一種纖維蛋白原免疫比濁法檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及臨床體外檢測試劑技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種纖維蛋白原免疫比濁法檢 測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維蛋白原是一種由肝臟合成的具有凝血功能的蛋白質(zhì)，是纖維蛋白的前體。分 子量340000,半衰期4~6日。血漿中參考值2~4克/升。纖維蛋白原由α、β、γ三對不同多肽 鏈所組成，多肽鏈間以二硫鍵相連。在凝血酶作用下，α鏈與β鏈分別釋放出Α肽與Β肽，生成 纖維蛋白單體。在此過程中，由于釋放了酸性多肽，負電性降低，單體易于聚合成纖維蛋白 多聚體。但此時單體之間借氫鍵與疏水鍵相連，尚可溶于稀酸和尿素溶液中。進一步在Ca+2 與活化的xm因子作用下，單體之間以共價鍵相連，則變成穩(wěn)定的不溶性纖維蛋白凝塊，完 成凝血過程。肝功能嚴重障礙或先天性缺乏，均可使血漿纖維蛋白原濃度下降，嚴重時可有 出血傾向。
[0003] 纖維蛋白原與肝臟疾病:纖維蛋白原系肝臟合成，主要分布在血漿，亦存在于血小 板和巨核細胞。正常血漿濃度為1.5~3.5g/L，因此當肝臟嚴重受損，使肝臟合成纖維蛋白 原功能發(fā)生障礙，則血漿中纖維蛋白原濃度降低。纖維蛋白原是肝臟合成的一種血漿糖蛋 白?？蓞⑴c血栓及冠狀動脈的形成和發(fā)展，是反映血栓狀態(tài)一個指標，也是急性冠狀動脈事 件的獨立預(yù)報因子之一。纖維蛋白原升高提示機體纖溶活性降低，促血栓形成。
[0004] 纖維蛋白原與腎病綜合征（NS) :NS患者的凝血因子改變，以纖維蛋白原水平增 高最為明顯。纖維蛋白原水平增高可達l〇g/L，這是由于合成增加的結(jié)果，這種增高與其從 尿中丟失的量成比例，但纖維蛋白原的分解代謝率則正常。NS患者的纖維蛋白原和膽固醇 水平有顯著相關(guān)性，而且兩者與血清白蛋白水平呈負相關(guān)。
[0005] 纖維蛋白原與粥樣硬化:纖維蛋白原和纖維素與粥樣斑塊形成的關(guān)系極為密切。 已知纖維蛋白溶解機制受到多種因素影響，例如吸煙、糖尿病，尤其是高血清甘油三酯都能 引起血漿纖維酶原激活物抑制劑升高，從而降低了纖溶酶原的合成。血液粘稠度比較高，這 些均有利于纖維素的形成。纖維蛋白原是一種急性時相蛋白，作為凝血因子I由血液進入動 脈壁內(nèi)，在凝血酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白單體繼發(fā)交聯(lián)為纖維蛋白，可直接破壞內(nèi)皮細胞 吸附在紅細胞表面，使動脈血栓發(fā)生率增加，并促進粥樣斑快進展。另外血漿纖維蛋白原可 沉積于血管壁，加速動脈粥樣硬化，人們已發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化的斑塊中纖維蛋白凝聚物的 量組疾病纖維蛋白原含量均增高，并都具有血液粘度增高。動脈粥樣硬化甚者阻塞的特征。
[0006] 纖維蛋白原與心腦血管疾病:對急性缺血綜合征中血栓的研究表明，血漿纖維蛋 白原水平是獨立的危險因素，有冠狀動脈阻塞病的患者血漿中纖維蛋白原水平較高，心肌 梗死的范圍也與纖維蛋白原增加程度密切相關(guān)。有不穩(wěn)定心絞痛的病人，在其發(fā)生心肌梗 死之前，往往有血漿纖維蛋白原水平升高現(xiàn)象。在心肌梗死病程中，再梗死多發(fā)生在纖維蛋 白原水平超過7g/L的患者。
[0007] 纖維蛋白原與血液流變學(xué):發(fā)現(xiàn)纖維蛋白原與全血粘度、血漿粘度、血沉及血小板 聚集之間呈顯著正相關(guān)，提示血漿纖維蛋白原含量升高，可使血液粘度增高。紅細咆聚集增 高，血小板聚集增高，從而使血液處于高凝狀態(tài)促進血栓形成。血漿纖維蛋白原含量升高因 其分子量大。濃度高，又具有聚合作用，是除紅細胞外使血液粘度增高的重要因素；因此，血 漿纖維蛋白原含量在判斷疾病的發(fā)生發(fā)展上具有十分重要的意義。 纖維蛋白原與其它因素:影響纖維蛋白原水平的其它因素較多，如遺傳傾向性、年齡增 長、高脂血癥、吸煙、原發(fā)性高血壓、肥胖癥、口服避孕藥及妊娠期等，均是血漿纖維蛋白原 升尚的危險因素。
[0008] 纖維蛋白原免疫比濁法檢測試劑盒基于當樣本與試劑混合，樣本中的Fb特異性地 與抗體反應(yīng)形成不溶性的抗原-抗體復(fù)合物，引起濁度增加，在340nm波長下檢測其濁度的 變化，變化程度與樣本中Fb的濃度成正比。該方法是一種無需預(yù)處理樣本，技術(shù)和設(shè)備要求 不高，而精密度和特異性更高的分析方法。由于該方法不需要昂貴的設(shè)備，可以實現(xiàn)自動 化，且可測定大量標本，因此受到臨床廣泛推廣。但是普通的纖維蛋白原免疫比濁法檢測試 劑穩(wěn)定性不好，靈敏度也不高，因而限制了其在臨床上的推廣應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 針對于現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種纖維蛋白原免疫比濁法檢測試劑 盒，該試劑盒與常規(guī)的試劑盒相比，穩(wěn)定性比常規(guī)的檢測試劑盒要好，分析靈敏度高，有利 于試劑在臨床上的推廣應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明是通過以下措施實現(xiàn)的： 一種纖維蛋白原免疫比濁法檢測試劑盒，其特征在于，它包含試劑R1、試劑R2和校準 品，其中試劑R1組成為：100mm〇l/L pH6.8 Tris緩沖液、0.1%疊氮鈉、0.1%-2%二氧化硅包覆 的磁性納米顆粒;試劑R2組成為：100mm〇l/L pH6.8 Tris緩沖液、30ml/L羊抗人Fb抗體、20-40g/L 牛血清白蛋白、0.05% Kathon-CG。
[0011 ] 所述二氧化娃包覆的磁性納米顆粒為Fe3〇4/Si〇2復(fù)合納米粒子，粒徑為20_50nm。
[0012] 所述試劑R1和試劑R2在使用時的比例為R1 :R2=3:1。
[0013] 本發(fā)明所使用的二氧化硅包覆的磁性納米顆粒是采用以下方法制備的： 采用多元醇法制備Fe304納米粒子。取一定的乙酰丙酮鐵和三甘醇加入到回流加熱反 應(yīng)裝置中，在磁力攪拌和Ar氣保護的條件下，將裝置緩慢加熱至沸騰，并保持回流一段時 間。冷卻后向反應(yīng)溶液中加入乙酸乙酯使生成的四氧化三鐵納米粒子產(chǎn)生絮凝，磁性分離 黑色產(chǎn)物，清洗數(shù)次，分散到乙醇中，即得到穩(wěn)定的Fe 304納米粒子乙醇膠體溶液。之后將所 得Fe3〇4納米粒子采用Stober水解法制得Si〇2包覆的Fe3〇4納米粒子。所得Fe3〇4/Si〇2復(fù)合納 米粒子的粒徑為20_50nm〇
[0014] 本發(fā)明所使用的校準品為久峰潤達生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Fb校準品。
[0015] 本發(fā)明的試劑盒在具有雙試劑功能的自動生化分析儀上進行，其具體使用方法見 圖4,加入生理鹽水、樣本或校準品5μ1，之后再加入R1試劑225μ1預(yù)孵育5min后讀取吸光度 A1，之后再加入75μ1的試劑R2反應(yīng)5min后，讀取吸光度A2，并計算Δ A。
[0016] 本發(fā)明的有益效果： 本發(fā)明提供的纖維蛋白原免疫比濁法檢測試劑盒，通過在試劑R1中加入二氧化硅包覆 的磁性納米顆粒，該磁性納米顆粒在靜電吸附的作用下與羊抗人Fb抗體結(jié)合，從而使抗體 在磁性納米顆粒上形成凝集，大大的提高了試劑的分析靈敏度。同時在試劑R2中加入牛血 清白蛋白，解決了抗體在稀溶液中不穩(wěn)定這一難題，在試驗中它能使抗體穩(wěn)定，且相對地中 性，但不會影響抗體的性質(zhì)，而Kathon-CG是一種新型高效環(huán)保型廣譜殺菌劑、防腐劑，在該 試劑盒中使用Kathon-CG有效解決了BSA長時間保存易發(fā)霉的缺點，因此BSA與Kathon-CG共 同作用有效地增強了試劑盒的穩(wěn)定性，卻不會對試劑的準確度產(chǎn)生影響，有利于該試劑在 市場中進一步的推廣。
【附圖說明】
[0017] 圖1實施例2準確度驗證實驗檢測結(jié)果與對照組檢測結(jié)果相關(guān)性； 圖2實施例3準確度驗證實驗檢測結(jié)果與對照組檢測結(jié)果相關(guān)性；