本發(fā)明涉及一種檢測(cè)蛋白的熒光試劑，特別涉及一種用于檢測(cè)微量卵清白蛋白和h5n1血凝素蛋白的實(shí)時(shí)“點(diǎn)亮”型熒光試劑，屬于熒光生物傳感器領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

卵清蛋白就是動(dòng)物卵中的貯藏蛋白，是給發(fā)育中的胚胎提供氨基酸的。植物種子中也有許多貯藏蛋白，是種子萌發(fā)的養(yǎng)料來(lái)源，也是食物中重要的蛋白質(zhì)來(lái)源。卵清蛋白是一種糖蛋白，含有微量的磷，是卵清中蛋白質(zhì)的主要成分，約占65％。雞的卵清蛋白分子量約4萬(wàn)5千，氨基末端是甘氨酸，但其氨基被乙酞化。在生物制品行業(yè)，通常被用來(lái)與小分子半抗原偶聯(lián)，合成完全抗原，用于免疫動(dòng)物或者包被酶標(biāo)板。sugawara等報(bào)道了用電活性化合物標(biāo)記的肽對(duì)卵清白蛋白的伏安法測(cè)定，檢測(cè)限為2.3×10^-11mol/l，但是操作比較復(fù)雜。目前，中國(guó)藥品生物制品檢定所采用德國(guó)seramun試劑盒，但進(jìn)口試劑盒價(jià)格昂貴，使常規(guī)應(yīng)用受到限制。

禽流感(ai)是由a型流感病毒引起的一種禽類(lèi)烈性傳染病。自1878年意大利首先發(fā)現(xiàn)至今，該病在全球范圍暴發(fā)與流行。目前，高致病性禽流感(highlypathogenicavianinfluenza,hp：ai)己被國(guó)際獸疫局規(guī)定為a類(lèi)傳染病。近年來(lái)，hpai的暴發(fā)給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。病毒衣殼的識(shí)別蛋白血凝素(ha)與宿主細(xì)胞的糖綴合物之間的相互作用的特異性(選擇性)也有助于病毒在人之間的氣溶膠的有效擴(kuò)散。因此，檢測(cè)識(shí)別血凝素蛋白具有重要意義。cheng-yuli等人利用單個(gè)近紅外納秒脈沖激光器進(jìn)行雙光子激發(fā)基于雙光子激發(fā)的光鑷對(duì)于h5n1病毒基因序列的熒光檢測(cè)，該方法對(duì)于血凝素蛋白(ha)的檢測(cè)限為18pm。但是目前對(duì)于ha的檢測(cè)方法操作都比較復(fù)雜，且成本高，因此對(duì)病毒的檢測(cè)受到限制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)微量蛋白的實(shí)時(shí)“點(diǎn)亮”型熒光試劑，所述熒光試劑可以定量檢測(cè)卵清白蛋白以及h5n1血凝素蛋白的濃度，而且檢測(cè)靈敏度高且非?？旖?，檢測(cè)成本低。

本發(fā)明的目的由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種用于檢測(cè)微量蛋白的實(shí)時(shí)“點(diǎn)亮”型熒光試劑，所述熒光試劑由物質(zhì)a、二甲基亞砜(dmso)和溶液b組成；

所述物質(zhì)a為hpb-pf6、hpb-clo4或hpb-bf4，其結(jié)構(gòu)式如下：

其中，x為f6^-、clo4^-或bf4^-；

所述溶液b為去離子水、磷酸鹽緩沖液或生理鹽水；

所述蛋白為卵清白蛋白或h5n1血凝素蛋白。

所述熒光試劑中，物質(zhì)a的濃度為10^-6mol/l～10^-4mol/l；二甲基亞砜的體積與溶液b的體積比為1:99～1:9999。

所述熒光試劑適用于對(duì)濃度為0.5μg/ml～10μg/ml的卵清白蛋白以及濃度不大于1.67μg/ml的h5n1血凝素蛋白進(jìn)行檢測(cè)。

一種本發(fā)明所述的用于檢測(cè)微量蛋白的實(shí)時(shí)“點(diǎn)亮”型熒光試劑的制備方法，所述方法步驟如下：

(1)將4,4'-((1e，1'e)-(((1e，3e)-1,2,3,4-四苯基丁-1,3-二烯(1,4-亞苯基))雙(乙烯-1,2-二基)))雙(n-甲基吡啶鎓)碘化物(hpb-pym)溶于乙腈中，再加入鉀鹽，0℃～30℃下反應(yīng)1h～2h，進(jìn)行后處理即得到物質(zhì)a；

(2)將步驟1制備得到的物質(zhì)a溶解于dmso中，再加入溶液b，混合均勻，得到所述熒光試劑。

所述鉀鹽為kpf6、kclo4或kbf4。

hpb-pym的摩爾數(shù)與鉀鹽的摩爾數(shù)比值大于2。

步驟(1)中，鉀鹽為kpf6或kclo4時(shí)，所述后處理即向反應(yīng)溶液中加入過(guò)量水沉淀，固液分離后得到的固體物質(zhì)即為hpb-pf6或hpb-clo4；鉀鹽為kbf4時(shí)，所述后處理即將反應(yīng)溶液進(jìn)行萃取并旋蒸，得到的固體物質(zhì)即為hpb-bf4。

有益效果：

(1)本發(fā)明所述的熒光試劑能夠?qū)β亚灏椎鞍滓约癶5n1血凝素蛋白進(jìn)行原位定量檢測(cè)，具有實(shí)時(shí)“點(diǎn)亮”效果，且檢測(cè)快速、靈敏度高；另外，所述熒光試劑能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)濃度在0.5μg/ml～10μg/ml范圍內(nèi)的卵清白蛋白以及濃度不大于1.67μg/ml的h5n1血凝素蛋白檢測(cè)，而且在此范圍內(nèi)檢測(cè)時(shí)，熒光強(qiáng)度增加倍數(shù)與被加入的卵清白蛋白以及h5n1血凝素蛋白的含量呈現(xiàn)非常好的線性關(guān)系，可作為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線用于待測(cè)的卵清白蛋白以及h5n1血凝素蛋白。

(2)本發(fā)明所述的熒光試劑的制備工藝簡(jiǎn)單，易操作，成本低。

附圖說(shuō)明

圖1為向?qū)嵤├?制備的熒光試劑ⅰ中加入不同蛋白質(zhì)后的熒光譜圖的對(duì)比圖。

圖2為向?qū)嵤├?中制備的熒光試劑ⅰ中加入不同氨基酸以及卵清白蛋白后的熒光譜圖的對(duì)比圖。

圖3為向?qū)嵤├?中制備的熒光試劑ⅰ中加入不同濃度卵清白蛋白后的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線圖。

圖4為實(shí)施例1中制備的熒光試劑ⅰ在不同卵清白蛋白濃度下的熒光譜圖。

圖5為實(shí)施例1中熒光試劑ⅰ的熒光強(qiáng)度變化率隨加入卵清白蛋白濃度的變化曲線及其擬合直線圖。

圖6為實(shí)施例1中熒光試劑ii的熒光強(qiáng)度變化率隨加入卵清白蛋白濃度的變化曲線圖。

圖7為實(shí)施例1中熒光試劑ⅲ的熒光強(qiáng)度變化率隨加入卵清白蛋白濃度的變化曲線圖。

圖8為向?qū)嵤├?制備的熒光試劑ⅰ中加入不同蛋白質(zhì)后的熒光譜圖的對(duì)比圖。

圖9為向?qū)嵤├?中制備的熒光試劑ⅰ中加入不同氨基酸以及卵清白蛋白后的熒光譜圖的對(duì)比圖。

圖10為向?qū)嵤├?中制備的熒光試劑ⅰ中加入不同濃度卵清白蛋白后的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線圖。

圖11為實(shí)施例2中熒光試劑ⅰ的熒光強(qiáng)度變化率隨加入卵清白蛋白濃度的變化曲線及其擬合直線圖。

圖12為實(shí)施例2中熒光試劑ii的熒光強(qiáng)度變化率隨加入卵清白蛋白濃度的變化曲線圖。

圖13為實(shí)施例2中熒光試劑ⅲ的熒光強(qiáng)度變化率隨加入卵清白蛋白濃度的變化曲線圖。

圖14為向?qū)嵤├?制備的熒光試劑ⅰ中加入不同蛋白質(zhì)后的熒光譜圖的對(duì)比圖。

圖15為向?qū)嵤├?中制備的熒光試劑ⅰ中加入不同氨基酸以及卵清白蛋白后的熒光譜圖的對(duì)比圖。

圖16為向?qū)嵤├?中制備的熒光試劑ⅰ中加入不同濃度卵清白蛋白后的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線圖。

圖17為實(shí)施例3中熒光試劑ⅰ的熒光強(qiáng)度變化率隨加入卵清白蛋白濃度的變化曲線及其擬合直線圖。

圖18為實(shí)施例3中熒光試劑ii的熒光強(qiáng)度變化率隨加入卵清白蛋白濃度的變化曲線圖。

圖19為實(shí)施例3中熒光試劑ⅲ的熒光強(qiáng)度變化率隨加入卵清白蛋白濃度的變化曲線圖。

圖20為實(shí)施例4中熒光試劑ⅰ的熒光強(qiáng)度變化率隨加入h5n1血凝素蛋白濃度的變化曲線及其擬合直線圖。

圖21為向?qū)嵤├?中制備的熒光試劑ⅰ中加入不同濃度h5n1血凝素蛋白后的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線圖。

圖22為實(shí)施例中hpb-pym合成的路線圖。

其中，i為加入生物分子后的熒光強(qiáng)度，i0為空白熒光試劑的熒光強(qiáng)度，i-i0/i0表示熒光強(qiáng)度增大倍數(shù)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來(lái)詳述本發(fā)明，但不限于此。

以下實(shí)施例中：

所用試劑以及儀器的具體信息如表1和表2所示。

表1試劑信息

表2

實(shí)施例中所用hpb-pym的具體制備步驟如下：

(1)hpb-br的制備

將80ml異丙醇和水的混合物(v異丙醇:v水＝9:1)加入干燥的250ml圓底燒瓶中，然后在氮?dú)夥障乱来渭尤?4mmol(4.82g)二苯基乙炔、20mmol(3.56g)4-溴苯基硼酸、24mmol(6.60g)碳酸銀和0.50mmol(0.112g)醋酸鈀，繼續(xù)通氮?dú)獬?，并?0℃下磁力攪拌3h，將圓底燒瓶中的反應(yīng)混合物冷卻至室溫，通過(guò)過(guò)濾分離沉淀物后，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮濾液，將旋蒸后所得粗產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱色譜(二氯甲烷/石油醚，1:10)純化，得到黃綠色固體狀的hpb-br；

(2)hpb-py的制備

依次將3.00mmol(2.00g)hpb-br、9.02mmol(1ml)4-乙烯基吡啶、0.312mmol(0.067g)醋酸鈀、1ml三乙胺、0.164mmol(0.05g)三(鄰甲基苯基)磷和20ml色譜級(jí)n,n-二甲基甲酰胺加入圓底燒瓶中，然后將反應(yīng)混合物冷凍-抽氣-解凍脫氣三次后，再在110℃下用磁力攪拌加熱21h，將圓底燒瓶中的反應(yīng)混合物冷卻后再倒入水中，并用二氯甲烷萃取，萃取分離得到的有機(jī)相用硫酸鎂干燥，過(guò)濾，并通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，將旋蒸所得的粗產(chǎn)物通過(guò)柱色譜法(乙酸乙酯/石油醚，1:4)純化，得到純的hpb-py黃棕色團(tuán)固體；

(3)hpb-pym的制備

將2.79mmol(2.00g)hpb-py和9.96mmol(0.62ml)碘甲烷溶于二氯甲烷中并在室溫下攪拌24h，然后向反應(yīng)混合物中加入大量正己烷以沉淀產(chǎn)物，然后通過(guò)過(guò)濾收集所得沉淀，并用乙酸乙酯洗滌，將收集的產(chǎn)物在真空下干燥24h，得到純的hpb-pym紅色固體。

以下實(shí)施例中所述熒光強(qiáng)度的檢測(cè)均檢測(cè)3～5次，然后取平均值。

實(shí)施例1

(1)hpb-pf6的制備

先將100mg的hpb-pym溶解于5ml乙腈中，再加入1mlkpf6飽和水溶液，25℃下攪拌反應(yīng)1h后，再向反應(yīng)體系中加入150ml去離子水，并依次進(jìn)行超聲、抽濾，得到紅色固體即為hpb-pf6。

采用核磁共振波譜儀和質(zhì)譜儀對(duì)本實(shí)施例所制備的hpb-pf6進(jìn)行表征，得到的核磁氫譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)如下：

¹h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ(ppm)：8.813-8.830(d，4h)，8.137-8.154(d，4h)，7.843-7.884(d，2h)，7.469-7.489(d，4h)，7.376-7.416(d，2h)，7.144-7.236(d，10h)，6.844-7.013(m，14h)，4.235(s，6h)；

正離子模式：[c56h46n2]²⁺電噴霧電離質(zhì)譜(m/z)，理論值：373.19，實(shí)測(cè)值：373.65；

負(fù)離子模式：[pf6]^-電噴霧電離質(zhì)譜(m/z)，理論值：144.96，實(shí)測(cè)值：145.10；

根據(jù)氫譜和質(zhì)譜的數(shù)據(jù)可知，本實(shí)施例所制備得到的紅色固體是hpb-pf6。

(2)熒光試劑的制備

將本實(shí)施所制備的hpb-pf6溶解于dmso中，得到濃度為1×10^-2mol/l的溶液a；取30μl溶液a，加入2700μl的h2o，配成dmso的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％、hpb-pf6的濃度為1×10^-4mol/l的溶液b；最后用h2o將溶液b稀釋成dmso的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01％、hpb-pf6的濃度為1×10^-6mol/l的熒光試劑，記為熒光試劑ⅰ。

在上述熒光試劑ⅰ的制備過(guò)程中，將h2o分別替換為pbs(磷酸鹽緩沖液)、ns(生理鹽水)，其他條件不變，則在溶液pbs中制備的熒光試劑記為熒光試劑ii，在溶液ns中制備的熒光試劑記為熒光試劑ⅲ。

(3)特異性識(shí)別試驗(yàn)

取10份體積均為3ml的熒光試劑ⅰ，分別將卵清白蛋白、牛血清白蛋白、血紅蛋白、胸苷、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白、伴刀豆凝集素a以及轉(zhuǎn)鐵蛋白加入熒光試劑ⅰ中，且每份熒光試劑ⅰ中加入一種體積為10μl、濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)。用熒光分光光度計(jì)測(cè)量與不同蛋白質(zhì)混合后的熒光試劑ⅰ的熒光信號(hào)(激發(fā)波長(zhǎng)為422nm)，由圖1可知，熒光試劑ⅰ對(duì)卵清白蛋白具有較好的點(diǎn)亮響應(yīng)，而對(duì)其他蛋白質(zhì)變化很弱。

(4)特異性識(shí)別試驗(yàn)

取21份體積均為3ml的熒光試劑ⅰ，分別將丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、組氨酸、色氨酸、精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、酪氨酸以及半胱氨酸加入到20份不同的中熒光試劑ⅰ中，且每份熒光試劑ⅰ中加入的氨基酸的體積為50μl、濃度為10^-3mol/l；將6μl濃度為0.5mg/ml的卵清白蛋白加入另外一份熒光試劑ⅰ中。用熒光分光光度計(jì)測(cè)量加入卵清白蛋白以及不同氨基酸后熒光試劑ⅰ的熒光信號(hào)(激發(fā)波長(zhǎng)為423nm)，由圖2可知，熒光試劑ⅰ對(duì)卵清白蛋白具有特異性點(diǎn)亮響應(yīng)，而對(duì)氨基酸均無(wú)明顯變化，即卵清白蛋白及其他蛋白質(zhì)水解后的游離氨基酸不會(huì)影響熒光試劑ⅰ對(duì)卵清白蛋白的檢出效果。

(5)檢出時(shí)間試驗(yàn)

將卵清白蛋白溶液稀釋于水中，得到濃度為0.5mg/ml的卵清白蛋白溶液d；取3ml熒光試劑ⅰ，首先用熒光分光光度計(jì)測(cè)量空白熒光試劑ⅰ的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)為423nm)，然后向熒光試劑ⅰ中加入6μld溶液(此時(shí)混合溶液中卵清白蛋白的總濃度為1μg/ml)，并立刻測(cè)其熒光強(qiáng)度，5min后再用熒光分光光度計(jì)測(cè)量一次熒光強(qiáng)度；重復(fù)以上操作，每次向熒光試劑ⅰ中加入6μld溶液，直至加入到熒光試劑ⅰ中卵清白蛋白的總濃度為4μg/ml。由圖3可知，熒光試劑ⅰ對(duì)于卵清白蛋白的檢測(cè)非常快捷，在熒光試劑ⅰ與卵清白蛋白混合后立即測(cè)量的熒光強(qiáng)度與混合5min后測(cè)量的熒光強(qiáng)度幾乎無(wú)差別，即熒光試劑ⅰ對(duì)卵清白蛋白的檢出效果為即時(shí)響應(yīng)。

(6)定量檢測(cè)試驗(yàn)

取3ml熒光試劑ⅰ，每次向熒光試劑ⅰ中加入3μld溶液，直至加入到熒光試劑ⅰ中的卵清白蛋白的總濃度為5.0μg/ml，用熒光分光光度計(jì)測(cè)量空白熒光試劑ⅰ及每次加入卵清白蛋白后的熒光試劑ⅰ的熒光信號(hào)(激發(fā)波長(zhǎng)為423nm)。由圖4可知，隨著卵清白蛋白濃度的增加，熒光試劑ⅰ的發(fā)光強(qiáng)度逐漸增加。

當(dāng)熒光試劑ⅰ中加入的溶液d體積為3μl～30μl時(shí)，即熒光試劑ⅰ中卵清白蛋白的濃度為0.5μg/ml～5μg/ml時(shí)，由圖5可知熒光試劑ⅰ的熒光強(qiáng)度變化率(ii-i0)/i0與溶液d的加入體積存在一定的線性關(guān)系，線性方程為：(ii-i0)/i0＝1.46028×x+0.24774，r²＝1；其中，i表示1-10的正整數(shù)，r表示線性相關(guān)度。

(7)使用不同溶液制得的熒光試劑對(duì)卵清白蛋白的檢出效果試驗(yàn)

分別取3ml熒光試劑ⅰ、3ml熒光試劑ii和3ml熒光試劑ⅲ，分別向三種熒光試劑中分多次加入卵清白蛋白；其中，熒光試劑ⅰ中每次加入體積為3μl、濃度為0.5mg/ml的卵清白蛋白，熒光試劑ii中每次加入體積為9μl、濃度為0.5mg/ml的卵清白蛋白，熒光試劑ⅲ中每次加入體積為9μl、濃度為0.5mg/ml的卵清白蛋白。用熒光分光光度計(jì)測(cè)量三種空白熒光試劑以及每次加入卵清白蛋白后三種熒光試劑的熒光信號(hào)(激發(fā)波長(zhǎng)為423nm)。由圖5、6、7可知，隨著卵清白蛋白濃度的增加，三種熒光試劑的發(fā)光強(qiáng)度都逐漸增加，即在dmso/h2o、dmso/pbs、dmso/ns不同溶解體系中，所制備的熒光試劑都能實(shí)現(xiàn)其對(duì)卵清白蛋白的檢出功能。

實(shí)施例2

(1)hpb-clo4的制備

先將100mg的hpb-pym溶解于5ml乙腈中，再加入1mlkclo4飽和dmso溶液，5℃下反應(yīng)2h后，再向反應(yīng)體系中加入100ml去離子水，并依次進(jìn)行超聲、抽濾，得到紅色固體即為hpb-clo4。

采用核磁共振波譜儀和質(zhì)譜儀對(duì)本實(shí)施例所制備的hpb-clo4進(jìn)行表征，得到的核磁氫譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)如下：

¹h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ(ppm)：8.820-8.836(d，4h)，8.143-8.159(d，4h)，7.848-7.889(d，2h)，7.473-7.492(d，4h)，7.381-7.422(d,，2h)，7.150-7.239(d，10h)，6.846-7.018(m，14h)，4.240(s，6h)；

正離子模式：[c56h46n2]²⁺電噴霧電離質(zhì)譜(m/z)，理論值：373.19，實(shí)測(cè)值：373.35；

負(fù)離子模式：[clo4]^-電噴霧電離質(zhì)譜(m/z)，理論值：98.95，實(shí)測(cè)值：98.60；

根據(jù)氫譜和質(zhì)譜的數(shù)據(jù)可知，本實(shí)施例所制備得到的紅色固體是hpb-clo4。

(2)熒光試劑的制備

將本實(shí)施例所制備的hpb-clo4溶解于dmso中，得到濃度為1×10^-2mol/l的溶液a；取30μl溶液a，加入2700μl的h2o，配成dmso的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％、hpb-clo4的濃度為1×10^-4mol/l的溶液b；最后用h2o將溶液b稀釋成dmso的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01％、hpb-clo4的濃度為1×10^-6mol/l的熒光試劑，并記為熒光試劑ⅰ；

在上述熒光試劑ⅰ的制備過(guò)程中，將h2o分別替換為pbs、ns，其他條件不變，則在溶液pbs中制備的熒光試劑記為熒光試劑ii，在溶液ns中制備的熒光試劑記為熒光試劑ⅲ。

(3)特異性識(shí)別試驗(yàn)

取10份體積均為3ml的熒光試劑ⅰ，分別將卵清白蛋白、牛血清白蛋白、血紅蛋白、胸苷、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白、伴刀豆凝集素a以及轉(zhuǎn)鐵蛋白加入熒光試劑ⅰ中，且每份熒光試劑ⅰ中加入一種體積為10μl、濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)。用熒光分光光度計(jì)測(cè)量與不同蛋白質(zhì)混合后的熒光試劑ⅰ的熒光信號(hào)(激發(fā)波長(zhǎng)為422nm)，由圖8可知，熒光試劑ⅰ對(duì)卵清白蛋白具有較好的點(diǎn)亮響應(yīng)。

(4)特異性識(shí)別試驗(yàn)

取21份體積均為3ml的熒光試劑ⅰ，分別將丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、組氨酸、色氨酸、精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、酪氨酸以及半胱氨酸加入到20份不同的中熒光試劑ⅰ中，且每份熒光試劑ⅰ中加入的氨基酸的體積為50μl、濃度為10^-3mol/l；將10μl濃度為1mg/ml的卵清白蛋白加入另外一份熒光試劑ⅰ中。用熒光分光光度計(jì)測(cè)量加入卵清白蛋白以及不同氨基酸后熒光試劑ⅰ的熒光信號(hào)(激發(fā)波長(zhǎng)為423nm)，由圖9可知，熒光試劑ⅰ對(duì)卵清白蛋白具有特異性點(diǎn)亮響應(yīng)，而對(duì)氨基酸均無(wú)明顯變化，即卵清白蛋白及其他蛋白質(zhì)水解后的游離氨基酸不會(huì)影響熒光試劑ⅰ對(duì)卵清白蛋白的檢出效果。

(5)檢出時(shí)間試驗(yàn)

將卵清白蛋白溶液稀釋于水中，得到濃度為1mg/ml的卵清白蛋白溶液d；取3ml熒光試劑ⅰ，首先用熒光分光光度計(jì)測(cè)量空白熒光試劑ⅰ的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)為423nm)，然后向熒光試劑ⅰ中加入3μld溶液(此時(shí)混合溶液中卵清白蛋白的總濃度為1μg/ml)，并立刻測(cè)其熒光強(qiáng)度，5min后再用熒光分光光度計(jì)測(cè)量一次熒光強(qiáng)度；重復(fù)以上操作，再依次向熒光試劑ⅰ中加入3μld溶液、4μld溶液。由圖10可知，熒光試劑ⅰ對(duì)于卵清白蛋白的檢測(cè)非常快捷，在熒光試劑ⅰ與卵清白蛋白混合后立即測(cè)量的熒光強(qiáng)度與混合5min后測(cè)量的熒光強(qiáng)度幾乎無(wú)差別，即熒光試劑ⅰ對(duì)卵清白蛋白的檢出效果為即時(shí)響應(yīng)。

(6)定量檢測(cè)試驗(yàn)

取3ml熒光試劑ⅰ，每次向熒光試劑ⅰ中加入3μld溶液，直至加入到熒光試劑ⅰ中的卵清白蛋白的總濃度為5.0μg/ml，用熒光分光光度計(jì)測(cè)量空白熒光試劑ⅰ及每次加入卵清白蛋白后的熒光試劑ⅰ的熒光信號(hào)(激發(fā)波長(zhǎng)為423nm)。當(dāng)熒光試劑ⅰ中加入的溶液d體積為3μl～30μl時(shí)，即熒光試劑ⅰ中卵清白蛋白的濃度為0.5μg/ml～5μg/ml時(shí)，由圖11可知，熒光試劑ⅰ的熒光強(qiáng)度變化率(ii-i0)/i0與溶液d的加入體積存在一定的線性關(guān)系，線性方程為：(ii-i0)/i0＝2.55746×x+0.40137，r²＝0.9977；其中，i表示1-10的正整數(shù)，r表示線性相關(guān)度。

(7)使用不同溶液制得的熒光試劑對(duì)卵清白蛋白的檢出效果試驗(yàn)

分別取3ml熒光試劑ⅰ、3ml熒光試劑ii和3ml熒光試劑ⅲ，分別向三種熒光試劑中分多次加入卵清白蛋白；其中，熒光試劑ⅰ中每次加入體積為3μl、濃度為0.5mg/ml的卵清白蛋白，熒光試劑ii中每次加入體積為5μl、濃度為0.5mg/ml的卵清白蛋白，熒光試劑ⅲ中每次加入體積為5μl、濃度為0.5mg/ml的卵清白蛋白。用熒光分光光度計(jì)測(cè)量三種空白熒光試劑以及每次加入卵清白蛋白后三種熒光試劑的熒光信號(hào)(激發(fā)波長(zhǎng)為423nm)。由圖11、12、13可知，隨著血清白蛋白濃度的增加，三種熒光試劑的發(fā)光強(qiáng)度都逐漸增加，即在dmso/h2o、dmso/pbs、dmso/ns不同溶解體系中，所制備的熒光試劑都能實(shí)現(xiàn)其對(duì)卵清白蛋白的檢出功能。

實(shí)施例3

(1)hpb-bf4的制備

先將100mg的hpb-pym溶解于5ml乙腈中，再加入1mlkbf4飽和水溶液，15℃下攪拌反應(yīng)1.5h后，用二氯和水萃取反應(yīng)溶液，并將萃取得到的有機(jī)相進(jìn)行旋蒸，得到的紅色固體即為hpb-bf4。

采用核磁共振波譜儀和質(zhì)譜儀對(duì)本實(shí)施例所制備的hpb-bf4進(jìn)行表征，得到的核磁氫譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)如下：

¹h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ(ppm)：8.824-8.840(d，4h)，8.145-8.161(d，4h)，7.850-7.891(d，2h)，7.472-7.492(d，4h)，7.382-7.423(d，2h)，7.149-7.238(d，10h)，6.843-7.017(m，14h)，4.241(s，6h)；

正離子模式：[c56h46n2]²⁺電噴霧電離質(zhì)譜(m/z)，理論值：373.19；實(shí)測(cè)值：373.25；

負(fù)離子模式：[bf4]^-電噴霧電離質(zhì)譜(m/z)，理論值：87.00；實(shí)測(cè)值：86.90；

根據(jù)氫譜和質(zhì)譜的數(shù)據(jù)可知，本實(shí)施例所制備得到的紅色固體是hpb-bf4。

(2)熒光試劑的制備

將本實(shí)施例所制備的hpb-bf4溶解于dmso中，得到濃度為1×10^-2mol/l的溶液a；取30μl溶液a，加入2700μl的h2o，配成dmso的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％、hpb-bf4的濃度為1×10^-4mol/l的溶液b；最后用h2o將溶液b稀釋成dmso的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01％、hpb-clo4的濃度為1×10^-6mol/l的熒光試劑，記為熒光試劑ⅰ。

在上述熒光試劑ⅰ的制備過(guò)程中，將h2o分別替換為pbs、ns，其他條件不變，則在溶液pbs中制備的熒光試劑記為熒光試劑ii，在溶液ns中制備的熒光試劑記為熒光試劑ⅲ。

(3)特異性識(shí)別試驗(yàn)

取10份體積均為3ml的熒光試劑ⅰ，分別將卵清白蛋白、牛血清白蛋白、血紅蛋白、胸苷、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白、伴刀豆凝集素a以及轉(zhuǎn)鐵蛋白加入熒光試劑ⅰ中，且每份熒光試劑ⅰ中加入一種體積為10μl、濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)。用熒光分光光度計(jì)測(cè)量與不同蛋白質(zhì)混合后的熒光試劑ⅰ的熒光信號(hào)(激發(fā)波長(zhǎng)為422nm)，由圖14可知，熒光試劑ⅰ對(duì)卵清白蛋白具有較好的點(diǎn)亮響應(yīng)。

(4)特異性識(shí)別試驗(yàn)

取21份體積均為3ml的熒光試劑ⅰ，分別將丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、組氨酸、色氨酸、精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、酪氨酸以及半胱氨酸加入到20份不同的中熒光試劑ⅰ中，且每份熒光試劑ⅰ中加入的氨基酸的體積為50μl、濃度為10^-3mol/l；將10μl濃度為1mg/ml的卵清白蛋白加入另外一份熒光試劑ⅰ中。用熒光分光光度計(jì)測(cè)量加入卵清白蛋白以及不同氨基酸后熒光試劑ⅰ的熒光信號(hào)(激發(fā)波長(zhǎng)為423nm)，由圖15可知，熒光試劑ⅰ對(duì)卵清白蛋白具有特異性點(diǎn)亮響應(yīng)，而對(duì)氨基酸均無(wú)明顯變化，即卵清白蛋白及其他蛋白質(zhì)水解后的游離氨基酸不會(huì)影響熒光試劑ⅰ對(duì)卵清白蛋白的檢出效果。

(5)檢出時(shí)間試驗(yàn)

將卵清白蛋白溶液稀釋于水中，得到濃度為1mg/ml的卵清白蛋白溶液d；取3ml熒光試劑ⅰ，首先用熒光分光光度計(jì)測(cè)量空白熒光試劑ⅰ的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)為423nm)，然后向熒光試劑ⅰ中加入3μld溶液(此時(shí)混合溶液中卵清白蛋白的總濃度為1μg/ml)，并立刻測(cè)其熒光強(qiáng)度，5min后再用熒光分光光度計(jì)測(cè)量一次熒光強(qiáng)度；重復(fù)以上操作，再依次向熒光試劑ⅰ中加入3μld溶液、4μld溶液。由圖16可知，熒光試劑ⅰ對(duì)于卵清白蛋白的檢測(cè)非常快捷，在熒光試劑ⅰ與卵清白蛋白混合后立即測(cè)量的熒光強(qiáng)度與混合5min后測(cè)量的熒光強(qiáng)度幾乎無(wú)差別，即熒光試劑ⅰ對(duì)卵清白蛋白的檢出效果為即時(shí)響應(yīng)。

(6)定量檢測(cè)試驗(yàn)

將卵清白蛋白溶液稀釋于水中，得到濃度為0.5mg/ml的卵清白蛋白溶液e；取3ml熒光試劑ⅰ，每次加入6μle溶液，直至加入到熒光試劑ⅰ中的卵清白蛋白的總濃度為10μg/ml，用熒光分光光度計(jì)測(cè)量空白熒光試劑ⅰ及每次加入卵清白蛋白后的熒光試劑ⅰ的熒光信號(hào)(激發(fā)波長(zhǎng)為423nm)。當(dāng)熒光試劑ⅰ中加入的溶液e體積為6μl～60μl時(shí)，即熒光試劑ⅰ中卵清白蛋白的濃度為1μg/ml～10μg/ml時(shí)，由圖17可知，熒光試劑ⅰ的熒光強(qiáng)度變化率(ii-i0)/i0與溶液d的加入體積存在一定的線性關(guān)系，線性方程為：(ii-i0)/i0＝0.15575×x+0.06568，r²＝0.99843；其中，i表示1-10的正整數(shù)，r表示線性相關(guān)度。

(7)使用不同溶液制得的熒光試劑對(duì)卵清白蛋白的檢出效果試驗(yàn)

分別取3ml熒光試劑ⅰ、3ml熒光試劑ii和3ml熒光試劑ⅲ，分別向三種熒光試劑中分多次加入卵清白蛋白；其中，熒光試劑ⅰ中每次加入體積為6μl、濃度為0.5mg/ml的卵清白蛋白，熒光試劑ii中每次加入體積為6μl、濃度為0.5mg/ml的卵清白蛋白，熒光試劑ⅲ中每次加入體積為9μl、濃度為1mg/ml的卵清白蛋白。用熒光分光光度計(jì)測(cè)量三種空白熒光試劑以及每次加入卵清白蛋白后三種熒光試劑的熒光信號(hào)(激發(fā)波長(zhǎng)為423nm)。由圖17、18、19可知，隨著卵清白蛋白濃度的增加，三種熒光試劑的發(fā)光強(qiáng)度都逐漸增加，即在dmso/h2o、dmso/pbs、dmso/ns不同溶解體系中，所制備的熒光試劑都能實(shí)現(xiàn)其對(duì)卵清白蛋白的檢出功能，但是其在pbs和ns中誤差比較大，檢測(cè)效果不如hpb-pf6熒光試劑和hpb-clo4熒光試劑。

實(shí)施例4

采用實(shí)施例1所制備的熒光試劑ⅰ對(duì)h5n1血凝素蛋白進(jìn)行性能表征：

(1)檢出時(shí)間試驗(yàn)

將h5n1血凝素蛋白稀釋于水中，得到濃度為0.25mg/ml的卵清白蛋白溶液d；取3ml熒光試劑ⅰ，首先用熒光分光光度計(jì)測(cè)量空白熒光試劑ⅰ的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)為423nm)，然后向熒光試劑ⅰ中加入4μld溶液(此時(shí)混合溶液中h5n1血凝素蛋白的總濃度為1/3μg/ml)，并立刻測(cè)其熒光強(qiáng)度，1min后再用熒光分光光度計(jì)測(cè)量一次熒光強(qiáng)度；重復(fù)以上操作，每次向熒光試劑ⅰ中加入4μld溶液，直至加入到熒光試劑ⅰ中h5n1血凝素蛋白的總濃度為5/3μg/ml。由圖21可知，熒光試劑ⅰ對(duì)h5n1血凝素蛋白的檢測(cè)非常快捷，在熒光試劑ⅰ與h5n1血凝素蛋白混合后立即測(cè)量的熒光強(qiáng)度與混合1min后測(cè)量的熒光強(qiáng)度幾乎無(wú)差別，即熒光試劑ⅰ對(duì)h5n1血凝素蛋白的檢出效果為即時(shí)響應(yīng)。

(2)定量檢測(cè)試驗(yàn)

取3ml熒光試劑ⅰ，每次向熒光試劑ⅰ中加入4μld溶液，直至加入到熒光試劑ⅰ中的h5n1血凝素蛋白的總濃度為5/3μg/ml，用熒光分光光度計(jì)測(cè)量空白熒光試劑ⅰ及每次加入h5n1血凝素蛋白后的熒光試劑ⅰ的熒光信號(hào)(激發(fā)波長(zhǎng)為423nm)。又檢測(cè)結(jié)果可知，隨著h5n1血凝素蛋白濃度的增加，熒光試劑ⅰ的發(fā)光強(qiáng)度逐漸增加。

當(dāng)熒光試劑ⅰ中加入的溶液d體積為4μl～20μl時(shí)，即熒光試劑ⅰ中h5n1血凝素蛋白的濃度為1/3μg/ml～5/3μg/ml時(shí)，由圖20可知熒光試劑ⅰ的熒光強(qiáng)度變化率(ii-i0)/i0與溶液d的加入體積存在一定的線性關(guān)系，線性方程為：(ii-i0)/i0＝2.12171×x+0.01947，r²＝0.9997；其中，i表示1-5的正整數(shù)，r表示線性相關(guān)度。

本發(fā)明包括但不限于以上實(shí)施例，凡是在本發(fā)明精神的原則之下進(jìn)行的任何等同替換或局部改進(jìn)，都將視為在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。