專利名稱：具有LH與FSH聯(lián)合激動活性的甘氨酸-取代的噻吩并[2,3-d]嘧啶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有糖蛋白激素激動活性的化合物，特別是具有促黃體激素(LH)和促卵泡激素(FSH)激動活性的化合物。本發(fā)明此外涉及含有它們的藥物組合物以及這些化合物在醫(yī)療中的用途，特別是用于生育控制。
促性腺激素在多種機體功能中起到重要功能，包括代謝、溫度調(diào)節(jié)和生殖過程。垂體促性腺激素FSH和LH例如在刺激卵泡發(fā)育和成熟中扮演關(guān)鍵角色，LH參與誘導(dǎo)排卵過程(Sharp，R.M.Clin.Endocrinol33787-807，1990；Dorrington and Armstrong，RecentProg.Horm.Res35301-342，1979；Levy et al，HumanReproduction152258-2265，2000)。
目前，LH在臨床上與FSH聯(lián)合用于刺激卵巢，也就是過度刺激卵巢，用于不孕不排卵婦女的體外受精(IVF)和誘導(dǎo)排卵(Insler，V.，Int.J.Fertility3385-97，1988，Navot and Rosenwaks，J.VitroFert.Embryo Transfer53-13，1988)，以及用于男性性腺機能減退癥和男性不育。
促性腺激素作用于特殊的生殖腺細(xì)胞類型，引發(fā)卵巢和睪丸的分化和類固醇合成。這些垂體與胎盤激素的作用受特異性血漿膜受體的介導(dǎo)，這些血漿膜受體是一大家族G-蛋白偶聯(lián)受體的成員。它們由單一的多肽和七種跨膜結(jié)構(gòu)域組成，能夠與Gs蛋白發(fā)生相互作用，引起腺苷酸環(huán)化酶的活化。
用于治療目的的促性腺激素能夠從人尿來源分離，但是純度低(Morse et al，Amer.J.Reproduct.Immunol.and Microbiology17143，1988)。作為替代選擇，它們可以作為重組的促性腺激素被制備。除了這些蛋白質(zhì)以外，促性腺激素受體能夠被合成的小分子化合物活化或滅活。WO 00/61586已經(jīng)描述了二環(huán)雜芳族化合物。體外和體內(nèi)實驗顯示，它們可用作LH激動劑。
在正常的女性中，垂體LH和FSH的釋放是以中期突然釋放為特征的，它先于排卵。排卵是以三種不同的生理現(xiàn)象為特征的，也就是卵母細(xì)胞成熟、卵泡破裂和黃體化。LH突然釋放在體內(nèi)誘導(dǎo)這些現(xiàn)象中的角色是毋庸置疑的，而FSH突然釋放的角色不太清楚。不過，最近已經(jīng)顯示，F(xiàn)SH在體外通過誘導(dǎo)丘細(xì)胞產(chǎn)生一種因子來誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟，該因子明確地克服次黃嘌呤誘發(fā)的減數(shù)分裂抑制(Lu et al，Mol.Cell.Endocrinol.164191-196，2000)。該因子被認(rèn)為是一種減數(shù)分裂活化甾醇(MAS)。
本發(fā)明提供顯示LH活性的小分子化合物。除了LH活性以外，它們還意外地具有FSH活性。一般而言，這些化合物是噻吩并[2，3-d]嘧啶，其在嘧啶環(huán)的4-位被苯基取代，該苯基又在間位被取代。該取代基包含三原子間隔基(NH-C(O)-CH2)，它進(jìn)一步被取代的氨基所官能化。一般地，這些化合物具有不同程度的，但是通常小于LH激動活性的FSH激動活性。
本發(fā)明涉及通式I的甘氨酸取代的噻吩并[2，3-d]嘧啶衍生物 (式I)或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中X是O或H，H；A是S、NH、N(R6)、O或一條鍵；R1是(1-4C)烷基、(2-4C)烯基、苯基或(2-5C)雜芳基，所述苯基或雜芳基環(huán)可選地被一個或多個下列取代基取代羥基、鹵素、硝基、三氟甲基、氰基、氨基或(1-4C)(二)烷基氨基；
R2是H、(1-4C)烷基、(1-4C)烷氧基(2-4C)烷基或羥基(2-4C)烷基；R3和R4可以獨立地選自H、(1-4C)烷基和羥基(1-4C)烷基；R5是H或(1-4C)烷基；R6可以選自與R1所述相同的基團(tuán)。
用在式I定義中的術(shù)語(1-4C)烷基表示具有1-4個碳原子的直鏈或支鏈烷基，有甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。
用在式I定義中的術(shù)語(2-4C)烯基表示具有2-4個碳原子的直鏈或支鏈烯基，有乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-甲基-乙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-甲基-1-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、1-甲基-1-丙烯基、1-乙基-乙烯基。
術(shù)語(1-4C)烷氧基(1-4C)烷基表示具有1-4個碳原子的烷基，經(jīng)由氧原子連接到另一個具有1-4個碳原子的烷基上，烷基部分具有與前文定義相同的含義。
術(shù)語(1-4C)烷氧基(2-4C)烷基表示具有1-4個碳原子的烷基，經(jīng)由氧原子連接到另一個具有2-4個碳原子的烷基上，烷基部分具有與前文定義相同的含義。
術(shù)語羥基(1-4C)烷基表示羥基連接到具有1-4個碳原子的烷基上，烷基部分具有與前文定義相同的含義。
術(shù)語羥基(2-4C)烷基表示羥基連接到具有2-4個碳原子的烷基上，烷基部分具有與前文定義相同的含義。
術(shù)語(1-4C)(二)烷基氨基表示一個或兩個如前文所定義的具有1-4個碳原子的烷基連接到氮原子上。
術(shù)語(2-5C)雜芳基表示可選被取代的具有2-5個碳原子的芳族基團(tuán)，至少包括一個選自N、O和/或S的雜原子，象咪唑基、噻吩基、呋喃基或吡啶基。
術(shù)語鹵素表示氟、氯、溴或碘。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，上述式I化合物顯示激動性LH和FSH活性。在一項體外生物測定中，分別使用被人LH或FSH受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LH受體的EC50小于5.10-8M，而FSH受體的EC50小于10-5M。通常，F(xiàn)SH活性是LH激動劑刺激活性的約1％至約10％。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及藥物組合物，包含具有通式I的噻吩并[2，3-d]嘧啶衍生物或其鹽。
因而，根據(jù)本發(fā)明的化合物能夠用于治療。本發(fā)明的進(jìn)一方面涉及具有通式I的噻吩并[2，3-d]嘧啶化合物在藥物制造中的用途，該藥物用于生育控制，更優(yōu)選地用于誘導(dǎo)排卵。本發(fā)明化合物用于活化LH和FSH受體。本發(fā)明的化合物因此能夠用在治療女性生育問題的方法中。
本發(fā)明的噻吩并[2，3-d]嘧啶化合物可以具有一個或多個手性碳原子。因此這些化合物可以以手性純化合物或者非對映體和/或?qū)τ丑w混合物的形式得到。得到手性純化合物的方法是本領(lǐng)域熟知的，例如結(jié)晶法或色譜法。
就治療用途而言，式I化合物的鹽是其中抗衡離子是藥學(xué)上可接受的那些。不過，式I的堿的酸加成鹽例如也可以用于制備或純化藥學(xué)上可接受的化合物。所有的鹽，無論藥學(xué)上可接受與否，都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
酸加成鹽的實例包括從無機酸和有機酸衍生的那些，無機酸是例如鹽酸、磷酸、硫酸，優(yōu)選鹽酸，有機酸是例如枸櫞酸、酒石酸、乙酸、乳酸、馬來酸、丙二酸、富馬酸、乙醇酸、琥珀酸等。
式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在本文中也被稱為活性成分，適合于它們的給藥途徑有肌內(nèi)注射、皮下注射、靜脈內(nèi)注射或腹膜內(nèi)注射、口服和鼻內(nèi)給藥。優(yōu)選地，所述化合物可以被口服給藥。活性成分或其藥物組合物的精確給藥劑量和計劃必然依賴于所要實現(xiàn)的治療效果(不育的治療；避孕)，并可以因特定化合物、給藥途徑和接受藥物治療的個體的年齡和狀況而異。
一般而言，腸胃外給藥要求比更依賴于吸收的其他給藥方法更少的劑量。不過，人用劑量優(yōu)選地含有0.0001-25mg/kg體重。所需的劑量可以作為一次劑量或按適當(dāng)?shù)拈g隔在當(dāng)天內(nèi)給藥的多個子劑量。在女性受治療者的情況下，劑量可以按適當(dāng)?shù)娜掌陂g隔在月經(jīng)周期內(nèi)給藥，用于供養(yǎng)卵泡，或者作為單一劑量給藥，用于誘導(dǎo)排卵。給藥的劑量以及計劃在女性與男性受治療者之間可以有所差異。
在體外或離體(ex vivo)應(yīng)用中，例如在IVF應(yīng)用中，在培養(yǎng)基中使用本發(fā)明的化合物，濃度大約0.01-5μg/ml。
本發(fā)明因而還涉及藥物組合物，包含式I的噻吩并[2，3-d]嘧啶化合物以及藥學(xué)上可接受的助劑，和可選的其他治療劑。在與組合物其他成分相容并且對其受治療者無害的意義上，助劑必須是“可接受的”。
藥物組合物包括適合于口服、直腸、鼻、局部(包括透皮、頰和舌下)、陰道或腸胃外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮內(nèi))給藥的那些。組合物可以通過藥學(xué)領(lǐng)域熟知的任何方法制備，例如利用例如下述文獻(xiàn)中公開的方法Gennaro et al.，Remington’s-Pharmaceutical Sciences(18th ed.，Mack Publishing company，1990，尤其參見Part 8Pharmaceutical Preparations and TheirManufacture)。
這類方法包括將活性成分與任何輔助劑結(jié)合的步驟。輔助劑也被稱為附加成分，包括本領(lǐng)域常用的那些(Gennaro，出處同上)，例如填充劑、粘合劑、稀釋劑、崩解劑、潤滑劑、著色劑、矯味劑和潤濕劑。
適合于口服給藥的藥物組合物可以呈現(xiàn)為離散的劑量單元，例如丸劑、片劑或膠囊劑，或者粉劑或顆粒劑，或者溶液劑或混懸劑?；钚猿煞诌€可以呈現(xiàn)為大丸劑或糊劑。所述組合物還可以被加工成栓劑或灌腸劑，用于直腸給藥。
就腸胃外給藥而言，適合的組合物包括水性和非水性無菌注射劑。組合物可以存在于單劑量或多劑量容器內(nèi)，例如密封的小瓶和安瓿，并可以貯存在冷凍干燥(凍干)狀況下，僅需在使用前加入無菌的液體載體，例如水。
適合于鼻吸入給藥的組合物或制劑包括微細(xì)的粉劑或霧劑，它們可以借助計量劑量的加壓氣溶膠、霧化器或吹入器而生成。
本發(fā)明的噻吩并[2，3-d]嘧啶化合物還可以以可植入的藥具的形式給藥，所述藥具由包有釋放速率調(diào)節(jié)膜的活性材料核心組成。這類植入物被皮下或局部應(yīng)用，將按大約恒定的速率釋放活性成分達(dá)相當(dāng)長的時間，例如數(shù)周至數(shù)年。這類可植入藥具的制備方法是本領(lǐng)域已知的，例如歐洲專利0,303,306(AKZO N.V.)所述。
因而，本發(fā)明的化合物能夠用于與天然LH相同的臨床目的，其優(yōu)點是它們具有FSH活性，顯示改變了的穩(wěn)定性，并且能夠被不同地給藥。
由式(I)代表的本發(fā)明化合物一般可以這樣制備在適當(dāng)?shù)娜軇┲?，例如N，N-二甲基甲酰胺或THF中，在室溫下，在叔胺堿例如N，N-二異丙基乙胺的存在下，用通式(III)的胺對其中Q＝Cl或Br的通式(II)化合物進(jìn)行親核取代。很多通式(III)的胺都是商業(yè)上可得到的。
其中Q＝Cl或Br的式(II)衍生物可以這樣制備在叔胺堿例如N，N-二異丙基乙胺存在下，在適合的溶劑例如二氯甲烷或THF中，進(jìn)行式(V-a)的間苯胺衍生物與其中Q＝Cl或Br的(IV)型酰氯的區(qū)域選擇性?；?。

式(V)化合物可以這樣獲得使用適當(dāng)?shù)倪€原劑，例如氫，在金屬(Pd/Pt)催化劑的存在下，進(jìn)行式(VI)衍生物中硝基官能團(tuán)的本領(lǐng)域已知的還原。有關(guān)的還原已經(jīng)描述在P.M.Carabateas，P.R.Brundage，K.O.Gelotte，M.D.Gruett，R.R.Lorenz，J.Heterocycl.Chem.21，1849(1984)中。作為替代選擇，可以使用氯化錫(II)，在質(zhì)子溶劑例如乙醇中，在鹽酸的存在下，在升高的溫度下進(jìn)行所述還原(J.Heilbron，J.Chem.Soc，1279(1940))。
通式(VI)的噻吩并嘧啶可以這樣獲得在偶聯(lián)劑例如O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)或溴代三吡咯烷子基鏻六氟磷酸鹽(PyBrOP)，和叔胺堿例如N，N-二異丙基乙胺作用下，進(jìn)行羧酸(VII)與叔丁胺的縮合。
相應(yīng)的乙基酯(VIII)向羧酸(VII)的皂化是在堿例如氫氧化鋰、氫氧化鉀或氫氧化鈉的存在下，在含水的二噁烷中，在高溫下(80℃至回流)進(jìn)行的。
通式(VIII)的二環(huán)體系是這樣生成的在N，N-二異丙基乙胺的媒介下，進(jìn)行式(X)氯化物與巰基乙酸乙酯的取代，然后進(jìn)行中間體硫醚(IX)的堿催化合環(huán)。這種類型的噻吩并[2，3-d]嘧啶環(huán)生成已經(jīng)描述在S.A.Abdel-Hady，M.A.Badawy，Y.A.Ibrahim，Sulfur Lett.9，101(1989)和S.Tumkevicius，Liebigs Ann.，1703(1995)中。 環(huán)化反應(yīng)的合適條件是含乙醇鈉的乙醇或含N，N-二異丙基乙胺的甲苯/乙醇(1/1，v/v)，在回流溫度下。
式(X)化合物可以遵照文獻(xiàn)工藝合成，例如A.A.Santilli，D.H.Kim and S.V.Wanser，J.Heterocycl.Chem.8，445，1971所述。在典型的實驗中，在高溫下(80℃至回流)，將通式(XI)的酰胺用POCl3處理。向反應(yīng)混合物加入適當(dāng)?shù)娜軇缍f烷，和/或加入PCl5或N，N-二甲基苯胺，可以縮短反應(yīng)時間，提高氯化物(X)收率。
生成式(XI)內(nèi)酰胺的通用途徑包括氰基乙酸乙酯與3-硝基苯甲醛和化合物(XII)的縮合，化合物(XII)可以是異硫脲(XII-a)、異脲(XII-b)、單取代的胍(XII-c)、二取代的胍(XII-d)或脒(XII-e)。
在典型的實驗中，將氰基乙酸乙酯、3-硝基苯甲醛和衍生物(XII)懸浮在適當(dāng)?shù)娜軇├缫掖?、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、四氫呋喃或吡啶中，加入堿，例如碳酸鉀、乙酸鈉、甲醇鈉或乙醇鈉。反應(yīng)在高溫下(70℃至回流)進(jìn)行。過濾后，將殘余物溶于水并酸化(pH2)，然后產(chǎn)物(XI)沉淀出來(S.Kambe，K.Saito andH.Kishi，Synthesis，287(1979)；A.M.Abd-Elfattah，S.M.Hussain and A.M.El-Reedy，Tetrahedron39，3197(1983)；S.M.Hussain，A.A.El-Barbary and S.A.Mansour，J.Heterocycl.Chem.22，169(1985))。
作為替代選擇，由式(I-a)表示的其中A＝N的本發(fā)明化合物可以由通式(XIII)的亞砜衍生物經(jīng)過用通式(XIV)的胺親核試劑的親核取代加以制備。反應(yīng)通常在升高的溫度下，在叔胺堿例如N，N-二異丙基乙胺存在下，在適當(dāng)?shù)娜軇├?，4-二噁烷中進(jìn)行。
類似地，由式(I-b)表示的其中A＝O的本發(fā)明化合物可以由通式(XIII)的亞砜衍生物經(jīng)與通式(XV)的醇化物親核試劑的親核取代加以制備。反應(yīng)是在叔丁醇鉀的存在下、利用過量醇R1-OH進(jìn)行的。
通式(XIII)的亞砜衍生物可通過式(I-c)表示的，其中R1＝Me，A＝S的通式(I)化合物的氧化而得。氧化是用3-氯過苯甲酸的三氟乙酸溶液進(jìn)行的。溶劑的酸性防止了5-氨基氧化為相應(yīng)的5-亞硝基衍生物。
測定受體結(jié)合的方法以及測定促性腺激素生物活性的體外與體內(nèi)測定法是公知的。一般而言，使被表達(dá)的受體與供試化合物接觸，并測量結(jié)合或者功能響應(yīng)的刺激或抑制。
為了測量功能響應(yīng)，在適合的宿主細(xì)胞中表達(dá)所分離的編碼LH或FSH受體基因，優(yōu)選人受體的DNA。這樣一種細(xì)胞可以是中國倉鼠卵巢細(xì)胞，但是其他細(xì)胞也是適合的。優(yōu)選地，細(xì)胞是哺乳動物來源的(Jiaet al，Mol.Endocrin.，5759-776，1991)。
構(gòu)建重組的LH或FSH表達(dá)細(xì)胞系的方法是本領(lǐng)域熟知的(Sambrook et al.，Molecular Cloninga Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，latestedition)。受體的表達(dá)是借助編碼所需蛋白質(zhì)的DNA的表達(dá)來實現(xiàn)的。位點定向誘變、連接另外的序列、PCR和構(gòu)建適合的表達(dá)系統(tǒng)的技術(shù)迄今都是本領(lǐng)域熟知的。編碼所需蛋白質(zhì)的部分或全部DNA可以利用標(biāo)準(zhǔn)的固相技術(shù)以合成方式構(gòu)建，優(yōu)選地包括限制位點以有利于連接?？梢韵駾NA編碼序列提供適合于所包括的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的控制元件。眾所周知，表達(dá)系統(tǒng)是現(xiàn)成的，它們與多種宿主是相容的，包括原核生物宿主如細(xì)菌，和真核生物宿主如酵母、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、鳥類細(xì)胞等。
然后使表達(dá)受體的細(xì)胞與供試化合物接觸，觀察結(jié)合或者功能響應(yīng)的刺激或抑制。
作為替代選擇，可以使用分離的含有所表達(dá)的受體的細(xì)胞膜來測量化合物的結(jié)合。
為測量結(jié)合，可以使用放射性或熒光標(biāo)記的化合物。作為參照化合物，可以使用人重組LH或FSH。在替代方式中，還可以進(jìn)行競爭結(jié)合測定。
另一種測定法涉及通過測定受體介導(dǎo)的cAMP蓄積的刺激來篩選LH或FSH受體激動劑化合物。因而，這樣一種方法包括受體在宿主細(xì)胞表面上的表達(dá)和使該細(xì)胞暴露于供試化合物。然后測量cAMP的量。cAMP的水平將有減少或增加，這依賴于供試化合物在與受體結(jié)合后的抑制或刺激效應(yīng)。
除了直接測量所暴露的細(xì)胞中的例如cAMP水平以外，還可以使用這樣的細(xì)胞，其除了用編碼受體的DNA轉(zhuǎn)染以外，還用編碼報道基因的第二DNA轉(zhuǎn)染，該報道基因的表達(dá)響應(yīng)于cAMP的水平。這類報道基因可能是cAMP可誘導(dǎo)的，或者可能以這樣一種方式構(gòu)建，使它們連接于新穎的cAMP響應(yīng)性元件。一般而言，報道基因的表達(dá)可以受到任何對cAMP水平的變化做出反應(yīng)的響應(yīng)元件的控制。適合的報道基因例如有LacZ、堿性磷酸酶、蟲熒光素酶和綠熒光蛋白。這類轉(zhuǎn)活化(transactivation)測定法的原理是本領(lǐng)域熟知的，例如描述在Stratowa，Ch，Himmler，A and Czernilofsky，A.P.(1995)Curr.Opin.Biotechnol.6574中。
就選擇對LH或FSH受體有活性的化合物而言，當(dāng)使用LH或FSH作為參照時，在10-5M下測試必須導(dǎo)致活性在最大活性的20％以上。另一條標(biāo)準(zhǔn)可能是EC50值，它必須＜10-5M，優(yōu)選＜10-7M。
技術(shù)人員將認(rèn)識到，可取的EC50值依賴于所測試的化合物。例如，EC50小于10-5M的化合物一般被視為藥物選擇的候選者。優(yōu)選地，該數(shù)值低于10-7M。不過，具有更高EC50但是就特定受體而言有選擇性的化合物甚至可以是更好的候選者。
篩選LH受體激動性化合物還可以利用小鼠萊迪希氏細(xì)胞生物測定法進(jìn)行(Van Damme，M.，Robersen，D.and Diczfalusy，E.(1974).Acta Endocrinol.77655-671.Mannaerts，B.，Kloosterboer，H.and Schuurs，A.(1987).Neuroendocrinology of reproduction.R.Rolland et al.Eds.，Elsevier Science Publishers B.V.，49-58)。該測定法中，可以在從雄性小鼠分離的萊迪希氏細(xì)胞中測量對LH受體介導(dǎo)的睪酮產(chǎn)生的刺激。
還可以在離體模型中，使用培養(yǎng)的小鼠卵泡，按照Nayudu，P.和Osborn，S.所述(1992，J.Reproduction and Fertility95349-362)測定化合物的FSH激動活性。因此，分離小鼠卵泡，并在FSH激動性化合物的存在下培養(yǎng)，以誘導(dǎo)卵泡生長。卵泡的直徑和培養(yǎng)基中的雌二醇是卵泡生長的指標(biāo)。
為了測量化合物的LH體內(nèi)活性，可以研究未成熟小鼠的排卵誘導(dǎo)。在該測定法中，將未成熟的雌性小鼠與尿FSH進(jìn)行抗原接觸，大約48小時后用LH激動性化合物處理。在LH激動劑處理后殺死動物，在顯微鏡下評估輸卵管中的卵子數(shù)量。
為了測量化合物的FSH體內(nèi)活性，在0、8、24和32小時將未成熟的雌性大鼠用FSH激動性化合物處理，誘導(dǎo)卵泡生長。在實驗開始后52小時，向動物注射hCG以誘導(dǎo)排卵。在實驗開始后72小時殺死動物，在顯微鏡下評估輸卵管中的卵子數(shù)量。另外，測定卵巢的重量。
本發(fā)明的化合物在臨床上可用于現(xiàn)已使用LH或hCG的那些情形。這些情形包括性腺機能減退的男性或女性受治療者中的LH替代、中期給藥誘導(dǎo)排卵(排卵誘導(dǎo)(OI))或者黃體的受控過度刺激(COH)或刺激。
下列實施例舉例說明本發(fā)明，決不應(yīng)當(dāng)被解釋為限制發(fā)明的范圍。
實施例實施例1叔丁基5-氨基-2-甲硫基-4-(3-((N-甲基-N-(2-羥基乙基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(a).5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-甲硫基-6-羥基-嘧啶將S-甲基異硫脲硫酸鹽(69.0g)、3-硝基苯甲醛(75.0g)、氰基乙酸乙酯(56.0ml)與碳酸鉀(72.5g)在絕對EtOH(1500ml)中的混合物在60℃下攪拌16小時。將反應(yīng)混合物在冰浴中冷卻至0℃。濾出所得沉淀，用絕對EtOH洗滌，并溶于熱水(100℃)。將溶液冷卻至室溫，用2N HCl酸化至pH2，在冰浴中冷卻至0℃。濾出所得沉淀，用冰水洗滌。用1，4-二噁烷共蒸發(fā)除去沉淀中殘留的水。
收率54.0g。
MS-ESI[M+H]+＝289.0TLCRf＝0.3，硅膠，DCM/MeOH＝9/1(v/v)。
(b).6-氯-5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-甲硫基-嘧啶向攪拌著的5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-甲硫基-6-羥基-嘧啶(實施例1(a)，25.0g)在無水1，4-二噁烷(300ml)中的溶液中加入POCl3(100ml)。在90℃下3小時后，將混合物冷卻至室溫，并在減壓下濃縮。將殘余物溶于1，4-二噁烷(100ml)，將所得溶液冷卻至0℃。小心地加入冰水。濾出所得沉淀，用水洗滌。用1，4-二噁烷共蒸發(fā)除去沉淀中殘留的水。
收率26.0g。
MS-ESI[M+H]+＝307.0TLCRf＝0.5，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(c).乙基5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-甲硫基-6-(乙氧羰基甲硫基)-嘧啶向攪拌著的2-巰基乙酸乙酯(9.3ml)與6-氯-5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-甲硫基-嘧啶(實施例1(b)，26.0g)在EtOH(250ml)與DCM(250ml)混合物中的溶液加入DIPEA(15.7ml)。在室溫下1小時后，向混合物加入0.1N HCl水溶液(500ml)，然后用DCM萃取(3×500ml)，干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。
收率28.0gMS-ESI[M+H]+＝391.4TLCRf＝0.5，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(d).5-氨基-4-(3-硝基苯基)-2-甲硫基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯將乙基5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-甲硫基-6-(乙氧羰基甲硫基)-嘧啶(實施例1(c)，28.0g)與DIPEA(30ml)在甲苯(150ml)與EtOH(150ml)混合物中的混合物在回流溫度(100℃)下攪拌16小時。然后將混合物冷卻至室溫，在減壓下濃縮。用甲苯共蒸發(fā)除去殘留的DIPEA。
收率28.0gMS-ESI[M+H]+＝391.4TLCRf＝0.6，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(e).5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-甲硫基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯向5-氨基-4-(3-硝基苯基)-2-甲硫基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯(實施例1(d)，28.0g)、濃HCl水溶液(15ml)與氯化錫(II)(41.0g)在1，4-二噁烷(400ml)中的混合物中加入EtOH(400ml)。將混合物在90℃下攪拌16小時。然后將混合物冷卻至室溫，在減壓下濃縮。將殘余物懸浮在EtOAc(1000ml)中。加入4N NaOH水溶液，使pH為10-11。將混合物劇烈攪拌，分離有機層并干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。
收率21.0gMS-ESI[M+H]+＝361.0TLCRf＝0.6，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(f).5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-甲硫基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸向5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-甲硫基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯(實施例1(e)，21.0g)在1，4-二噁烷(300ml)與水(100ml)混合物中的溶液加入氫氧化鉀(32.4g)。在90℃下16小時后，將混合物冷卻至10℃，在劇烈攪拌下加入2N枸櫞酸水溶液(300ml)。濾出所得沉淀，用水(180ml)洗滌，在真空中干燥。
收率14.0gMS-ESI[M+H]+＝333.0TLCRf＝0.5，硅膠，DCM/MeOH＝9/1(v/v)。
(g).叔丁基5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-甲硫基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-甲硫基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸(實施例1(f)，14.0g)、DIPEA(17.4ml)與叔丁胺(7.3g)在DCM/DMF(1/1，v/v，250ml)中的溶液加入TBTU(16.1g)。在室溫下3小時后，將混合物用DCM(50ml)稀釋，用飽和NaHCO3水溶液(3×100ml)、0.1NHCl水溶液(100ml)和水(100ml)洗滌。在減壓下濃縮有機層。粗產(chǎn)物經(jīng)過熱的絕對EtOH(300ml)結(jié)晶純化。
收率10.5gMS-ESI[M+H]+＝388.2HPLCRt＝30.72min，Luna C-18(2)，5μm，250×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑水/ACN/MeOH＝90/9.5/0.5至0/95/5，運轉(zhuǎn)時間＝50min。
(h).叔丁基5-氨基-2-甲硫基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向叔丁基5-氨基-2-甲硫基-4-(3-氨基苯基)-噻吩并[2，3-d]-嘧啶-6-酰胺(實施例1(g)，1.08g)與DIPEA(2.43ml)在無水DCM(20ml)中的溶液中加入溴乙酰氯(615mg)。在室溫下3小時后，將混合物用DCM稀釋，用飽和NaHCO3水溶液洗滌，干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)過硅膠色譜法純化，使用庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)作為洗脫劑。
收率910mgMS-ESI[M+H]+＝510.2TLCRf＝0.3，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(i).叔丁基5-氨基-2-甲硫基-4-(3-((N-甲基-N-(2-羥基乙基)-甘氨酰基)-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-甲硫基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例1(h)，250mg)在DCM(5ml)中的溶液加入N-甲基-2-氨基-乙醇(250mg)。在室溫下16小時后，將混合物用DCM(50ml)稀釋，用飽和NaHCO3水溶液洗滌，干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)過HPLC純化，使用Luna C-18柱，使用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率112mg(TFA-鹽)MS-ESI[M+H]+＝503.2HPLCRt＝11.45min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例2叔丁基5-氨基-2-甲硫基-4-(3-((N-(1-羥基-2-甲基-丙-2-基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-甲硫基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例1(h)，250mg)在DCM(5ml)中的溶液加入2-氨基-2-甲基-丙醇(250mg)。在室溫下16小時后，將混合物用DCM(50ml)稀釋，用飽和NaHCO3水溶液洗滌，干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)過HPLC純化，使用Luna C-18柱，使用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率67mg(TFA-鹽)MS-ESI[M+H]+＝517.2HPLCRt＝12.67min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例3叔丁基5-氨基-2-甲硫基-4-(3-((N-(甲氧羰基甲基)-甘氨酰基)-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-甲硫基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例1(h)，250mg)與N，N-二異丙基乙胺(0.20ml)在DCM(5ml)中的溶液加入甘氨酸甲酯鹽酸鹽(200mg)。在室溫下16小時后，將混合物用DCM(50ml)稀釋，用飽和NaHCO3水溶液洗滌，干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)過HPLC純化，使用LunaC-18柱，使用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率133mg(TFA-鹽)MS-ESI[M+H]+＝517.2HPLCRt＝11.87min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例4叔丁基5-氨基-2-甲硫基-4-(3-((N-乙基-N-(2-甲氧基乙基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-甲硫基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例1(h)，200mg)在DCM(5ml)中的溶液加入N-(2-甲氧基乙基)-乙胺(266mg)。在室溫下16小時后，將混合物用DCM(50ml)稀釋，用飽和NaHCO3水溶液洗滌，干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)過HPLC純化，使用Luna C-18柱，使用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率84mg(TFA-鹽)MS-ESI[M+H]+＝531.2HPLCRt＝12.62min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例5叔丁基5-氨基-2-甲硫基-4-(3-((N-(R-1-甲氧羰基-2-甲基-丙-1-基)-甘氨酰基)-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-甲硫基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例1(h)，250mg)與N，N-二異丙基乙胺(0.20ml)在DCM(5ml)中的溶液加入D-纈氨酸甲酯鹽酸鹽(250mg)。在室溫下16小時后，將混合物用DCM(50ml)稀釋，用飽和NaHCO3水溶液洗滌，干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)過HPLC純化，使用Luna C-18柱，使用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率77mg(TFA-鹽)MS-ESI[M+H]+＝559.2HPLCRt＝13.22min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例6叔丁基5-氨基-2-甲硫基-4-(3-((N，N-雙-(2-甲氧基乙基)-甘氨酰基)-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-甲硫基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例1(h)，250mg)在DCM(5ml)中的溶液加入N，N-雙-(2-甲氧基乙基)-胺(400mg)。在室溫下16小時后，將混合物用DCM(50ml)稀釋，用飽和NaHCO3水溶液洗滌，干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)過HPLC純化，使用Luna C-18柱，使用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率166mg(TFA-鹽)MS-ESI[M+H]+＝561.3HPLCRt＝13.62min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例7叔丁基5-氨基-2-甲硫基-4-(3-((2，3-二羥基-丙-1-基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-甲硫基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例1(h)，250mg)在DCM(5ml)中的溶液加入3-氨基-2-羥基-丙醇(250mg)。在室溫下16小時后，將混合物用DCM(50ml)稀釋，用飽和NaHCO3水溶液洗滌，干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)過HPLC純化，使用Luna C-18柱，使用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率164mg(TFA-鹽)MS-ESI[M+H]+＝519.2HPLCRt＝12.62min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例8叔丁基5-氨基-2-甲硫基-4-(3-((1，3-二羥基丙-2-基)-甘氨酰基)-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-甲硫基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例1(h)，250mg)在DCM(5ml)中的溶液加入2-氨基-3-羥基丙醇(250mg)。在室溫下16小時后，將混合物用DCM(50ml)稀釋，用飽和NaHCO3水溶液洗滌，干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)過HPLC純化，使用Luna C-18柱，使用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率117mg(TFA-鹽)MS-ESI[M+H]+＝519.2HPLCRt＝12.62min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例9叔丁基5-氨基-2-苯基-4-(3-((N-乙基-N-(2-羥基乙基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(a).5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-苯基-6-羥基-嘧啶將鹽酸芐脒(16.4g)、3-硝基苯甲醛(15.1g)、氰基乙酸乙酯(11.2ml)與碳酸鉀(16.6g)在絕對EtOH(250ml)中的混合物在60℃下攪拌8小時。將反應(yīng)混合物在冰浴中冷卻至0℃。濾出所得沉淀，用絕對EtOH洗滌，在水(100℃)中加熱，直至得到澄清溶液。將溶液冷卻至50℃，加入2N HCl水溶液酸化至pH2，在冰浴中冷卻至0℃。濾出所得沉淀，用冰水洗滌。用1，4-二噁烷共蒸發(fā)除去殘留的水。
收率15.0gMS-ESI[M+H]+＝319.2TLCRf＝0.3，硅膠，DCM/MeOH＝9/1(v/v)。
(b).6-氯-5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-苯基-嘧啶向攪拌著的5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-苯基-6-羥基-嘧啶(實施例9(a)，15.0g)與二甲基苯胺(0.5ml)在無水1，4-二噁烷p.a.(200ml)中的溶液加入POCl3(50ml)。在90℃下3小時后，濾出溫?zé)岬幕旌衔?，在減壓下濃縮濾液。將粗產(chǎn)物溶于1，4-二噁烷，加入冰水。濾出所得沉淀，用水洗滌。用1，4-二噁烷共蒸發(fā)除去殘留的水。
收率15.8gMS-ESI[M+H]+＝337.4TLCRf＝0.8，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(c).乙基5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-苯基-6-(乙氧羰基甲硫基)-嘧啶在氮氣氛下，向攪拌著的2-巰基乙酸乙酯(5.15ml)與6-氯-5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-苯基-嘧啶(實施例9(b)，15.8g)在EtOH(125ml)與DCM(125ml)混合物中的溶液加入DIPEA(8.71ml)。在室溫下2小時后，將混合物用DCM稀釋，直至完全溶解，用0.5N HCl水溶液洗滌，干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。
收率19.7gMS-ESI[M+H]+＝421.2TLCRf＝0.7，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(d).5-氨基-4-(3-硝基苯基)-2-苯基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯向攪拌著的乙基5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-苯基-6-(乙氧羰基甲硫基)-嘧啶(實施例9(c)，19.7g)在絕對EtOH(100ml)與甲苯p.a.(100ml)混合物中的溶液加入DIPEA(20.0ml)。在100℃下48小時后，將混合物冷卻至0℃。濾出所得沉淀，用冷EtOH洗滌，在40℃真空干燥。
收率17.0gMS-ESI[M+H]+＝421.2TLCRf＝0.5，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(e).5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-苯基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯向5-氨基-4-(3-硝基苯基)-2-苯基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯(實施例9(d)，16.6g)在1，4-二噁烷p.a.(250ml)中的溶液加入氯化錫(II)(23.0g)在絕對EtOH(250ml)中的溶液。加入37％HCl水溶液(6.9ml)，并將混合物在回流(90℃)下加熱16小時。將混合物冷卻至室溫，在減壓下濃縮。將殘余物懸浮在EtOAc(500ml)中。加入4N NaOH水溶液，得到pH10-11。將混合物用飽和NaCl水溶液稀釋。分離有機層，干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。
收率17.0gMS-ESI[M+H]+＝421.2TLCRf＝0.5，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(f).5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-苯基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸向5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-苯基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯(實施例9(e)，17.0g)在1，4-二噁烷(210ml)與水(80ml)混合物中的溶液加入氫氧化鉀(20.0g)。在90℃下16小時后，將混合起冷卻至0℃。濾出所得沉淀，懸浮在水(300ml)中，冷卻至0℃。將混合物用2N枸櫞酸水溶液酸化至pH3，在0℃至室溫下攪拌2小時。濾出所得沉淀，用水洗滌，在40℃真空干燥。
收率13.3gMS-ESI[M+H]+＝363.0TLCRf＝0.2，硅膠，DCM/MeOH＝95/5(v/v)。
(g).叔丁基5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-苯基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺在氮氣氛下，向5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-苯基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸(實施例9(f)，13.3g)在DCM(250ml)與DMF(50ml)混合物中的混合物加入DIPEA(15.3ml)、叔丁胺(9.3ml)和TBTU(14.1g)。在室溫下3小時后，將混合物用DCM稀釋，并用飽和NaHCO3水溶液、0.1N HCl水溶液和飽和NaCl水溶液洗滌。將有機層干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)過硅膠色譜法純化，使用庚烷/EtOAc＝3/7至1/1(v/v)作為洗脫劑。
收率14.7g
MS-ESI[M+H]+＝418.4TLCRf＝0.4，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(h).叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-苯基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向叔丁基5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-苯基-噻吩并[2，3-d]-嘧啶-6-酰胺(實施例9(g)，5.8g)與DIPEA(12.2ml)在DCM(50ml)中的溶液滴加溴乙酰氯(2.80ml)。在室溫下3小時后，將混合物用DCM稀釋，用飽和NaHCO3水溶液洗滌，干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)過硅膠色譜法純化，使用庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)作為洗脫劑。得到叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-苯基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺與叔丁基5-氨基-4-(3-(2-氯乙酰氨基)-苯基)-2-苯基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺的1∶1(mol/mol)混合物。
收率2.6gMS-ESI[M+H]+＝540.2，[M’+H]+＝494.2TLCRf＝0.3，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(i).叔丁基5-氨基-2-苯基-4-(3-((N-乙基-N-(2-羥基乙基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-苯基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例9(h)，500mg)在DCM(5ml)中的攪拌著的溶液中，加入N-乙基-2-氨基-乙醇(500mg)。在室溫下攪拌17小時后，將反應(yīng)混合物用DCM(100ml)稀釋，用NaHCO3水溶液(1M，2×50ml)洗滌，干燥(MgSO4)，在真空中濃縮。殘余物經(jīng)過HPLC純化，使用LunaC-18柱，使用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率271mg(TFA-鹽)MS-ESI[M+H]+＝547.2HPLCRt＝11.88min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例10叔丁基5-氨基-2-苯基-4-(3-(N-(甲氧羰基甲基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向攪拌著的叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-苯基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例9(h)，500mg)與N，N-二異丙基乙胺(DiPEA，1ml)在DCM(5ml)中的溶液加入甘氨酸甲酯鹽酸鹽(700mg)。在室溫下攪拌17小時后，將反應(yīng)混合物用DCM(100ml)稀釋，用NaHCO3水溶液(1M，2×50ml)洗滌，干燥(MgSO4)，在真空中濃縮。殘余物經(jīng)過HPLC純化，使用Luna C-18柱，采用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率321mg(TFA-鹽)MS-ESI[M+H]+＝547.2HPLCRt＝12.54min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例11叔丁基5-氨基-2-(2-呋喃基)-4-(3-((N-甲基-N-(2-羥基乙基)-甘氨酰基)-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(a).2-脒基呋喃向冷卻的(冰浴，0℃)含有2-糠腈(13ml)的反應(yīng)容器中加入冷卻的(0℃)飽和HCl乙醇溶液(40ml)。使所得溶液達(dá)到環(huán)境溫度，在氮氣氛下攪拌48小時。在真空中濃縮反應(yīng)混合物后，將含有相應(yīng)的2-呋喃基乙基亞氨酸酯(imidate)的殘余物重新溶于乙醇(20ml)，并在0℃氮氣氛下攪拌。隨后，加入飽和的氨乙醇溶液(40ml)，將反應(yīng)混合物在密封的反應(yīng)容器內(nèi)攪拌48小時。過濾反應(yīng)混合物后，在減壓下濃縮濾液。粗化合物無需進(jìn)一步純化即可用于下一步。
收率15.0g(b).5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-(2-呋喃基)-6-羥基-嘧啶將2-脒基呋喃(實施例11(a)，15g)、3-硝基苯甲醛(24g)、氰基乙酸乙酯(17ml)與碳酸鉀(25g)在絕對EtOH(300ml)中的混合物在60℃下攪拌16小時。將反應(yīng)混合物在冰浴中冷卻至0℃。濾出所得沉淀，用絕對EtOH洗滌，在水中加熱(100℃)并攪拌，直至得到乳狀懸浮液。將懸浮液冷卻至50℃，加入2N HCl水溶液酸化至pH2，在冰浴中冷卻至0℃。濾出所得沉淀，用冰水洗滌。用1，4-二噁烷共蒸發(fā)除去殘留的水。
收率16.0gMS-ESI[M+H]+＝309.2TLCRf＝0.3，硅膠，DCM/MeOH＝9/1(v/v)。
(c).6-氯-5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-(2-呋喃基)-嘧啶向攪拌著的5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-(2-呋喃基)-6-羥基-嘧啶(實施例11(b)，16.0g)與二甲基苯胺(0.5ml)在無水1，4-二噁烷p.a.(250ml)中的溶液加入POCl3(50ml)。在90℃下2小時后，過濾溫?zé)岬幕旌衔?，在減壓下濃縮濾液。將殘余物溶于1，4-二噁烷，加入冰水。濾出所得沉淀，用水洗滌。用1，4-二噁烷共蒸發(fā)除去殘留的水。
收率16.0gMS-ESI[M+H]+＝327.2TLCRf＝0.75，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(d).乙基5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-(2-呋喃基)-6-(乙氧羰基甲硫基)-嘧啶在氮氣氛下，向攪拌著的2-巰基乙酸乙酯(5.4ml)與6-氯-5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-(2-呋喃基)-嘧啶(實施例11(c)，16.0g)在EtOH(125ml)與DCM(125ml)混合物中的溶液加入DIPEA(9.1ml)。在室溫下2小時后，將混合物用DCM稀釋直至完全溶解，用0.5N HCl水溶液洗滌，干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。
收率20.0gMS-ESI[M+H]+＝411.2TLCRf＝0.7，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(e).5-氨基-4-(3-硝基苯基)-2-(2-呋喃基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯向攪拌著的乙基5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-(2-呋喃基)-6-(乙氧羰基甲硫基)-嘧啶(實施例11(d)，20g)在絕對EtOH(100ml)與甲苯p.a.(100ml)混合物中的溶液加入DIPEA(20.0ml)。在100℃下48小時后，將混合物冷卻至0℃。濾出所得沉淀，用冷EtOH洗滌，在40℃真空干燥。
收率20gMS-ESI[M+H]+＝411.2TLCRf＝0.6，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(f).5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-(2-呋喃基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯向5-氨基-4-(3-硝基苯基)-2-(2-呋喃基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯(實施例11(e)，20g)在1，4-二噁烷p.a.(250ml)中的溶液加入氯化錫(II)(28.0g)在絕對EtOH(250ml)中的溶液。加入37％HCl水溶液(8.5ml)，將混合物在回流(90℃)下加熱16小時。使混合物冷卻至室溫，在減壓下濃縮。將殘余物懸浮在EtOAc(500ml)中。加入4N NaOH水溶液，得到pH10-11。將混合物用飽和NaCl水溶液稀釋。分離有機層，干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。
收率17.5gMS-ESI[M+H]+＝381.2TLCRf＝0.4，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(g).5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-(2-呋喃基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸向5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-(2-呋喃基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯(實施例11(f)，17.5g)在1，4-二噁烷(210ml)與水(80ml)混合物中的溶液加入氫氧化鉀(23.0g)。在90℃下8小時后，將混合物冷卻至0℃。濾出所得沉淀并懸浮在水(300ml)中，冷卻至0℃。向混合物加入2N枸櫞酸水溶液酸化至pH3，在0℃至室溫下攪拌2小時。濾出所得沉淀，用水洗滌，在40℃真空干燥。
收率16.9gMS-ESI[M+H]+＝353.2TLCRf＝0.2，硅膠，DCM/MeOH＝95/5(v/v)。
(h).叔丁基5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-(2-呋喃基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺在氮氣氛下，向5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-(2-呋喃基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸(實施例11(g)，16.9g)在DCM(250ml)與DMF(50ml)混合物中的溶液加入DIPEA(19.2ml)、叔丁胺(11.6ml)和TBTU(17.7g)。在室溫下3小時后，生成大量黃色沉淀，濾出。將殘余物用乙醚洗滌，在40℃真空干燥。
收率18.0gMS-ESI[M+H]+＝408.2TLCRf＝0.4，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(i).叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-(2-呋喃基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向叔丁基5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-(2-呋喃基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例11(h)，250mg)與DIPEA(0.5ml)在DCM(5ml)中的溶液滴加溴乙酰氯(100μl)。在室溫下3小時后，將混合物用DCM稀釋，用飽和NaHCO3水溶液洗滌，干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)過硅膠色譜法純化，使用庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)作為洗脫劑。得到叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-(2-噻吩基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺與叔丁基5-氨基-4-(3-(2-氯乙酰氨基)-苯基)-2-(2-噻吩基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺的1∶1(mol/mol)混合物。
收率124mgMS-ESI[M+H]+＝540.2，[M’+H]+＝494.2TLCRf＝0.3，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(j).叔丁基5-氨基-2-(2-呋喃基)-4-(3-((N-甲基-N-(2-羥基乙基)-甘氨酰基)-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向攪拌著的叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-(2-呋喃基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例11(i)，130mg)在DCM(5ml)中的溶液加入N-甲基-2-氨基-乙醇(200mg)。在室溫下攪拌17小時后，將反應(yīng)混合物用DCM(50ml)稀釋，用NaHCO3水溶液(1M，2×10ml)洗滌，干燥(MgSO4)，在真空中濃縮。殘余物經(jīng)過HPLC純化，使用Luna C-18柱，采用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率81mg(TFA-鹽)MS-ESI[M+H]+＝523.2HPLCRt＝11.01min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例12叔丁基5-氨基-2-(2-呋喃基)-4-(3-(N-(1-羥基-2-甲基-丙-2-基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向攪拌著的叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-(2-呋喃基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例11(i)，130mg)在DCM(5ml)中的溶液加入2-氨基-2-甲基-丙醇(260mg)。在室溫下攪拌17小時后，將反應(yīng)混合物用DCM(50ml)稀釋，用NaHCO3水溶液(1M，2×10ml)洗滌，干燥(MgSO4)，在真空中濃縮。殘余物經(jīng)過HPLC純化，使用Luna C-18柱，采用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率54mg(TFA-鹽)MS-ESI[M+H]+＝537.2HPLCRt＝11.15min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例13叔丁基5-氨基-2-(2-呋喃基)-4-(3-(N-(甲氧羰基甲基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向攪拌著的叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-(2-呋喃基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例11(i)，130mg)與DiPEA(0.5ml)在DCM(5ml)中的溶液加入甘氨酸甲酯鹽酸鹽(324mg)。在室溫下攪拌17小時后，將反應(yīng)混合物用DCM(50ml)稀釋，用NaHCO3水溶液(1M，2×10ml)洗滌，干燥(MgSO4)，在真空中濃縮。殘余物經(jīng)過HPLC純化，使用Luna C-18柱，采用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率74mg(TFA-鹽)MS-ESI[M+H]+＝537.2HPLCRt＝12.09min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例14叔丁基5-氨基-2-(2-噻吩基)-4-(3-((N-甲基-N-(2-羥基乙基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺
(a).5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-(2-噻吩基)-6-羥基-嘧啶將鹽酸2-脒基噻吩(10.0g)、3-硝基苯甲醛(9.7g)、氰基乙酸乙酯(6.81ml)與碳酸鉀(10.1g)在絕對EtOH(200ml)中的混合物在60℃下攪拌8小時。將反應(yīng)混合物在冰浴中冷卻至0℃，過濾，用絕對EtOH洗滌，將殘余物溶于水(100℃)。將溶液冷卻至50℃，用2N HCl水溶液酸化至pH2，在冰浴中冷卻至0℃。濾出所得沉淀，用冰水洗滌。用1，4-二噁烷共蒸發(fā)除去殘留的水。
收率10.0gMS-ESI[M+H]+＝325.0TLCRf＝0.3，硅膠，DCM/MeOH＝9/1(v/v)。
(b).6-氯-5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-(2-噻吩基)-嘧啶向攪拌著的5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-(2-噻吩基)-6-羥基-嘧啶(實施例14(a)，10.0g)與二甲基苯胺(幾滴)在無水1，4-二噁烷(150ml)中的溶液加入POCl3(30ml)。在90℃下3小時后，將混合物冷卻至室溫，在減壓下濃縮。將殘余物溶于1，4-二噁烷，小心地加入冰水。濾出所得沉淀，用水洗滌。用1，4-二噁烷共蒸發(fā)除去殘留的水，并在40℃真空干燥。
收率9.8gMS-ESI[M+H]+＝343.4TLCRf＝0.8，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(c).乙基5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-(2-噻吩基)-6-(乙氧羰基甲硫基)-嘧啶在氮氣氛下，向攪拌著的2-巰基乙酸乙酯(3.28ml)與6-氯-5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-(2-噻吩基)-嘧啶(實施例14(b)，9.8g)在EtOH(80ml)與DCM(80ml)混合物中的溶液加入DIPEA(5.57ml)。在室溫下2小時后，將混合物用DCM稀釋直至完全溶解，用0.5N HCl水溶液洗滌，干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。
收率12.9gMS-ESI[M+H]+＝427.2
TLCRf＝0.7，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(d).5-氨基-4-(3-硝基苯基)-2-(2-噻吩基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯向攪拌著的乙基5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-(2-噻吩基)-6-(乙氧羰基甲硫基)-嘧啶(實施例14(c)，12.9g)在絕對EtOH(75ml)與甲苯p.a.(75ml)混合物中的溶液加入DIPEA(13.0ml)。在100℃下48小時后，將混合物冷卻至0℃。濾出所得沉淀，用冷EtOH洗滌，在40℃真空干燥。
收率11.0gMS-ESI[M+H]+＝427.2TLCRf＝0.6，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(e).5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-(2-噻吩基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯向5-氨基-4-(3-硝基苯基)-2-(2-噻吩基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯(實施例14(d)，10.86g)在1，4-二噁烷(150ml)中的溶液加入氯化錫(II)(15g)在絕對EtOH(150ml)中的溶液。加入37％HCl水溶液(4.5ml)，將混合物在回流下加熱16小時。使混合物冷卻至室溫，在減壓下濃縮。將殘余物懸浮在EtOAc(400ml)中，加入THF直至完全溶解。加入4N NaOH水溶液，得到pH10-11。將混合物用飽和NaCl水溶液稀釋。分離有機層，干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。
收率12.0gMS-ESI[M+H]+＝397.2TLCRf＝0.4，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(f).5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-(2-噻吩基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸向5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-(2-噻吩基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯(實施例14(e)，10.1g)在1，4-二噁烷(150ml)與水(50ml)混合物中的溶液加入氫氧化鉀(13g)。在90℃下16小時后，將混合物冷卻至0℃。濾出所得沉淀，懸浮在水(180ml)中，冷卻至0℃。向混合物加入2N枸櫞酸水溶液酸化至pH3，在0℃下攪拌2小時。濾出所得沉淀，用水洗滌，在40℃真空干燥。
收率6.3gMS-ESI[M+H]+＝369.2TLCRf＝0.2，硅膠，DCM/MeOH＝95/5(v/v)。
(g).叔丁基5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-(2-噻吩基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺在氮氣氛下，向5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-(2-噻吩基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸(實施例14(f)，6.3g)在DCM(125ml)與DMF(N，N-二甲基甲酰胺)(25ml)混合物中的混合物中，加入DIPEA(7.1ml)、叔丁胺(4.3ml)和TBTU(6.6g)。在室溫下3小時后，將混合物用DCM稀釋，用飽和NaHCO3水溶液、0.1N HCl水溶液和飽和NaCl水溶液洗滌。將有機層干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)過硅膠色譜法純化，使用庚烷/EtOAc＝3/7至1/1(v/v)作為洗脫劑。
收率6.45gMS-ESI[M+H]+＝424.2TLCRf＝0.3，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(h).叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-(2-噻吩基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向叔丁基5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-(2-噻吩基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例14(g)，5.0g)與DIPEA(10.5ml)在DCM(50ml)中的溶液加入溴乙酰氯(2.40ml)。在室溫下3小時后，將混合物用DCM稀釋，用飽和NaHCO3水溶液洗滌，干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)過硅膠色譜法純化，使用庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)作為洗脫劑。得到叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-(2-噻吩基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺與叔丁基5-氨基-4-(3-(2-氯乙酰氨基)-苯基)-2-(2-噻吩基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺的混合物。
收率3.0gMS-ESI[M+H]+＝546.2，[M’+H]+＝500.2
TLCRf＝0.2，硅膠，甲苯/EtOAc＝7/1(v/v)。
(i).叔丁基5-氨基-2-(2-噻吩基)-4-(3-((N-甲基-N-(2-羥基乙基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向攪拌著的叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-(2-噻吩基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例14(h)，100mg)在DCM(5ml)中的溶液加入N-甲基-2-氨基-乙醇(140mg)。在室溫下攪拌17小時后，將反應(yīng)混合物用DCM(50ml)稀釋，用NaHCO3水溶液(1M，2×10ml)洗滌，干燥(MgSO4)，在真空中濃縮。殘余物經(jīng)過HPLC純化，使用Luna C-18柱，采用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率59mg(TFA-鹽)MS-ESI[M+H]+＝539.2HPLCRt＝11.01min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例15叔丁基5-氨基-2-(2-噻吩基)-4-(3-((N-(甲氧羰基甲基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向攪拌著的叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-(2-噻吩基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例14(h)，100mg)與DiPEA(0.5ml)在DCM(5ml)中的溶液加入甘氨酸甲酯鹽酸鹽(250mg)。在室溫下攪拌17小時后，將反應(yīng)混合物用DCM(50ml)稀釋，用NaHCO3水溶液(1M，2×10ml)洗滌，干燥(MgSO4)，在真空中濃縮。殘余物經(jīng)過HPLC純化，使用Luna C-18柱，采用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率74mg(TFA-鹽)
MS-ESI[M+H]+＝553.0HPLCRt＝12.57min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例16叔丁基5-氨基-2-(2-噻吩基)-4-(3-((N，N-二-(2-甲氧基乙基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向攪拌著的叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-(2-噻吩基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例14(h)，100mg)在DCM(5ml)中的溶液加入N，N-二-(2-甲氧基乙基)-胺(200mg)。在室溫下攪拌17小時后，將反應(yīng)混合物用DCM(50ml)稀釋，用NaHCO3水溶液(1M，2×10ml)洗滌，干燥(MgSO4)，在真空中濃縮。殘余物經(jīng)過HPLC純化，使用Luna C-18柱，采用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率59mg(TFA-鹽)MS-ESI[M+H]+＝597.4HPLCRt＝13.84min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例17叔丁基5-氨基-2-乙氨基-4-(3-((N-乙基-N-(2-甲氧基乙基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(a).叔丁基5-氨基-2-甲亞磺?；?4-(3-((N-乙基-N-(2-甲氧基乙基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向攪拌著的叔丁基5-氨基-2-甲硫基-4-(3-((N-乙基-N-(2-甲氧基乙基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例4，1.0g)在三氟乙酸(TFA，25ml)中的溶液加入3-氯過苯甲酸(m-CPBA，1.0g)。17小時后，將反應(yīng)混合物在環(huán)境溫度(20℃)下減壓濃縮，重新溶于DCM(100ml)，小心地用飽和NaHCO3水溶液(2×50ml)和水(50ml)洗滌，干燥(MgSO4)，在真空中濃縮。粗殘余物無需進(jìn)一步純化即可用于下一步。
收率820mgMS-ESI[M+H]+＝547.3TLCRf＝0.2，硅膠，DCM/MeOH＝9/1(v/v)。
(b).叔丁基5-氨基-2-乙氨基-4-(3-((N-乙基-N-(2-甲氧基乙基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向攪拌著的叔丁基5-氨基-2-甲亞磺?；?4-(3-((N-乙基-N-(2-甲氧基乙基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例17(a)，100mg)與DiPEA(0.5ml)在1，4-二噁烷(5ml)中的溶液加入鹽酸乙胺(150mg)，將反應(yīng)混合物加熱至60℃維持3小時。在減壓下濃縮反應(yīng)混合物后，將殘余物溶于DCM(50ml)，用鹽水(1M，25ml)和水(25ml)洗滌。隨后，將有機層干燥(MgSO4)，在真空中濃縮。如此得到的殘余物經(jīng)過HPLC純化，使用Luna C-18柱，采用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率36mg(TFA-鹽)MS-ESI[M+H]+＝528.4HPLCRt＝10.21min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例18叔丁基5-氨基-2-(N，N-二甲氨基)-4-(3-((N-甲基-N-(2-羥基乙基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺
(a).叔丁基5-氨基-2-甲亞磺?；?4-(3-((N-甲基-N-(2-羥基乙基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向攪拌著的叔丁基5-氨基-2-甲硫基-4-(3-((N-甲基-N-(2-羥基乙基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例1(i)，1.0g)在三氟乙酸(TFA，25ml)中的溶液加入3-氯過苯甲酸(m-CPBA，1.0g)。17小時后，將反應(yīng)混合物在環(huán)境溫度(20℃)下減壓濃縮，重新溶于DCM(100ml)，小心地用飽和NaHCO3水溶液(2×50ml)和水(50ml)洗滌，干燥(MgSO4)，在真空中濃縮。粗殘余物無需進(jìn)一步純化即可用于下一步。
收率910mgMS-ESI[M+H]+＝519.6TLCRf＝0.15，硅膠，DCM/MeOH＝9/1(v/v)。
(b).叔丁基5-氨基-2-(N，N-二甲氨基)-4-(3-((N-甲基-N-(2-羥基乙基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向攪拌著的叔丁基5-氨基-2-甲亞磺?；?4-(3-((N-甲基-N-(2-羥基乙基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例18(a)，100mg)與DiPEA(0.5ml)在1，4-二噁烷(5ml)中的溶液加入鹽酸二甲胺(150mg)，將反應(yīng)混合物加熱至60℃維持3小時。在減壓下濃縮反應(yīng)混合物后，將殘余物溶于DCM(50ml)，用鹽水(1M，25ml)和水(25ml)洗滌。隨后，將有機層干燥(MgSO4)，在真空中濃縮。如此得到的殘余物經(jīng)過HPLC純化，使用Luna C-18柱，采用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率36mg(TFA-鹽)MS-ESI[M+H]+＝500.2HPLCRt＝10.03min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例19叔丁基5-氨基-2-乙氨基-4-(3-((N-(甲氧羰基甲基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(a).叔丁基5-氨基-2-甲亞磺酰基-4-(3-((N-(甲氧羰基甲基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向攪拌著的叔丁基5-氨基-2-甲硫基-4-(3-((N-(甲氧羰基甲基)-甘氨酰基)-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例3，1.0g)在三氟乙酸(TFA，25ml)中的溶液加入3-氯過苯甲酸(m-CPBA，1.0g)。17小時后，將反應(yīng)混合物在環(huán)境溫度(20℃)減壓下濃縮，重新溶于DCM(100ml)，小心地用飽和NaHCO3水溶液(2×50ml)和水(50ml)洗滌，干燥(MgSO4)，在真空中濃縮。粗殘余物無需進(jìn)一步純化即可用于下一步。
收率680mgMS-ESI[M+H]+＝533.6TLCRf＝0.17，硅膠，DCM/MeOH＝9/1(v/v)。
(b).叔丁基5-氨基-2-乙氨基-4-(3-((N-(甲氧羰基甲基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向攪拌著的叔丁基5-氨基-2-甲亞磺?；?4-(3-((N-(甲氧羰基甲基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例19(a)，100mg)與DiPEA(0.5ml)在1，4-二噁烷(5ml)中的溶液加入鹽酸乙胺(150mg)，將反應(yīng)混合物加熱至60℃達(dá)3小時。在減壓下濃縮反應(yīng)混合物后，將殘余物溶于DCM(50ml)，用鹽水(1M，25ml)和水(25ml)洗滌。隨后，將有機層干燥(MgSO4)，在真空中濃縮。如此得到的殘余物經(jīng)過HPLC純化，使用Luna C-18柱，采用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率57mg(TFA-鹽)
MS-ESI[M+H]+＝514.2HPLCRt＝12.56min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例20叔丁基5-氨基-2-異丙氨基-4-(3-((N-乙基-N-(2-甲氧基乙基)-甘氨酰基)-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向攪拌著的叔丁基5-氨基-2-甲亞磺酰基-4-(3-((N-乙基-N-(2-甲氧基乙基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例17(a)，100mg)與DiPEA(0.5ml)在1，4-二噁烷(5ml)中的溶液加入異丙胺(150mg)，將反應(yīng)混合物加熱至60℃達(dá)3小時。在減壓下濃縮反應(yīng)混合物后，將殘余物溶于DCM(50ml)，用鹽水(1M，25ml)和水(25ml)洗滌。隨后，將有機層干燥(MgSO4)，在真空中濃縮。如此得到的殘余物經(jīng)過HPLC純化，使用Luna C-18柱，采用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率57mg(TFA-鹽)MS-ESI[M+H]+＝542.4HPLCRt＝11.01min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例21叔丁基5-氨基-2-烯丙氨基-4-(3-((N-(甲氧羰基甲基)-甘氨酰基)-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向攪拌著的叔丁基5-氨基-2-甲亞磺?；?4-(3-((N-(甲氧羰基甲基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例19(a)，100mg)與DiPEA(0.5ml)在1，4-二噁烷(5ml)中的溶液加入烯丙胺(200mg)，將反應(yīng)混合物加熱至60℃達(dá)3小時。在減壓下濃縮反應(yīng)混合物后，將殘余物溶于DCM(50ml)，用鹽水(1M，25ml)和水(25ml)洗滌。隨后，將有機層干燥(MgSO4)，在真空中濃縮。如此得到的殘余物經(jīng)過HPLC純化，使用Luna C-18柱，采用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率65mg(TFA-鹽)MS-ESI[M+H]+＝526.4HPLCRt＝13.18min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例22叔丁基5-氨基-2-甲氧基-4-(3-((N-乙基-N-(2-甲氧基乙基)-甘氨酰基)-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向攪拌著的叔丁基5-氨基-2-甲亞磺?；?4-(3-((N-乙基-N-(2-甲氧基乙基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例17(a)，200mg)在甲醇(5ml)中的溶液加入叔丁醇鉀(100mg)，將反應(yīng)混合物加熱至50℃達(dá)3小時。在減壓下濃縮反應(yīng)混合物后，將殘余物溶于DCM(50ml)，用氯化銨水溶液(1M，25ml)、鹽水(1M，25ml)和水(25ml)洗滌。隨后，將有機層干燥(MgSO4)，在真空中濃縮。如此得到的殘余物經(jīng)過HPLC純化，使用Luna C-18柱，采用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA與水的混合物中冷凍干燥。
收率92mg(TFA-鹽)MS-ESI[M+H]+＝515.4
HPLCRt＝12.21min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例23叔丁基5-氨基-2-烯丙氧基-4-(3-((N-乙基-N-(2-甲氧基乙基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向攪拌著的叔丁基5-氨基-2-甲亞磺?；?4-(3-((N-乙基-N-(2-甲氧基乙基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例17(a)，200mg)在烯丙醇(5ml)中的溶液加入叔丁醇鉀(100mg)，將反應(yīng)混合物加熱至50℃達(dá)3小時。在減壓下濃縮反應(yīng)混合物后，將殘余物溶于DCM(50ml)，用氯化銨水溶液(1M，25ml)、鹽水(1M，25ml)和水(25ml)洗滌。隨后，將有機層干燥(MgSO4)，在真空中濃縮。如此得到的殘余物經(jīng)過HPLC純化，使用Luna C-18柱，采用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率63mg(TFA-鹽)MS-ESI[M+H]+＝541.4HPLCRt＝12.71min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例24叔丁基5-氨基-2-異丙氧基-4-(3-((N-乙基-N-(2-甲氧基乙基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向攪拌著的叔丁基5-氨基-2-甲亞磺?；?4-(3-((N-乙基-N-(2-甲氧基乙基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例17(a)，200mg)在異丙醇(5ml)中的溶液加入叔丁醇鉀(100mg)，將反應(yīng)混合物加熱至50℃達(dá)3小時。在減壓下濃縮反應(yīng)混合物后，將殘余物溶于DCM(50ml)，用氯化銨水溶液(1M，25ml)、鹽水(1M，25ml)和水(25ml)洗滌。隨后，將有機層干燥(MgSO4)，在真空中濃縮。如此得到的殘余物經(jīng)過HPLC純化，使用Luna C-18柱，采用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率32mg(TFA-鹽)MS-ESI[M+H]+＝543.4HPLCRt＝12.93min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例25叔丁基5-氨基-2-(4-吡啶基)-4-(3-((N-(1-羥基-2-甲基-丙-2-基)-甘氨酰基)-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(a).5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-(4-吡啶基)-6-羥基-嘧啶將鹽酸4-脒基吡啶(16.5g)、3-硝基苯甲醛(15.1g)、氰基乙酸乙酯(11.2ml)與碳酸鉀(16.6g)在絕對EtOH(250ml)中的混合物在60℃下攪拌16小時。將反應(yīng)混合物在冰浴中冷卻至0℃，濾出所得沉淀，用絕對EtOH洗滌，在水中加熱(100℃)直至得到澄清溶液。將溶液冷卻至50℃，用2N HCl水溶液酸化至pH2，在冰浴中冷卻至0℃。濾出所得沉淀，用冰水洗滌。用1，4-二噁烷共蒸發(fā)除去殘留的水。
收率18.3gMS-ESI[M+H]+＝320.2TLCRf＝0.2，硅膠，DCM/MeOH＝9/1(v/v)。
(b).6-氯-5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-(4-吡啶基)-嘧啶向攪拌著的5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-(4-吡啶基)-6-羥基-嘧啶(實施例25(a)，18.3g)與二甲基苯胺(0.5ml)在無水1，4-二噁烷p.a.(200ml)中的溶液加入POCl3(50ml)。在90℃下3小時后，過濾溫?zé)岬幕旌衔?，在減壓下濃縮濾液。將殘余物溶于1，4-二噁烷，加入冰水。濾出所得沉淀，用水洗滌。用1，4-二噁烷共蒸發(fā)除去殘留的水。
收率17.2gMS-ESI[M+H]+＝338.4TLCRf＝0.7，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(c).乙基5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-(4-吡啶基)-6-(乙氧羰基甲硫基)-嘧啶在氮氣氛下，向攪拌著的2-巰基乙酸乙酯(5.7ml)與6-氯-5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-(4-吡啶基)-嘧啶(實施例25(b)，17.2g)在EtOH(125ml)與DCM(125ml)混合物中的溶液加入DIPEA(9.8ml)。在室溫下2小時后，將混合物用DCM稀釋直至完全溶解，用0.5N HCl水溶液洗滌，干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。
收率20.5gMS-ESI[M+H]+＝422.0TLCRf＝0.6，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(d).5-氨基-4-(3-硝基苯基)-2-(4-吡啶基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯向攪拌著的乙基5-氰基-4-(3-硝基苯基)-2-(4-吡啶基)-6-(乙氧羰基甲硫基)-嘧啶(實施例25(c)，20.5g)在絕對EtOH(100ml)與甲苯p.a.(100ml)混合物中的溶液加入DIPEA(20.0ml)。在100℃下48小時后，將混合物冷卻至0℃。濾出所得沉淀，用冷EtOH洗滌，在40℃真空中干燥。
收率15.7gMS-ESI[M+H]+＝422.2TLCRf＝0.5，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(e).5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-(4-吡啶基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯向5-氨基-4-(3-硝基苯基)-2-(4-吡啶基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯(實施例25(d)，15.7g)在1，4-二噁烷p.a.(250ml)中的溶液加入氯化錫(II)(21.0g)在絕對EtOH(250ml)中的溶液。加入37％HCl水溶液(6.9ml)，將混合物在回流(90℃)下加熱16小時。使混合物冷卻至室溫，在減壓下濃縮。將殘余物懸浮在EtOAc(500ml)中。加入4N NaOH水溶液，得到pH10-11。將混合物用飽和NaCl水溶液稀釋。分離有機層，干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。
收率12.0gMS-ESI[M+H]+＝392.2TLCRf＝0.3，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(f).5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-(4-吡啶基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸向5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-(4-吡啶基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯(實施例25(e)，12.0g)在1，4-二噁烷(210ml)與水(80ml)混合物中的溶液加入氫氧化鉀(15.7g)。在90℃下16小時后，將混合物冷卻至0℃。濾出所得沉淀，懸浮在水(300ml)中，冷卻至0℃。向混合物加入2N枸櫞酸水溶液酸化至pH3，在0℃至室溫下攪拌2小時。濾出所得沉淀，用水洗滌，在40℃真空中干燥。
收率12.0gMS-ESI[M+H]+＝364.2TLCRf＝0.1，硅膠，DCM/MeOH＝95/5(v/v)。
(g).叔丁基5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-(4-吡啶基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺在氮氣氛下，向5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-(4-吡啶基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸(實施例25(f)，12.0g)在DCM(250ml)與DMF(50ml)混合物中的混合物加入DIPEA(12.9ml)、叔丁胺(7.8ml)和TBTU(11.9g)。在室溫下2小時后，將混合物用DCM稀釋，用飽和NaHCO3水溶液、0.1N HCl水溶液和飽和NaCl水溶液洗滌。將有機層干燥(MgSO4)，在減壓下濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)過硅膠色譜法純化，使用二氯甲烷/甲醇＝1/0至95/5(v/v)作為洗脫劑。
收率12.2gMS-ESI[M+H]+＝419.4TLCRf＝0.3，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(h).叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-(4-吡啶基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向叔丁基5-氨基-4-(3-氨基苯基)-2-(4-吡啶基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例25(g)，2.0g)與N，N-二甲基苯胺(3.0ml)在THF(50ml)中的溶液滴加溴乙酰溴(0.59ml)在THF(25ml)中的溶液。在室溫下30分鐘后，將混合物在減壓下濃縮，隨后溶于DCM(100ml)，用飽和NaHCO3水溶液洗滌，干燥(MgSO4)，在真空中濃縮。殘余物無需進(jìn)一步純化即可用于下一步。
收率2.3gMS-ESI[M+H]+＝539.2TLCRf＝0.3，硅膠，庚烷/EtOAc＝3/2(v/v)。
(i).叔丁基5-氨基-2-(4-吡啶基)-4-(3-((N-(1-羥基-2-甲基-丙-2-基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向攪拌著的叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-(4-吡啶基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例25(h)，200mg)在DCM(5ml)中的溶液加入2-氨基-2-甲基-丙醇(300mg)。在室溫下攪拌17小時后，將反應(yīng)混合物用DCM(100ml)稀釋，用NaHCO3水溶液(1M，2×50ml)洗滌，干燥(MgSO4)，在真空中濃縮。殘余物經(jīng)過HPLC純化，使用Luna C-18柱，采用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率73mg(TFA-鹽)MS-ESI[M+H]+＝548.2HPLCRt＝9.65min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例26叔丁基5-氨基-2-(4-吡啶基)-4-(3-((N，N-雙-(2-甲氧基乙基)-甘氨?；?-氨基)-苯基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺向攪拌著的叔丁基5-氨基-4-(3-(2-溴乙酰氨基)-苯基)-2-(4-吡啶基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-酰胺(實施例25(h)，200mg)在DCM(5ml)中的溶液加入雙-(2-甲氧基乙基)-胺(300mg)。在室溫下攪拌17小時后，將反應(yīng)混合物用DCM(100ml)稀釋，用NaHCO3水溶液(1M，2×50ml)洗滌，干燥(MgSO4)，在真空中濃縮。殘余物經(jīng)過HPLC純化，使用Luna C-18柱，采用如下梯度0.1％TFA水溶液+10％ACN水溶液/ACN＝90/10至10/90(v/v)，時間30min。然后將標(biāo)題化合物從1，4-二噁烷、0.1％TFA水溶液與水的混合物中冷凍干燥。
收率170mg(TFA-鹽)MS-ESI[M+H]+＝592.2HPLCRt＝12.02min，柱子Luna C-18(2)，3μm，100×2.0mm，檢測UV＝210nm，爐溫＝40℃，流速＝0.25ml/min，洗脫劑磷酸鹽緩沖液50mM pH2.1/水/ACN＝10/80/10至10/10/80(v/v/v)，運轉(zhuǎn)時間＝20min。
實施例27CHO-LH和CHO-FSH體外生物活性在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中測試化合物的LH激動活性，該細(xì)胞用人LH受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，并且用指導(dǎo)蟲熒光素酶報道基因表達(dá)的cAMP響應(yīng)性元件(CRE)/啟動子共同轉(zhuǎn)染。配體與Gs-偶聯(lián)LH受體的結(jié)合將導(dǎo)致cAMP的增加，這繼而誘導(dǎo)熒光素酶報道基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)活化增加。利用熒光計數(shù)器量化熒光素酶的信號。計算供試化合物的EC50值(供試化合物導(dǎo)致最大值一半(50％)刺激的濃度)。為此，使用軟件程序GraphPad PRISM，3.0版(GraphPad software Inc.，San Diego)。
按相似的方式，在CHO細(xì)胞中測試化合物的FSH激動活性，該細(xì)胞用熒光素酶報道基因和人FSH受體轉(zhuǎn)染。結(jié)果如表1所示。
體內(nèi)生物活性為了測量LH/FSH受體激動性化合物的體內(nèi)活性，研究了未成熟小鼠的排卵誘導(dǎo)。在該測定法中，將未成熟的雌性小鼠用尿FSH進(jìn)行抗原接觸(Humegon 12.5IU/動物)。大約48小時后，將動物用LH/FSH激動性化合物處理，所述化合物的制備如實施例1、4、9和17所述，劑量水平為50mg/kg。在LH/FSH激動劑處理后24小時殺死動物，在顯微鏡下評估輸卵管中的卵子數(shù)量。平均測試了10-15只動物。平均卵子數(shù)達(dá)到8個，實施例17化合物除外(該化合物為0.4個)。
表權(quán)利要求
1.通式I的噻吩并[2，3-d]嘧啶衍生物 (式I)或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中X是O或H，H；A是S、NH、N(R6)、O或一條鍵；R1是(1-4C)烷基、(2-4C)烯基、苯基或(2-5C)雜芳基，所述苯基或雜芳基環(huán)可選地被一個或多個下列取代基取代羥基、鹵素、硝基、三氟甲基、氰基、氨基或(1-4C)(二)烷基氨基；R2是H、(1-4C)烷基、(1-4C)烷氧基(2-4C)烷基或羥基(2-4C)烷基；R3和R4獨立地選自H、(1-4C)烷基和羥基(1-4C)烷基；R5是H或(1-4C)烷基；和R6選自與R1所述相同的基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中X是H，H。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的化合物，其中R5是(1-4C)烷基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的化合物，其中R3＝R4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的化合物，其中R3＝R4＝H。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的化合物，其中R2是(1-4C)烷基。
7.用于治療的根據(jù)權(quán)利要求1-6的化合物。
8.藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1-6的噻吩并[2，3-d]嘧啶化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物以及藥學(xué)上可接受的助劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-6的噻吩并[2，3-d]嘧啶化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物在用于生育控制的藥物制造中的用途。
10.治療患者生育障礙的方法，該方法對需要的患者給以有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-6的化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及通式(I)的甘氨酸取代的噻吩并[2，3－d]嘧啶衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中X是O或H，H；A是S、NH、N(R
文檔編號C07D495/04GK1551883SQ02817240
公開日2004年12月1日 申請日期2002年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月4日
發(fā)明者R·G·J·M·漢森, C·M·緹密爾斯, J·克爾德, R G J M 漢森, 緹密爾斯 申請人:阿克佐諾貝爾公司