基于膠乳免疫比濁法的微量白蛋白試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于膠乳免疫比濁法的微量白蛋白試劑盒，其包括：試劑A，所述試劑A為pH＝8.5～9.4的甘氨酸緩沖體系，含有0.1～0.5g/L的高分子促聚劑、1～10g/L的表面活性劑和0.5～10g/L的電解質(zhì)；以及試劑B，所述試劑B為pH＝7.0～7.5的MES緩沖體系，含有2.5～3g/L的羊抗人微量白蛋白多克隆抗體、5～10mL/L的羊抗人微量白蛋白多克隆抗體包被的膠乳、1～10g/L的表面活性劑和0.5～10g/L的電解質(zhì)。本發(fā)明還公開了制備試劑B的方法。所述試劑盒可有效避免非特異性反應(yīng)，檢測靈敏度較高，且具有較低的檢測限，可用于臨床微量白蛋白的測定。
【專利說明】
基于膠乳免疫比濁法的微量白蛋白試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于膠乳免疫比濁法的微量白蛋白 試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 微量白蛋白是指在人體尿中出現(xiàn)的微量白蛋白。白蛋白是一種血液中的正常蛋白 質(zhì)，但在生理條件下尿液中僅出現(xiàn)極少量白蛋白。正常情況下，尿液中微量白蛋白的濃度不 超過20mg/L，當(dāng)尿液的微量白蛋白濃度達(dá)到20~200mg/L時則為微量白蛋白尿，反映人體腎 臟異常滲漏蛋白質(zhì)。微量白蛋白的檢測是早期發(fā)現(xiàn)腎病最敏感、最可靠的診斷指標(biāo)。通過尿 液微量白蛋白的檢測結(jié)果，結(jié)合發(fā)病情況、癥狀以及病史陳述可以較為準(zhǔn)確地診斷病情。而 定期檢測尿液微量白蛋白，可對腎病的預(yù)防及早期治療起到積極作用。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中檢測微量白蛋白的臨床使用的方法主要有免疫比濁法和放射免疫擴(kuò) 散法等，其中免疫比濁法是抗原抗體結(jié)合動態(tài)測定方法，操作相對簡單、成本低，在生化分 析儀上使用較為廣泛。免疫比濁法可分為免疫透射比濁法和免疫散射比濁法。其基本原理 是：當(dāng)抗原與抗體在特殊稀釋系統(tǒng)中反應(yīng)而且比例合適(一般抗體過量)時，形成的可溶性 免疫復(fù)合物在稀釋系統(tǒng)中在高分子促聚劑(聚乙二醇等）的作用下聚合析出直徑為340nm~ 700nm的顆粒，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當(dāng)抗體濃度固定時，形成的免疫復(fù)合物的量隨著檢樣中 抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度也隨之增加。當(dāng)入射光照射不同濁度的反應(yīng)液時可被 不同程度的吸收、反射和折射，通過測定反應(yīng)液的濁度與一系列標(biāo)準(zhǔn)品對照，即可得出檢樣 中抗原的含量。在普通的免疫透射比濁法或免疫散射比濁法中，少量的小的抗原抗體復(fù)合 物極難形成濁度，除非放置較長時間，但檢測的靈敏度會較低，而加大抗體抗原的用量又會 增加檢測成本，而且不符合微量化的要求。基于此，現(xiàn)有技術(shù)中公開有膠乳增強(qiáng)免疫比濁法 即膠乳免疫比濁法，其原理是將與待測物質(zhì)相對應(yīng)的抗體包被在一定直徑的膠乳顆粒上， 使抗原抗體結(jié)合物的體積增大，光通過之后，透射光和散射光的強(qiáng)度變化更為顯著，從而提 高試驗的靈敏度。
[0004] 但是在膠乳免疫比濁法中，添加的高分子促聚劑雖然可以使抗體更容易結(jié)合抗 原，但是同時也會使抗體結(jié)合其他物質(zhì)，導(dǎo)致非特異性增強(qiáng);而且活化膠乳亦使得抗體本身 的反應(yīng)性顯著增加，增多超量的高分子促聚劑，會使更多的膠乳聚集，進(jìn)一步促進(jìn)非特異性 反應(yīng)，結(jié)果容易導(dǎo)致聚集的膠乳顆粒粒徑不均勻，反應(yīng)重現(xiàn)性低，檢測時的特征波長不固 定。而在臨床使用過程中，參數(shù)都是固定的，特征波長的變動使得該技術(shù)在實際臨床應(yīng)用中 有一定局限性。另外，現(xiàn)有的膠乳免疫比濁法所用的膠乳在制備過程中需要分離過量的 EDC、NHS等活化試劑，而且需要進(jìn)行封閉處理，操作上較為繁瑣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 因此，針對現(xiàn)有技術(shù)中用膠乳免疫比濁法測定微量白蛋白時易出現(xiàn)非特異反應(yīng)的 技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種可有效避免非特異性反應(yīng)，而且檢測靈敏度高、檢測 限低的基于膠乳免疫比濁法的微量白蛋白試劑盒。
[0006] 本發(fā)明的基于膠乳免疫比濁法的微量白蛋白試劑盒包括：
[0007] 試劑A，所述試劑A為pH = 8.5~9.4的甘氨酸緩沖體系，含有0.1~0.5g/L的高分子 促聚劑、1~l〇g/L的表面活性劑和0.5~10g/L的電解質(zhì)；
[0008] 以及試劑B，所述試劑B為pH = 7.0~7.5的MES緩沖體系，含有2.5~3g/L的羊抗人 微量白蛋白多克隆抗體、5~1 OmL/L的羊抗人微量白蛋白多克隆抗體包被的膠乳、1~1 Og/L 的表面活性劑和0.5~10g/L的電解質(zhì)。
[0009] 所述膠乳為pH = 7 · 0~7 · 5的MES緩沖體系，是粒徑為30~80nm優(yōu)選40~50nm的羧 基微球經(jīng)NHS(N-羥基丁二酰亞胺)和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽） 活化后再由羊抗人微量白蛋白多克隆抗體包被得到的乳膠;所述膠乳中，羧基微球的濃度 為1~2g/L優(yōu)選lg/L，NHS與羧基微球的質(zhì)量比為0.05~0.1:1，EDC與羧基微球的質(zhì)量比為 0.05~0.1:1，包被用的羊抗人微量白蛋白多克隆抗體與羧基微球的質(zhì)量比為0.05~0.1: 1〇
[0010] 優(yōu)選的，所述試劑A和所述試劑B分別還含有0.5~lg/L的防腐劑，所述防腐劑為 proclin300和/或疊氮鈉。
[0011] 優(yōu)選的，所述試劑A中的高分子促聚劑為聚乙二醇6000,聚乙二醇6000在所述試劑 A中的濃度為0.2~0.5g/L;所述試劑A和所述試劑B中的表面活性劑均為曲拉通X100;所述 試劑A和所述試劑B中的電解質(zhì)均為氯化鈉。
[0012]本發(fā)明的一較佳實施例的所述試劑A為pH = 9.0的100mmol/L甘氨酸緩沖體系，含 有0.5g/L的聚乙二醇6000、18/1的曲拉通乂100、58/1的氯化鈉和18/1的疊氮鈉。
[0013]本發(fā)明的一較佳實施例的所述試劑B為pH = 7.0的50mmol/L MES緩沖體系，含有 2.8g/L的羊抗人微量白蛋白多克隆抗體、5mL/L的羊抗人微量白蛋白多克隆抗體包被的膠 乳、lg/L的曲拉通X100、5g/L的氯化鈉和lg/L的疊氮鈉。
[0014]本發(fā)明另一目的還在于公開一種制備試劑B的方法，所述試劑B為pH = 7.0~7.5的 MES緩沖體系，含有2.5~3g/L的羊抗人微量白蛋白多克隆抗體、5~10mL/L的羊抗人微量白 蛋白多克隆抗體包被的膠乳、1~l〇g/L的表面活性劑和0.5~10g/L的電解質(zhì)；
[0015]該方法包括如下步驟：
[0016] 1)用pH = 7 · 0~7 · 5的MES緩沖液將羧基微球稀釋至1~2g/L，再加入NHS和EDC，15 ~25 °C下反應(yīng)20~30分鐘得到活化膠乳；
[0017] 2)向活化膠乳中加入包被用的羊抗人微量白蛋白多克隆抗體，在25~37°C下振搖 孵育2~4小時，制得羊抗人微量白蛋白多克隆抗體包被的膠乳；
[0018] 3)根據(jù)所述試劑B的各組分濃度，向pH=7.0~7.5的MES緩沖液中加入表面活性 劑、電解質(zhì)和羊抗人微量白蛋白多克隆抗體，然后加入步驟2)制得的羊抗人微量白蛋白多 克隆抗體包被的膠乳；
[0019] 4)用0.2yL尼龍膜過濾除菌和大顆粒，得試劑B。
[0020] 步驟1)中的羧基微球粒徑為30~80nm優(yōu)選40~50nm;NHS與羧基微球的質(zhì)量比為 0.05~0.1:1，EDC與羧基微球的質(zhì)量比為0.05~0.1:1;步驟2)中，包被用的羊抗人微量白 蛋白多克隆抗體與羧基微球的質(zhì)量比為〇. 05~0.1:1。
[0021 ]步驟2)和步驟3)中加入的羊抗人微量白蛋白多克隆抗體預(yù)先用pH=7.0~7.5的 MES緩沖液稀釋至20~30g/L。
[0022] 步驟3)中，還添加有防腐劑pr〇Clin300和/或疊氮鈉，所述防腐劑添加濃度為0.5 ~lg/L〇
[0023] 本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)及積極進(jìn)步效果在于：
[0024] 1、本發(fā)明的一關(guān)鍵技術(shù)是試劑B中控制羊抗人微量白蛋白多克隆抗體與活化膠乳 中的羧基微球的質(zhì)量比例為200~400:1，同時羧基微球的粒徑為30~80nm尤其是40~ 5〇nm，使少量包被用抗體與羧基微球結(jié)合，這樣便形成了普通抗體和攜帶羧基微球的包被 抗體的混合體，而且通過〇.2yL膜過濾去除聚集的微球。當(dāng)加入抗原時，抗原就會按照比例 與這兩種抗體結(jié)合，聚集形成的顆粒物就會包含1個或幾個羧基微球，反應(yīng)的性能大大增 加，盡可能避免非特異性反應(yīng)。
[0025] 2、本發(fā)明另一關(guān)鍵技術(shù)是高分子促聚劑的用量，濃度為0.1~0.5g/L。本發(fā)明由于 加入了含有羧基微球的活化膠乳，抗體的反應(yīng)性顯著增加，但是若按現(xiàn)有技術(shù)中為促進(jìn)免 疫復(fù)合物聚集而添加過量的高分子促聚劑，反倒會使更多的羧基微球聚集，產(chǎn)生非特異性 反應(yīng)。本發(fā)明試圖調(diào)整高分子促聚劑的用量以盡可能的避免非特異性反應(yīng)，由于含有活化 的羧基微球，反應(yīng)本身具有一定的靈敏度，所以考慮較少的高分子促聚劑是否就能具有較 好的促聚作用。實驗的實際結(jié)果也確實如此，當(dāng)高分子促聚劑的用量降低至濃度為0.1~ 0.5g/L時可達(dá)到較佳的效果。
[0026] 3、本發(fā)明還有一關(guān)鍵技術(shù)涉及所述試劑B的制備過程，首先膠乳中的羧基微球經(jīng) NHS、EDC活化后與包被用的羊抗人微量白蛋白多克隆抗體混合孵育，然后與其余組分混合， 配制成試劑B。與傳統(tǒng)的膠乳制備過程相比，控制NHS、EDC以及包被用的羊抗人微量白蛋白 多克隆抗體的用量，可避免NHS、EDC與活化羧基微球分離過程，以及活化羧基微球封閉過 程，因此操作上更加簡化。
[0027] 綜上，本發(fā)明的所述試劑盒可用于全自動生化分析儀上檢測尿液中微量白蛋白的 含量，與現(xiàn)有的免疫比濁試劑相比，可有效避免非特異性反應(yīng)，特征吸收波長穩(wěn)定，可提高 反應(yīng)靈敏度，檢測限較低，可用于較低濃度樣本的檢測。而且與傳統(tǒng)的膠乳制備過程相比， 本發(fā)明的制備方法免去了較多的液固分離和封閉過程，操作上更加簡化。
【附圖說明】
[0028] 圖1為微量白蛋白標(biāo)準(zhǔn)尿液樣本的濃度及△ A值的對應(yīng)散點圖。
【具體實施方式】
[0029] 實施例1~3試劑盒及其制備
[0030] 試劑盒可用于膠乳免疫比濁法測定微量白蛋白，包括試劑A和試劑B。
[0031] 試劑A的組分如表1所示。
[0032] 表1試劑A的組分
[0035]試劑A的配制步驟為(配制1L):分別按照表1中實施例1~3的組分濃度，取甘氨酸 (7.5g，100mmol)溶于純化水（1L)中，然后加入對應(yīng)量的氯化鈉、曲拉通X100、聚乙二醇6000 和疊氮鈉，混勻并用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH得到試劑A。
[0036] (2)試劑B的組分如表2所示。
[0037] 表2試劑B的組分
[0039]表2中的膠乳為含有l(wèi)g/L的羧基微球的MES緩沖體系，膠乳中的羧基微球經(jīng)NHS和 EDC活化并由羊抗人微量白蛋白多克隆抗體包被，實施例1~3的膠乳中的NHS、EDC和羊抗人 微量白蛋白多克隆抗體與羧基微球質(zhì)量比如表3所示。
[0040]表3膠乳中的各組分與羧基微球的質(zhì)量比
[0042] 試劑B的配制步驟為(配制1L):
[0043] 1)取100yL固體含量為 10g/100mL的駿基微球（由Bangs laboratories，Inc提供）， 用MES緩沖液(50臟〇1/1，？!1=7.0，下同）稀釋至101^，然后加入表3所示比例對應(yīng)量的順3和 m)c，室溫反應(yīng)20分鐘得到活化膠乳。
[0044] 2)向活化膠乳中加入表3所示比例對應(yīng)體積的含30g//L羊抗人微量白蛋白多克隆 抗體的MES緩沖液，然后在37 °C下振搖孵育2小時制得羊抗人微量白蛋白多克隆抗體包被的 膠乳，即表2中所述的膠乳。
[0045] 3)向500mL的MES緩沖液中加入表2所示比例對應(yīng)量的氯化鈉、曲拉通X100、疊氮鈉 和表2所示比例對應(yīng)體積的含30g//L羊抗人微量白蛋白多克隆抗體的MES緩沖液，然后加入 步驟2)制得的羊抗人微量白蛋白多克隆抗體包被的10mL膠乳，并用MES緩沖液補(bǔ)足至1L。 [0046] 4)混勻后用0.22yL的尼龍膜過濾，除菌和除大顆粒得到試劑B。
[0047]效果實施例1
[0048]效果測試試劑盒：實施例1~3的試劑盒、對比例的微量白蛋白試劑盒（由英國 RAND0X公司生產(chǎn)）。
[0049]儀器：日立7170生化分析儀。
[0050] 測試波長：主波長340nm，副波長700nm〇
[0051] 測試方法:終點法，遞增性反應(yīng)。37°C條件下，首先試劑A與微量白蛋白的尿液樣本 混勻3~5分鐘，然后加入試劑B開始反應(yīng)，其中體積比試劑A:試劑B:樣本=200:40:2; 5分鐘 時比照空白測定初始吸光度A1，然后在10分鐘時比照空白測定吸光度A2，計算A2與A1的差 值ΑΑ〇
[0052] 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定
[0053]以實施例1~3和對比例的試劑盒分別逐一測定如表4所示的一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的微 量白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)樣本的AA值，而根據(jù)一系列微量白蛋白的濃度和測得的ΔΑ值可分別擬合 出各試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線為LOG IT-L0G4P函數(shù)。
[0054]微量白蛋白的濃度與測得的△ A值的對應(yīng)的散點圖如圖1所示，由圖1可知，實施例 1~3相比于對比例，補(bǔ)體C3的濃度與△ A值的線性關(guān)系更好，擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率將更 大，準(zhǔn)確度和靈敏度都有較大的提升。
[0055]表4標(biāo)準(zhǔn)尿液樣本的△ A值測試結(jié)果
[0058] 2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測效果
[0059]以實施例1~3和對比例的試劑盒分別測定的表5所示一系列含有已知濃度微量白 蛋白的血清樣本的△ A值，然后在擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線上分別得出對應(yīng)的測定濃度，該測定濃度 和實際濃度會出現(xiàn)偏差，如表5所示。
[0060] 表5測定結(jié)果對比
[0061]
[0062]臨床準(zhǔn)確度要求偏差不超過10 %。通過表4可知，對比例的試劑盒在檢測1.9mg/L 的樣本時偏差就超過了臨床要求的10%，其檢測限只能是3.8mg/L。而本發(fā)明的試劑盒在檢 測1.9mg/L樣本所得結(jié)果與實際濃度偏差在10%以內(nèi)，符合臨床準(zhǔn)確度要求，因此最低檢測 限可以達(dá)到1.9mg/L。
【主權(quán)項】
1. 一種基于膠乳免疫比濁法的微量白蛋白試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括： 試劑A，所述試劑A為pH = 8.5~9.4的甘氨酸緩沖體系，含有0.1~0.5g/L的高分子促聚 劑、1~10g/L的表面活性劑和0.5~10g/L的電解質(zhì)； 以及試劑B，所述試劑B為pH = 7.0~7.5的MES緩沖體系，含有2.5~3g/L的羊抗人微量 白蛋白多克隆抗體、5~1 OmL/L的羊抗人微量白蛋白多克隆抗體包被的膠乳、1~10g/L的表 面活性劑和〇. 5~10g/L的電解質(zhì)。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述膠乳為pH= 7.0~7.5的MES緩沖體系， 是粒徑為30~80nm優(yōu)選40~50nm的羧基微球經(jīng)NHS和EDC活化后再由羊抗人微量白蛋白多 克隆抗體包被得到的膠乳;所述膠乳中，羧基微球的濃度為1~2g/L優(yōu)選lg/L，NHS與羧基微 球的質(zhì)量比為〇. 05~0.1:1，EDC與羧基微球的質(zhì)量比為0.05~0.1:1，包被用的羊抗人微量 白蛋白多克隆抗體與羧基微球的質(zhì)量比為〇. 05~0.1:1。3. 如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑A和所述試劑B分別還含有0.5 ~lg/L的防腐劑，所述防腐劑為proclin300和/或疊氮鈉。4. 如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑A中的高分子促聚劑為聚乙二醇 6000，聚乙二醇6000在所述試劑A中的濃度為0.2~0.5g/L;所述試劑A和所述試劑B中的表 面活性劑均為曲拉通X100;所述試劑A和所述試劑B中的電解質(zhì)均為氯化鈉。5. 如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑A為pH = 9.0的100mmol/L甘氨酸 緩沖體系，含有〇.5g/L的聚乙二醇6000、lg//L的曲拉通X100、5 g//L的氯化鈉和lg/L的疊氮 鈉。6. 如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑B為pH = 7.0的50mmol/L MES緩沖 體系，含有2.8g/L的羊抗人微量白蛋白多克隆抗體、5mL/L的羊抗人微量白蛋白多克隆抗體 包被的膠乳、lg/L的曲拉通X100、5g/L的氯化鈉和lg/L的疊氮鈉。7. -種制備試劑B的方法，其特征在于，所述試劑B為pH = 7.0~7.5的MES緩沖體系，含 有2.5~3g/L的羊抗人微量白蛋白多克隆抗體、5~10mL/L的羊抗人微量白蛋白多克隆抗體 包被的膠乳、1~l〇g/L的表面活性劑和0.5~10g/L的電解質(zhì)； 該方法包括如下步驟： 1) 用pH = 7 ·0~7 · 5的MES緩沖液將羧基微球稀釋至1~2g/L，再加入NHS和EDC，15~25 °C下反應(yīng)20~30分鐘得到活化膠乳； 2) 向活化膠乳中加入包被用的羊抗人微量白蛋白多克隆抗體，在25~37°C下振搖孵育 2~4小時，制得羊抗人微量白蛋白多克隆抗體包被的膠乳； 3) 根據(jù)所述試劑B的各組分濃度，向pH = 7.0~7.5的MES緩沖液中加入表面活性劑、電 解質(zhì)和羊抗人微量白蛋白多克隆抗體，然后加入步驟2)制得的羊抗人微量白蛋白多克隆抗 體包被的膠乳； 4) 用0.2yL尼龍膜過濾除菌和大顆粒，得試劑B。8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟1)中的羧基微球粒徑為30~80nm優(yōu)選40 ~50nm;NHS與羧基微球的質(zhì)量比為0.05~0.1:1，EDC與羧基微球的質(zhì)量比為0.05~0.1:1; 步驟2)中，包被用的羊抗人微量白蛋白多克隆抗體與羧基微球的質(zhì)量比為0.05~0.1:1。9. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟2)和步驟3)中加入的羊抗人微量白蛋白 多克隆抗體預(yù)先用pH=7.0~7.5的MES緩沖液稀釋至20~30g/L。10.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟3)中，還添加有防腐劑proclin300和/ 或疊氮鈉，所述防腐劑添加濃度為〇. 5~lg/L。
【文檔編號】G01N33/68GK106093433SQ201610431489
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月17日
【發(fā)明人】王軍峰, 鄧小龍, 孟菲
【申請人】上海執(zhí)誠生物科技有限公司