在下磷酸化TGF-β的I型受體-ALK5的GS結(jié)構(gòu)域。ALK5隨后磷酸化位于細胞質(zhì)的蛋白質(zhì)smad2及smad3的兩個羧基端絲氨酸。一般而言，據(jù)信在許多物種中，II型受體調(diào)節(jié)細胞增殖及I型受體調(diào)節(jié)基質(zhì)生成。因而，本發(fā)明優(yōu)選的化合物可選擇性地抑制I型受體，進而抑制基質(zhì)生成，而不影響II型受體介導的增殖。
TGF-β1軸的活化及細胞外基質(zhì)的擴張為慢性腎病及血管疾病發(fā)生發(fā)展的早期及持續(xù)性因素。Border W.A.，Noble N.A.，N.Engl.J.Med.，Nov.10，1994；331(19)1286-92。此外，通過TGF-β1受體ALK5對smad3的磷酸化作用，TGF-β1在形成纖維連接蛋白、血纖維蛋白溶酶原激活因子抑制劑-1，鞏膜沉積物的成分的形成中發(fā)揮作用。Zhang Y.，F(xiàn)eng X.H.，Derynck R.，Nature，Aug.27，1998；394(6696)909-13；Usui T.，Takase M.，Kaji Y.，SuzukiK.，Ishida K.，Tsuru T.，Miyata K.，Kawabata M.，Yamashita H.，Invest.Ophthalmol. Vis.Sci.，Oct.1998；39(11)1981-9。
腎臟及心血管系統(tǒng)的進行性纖維化是罹病及死亡主要原因，也是醫(yī)療成本增加的重要原因。TGF-β1與許多腎臟纖維化疾病有關(guān)。Border W.A.，Noble N.A.，N.Engl.J.Med.，Nov 10，1994；331(19)1286-92。TGF-β1在下述疾病中升高急慢性腎小球腎炎，Yoshioka K.，Takemura T.，Murakami K.，Okada M.，Hino S.，Miyamoto H.，Maki S.，Lab.Invest.，F(xiàn)eb.1993；68(2)154-63，糖尿病腎病，Yamamoto，T.，Nakamura，T.，Noble，N.A.，Ruoslahti，E.，Border，W.A.，(1993) PNAS 901814-1818，同種異體移植物排斥，HIV腎病及血管緊張素誘導的腎病，Border W.A.，Noble N.A.，N.Engl.J.Med，Nov.10，1994；331(19)1286-92。在這些疾病中，TGF-β1的表達水平與細胞外基質(zhì)的生成是一致的。三方面的證據(jù)表明了TGF-β1與基質(zhì)生成的因果關(guān)系。第一，在體外，外源性TGF-β1可誘導正常的腎小球、腎小球系膜細胞及非腎細胞生成細胞外基質(zhì)蛋白，并抑制蛋白酶的活性。第二，對抗TGF-β1抗體的中和可阻止患腎病大鼠細胞外基質(zhì)的累積。第三，TGF-β1轉(zhuǎn)基因小鼠或?qū)GF-β1基因轉(zhuǎn)染入正常大鼠腎臟內(nèi)將導致腎小球硬化的快速產(chǎn)生。KoppJ.B.，F(xiàn)actor VM.，Mozes M.，Nagy P.，Sanderson N.，Bottinger E.P.，KlotmanP.E.，Thorgeirsson S.S.，Lab Invest，June 1996；74(6)991-1003。因而，抑制TGF-β1的活性被視為慢性腎病的一種治療措施。
TGF-β1及其受體水平在損傷血管壁中增加，并在氣囊血管成形術(shù)后的新內(nèi)膜形成中得到體現(xiàn)。Saltis J.，Agrotis A.，Bobik A.，Clin Exp PharmacolPhysiol，Mar.1996；23(3)193-200。此外，TGF-β1為平滑肌細胞(″SMC″)體外遷徙的強大促進因素，并且SMC在動脈壁上的遷徙促進了動脈粥樣硬化及瓣膜術(shù)后再狹窄的病理進程。此外，在內(nèi)皮細胞產(chǎn)物與總膽固醇關(guān)系的多變量分析中，TGF-β受體ALK5與總膽固醇相關(guān)(P＜0.001)，Blann A.D.，Wang J.M.，Wilson P.B.，Kumar S.，Atherosclerosi，F(xiàn)eb.1996；120(1-2)221-6。此外，源自人動脈粥樣硬化損傷的SMC具有升高的ALK5/TGF-β的II型受體的比例。由于TGF-β1在纖維增生的血管損傷中過度表達，受體不同的細胞將以一種緩慢但不可控的方式生長，同時生成過量的細胞外基質(zhì)成分，McCaffrey T.A.，Consigli S.，Du B.，F(xiàn)alcone D.J.，Sanborn T.A.，Spokojny A.M.，Bush H.L.，Jr.，J Clin Invest，Dec.1995；96(6)2667-75。TGF-β1被免疫聚集到活性基質(zhì)合成的動脈粥樣硬化損傷的非泡沫狀巨噬細胞，表明在動脈粥樣硬化重構(gòu)過程中，非泡沫狀巨噬細胞可能以TGF-β依賴性的機制參與調(diào)節(jié)基質(zhì)基因的表達。因而，在動脈粥樣硬化及再狹窄中，也體現(xiàn)了抑制TGF-β1對ALK5的作用。
TGF-β也體現(xiàn)在損傷修復中。在一些模型上使用中和TGF-β1的抗體表明，在痊愈過程中通過限制過度的疤痕形成，抑制TGF-β1的信號轉(zhuǎn)導對損傷后功能的恢復是有益的。例如，在大鼠中，中和TGF-β1及TGF-β2的抗體減少了疤痕形成，改善了新皮細胞結(jié)構(gòu)，該過程是通過降低單核細胞及巨噬細胞的數(shù)量，同時降低表皮纖維連接蛋白及膠原沉積實現(xiàn)的，Shah M.，J.Cell.Sci.，1995，108，985-1002。此外，TGF-β抗體也促進了兔角膜損傷的痊愈，Moller-Pedersen T.，Curr.Eye Res.，1998，17，736-747，促進了大鼠胃潰瘍損傷的愈合，Ernst H.，Gut，1996，39，172-175。這些信息強烈地表明，在許多組織中限制TGF-β的活性將是有益的，同時也表明，在任何伴有長期TGF-β升高的疾病中，通過抑制smad2及smad3的信號轉(zhuǎn)導通道將是有益的。
TGF-β也體現(xiàn)在腹膜粘連上，Saed G.M.，et al，Wound Repair Regeneration，1999 Nov-Dec，7(6)，504-510。ALK5抑制劑將有助于防治外科手術(shù)后的腹膜及皮下纖維化粘連。
TGFβ1-抗體可防止移植于裸鼠腎腫瘤的生長，該過程的機制據(jù)認為是抗血管生成，Ananth，et al，Journal Of The American Society Of NephrologyAbstract，9433A(Abstract)。然而，腫瘤自身對TGF-β并不敏感，是腫瘤周圍組織對TGF-β敏感并通過分泌TGF-β的腫瘤促新血管的生成支持腫瘤的生長。因而，拮抗TGF-β通道應當可以阻止腫瘤的轉(zhuǎn)移以降低癌癥的風險。
令人吃驚的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一類苯基取代的三唑，其為ALK5激酶的選擇性非肽類強抑制劑，因而，其可用于防治各種經(jīng)由ALK5機制介導的疾病，如慢性腎病、急性腎病、創(chuàng)傷愈合、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、腎病、充血性心力衰竭、潰瘍、眼病、角膜損傷、糖尿病型腎病、神經(jīng)機能受損、阿耳茨海默氏病、動脈粥樣硬化、腹膜及皮下粘連、任何以纖維化為主要特征的疾病，包括但不限于肺纖維化、肝纖維化及再狹窄。
以纖維化為主要特征的疾病的實例，包括但不限于乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、酒精誘導的肝炎、血色素沉著病及原發(fā)性膽汁性硬化。
本發(fā)明提供了式(I)的化合物或其可藥用鹽
其中R1為萘基或苯基，其任選被一或多個選自鹵素、-O-C1-6烷基、-S-C1-6烷基、C1-6烷基、C1-6鹵代烷基、-O-(CH2)n-Ph、-S-(CH2)n-Ph、氰基、苯基及CO2R的取代基取代，其中R為氫原子或C1-6烷基，n為0、1、2或3；或R1為與5-7員的芳香環(huán)或非芳香環(huán)相稠合的苯基或吡啶基，其中，該環(huán)系任選包含多達3個雜原子，該雜原子獨立地選自N、O及S，且N可進一步任選被C1-6烷基取代，及其中環(huán)系可任選被＝O取代；R2及R3獨立地選自H、C1-6烷基、C1-6烷氧基、苯基、NH(CH2)n-Ph、NH-C1-6烷基、鹵素、CN、NO2、CONHR及SO2NHR；X1、X2及X3中的兩個為N，另一個為NR4，其中R4為氫原子、C1-6烷基、C3-7環(huán)烷基、-(CH2)p-CN、-(CH2)p-CO2H、-(CH2)p-CONHR5R6、-(CH2)pCOR5、-(CH2)q(OR7)2、-(CH2)pOR5、-(CH2)q-CH＝CH-CN、-(CH2)q-CH＝CH-CO2H、-(CH2)p-CH＝CH-CONHR5R6、-(CH2)pNHCOR8或-(CH2)pNR9R10；R5及R6獨立地為氫原子或C1-6烷基；R7為C1-6烷基；R8為C1-7烷基，或任選取代的芳基、雜芳基、芳基C1-6烷基或雜芳基C1-6烷基；R9及R10獨立地選自氫原子、C1-6烷基、芳基及芳基C1-6烷基；p為0-4；及q為1-4。
在式(I)化合物的三唑環(huán)中，很明顯，雙鍵應在兩個未取代的氮原子處。
當R1為與5-7員的芳香環(huán)或非芳香環(huán)相稠合的吡啶基時，吡啶環(huán)的氮原子可處于稠合點。優(yōu)選地，R1為任選取代的萘基或苯基。更優(yōu)選地，R1為任選被一或多個選自鹵素、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基及苯基取代的苯基；或R1為與5-7員的芳香環(huán)或非芳香環(huán)相稠合的苯基或吡啶基，其中，該環(huán)系任選包含多達3個雜原子，該雜原子獨立地選自N、O及S，且N可進一步任選被C1-6烷基取代，及其中的環(huán)系可任選被＝O取代；例如R1表示苯并[1，3]二氧環(huán)戊烯基、2，3-二氫苯并[1，4]二氧雜環(huán)己烯基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并[1，2，5]噁二唑基、苯并[1，2，5]噻二唑基、喹噁啉基、二氫苯并呋喃基、苯并咪唑基、C1-6烷基苯并咪唑基、[1，2，4]三唑并[1，5-a]吡啶基、苯并[1，4]噁嗪-3-酮、苯并噁唑基-2-酮或苯并[1，4]噁嗪。最優(yōu)選地，R1表示4-甲氧苯基、3-氟-4-甲氧苯基、3-氯苯基、3-氟-4-甲氧苯基或3-氯-4-甲氧苯基、或R1表示苯并[1，2，5]噻二唑基、[1，2，4]三唑并[1，5-a]吡啶基、二氫苯并呋喃基、2，3-二氫苯并[1，4]二氧雜環(huán)己烯基、苯并咪唑基、C1-6烷基苯并咪唑基、苯并[1，4]噁嗪-3-酮或苯并[1，4]噁嗪基。
優(yōu)選地，R2位于與三唑連接點的間位，R2優(yōu)選為鹵素，例如氯，C1-6烷基或NO2。更優(yōu)選地，R2為鹵素。
R3優(yōu)選為氫原子或鹵素。
優(yōu)選地，本發(fā)明方法應用的化合物分子量小于800，更優(yōu)選地，小于600。
本發(fā)明可能提及的具體化合物包括下列化合物及其可藥用鹽6-[5-(3-氯苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶；6-[5-(3-氟苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶；6-[5-(3-硝基苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶；6-[5-(3-甲基苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶；6-[5-(4-氯苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶；6-[5-(4-氟苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶；6-[5-(4-甲基苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶；6-[5-(3，4-二氟苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶；6-[5-(2-氯苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶；6-[5-(3-氯苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-4H-苯并[1，4]噁嗪-3-酮；5-[5-(3-氯苯基)-2H-[1，2，3]-三唑-4-基]-苯并[1，2，5]噻二唑；5-[5-(3-氟苯基)-2H-[1，2，3]-三唑-4-基]-苯并[1，2，5]噻二唑；5-[5-(3-溴苯基)-2H-[1，2，3]-三唑-4-基]-苯并[1，2，5]噻二唑；4-(3-氯苯基)-5-(4-甲氧苯基)-2H-[1，2，3]三唑；4-(3-氟苯基)-5-(4-甲氧苯基)-2H-[1，2，3]三唑；4-(3-氯苯基)-5-(3-氟-4-甲氧苯基)-2H-[1，2，3]三唑；4-(3-氟苯基)-5-(3-氟-4-甲氧苯基)-2H-[1，2，3]三唑；
6-[5-(3-氯苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-1-甲基-1H-苯并咪唑；4-(3-氯苯基)-5-(3-氯-4-甲氧苯基)-2H-[1，2，3]三唑；及4-(3-氟苯基)-5-(3-氯-4-甲氧苯基)-2H-[1，2，3]三唑。
式(I)化合物合適的可藥用鹽包括但不限于無機酸鹽，如鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、二磷酸鹽、氫溴酸鹽及硝酸鹽，包括有機酸鹽，如蘋果酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、棕櫚酸鹽、水楊酸鹽及硬脂酸鹽。
本發(fā)明一些化合物可經(jīng)水或有機溶劑結(jié)晶或重結(jié)晶。有時可能形成溶劑合物。在此范圍內(nèi)，本發(fā)明包括化學計量的溶劑合物，包括水合物以及諸如冷凍干燥過程中形成的包含不定量水的化合物。
式(I)一些化合物可以光學異構(gòu)體的形式存在，例如非對映異構(gòu)體以及各種比率的異構(gòu)體混合物，例如消旋混合物。本發(fā)明包括所有這些形式，尤其包括純凈的異構(gòu)體形式。不同異構(gòu)體形式可以常用的方法將彼此分離或拆分，或任何既定異構(gòu)體可以常用的合成方法或以立體定向合成方法或以不對稱合成方法得到。
由于式(I)化合物欲用于藥物組合物，易于理解它們都應該達到基本純凈的形式，例如純度至少為60％，更優(yōu)選至少75％，及優(yōu)選至少85％，尤其至少98％(％為重量百分含量)。制備的不純化合物可用于制備用于藥物組合物的更純凈形式；這些不純化合物應當包含至少1％，更優(yōu)選至少5％及優(yōu)選至少10％的式(I)化合物或其可藥用鹽。
此處使用的術(shù)語″C1-6烷基″，無論是其自身或為較大基團的一部分，例如C1-6烷氧基，指1～6碳原子的直鏈或支鏈基團，除鏈長另有限制，包括但不限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基及叔丁基。
C1-6鹵代烷基可包括一或多個鹵原子，尤其C1-6鹵烷基，可提及一個具體實例為CF3。
此處使用的術(shù)語″鹵″或″鹵素″均指由鹵原子氯、氟、碘，溴衍生的基團。
此處使用的術(shù)語″環(huán)烷基″指環(huán)狀基團，優(yōu)選包含3～7個碳，包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)戊基及環(huán)己基。
此處使用的術(shù)語″ALK5抑制劑″指一種化合物，并非指抑制性的smads，例如smad6及smad7，與抑制p38或II型受體相比其更優(yōu)選地選擇性地抑制ALK5受體。
此處使用的術(shù)語″ALK5介導的疾病″指任何由ALK5介導(或調(diào)節(jié))的疾病狀態(tài)，例如通過抑制TGF-β1信號轉(zhuǎn)導通道中的smad2/3的磷酸化而調(diào)節(jié)的疾病。
此處使用的術(shù)語″潰瘍″包括但不限于糖尿病潰瘍、慢性潰瘍、胃潰瘍及十二指腸潰瘍。
式(I)化合物可以本技術(shù)領(lǐng)域公認地工藝方法由已知的或商品化的起始原料制備。若起始原料無法購得，可由此處所述的方法合成或由已知工藝制備。
具體而言，式(I)化合物的制備如方案1所示在碘化亞銅的存在下，使用鈀催化劑將芳基溴(I)與三甲基甲硅烷基乙炔偶合，然后堿性條件下用碳酸鉀消除三甲基硅基，將未保護的末端乙炔(II)在鈀催化下與溴苯(III)反應。將生成的二取代乙炔(IV)以三甲基疊氮硅烷處理得到三唑(V)，其可在碳酸鉀存在條件下被合適的烷基化試劑L-R3烷基化，其中L為離去基團，如I。所得的異構(gòu)體可以層析的方法分離。
方案1 制備式(I)化合物的細節(jié)見實施例。
在制備化合物(I)的過程中，中間體的活潑官能團，例如羥基、羧基及氨基應當被保護。各種活潑官能團的保護方法及最終保護的衍生物的保護基的離去方法的詳細討論可參見如Protective Groups in OrganicChemistry，T.W.Greene及P.G.M.Wut，(Wiley-Interscience，New York，2ndedition，1991)。
式(I)化合物可以單獨制備或制備成至少包括2個化合物，如5～1,000化合物的化合物庫，更優(yōu)選包括10～100個式(I)的化合物。式(I)化合物庫可以組合的分離及混合(′split及mix′)方法，或以多重平行的液相或固相化學合成的方法，利用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)進行制備。
因而，本發(fā)明另一方面提供了包括至少2個式(I)化合物或其可藥用鹽的化合物庫。
本發(fā)明另一方面提供了一種治療哺乳動物中由ALK5受體介導的疾病的方法，包括向需要接受此種治療的哺乳動物使用有效量的式(I)化合物或其可藥用鹽。
本發(fā)明另一方面提供了一種用于治療的式(I)化合物或其可藥用鹽。
本發(fā)明另一方面提供了式(I)化合物或其可藥用鹽在用于制備治療哺乳動物中由ALK5受體介導的疾病的藥物中的用途。
ALK5機制介導的疾病，包括但不限于慢性腎病、急性腎病、創(chuàng)傷愈合、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、腎病、充血性心力衰竭、潰瘍、眼病、角膜損傷、糖尿病型腎病、神經(jīng)機能受損、阿耳茨海默氏病、動脈粥樣硬化、腹膜及皮下粘連、任何以纖維化為主要特征的疾病，包括但不限于肺纖維化、肝纖維化、例如乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、酒精誘導的肝炎、血色素沉著病及原發(fā)性膽汁性硬化及再狹窄。
術(shù)語“治療”指預防新或治療性治療。
本發(fā)明另一方面提供了一種抑制哺乳動物TGF-β信號轉(zhuǎn)導通道的方法，例如抑制以I型或活化素樣激酶ALK-5受體介導的smad2或smad3的磷酸化，該方法包括向需要接受此種治療的哺乳動物使用有效量的式(I)化合物或其可藥用鹽。
本發(fā)明另一方面提供了一種通過抑制哺乳動物TGF-β信號轉(zhuǎn)導通道抑制基質(zhì)形成的方法，例如抑制以I型或活化素樣激酶ALK-5受體介導的smad2或smad3的磷酸化，該方法包括向需要接受此種治療的哺乳動物使用有效量的式(I)化合物或其可藥用鹽。
式(I)化合物及可藥用鹽可以常用劑型施用，該劑型的制備方法為根據(jù)本領(lǐng)域熟知的常用方法，將式(I)化合物與標準的藥學載體或稀釋劑相組合。這些方法包括混合、制粒及壓制或?qū)⒑线m的成分溶解以制備理想制劑。
本發(fā)明另一方面提供了一種包括式(I)化合物或其可藥用鹽及可藥用載體或稀釋劑的藥物組合物。
本發(fā)明的藥物組合物可配制成適合以任何途徑向包括人的哺乳動物給藥的形式，并包括適于口服、局部或胃腸外給藥的形式。
本發(fā)明的組合物可以制成片劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、錠劑、乳膏劑或液體制劑，如口服、無菌的胃腸外給藥的溶液或懸液。
本發(fā)明局部使用的制劑可以是諸如軟膏劑、乳膏劑或洗液、眼膏、滴眼液或滴耳液、浸漬敷料及氣霧劑，并可包含適當?shù)某Ｓ锰砑觿绶栏瘎?，藥物穿透促進劑及膏劑和乳劑中使用的潤滑劑。
制劑也可包含一些可合用的常用載體，如乳劑或膏劑基質(zhì)，用于洗液的乙醇或油醇。這些載體的比例為制劑的1％～98％，更常為約80％。
口服使用的片劑及膠囊劑可制成單位劑量的給藥形式，可包含常用的輔料，如粘合劑，如糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨醇、黃芪膠或聚乙烯吡咯烷酮；填充劑，如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、磷酸鈣、山梨醇或甘氨酸；制片潤滑劑，如硬脂酸鎂、滑石粉、聚乙二醇或硅石；崩解劑，如馬鈴薯淀粉；或可接受的潤濕劑，如十二烷基磺酸鈉。片劑可按照正常的熟知的制藥方法包衣。口服液體制劑可制成諸如水或油的懸液、溶液、乳液、糖漿劑或酏劑形式，或制成干燥產(chǎn)品，用前以水或其它合適的介質(zhì)重構(gòu)。這些液體制劑可包含常用的添加劑，如助懸劑，如山梨醇、甲基纖維素、葡萄糖糖漿、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑，如卵磷脂、單油酸山梨聚糖或阿拉伯膠；非水介質(zhì)(可包括食用油)，如杏仁油、油脂如甘油、丙二醇或乙二醇；防腐劑，如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸，及必要時可加入常用的矯味劑或著色劑。
栓劑包括常用的栓劑基質(zhì)、如可可豆油或其它甘油酯。
不經(jīng)腸胃給藥的制劑，使用化合物及無菌介質(zhì)，優(yōu)選以水制成流體單位劑型。視使用的基質(zhì)及濃度，化合物可混懸或溶解于介質(zhì)里。制備溶液時，將化合物溶解于注射水中，在裝瓶或安培及封口前，過濾除菌。
有利地，諸如局部麻醉劑、防腐劑及緩沖劑能夠溶于介質(zhì)中。為了提高穩(wěn)定度，組合物裝瓶后冷凍，再于真空下除去水分，然后將冷凍干燥的粉末封裝，附帶一瓶注射用水用于使用前的液體的配制。胃腸外給藥的懸液的制備基本相同，除化合物是混懸在介質(zhì)中而不是溶解于其中，且不能過濾除菌。這些化合物的滅菌可在將其混懸于無菌介質(zhì)前將其暴露于環(huán)氧乙烷氛圍處理。有利地，組合物包含表面活性劑或潤濕劑以有利于化合物的均勻分散。
視不同給藥方法，組合物可包含0.1％重量，優(yōu)選10-60％重量的活性物質(zhì)。此處組合物包含單位劑量，每個劑量單位優(yōu)選包括50-500mg的活性物質(zhì)。用于成人治療的劑量優(yōu)選每天100～3000mg，例如視給藥途徑及給藥頻率每天1500mg。該劑量相當于每天1.5～50mg/kg。合適的劑量范圍為每天5～20mg/kg。
本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員應當明白式(I)化合物的最佳質(zhì)量及單次給藥間隔將視不同的疾病及嚴重程度、制劑、給藥途徑及部位、具體受治的哺乳動物而定，并且通過常規(guī)技術(shù)決定這些最佳值。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員也應當明白，最佳療程即式(I)化合物在既定時間內(nèi)每日的給藥次數(shù)可經(jīng)該領(lǐng)域熟練療程規(guī)范的技術(shù)人員利用常規(guī)的療程決定測試確定。
當式(I)化合物或其可藥用衍生物在上述劑量范圍內(nèi)使用時，無毒理學現(xiàn)象產(chǎn)生。
所有出版物，包括但不限于本說明書引用的專利及專利申請，其在此處引入作為參考，一如各自單獨具體引入此處作為參考一樣公開充分。
下列實施例僅用于闡釋本發(fā)明，不能從任何方面限制本發(fā)明的范圍。在實施例中，質(zhì)譜利用帶有化學電離(CI)技術(shù)的Hitachi Perkin-ElmerRMU-6E以及帶有電噴霧質(zhì)譜(ES)技術(shù)的Micromass Platform II進行測定。
簡寫CuI 碘化亞銅DMF 二甲基甲酰胺EtOAc乙酸乙酯MgSO4硫酸鎂NaHCO3碳酸氫鈉Na2SO4硫酸鈉Pd(PPh3)4四(三苯基磷)鈀(O)THF 四氫呋喃TMEDA 四甲基乙二胺制備1N＇-(5-溴-2-氨基吡啶)-N，N-二甲基甲脒
在氬氣保護下，將5-溴-2-氨基吡啶(9.8g，56.6mmol，1當量)溶于干燥DMF(20ml)及二甲基甲酰胺二甲基縮醛(20ml)溶液中。將溶液于130℃下回流16小時，冷卻后除去溶劑。所得粗品不經(jīng)純化直接用于下一步；m/z[APCIMS]228.0/230.0[M+H]+。
制備26-溴-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶 在氬氣保護下，將N＇-(5-溴-2-氨基吡啶)-N，N-二甲基甲脒(16.2g，～56.6mmol，1當量)溶于甲醇(90ml)及吡啶(10ml)混合溶液中，冷卻至0℃。攪拌下，加入羥胺-O-磺酸(7.3g，75.2mmol，1.3當量)得紫色溶液。升至室溫，攪拌16小時。除去溶劑后，將所得粗品懸于碳酸氫鈉水溶液(200ml)中，以乙酸乙酯萃取(2×200ml)。有機層以水和食鹽水(各100ml)洗滌后干燥(MgSO4)，除去溶劑。以硅膠快速層析純化，梯度洗脫初始洗脫比例為40-60℃石油醚乙酸乙酯2∶1～直至40-60℃石油醚乙酸乙酯1∶1洗脫得淡黃色固體(5g，44.6％)；1H NMR(250MHz；CDCl3)δ8.77(1H，s)，8.34(1H，s)，7.69(1H，d)，7.65(1H，d)；m/z[APCIMS]198.0/200.0[M+H]+。
制備36-三甲基甲硅烷基乙炔基-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶 將6-溴-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶(5g，25.26mmol，1當量)溶于THF(50ml)種，向溶液中充氬氣5分鐘。加入碘化亞銅(0.46g，2.53mmol，0.1當量)、二氯雙(三苯基)膦(0.36g，0.51mmol，0.02當量)，及三甲基甲硅烷基乙炔(7.14ml，4.96g，50.52mmol，2當量)。滴加入二異丙胺(6.78ml，5.1g，50.52mmol，2當量)，將所得深紅色懸液于氬氣下攪拌24小時。以硅藻土過濾，以大量乙酸乙酯洗滌，除去溶劑。將所得粗品懸于水(200ml)中，以乙酸乙酯萃取(2×200ml)，合并有機層，水和食鹽水洗(各100ml)，干燥(MgSO4)，除去溶劑。以硅膠快速層析純化，3∶1的40-60℃石油醚∶乙酸乙酯洗脫得淡黃色固體(2.9g，53.3％)。1HNMR(400MHz；CDCl3)δ8.72(1H，s)，8.36(1H，s)，7.69(1H，d)，7.54，(1H，d)，0.28(9H，s)；m/z[APCIMS]216[M+H]+。
制備46-乙炔基-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶 將6-三甲基甲硅烷基乙炔基-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶(2.9g，13.47mmol，1當量)溶于甲醇中，然后加入碳酸鉀(5.6g，40.4mmol，3當量)。將懸液攪拌2小時，除去溶劑。將粗品懸于水(100ml)中，以乙酸乙酯(2×100ml)萃取。合并有機層，分別以水及食鹽水(各50ml)洗滌，干燥(MgSO4)，除去溶劑得呈微桔紅色的固體(1.8g，95％)，不用純化直接用于下一步反應。m/z[APCIMS]144.1[M+H]+。
制備56-(3-氯苯基乙炔基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶 在攪拌條件下，將6-乙炔基-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶(693mg，4.846mmol)的TMEDA(15ml)及THF(15ml)溶液以氬氣脫氣。加入Pd(PPh3)4(0.253mg，0.219mmol，0.05當量)、CuI(100mg，0.524mmol，0.1當量)及3-氯碘苯(2.311g，9.69mmol，2當量)。在氬氣條件下，升溫至50℃反應16小時。真空除去溶劑，將粗品在乙酸乙酯(3×70ml)與飽和的NaHCO3水溶液(70ml)之間分配。合并乙酸乙酯層，干燥(Na2SO4)，過濾，減壓濃縮至干。硅膠層析純化，以比例為(4∶6)的乙酸乙酯∶石油溶劑洗脫得(824mg，67％)黃色固體；CIMS254.1[M+H]+。
制備65-溴苯并[1，2，5]噻二唑 向4-溴苯-1，2-二胺(17g，91mmol)中加入氯化亞砜(200ml)。然后加入一滴DMF。氬氣保護下升溫至80℃，回流反應過夜。將反應液冷卻至室溫，并分批加入到裝有在大燒杯中的冰中并以固體碳酸鉀中和。將混合物在乙酸乙酯與水溶液中分配。合并乙酸乙酯層，干燥(MgSO4)，減壓濃縮除去溶劑。目標化合物以硅膠層析分離，以比例為90％乙酸乙酯/10％甲醇洗脫得(12g，62％)。1HNMR(250MHz，CDCl3)δ7.61(1H，dd，J＝9，2Hz)，7.82(1H，d，J＝9Hz)，8.16(1H，s)。
制備7(4-溴-2-硝基苯氧基)乙酸乙酯 室溫攪拌下，向4-溴-2-硝基酚(3.71g，17.0mmol，1.0當量)的DMF(80ml)溶液中加入K2CO3(4.70g，34.0mmol，2.0當量)固體。將混合物在40℃加熱3小時，冷卻至室溫后在EtOAc和水中分配。水相以乙酸乙酯多次萃取，并將合并的有機層，分別以水及食鹽水洗滌，干燥(MgSO4)。濃縮得到黃色固體(5.01g，97％)，無需純化直接用于下一步。1HNMR(250MHz；CDCl3)δ8.00(1H，d)，7.62(1H，dd)，6.90(1H，d)，4.76(H，s)，4.26(2H，q)，1.29(3H，t)。
制備86-溴-4H-苯并[1，4]噁嗪-3-酮 室溫攪拌條件下，向(4-溴-2-硝基苯氧基)乙酸乙酯(4.01g，13.2mmol，1.0當量)的冰乙酸(70ml)溶液中加入鐵粉(14.70g，264.0mmol，20.0當量)。將混合物于60℃劇烈攪拌4小時后，冷卻至室溫。將混合物濾過Kieselguhr墊，乙酸乙酯洗滌，將溶液濃縮至干。將殘留物在乙酸乙酯(3×70ml)與飽和的NaHCO3水溶液(70ml)中分配。水相以乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯層，水洗、干燥(MgSO4)，濃縮得白色的目標化合物(2.90g，97％)，無需純化直接用于下一步反應。1HNMR(250MHz；CDCl3)δ10.79(1H，br.s)7.09-7.01(2H，m)，6.91(1H，d)，4.59(2H，s)。
實施例實施例16-[5-(3-氯苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶
在氬氣保護條件下，以疊氮三甲基硅烷(0.32ml，2.42mmol)處理攪拌的6-(3-氯苯基乙炔基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶(制備5)(205mg，0.807mmol)的DMF(1.1ml)溶液，并在130℃加熱9小時。真空濃縮除去DMF，并將混合物在EtOAc和食鹽水中分配。乙酸乙酯層經(jīng)干燥(Na2SO4)，過濾，濃縮至干。殘留物以硅膠層析純化，以比例為(2∶1)的石油溶劑∶乙酸乙酯至乙酸乙酯洗脫得類白色固體(83mg，35％)。1HNMR(250MHz；CDCl3)δ8.97(1H，S)，8.42(1H，s)，7.84(1H，d)，7.74(1H，dd)，7.62(1H，d)，7.46(3H，m)；沒有觀察到NH；m/z[ESMS]297[M+H]+。
實施例26-[5-(3-氟苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶 使用實施例1類似的方法，以6-(3-氟苯基乙炔基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶(171mg，0.722mmol)制備得到目標化合物。1HNMR(400MHz；d6-DMSO，游離堿)δ15.49(NH，br.s)，9.03(1H，s)，8.57(1H，s)，7.93(1H，d)，7.70(1H，d)，7.48-7.27(4H，m)；m/z[ESMS]281[M+H]+。
實施例36-[5-(3-硝基苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶 使用實施例1類似的方法，以6-(3-硝基苯基乙炔基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶(213mg，0.807mmol)制備得到目標化合物。1HNMR(400MHz；d6-DMSO，游離堿)δ15.74(NH，br.s)，9.15(1H，s)，8.59(1H，s)，8.40(1H，s)，8.27(1H，d)，7.95(2H，br.s)，7.73(2H，br.s)；m/z[ESMS]308[M+H]+。
實施例46-[5-(3-甲基苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶 使用實施例1類似的方法，以6-(3-甲基苯基乙炔基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶(188mg，0.805mmol)制備得到目標化合物。1HNMR(250MHz，CDCl3，游離堿)δ9.16(1H，s)，8.43(1H，s)，7.79(2H，d)，7.41-7.28(4H，m)，2.38(3H，s)；沒有觀察到NH；m/z[ESMS]277[M+H]+。
實施例56-[5-(4-氯苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶 使用實施例1類似的方法，以6-(4-氯苯基乙炔基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶(102mg，0.40mmol)制備得到目標化合物。1HNMR(250MHz；CD3OD，游離堿)δ8.83(1H，s)，8.35(1H，s)，7.73(1H，d)，7.69(1H，d)，7.45(2H，d)，7.36(2H，d)，沒有觀察到NH；[ESMS]297[M+H]+。
實施例66-[5-(4-氟苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶
使用實施例1類似的方法，以6-(4-氟苯基乙炔基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶(195mg，0.821mmol)制備得到目標化合物。1HNMR(400MHz；CDCl3，游離堿)δ13.45(NH，br.s)，9.12(1H，s)，8.44(1H，s)，7.83(1H，d)，7.74(1H，d)，7.57-7.51(2H，m)7.17-7.10(2H，m)；m/z[ESMS]281[M+H]+。
實施例76-[5-(4-甲基苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶 使用實施例1類似的方法，以6-(4-甲基苯基乙炔基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶(180mg，0.773mmol)制備得到目標化合物。1HNMR(400MHz；DMSO，游離堿)δ15.33(NH，br.s)，8.97(1H，s)，8.54(1H，s)，7.91(1H，d)，7.70(1H，d)，7.44(2H，d)7.27(2H，br.s)，2.45(3H，s)；m/z[ESMS]277[M+H]+。
實施例86-[5-(3，4-二氟苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶 使用實施例1類似的方法，以6-(3，4-二氟苯基乙炔基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶(139mg，0.545mmol)制備得到目標化合物。1HNMR(250MHz；CDCl3，游離堿)δ9.01(1H，s)，8.43(1H，s)，7.83(1H，d)，7.70(1H，d)，7.49-7.40(1H，m)，7.19-7.30(2H，m)，沒有觀察到NH；m/z[ESMS]299[M+H]+。
實施例96-[5-(2-氯苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶
使用實施例1類似的方法，以6-(2-氯苯基乙炔基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶(189mg，0.746mmol)制備得到目標化合物。1HNMR(400MHz；d6-DMSO，游離堿)δ15.63(1H，br.s)，8.74(1H，s)，8.51(1H，s)，7.91(1H，d)，7.68-7.52(5H，m)，m/z[ESMS]297[M+H]+。
實施例106-[5-(3-氯苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-4H-苯并[1，4]噁嗪-3-酮 攪拌條件下，向6-(3-氯苯基乙炔基)-4H-苯并[1，4]噁嗪-3-酮(0.311g，1.15mmol，1.0當量)的干燥DMF(1.5ml)溶液中，加入(三甲基硅烷基)疊氮化合物(0.397g，3.45mmol，3.0當量)?；旌衔镆詺鍤饷摎?分鐘，然后于密封管中在110℃共加熱72個小時。24小時后，再加入(三甲基硅烷基)疊氮化合物(0.397g，3.45mmol，3.0當量)。混合物冷卻后，在乙酸乙酯與水溶液中分配。水相以乙酸乙酯多次萃取后，合并乙酸乙酯層，分別以水及食鹽水洗滌，干燥(MgSO4)。濃縮得到固體，再經(jīng)硅膠快速層析分離，以50％EtOAc-石油醚至EtOAc梯度洗脫得黃色固體產(chǎn)物(0.063g，17％)。1HNMR(250MHz；DMSO-d6)(NMR，在室溫非常寬)δ10.80(1H，br.s)，7.55-7.35(4H，m)，7.20-6.90(3H，m)，4.63(2H，s)，沒有觀察到三唑的NH；m/z[ESMS]327.2[M+H]+。
實施例115-[5-(3-氯苯基-2H-[1，2，3]-三唑-4-基]-苯并[1，2，5]噻二唑
使用實施例10類似的方法，以5-(3-氯苯基乙炔基)-苯并[1，2，5]噻二唑制備得到目標化合物。1HNMR(400MHz，CDCl3)8.22(1H，s)，8.01(1H，d)，7.80(1H，d)，7.37(3H，m)，7.17(1H，t)，沒有觀察到NH。
實施例125-[5-(3-氟苯基-2H-[1，2，3]-三唑-4-基]-苯并[1，2，5]噻二唑 使用實施例10類似的方法，以5-(3-氟苯基乙炔基)-苯并[1，2，5]噻二唑制備得到目標化合物。1HNMR(400MHz，CDCl3)8.24(1H，s)，8.04(1H，d)，7.84(1H，d)，7.35(3H，m)，7.15(1H，t)，沒有觀察到NH。
實施例135-[5-(3-溴苯基-2H-[1，2，3]-三唑-4-基]-苯并[1，2，5]噻二唑 使用實施例10類似的方法，以5-(3-溴苯基乙炔基)-苯并[1，2，5]噻二唑制備得到目標化合物。1HNMR(400MHz，CDCl3)8.24(1H，s)，8.02(1H，d)，7.80(1H，s)，7.56(1H，d)，7.45(1H，d)，7.26(1H，t)，沒有觀察到NH；m/z[APCIMS]358/360[M+H+]。
實施例144-(3-氯苯基)-5-(4-甲氧苯基)-2H-[1，2，3]三唑 使用實施例10類似的方法，以3-(4-甲氧苯基乙炔基)氯苯制備得到目標化合物。1HNMR(400MHz，CDCl3)7.61(1H，m)，7.46(3H，m)，7.30(2H，m)，6.93(2H，m)，3.84(3H，s)，沒有觀察到NH；m/z[APCIMS]286.2[M+H+]。
實施例154-(3-氟苯基)-5-(4-甲氧苯基)-2H-[1，2，3]三唑
使用實施例10類似的方法，以3-(4-甲氧苯基乙炔基)氟苯制備得到目標化合物。1HNMR(250MHz，CDCl3)7.47(2H，d)，7.35(3H，m)，6.95(1H，m)，6.92(2H，d)，3.85(3H，s)，沒有觀察到NH；m/z[APCIMS]270.2[M+H+]。
實施例164-(3-氯苯基)-5-(3-氟-4-甲氧苯基)-2H-[1，2，3]三唑 使用實施例10類似的方法，以3-(3-氟-4-甲氧苯基乙炔基)氟苯制備得到目標化合物。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.60(1H，s)，7.37(5H，m)，6.97(1H，t)，3.92(3H，s)，沒有觀察到NH；m/z[APCIMS]304.1[M+H+]。
實施例174-(3-氟苯基)-5-(3-氟-4-甲氧苯基)-2H-[1，2，3]三唑 使用實施例10類似的方法，以3-(3-氟-4-甲氧苯基乙炔基)-氟苯制備得到目標化合物。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.33(5H，m)，7.09(1H，m)，6.97(1H，t)，3.93(3H，s)，沒有觀察到NH；m/z[APCIMS]288.2[M+H+]。
實施例186-[5-(3-氯苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-1-甲基-1H-苯并咪唑
使用實施例10類似的方法，以6-(3-氯苯基乙炔基)-1-甲基-1H-苯并咪唑制備得到目標化合物。1HNMR(HCl鹽，400MHz，MeOH)δ9.45(1H，s)，8.13(1H，s)，7.89(1H，d)，7.76(1H，d)，7.55(1H，s)，7.44-7.37(3H，m)，4.12(3H，s)，沒有觀察到NH)；m/z[APCIMS]267[M+H+]。
實施例194-(3-氯苯基)-5-(3-氯-4-甲氧苯基)-2H-[1，2，3]三唑 使用實施例10類似的方法，以3-(3-氯-4-甲氧苯基乙炔基)氯苯制備得到目標化合物。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.60(1H，d)，7.50(1H，d)，7.34(4H，m)，6.93(1H，t)，3.92(3H，s)，沒有觀察到NH。
實施例204-(3-氟苯基)-5-(3-氯-4-甲氧苯基)-2H-[1，2，3]三唑 使用實施例10類似的方法，以3-(3-氯-4-甲氧苯基乙炔基)氟苯(500mg，1.92mmol，1當量)制備得到目標化合物。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.57(1H，d)，7.46(1H，dd)，7.25(3H，m)，7.1(1H，t)，6.94(1H，d)，3.93(3H，s)，沒有觀察到NH。
生物學數(shù)據(jù)本發(fā)明化合物的生物活性可采用下述方法測定評估ALK5激酶磷酸化smad3的方法向Basic Flash-Plates(NEN Life Sciences)中吸入100微升0.1摩爾碳酸氫鈉(pH7.6)溶液，每100微升包被緩沖液包括150納克谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶-smad3融合蛋白。將板封閉，于室溫溫育10-24小時。然后將板以200微升包被緩沖液(0.1摩爾碳酸氫鈉)洗滌兩次，空氣中干燥2-4小時。
向磷酸化反應的各孔中加入90微升包含50毫摩爾HEPES緩沖液(pH7.4)；5毫摩爾MgCl2；1毫摩爾CaCl2；1毫摩爾二硫蘇糖醇；100微摩爾三磷酸鳥苷；0.5微Ci/孔γ33P-三磷酸腺苷(NEN Life Sciences)及400納克融合蛋白，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶位于ALK5激酶結(jié)構(gòu)域氮端(GST-ALK5)。背景計數(shù)時不加入任何GST-ALK5。在不同的化合物存在下，通過測定酶活性評估ALK5抑制劑。板于30℃溫育3小時。溫育后，吸出除去測定緩沖液，各孔皆以200微升冷10毫摩爾焦磷酸鹽的磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，洗滌完畢將板吹干。然后，利用Packard Top Count計數(shù)。
熒光各向異性激酶結(jié)合測定將激酶、熒光配體及各種濃度的測試化合物一起溫育，直至達到熱力學平衡，條件為在無測試化合物條件下，熒光配體顯著地為酶結(jié)合的(＞50％)，在足夠濃度(＞10×Ki)的強效抑制劑存在條件下，測得未結(jié)合的熒光配體的各向異性與結(jié)合值不同。
激酶濃度優(yōu)選≥1×Kf。所需的熒光配體濃度視使用的儀器及熒光以及物理化學性質(zhì)而定。使用的濃度必須低于激酶的濃度，優(yōu)選低于激酶濃度的一半。常規(guī)的方法為將所有組分溶于組成為50mM HEPE，pH7.5、1mM CHAP、1mM DTT、10mM MgCl2、2.5％DMSO緩沖溶液中。
ALK5酶濃度4nM熒光配體濃度1nM測試化合物濃度0.1nM-100uM將組分在10ul微升終體積中在LJL HE 384 B型黑色微量滴定板中溫育直至達到平衡(5-30分鐘)。
在LJL Acquest中讀取熒光各向異性。
定義Ki＝抑制劑結(jié)合的離解常數(shù)Kf＝熒光配體結(jié)合的離解常數(shù)熒光配體為下列化合物 其衍生自5-[2-(4-氨基甲基苯基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-4-基]-2-氯苯酚及若丹明綠。
基質(zhì)標記物的抑制Northern Blot方法酶測定中確定的活性數(shù)據(jù)按照如下得到A498腎上皮腫瘤細胞系自ATCC處獲得，生長于EMEM培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基加有10％胎牛牛血清、青霉素(5units/ml)及鏈霉素(5ng/ml)。當A498細胞在100mm皿中生長接近融合時，24小時不加入血清，以化合物預處理4小時后，加入10ng/ml TGF-β(R&D System，Inc.，Minneapolis MN)。將細胞接觸TGF-β124小時后，以酸苯酚/氯仿提取細胞RNA(Chomczynski及Sacchi，1987)。將10微克的總RNA以瓊脂糖凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至尼龍膜(Gene Screen，NEN Life Science，Boston MA)上。將膜用32P標記cDNA探針(Stratagene，LaJolla，CA)檢測纖維連接蛋白mRNA。將膜暴露于磷顯影板，所觀察的帶以Image Quant軟件(MolecularDynamic，Sunnyvale，CA)定量。
基質(zhì)標記物的抑制Western Blot方法酶測定中確定的活性數(shù)據(jù)按照如下得到當細胞在瓶中接近融合時，不加血清過夜，以TGF-β及化合物處理。處理24小時或48小時后以冰冷的磷酸緩沖鹽溶液洗滌，然后向板中加入500微升2X載樣緩沖液，刮擦下的細胞收集于微離心管中。(2X載樣緩沖液100mM Tris-Cl，pH6.8、4％十二烷基磺酸鈉、0.2％溴酚藍、20％甘油、5％β-巰基乙醇)。將細胞在管中裂解并渦旋。樣品煮沸10分鐘后，將20微升樣品加入至7.5％聚乙酰胺凝膠(BioRad)并電泳。
通過半干印跡將在凝膠上大小分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜上。將膜在含5％奶粉的磷酸緩沖液(PBS)及Tween-20中4℃封閉過夜。以PBS/Tween洗滌膜3次后，室溫下以一級抗體溫育4小時。以PBS/Tween洗滌膜3次后，室溫下以二級抗體溫育1小時。最后，以Amersham的ECL檢測試劑盒使信號顯色。
本發(fā)明化合物一般顯示出調(diào)節(jié)ALK5受體的活性，IC50值為0.0001～10μM。
權(quán)利要求
1.式(I)的化合物或其可藥用鹽 其中R1為萘基或苯基，其任選被一或多個選自鹵素、-O-C1-6烷基、-S-C1-6烷基、C1-6烷基、C1-6鹵代烷基、-O-(CH2)n-Ph、-S-(CH2)n-Ph、氰基、苯基及CO2R的取代基取代，其中R為氫原子或C1-6烷基，n為0、1、2或3；或R1為與5-7員的芳香環(huán)或非芳香環(huán)相稠合的苯基或吡啶基，其中，該環(huán)系任選包含多達3個雜原子，該雜原子獨立地選自N、O及S，且N可進一步任選被C1-6烷基取代，及其中環(huán)系可任選被＝O取代；R2及R3獨立地選自H、C1-6烷基、C1-6烷氧基、苯基、NH(CH2)n-Ph、NH-C1-6烷基、鹵素、CN、NO2、CONHR及SO2NHR；X1、X2及X3中的兩個為N，另一個為NR4，其中R4為氫原子、C1-6烷基、C3-7環(huán)烷基、-(CH2)p-CN、-(CH2)p-CO2H、-(CH2)p-CONHR5R6、-(CH2)pCOR5、-(CH2)q(OR7)2、-(CH2)pOR5、-(CH2)q-CH＝CH-CN、-(CH2)q-CH＝CH-CO2H、-(CH2)p-CH＝CH-CONHR5R6、-(CH2)pNHCOR8或-(CH2)pNR9R10；R5及R6獨立地為氫原子或C1-6烷基；R7為C1-6烷基；R8為C1-7烷基，或任選取代的芳基、雜芳基、芳基C1-6烷基或雜芳基C1-6烷基；R9及R10獨立地選自氫原子、C1-6烷基、芳基及芳基C1-6烷基；p為0-4；及q為1-4。
2.權(quán)利要求1所述的化合物，其中R1為任選被鹵素取代的苯基，或R1為與5-7員的芳香環(huán)或非芳香環(huán)相稠合的苯基或吡啶基，其中，該環(huán)系任選包含多達3個雜原子，該雜原子獨立地選自N、O及S，且N可進一步任選被C1-6烷基取代，及其中的環(huán)系可任選被＝O取代。
3.權(quán)利要求2所述的化合物，其中，R1表示4-甲氧苯基、3-氟-4-甲氧苯基、3-氯苯基、3-氟-4-甲氧苯基或3-氯-4-甲氧苯基，或R1表示苯并[1，2，5]噻二唑基、[1，2，4]三唑并[1，5-a]吡啶基、二氫苯并呋喃基、2，3-二氫苯并[1，4]二氧雜環(huán)己烯基、苯并咪唑基、C1-6烷基苯并咪唑基、苯并[1，4]噁嗪-3-酮或苯并[1，4]噁嗪基。
4.前述權(quán)利要求中任何一項所述的化合物，其中，R2位于與三唑連接點的間位。
5.前述權(quán)利要求中任何一項所述的化合物，其中，R2為鹵素、C1-6烷基或NO2。
6.實施例1～20中任何一例所定義的式(I)化合物或其可藥用鹽。
7.一種藥物組合物，其包括前述權(quán)利要求中任何一項所述的化合物，或其可藥用鹽及可藥用載體或稀釋劑。
8.權(quán)利要求1～6中任何一項所述的式(I)化合物，或其可藥用鹽或溶劑合物，其用于治療。
9.權(quán)利要求1～6中任何一項所述的式(I)化合物或其可藥用鹽在制備治療哺乳動物中由ALK5受體介導的疾病的藥物中的用途。
10.一種抑制哺乳動物TGF-β信號轉(zhuǎn)導通道的方法，包括向需要接受此種治療的哺乳動物使用治療有效劑量的權(quán)利要求1～6中任何一項所述的式(I)化合物或其可藥用鹽。
11.一種治療疾病的方法，包括向需要接受此種治療的哺乳動物使用治療有效劑量的權(quán)利要求1～6中任何一項所述的式(I)化合物或其可藥用鹽，所述疾病選自慢性腎病、急性腎病、創(chuàng)傷愈合、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、腎病、充血性心力衰竭、潰瘍、眼病、角膜損傷、糖尿病型腎病、神經(jīng)機能受損、阿耳茨海默氏病、動脈粥樣硬化、腹膜及皮下粘連、任何以纖維化為主要特征的疾病，包括但不限于肺纖維化、肝纖維化、例如乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、酒精誘導的肝炎、血色素沉著病及原發(fā)性膽汁性硬化及再狹窄。
12.一種抑制哺乳動物的基質(zhì)形成方法，包括向需要接受此種治療的哺乳動物使用治療有效劑量的權(quán)利要求1～6中任何一項所述的化合物或其可藥用鹽。
全文摘要
本發(fā)明公開了式(1)所述的苯基取代的三唑及其鹽和溶劑化物，其中R
文檔編號C07D413/04GK1608065SQ02825914
公開日2005年4月20日 申請日期2002年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月15日
發(fā)明者拉拉米·M·加斯特, 約翰·D·哈林, 杰格·P·希爾, 托馬斯·D·海特曼, 安德魯·H·佩恩 申請人:史密絲克萊恩比徹姆公司