專利名稱：生物催化合成d-芳基甘氨酸的酶制劑及其制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，特別涉及一種生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制 劑及其制備方法和應用。
背景技術(shù)：
D-芳基氨基酸(如，D-芳基甘氨酸)是一類十分重要的非天然氨基酸，由于其構(gòu) 型與天然氨基酸正好相反而可以用于藥物(如，拮抗劑)、肽以及甜味劑等的合成和制備， 近年來隨著對其應用價值的進一步開發(fā)，市場的需求量在迅猛增長。傳統(tǒng)的D-芳基氨基酸(如，D-芳基甘氨酸)的制備方法，包括了化學合成及拆分 法，但是其需要浪費一半的對映異構(gòu)體，造成生產(chǎn)效率低、產(chǎn)能低、能耗高等缺點。在生物催化D-芳基海因水解法中，傳統(tǒng)的技術(shù)為“一菌兩酶”法，如中國專利或?qū)?利申請01105347、200710191968等所述的。但是，該技術(shù)中所使用的一種微生物本身要兼 顧兩種酶，難以耐受高濃度的底物并在工業(yè)生產(chǎn)中保持連續(xù)的酶催化作用，因此難以加入 飽和濃度的底物而實現(xiàn)非均相酶催化。因此這些專利申請即使授權(quán)，也因不適合實際的工 業(yè)生產(chǎn)而放棄了專利權(quán)。中國專利申請200610048209. 0和200710062118. 7公開了一種非均相酶催化水解
5-芳基海因合成D-芳基甘氨酸或其衍生物的方法，以“兩菌兩酶”法來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的“一菌兩 酶”法，其中使用黃金節(jié)桿菌(Arthrobacter aurescens) LZ98或其突變菌UV-LZ98來產(chǎn)生 (Hydantoinase)方j(身寸M胃(Agrobacterium radiobacter) LZ99 ^^
突變菌UV-LZ99來產(chǎn)生氨甲酰胺水解酶，由此產(chǎn)生一定酶活性的酶制劑來使得相應合成方 法得以實現(xiàn)。然而，該方法中使用的制備酶制劑的兩株菌株購買成本較高，尤其是LZ99以 及突變菌UV-LZ99不但昂貴，而且產(chǎn)生的氨甲酰胺水解酶在工業(yè)規(guī)模的長時間發(fā)酵時穩(wěn)定 性不夠，發(fā)酵耐久性不足，大大限制了該專利的非均相酶催化水解5-芳基海因來合成D-芳 基甘氨酸的工業(yè)化應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種生物催化合成D-芳基甘氨酸的 酶制劑及其制備方法和應用，它能代替現(xiàn)有的用于非均相酶催化水解5-芳基海因制備 D-芳基甘氨酸的方法中的酶制劑，使生產(chǎn)成本大大降低，且方法簡單、易于工業(yè)化應用。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)本發(fā)明的第一個方面，生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑，它由產(chǎn)海因酶的黃 金節(jié)桿菌的活化細胞和產(chǎn)氨甲酰水解酶的放射形土壤桿菌的活化細胞組成。所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑，其特征是，所述黃金節(jié)桿菌產(chǎn)生的 海因酶的初始酶活性為大于0. 32U，所述放射形土壤桿菌產(chǎn)生的氨甲酰水解酶的初始的活 性大于IOU0
所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑，所述黃金節(jié)桿菌的初始海因酶活 性為 0. 32U 0. 45U。所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑，所述黃金節(jié)桿菌為黃金節(jié)桿菌 3256活化細胞，所述放射形土壤桿菌為放射形土壤桿菌3255活化細胞。本發(fā)明的第二個方面，所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑的制備方法， 它包括以下步驟a.將產(chǎn)海因酶的黃金節(jié)桿菌接種于含玉米漿、糖蜜、氫氧化鈉水溶液、氯化鈉、 2-硫尿嘧啶、硫酸鎂、硫酸錳和磷酸氫二銨的液體培養(yǎng)基中，于30 34°C攪拌活化培養(yǎng)。其 中，攪拌速度為60rpm，活化時間為12 18h，優(yōu)選14 16h ；空氣壓力為0. 18 0. 23Mpa， 優(yōu)選為0. 2Mpa ；空氣流量為20 26L/h ；反應釜壓力為0. 04 0. 06Mpa，優(yōu)選為0. 05Mpa ； 然后將該培養(yǎng)液用殼聚糖水溶液絮凝，過濾收獲固形酶制劑1 ；所述液體培養(yǎng)基含玉米漿360 460重量份、糖蜜380 480重量份、濃度為25 35% (w/w)的氫氧化鈉水溶液15 25重量份、氯化鈉40 60重量份、2-硫尿嘧啶27 37重量份硫酸鎂8 10重量份、硫酸錳1. 2 1. 8重量份和磷酸氫二銨3 4重量份，并 加水定容至8000重量份；b.將產(chǎn)氨甲酰水解酶的放射形土壤桿菌接種于含玉米漿、葡萄糖、蛋白胨、氯化 鈉、硫酸錳、磷酸氫二銨和阿拉伯糖的液體培養(yǎng)基中，于32 38°C攪拌活化培養(yǎng)，其中攪 拌速度為60rpm ；活化時間為15 22h，優(yōu)選16 18h，最優(yōu)選為17h ；空氣壓力為0. 18 0. 23Mpa，優(yōu)選為0. 2Mpa ；空氣流量為18 22L/h ；反應釜壓力為0. 04 0. 06Mpa，優(yōu)選為 0. 05Mpa ；在所述培養(yǎng)基中添加氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為6. 5 7. 8，優(yōu)選為6. 8 7. 3，最優(yōu)選為 7. 0，然后將該培養(yǎng)液用殼聚糖水溶液絮凝，過濾收獲固形酶制劑2 ；所述液體培養(yǎng)基含玉米漿200 400重量份、葡萄糖180 260重量份、蛋白胨 80 100重量份、25g氯化鈉20 30重量份、硫酸錳1. 6 2. 0重量份、磷酸氫二銨6. 8 7. 6重量份和阿拉伯糖12 16重量份；并將所述液體培養(yǎng)基加水定容至8000重量份；c.將步驟a制得的固形酶制劑1和步驟b制得的固形酶制劑2混合，制得生物催 化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑。其中所述固形酶制劑1和所述固形酶制劑2的重量配比隨 底物的不同而有所不同，通常控制二者比例為1 5 1 50，優(yōu)選的比例為1 5 1 20，更優(yōu)選的比例為1 2 1 5。本發(fā)明的第三個方面，所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑，它用于酶催 化非均相水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法中。所述的酶催化非均相水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法包括以下步驟①酶催化反應罐中，加入水和5-芳基海因，并調(diào)整pH值為6. 5 7. 8，芳基海因的 加入量占水和5-芳基海因總重量的5 21% (w/w)，得混合溶液；在步驟①中，由此配比的物料將形成懸濁液，即溶液呈過飽和狀態(tài)，有5-芳基海 因的固體原料存在。②在攪拌的條件下向酶催化反應罐中加入權(quán)利要求1 5任一所述的生物催化合 成D-芳基甘氨酸的酶制劑，在25 40°C下攪拌反應，直至無法檢測出5-芳基海因，得D-芳 基甘氨酸；其中所述生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑占步驟①中的混合溶液的總重量
5的1 10%，優(yōu)選為為2-8% ；反應時間8 66小時；③通過200目篩分離出D-芳基甘氨酸固體，經(jīng)過重結(jié)晶，獲得D-芳基甘氨酸晶 體；在步驟③中，由于存在菌體和細小的固體產(chǎn)品結(jié)晶，因此優(yōu)選通過200目篩分離， 所截留下來的固體是粒度較大的D-芳基甘氨酸晶體(粗產(chǎn)品)，菌體和碎小顆粒的固體產(chǎn) 物通過篩孔而進入到膜分離系統(tǒng)。④通過截留5000 5萬分子量超濾膜過濾和蒸發(fā)濃縮來提取酶催化反應溶液中 溶解的D-芳基甘氨酸，再經(jīng)過重結(jié)晶，得D-芳基甘氨酸晶體。由于分離出D-芳基甘氨酸晶體后所得的溶液是飽和的D-芳基甘氨酸，為了進一 步提高產(chǎn)率，因此采用了步驟④。即將步驟③能流過篩的液體通過膜過濾除去菌體，對濾液 濃縮得到D-芳基甘氨酸晶體，經(jīng)過重結(jié)晶，獲得D-芳基甘氨酸晶體。優(yōu)選的，所述的非均相酶催化水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法步驟④還可以 采用以下步驟先通過超濾膜過濾篩分分離透過篩孔的部分，即得酶催化反應罐中溶解有D-芳 基甘氨酸的溶液，其膜透析液被蒸發(fā)濃縮得另一部分D-芳基甘氨酸粗產(chǎn)品，再經(jīng)重結(jié)晶獲 得D-芳基甘氨酸晶體。所述的非均相酶催化水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法中的D-芳基甘氨酸為 D-苯甘氨酸、D-對羥基苯甘氨酸、D-氟苯甘氨酸、D-氯苯甘氨酸、D-溴苯甘氨酸、D-碘苯 甘氨酸、D-甲氧苯甘氨酸、D-吡啶系列甘氨酸、D-萘系列甘氨酸、D-喹啉系列甘氨酸D-嘧 啶甘氨酸、D-吡嗪甘氨酸、D-噠嗪甘氨酸、D-吲哚甘氨酸、D-噻吩甘氨酸、D-呋喃甘氨酸、 D-吡咯甘氨酸、D-吡唑甘氨酸、D-咪唑甘氨酸、D-噻唑甘氨酸、D-噁唑甘氨酸和D-異噁唑 甘氨酸中的一種。進一步的，所述制備非均相酶催化水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法中的D-芳 基甘氨酸為D-苯甘氨酸；所述D-苯甘氨酸的制備方法為①在酶催化反應罐中，加入水30kg和5-苯基海因2. 8kg，并調(diào)整pH值為6. 8 ；②在攪拌的條件下向酶催化反應罐加入權(quán)利要求1-5之任一所述的生物催化合 成D-芳基甘氨酸的酶制劑2. 8kg，在38°C下攪拌反應，直至無法檢測出5-苯基海因，并且 中間產(chǎn)物N-氨甲酰苯甘氨酸含量小于等于0. 25 % (w/w)，顯示反應基本完成，制得D-苯基 甘氨酸；③分離析出D-苯基甘氨酸固體，經(jīng)過重結(jié)晶，獲得D-苯基甘氨酸晶體產(chǎn)品；④通過超濾膜過濾和蒸發(fā)濃縮來提取酶催化反應溶液中溶解的D-苯基甘氨酸， 得另一部分，即D-苯基甘氨酸產(chǎn)品。在所述生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑中，所述黃金節(jié)桿菌和放射形土壤 桿菌均為活菌，優(yōu)選為活化培養(yǎng)的菌。因此，優(yōu)選本發(fā)明第一方面提供的生物催化合成 D-芳基甘氨酸的酶制劑是由產(chǎn)海因酶的黃金節(jié)桿菌的活化細胞和產(chǎn)氨甲酰水解酶的放射 形土壤桿菌的活化細胞組成。在本發(fā)明中，“活化細胞”表示菌體細胞經(jīng)過活化培養(yǎng)，使得細 胞具有相應的純化形式的酶的酶活性，即海因酶活性和氨甲酰水解酶活性。因此，所述生物 催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑可以在工業(yè)化生產(chǎn)過程中保持長時間的酶活性。盡管所 述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑是不可溶的(包括菌體)，但是根據(jù)本發(fā)明人長
6期觀察，配合使用本發(fā)明所述的非均相法制備的D-芳基甘氨酸的粗晶體顆粒比菌體及其 碎片大得多，因此可以容易地通過過篩分離的方法提取粗晶體顆粒，而不會引入過多菌體 雜質(zhì)以影響純度，也不會分離喪失掉粗晶體顆粒而導致產(chǎn)率下降。在本發(fā)明的第一方面中，黃金節(jié)桿菌的初始海因酶活性為大于0. 30U，放射形土壤 桿菌的初始氨甲酰水解酶為大于9U，優(yōu)選初始海因酶活性為大于0. 32U，也優(yōu)選初始氨甲 酰水解酶為大于10U，最佳選初始氨甲酰水解酶為9. 5U 15U，最佳選初始氨甲酰水解酶為 IOU 12U。由于在工業(yè)化生產(chǎn)過程中，酶的活性會逐漸降低。因此，本發(fā)明的第一方面中 的菌體本身需要有一定催化能力，而且該催化能力需要在工業(yè)化生產(chǎn)中定量可控的。這樣， 本發(fā)明使用活化后投料前針對菌體測定的初始活性作為催化能力指標，其具體測量方法可 以根據(jù)本發(fā)明具體實施例中所列的方式進行。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，由于改用了產(chǎn)氨甲酰水解酶 的放射形土壤桿菌，催化效率和穩(wěn)定性得以提高，中間產(chǎn)物積累少，因此產(chǎn)海因酶的黃金節(jié) 桿菌無需太好，其初始海因酶活性可以優(yōu)選為0. 32 0. 45U。這樣，可以使用市售的較便宜 的黃金節(jié)桿菌，如黃金節(jié)桿菌3256。另外，由于產(chǎn)氨甲酰水解酶的放射形土壤桿菌篩選較容 易，因此可以不使用昂貴的LZ系列菌種，而使用較便宜的市售放射形土壤桿菌，如放射形 土壤桿菌3255。在本發(fā)明的具體實施方式
中，優(yōu)選的酶制劑由放射形土壤桿菌3255和黃金 節(jié)桿菌3256組成，更優(yōu)選的酶制劑由放射形土壤桿菌3255活化細胞和黃金節(jié)桿菌3256活 化細胞組成。為了進一步改進現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，我們經(jīng)過艱苦實驗，發(fā)現(xiàn)當使用適當活化培 養(yǎng)的菌株細胞直接配制本發(fā)明的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑的時候(即采用本 發(fā)明的“兩菌”法)，其中即使采用了更為常規(guī)的氨甲酰水解酶(Carbamylase)代替現(xiàn)有“兩 菌兩酶”法中的氨甲酰胺水解酶，也能夠滿足非均相酶催化水解5-芳基海因合成D-芳基甘 氨酸的需求，因此可以不使用諸如突變菌UV-LZ99等昂貴的菌株來提取相應的氨甲酰胺水 解酶，從而最終配制成生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑。更令人意想不到的是，當采 用本發(fā)明的方法活化菌株細胞并配制生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑，甚至海因酶 的產(chǎn)生菌株也可以使用較為常規(guī)而且價格更為低廉的菌株。以上菌株的使用在降低成本的 同時，并不影響工業(yè)規(guī)模的酶催化非均相水解5-芳基海因合成D-芳基甘氨酸的穩(wěn)定性以 及耐久性，也可以直接使用原有非均相酶催化的設備以及發(fā)酵流程，無需新的設備成本投 入，也無需重新培訓生產(chǎn)線上的技術(shù)人員以掌握其他發(fā)酵流程。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果為①與原有“兩菌兩酶”法在非均相酶催化水解5-芳基海因合成D-芳基甘氨酸中 應用相比，本發(fā)明換用了酶并換用了活化和配制方法，本發(fā)明反應速度快、節(jié)能、產(chǎn)率高、產(chǎn)
品質(zhì)量穩(wěn)定等。②“兩菌”法無需提取酶的步驟，酶(菌)的活化過程與菌種細胞的培養(yǎng)放大過程 合二為一，簡化了實際生產(chǎn)的步驟，降低了生產(chǎn)成本。③菌種成本低，無需多種昂貴的菌種相配合(即使海因酶的活性較低，也不影響 最終發(fā)酵效率)，而且新的活化和配制方法使得配制后得到的酶制劑在生產(chǎn)中持久、穩(wěn)定， 無需像“兩酶兩菌”法那樣需要在長時間的反應過程中監(jiān)控酶活性并適時補加，可以方便地 放大到工業(yè)規(guī)模級的生產(chǎn)中，特別適于工業(yè)化生產(chǎn)。④底物適應性強，無須像現(xiàn)有的“兩菌兩酶”法那樣，D-對羥基苯甘氨酸可以使用
7放射形土壤桿菌LZ99發(fā)酵產(chǎn)生的酶，而對其他D-芳基甘氨酸則需要另外篩選出的放射形 土壤桿菌UV-LZ99的酶。⑤直接使用了細胞而不使用可溶性酶，可以避免混合發(fā)酵以及酶提取的步驟，只 需要活化菌種即可，對于長期困擾晶體純度的蛋白雜質(zhì)問題，我們經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)細胞體和用 非均相法結(jié)晶出來的粗產(chǎn)物大小不同，用市售的200目篩就可以簡單地分離，十分方便工 業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。實施例一1、海因酶制劑的制備在IOL發(fā)酵罐中，分別加入416g玉米漿、428g糖蜜、20mL 30% (w/w)氫氧化鈉水 溶液、50g氯化鈉、32g 2-硫尿嘧啶、IOg硫酸鎂、15g硫酸錳、3. 6g磷酸氫二銨以及水至體積 達到8L，于0. 1 0. 12Mpa壓力、120 125°C條件下消毒滅菌0. 5h，降溫至30. 5°C時，將預 先在250mL搖瓶中培養(yǎng)好的黃金節(jié)桿菌3256(購自石家莊中天生物技術(shù)有限責任公司)接 種于發(fā)酵罐中。隨后在空氣壓力為0. 2Mpa、空氣流量為20 26L/h的前提下，控制反應釜 壓力為0.05Mpa、溫度為33°C，攪拌發(fā)酵15h。然后，將發(fā)酵液用(w/w)殼聚糖400g絮 凝，沉淀出含海因酶細胞，減壓過濾得濕的海因酶制劑，即為活化的黃金節(jié)桿菌3256細胞。同時，另外取ImL發(fā)酵液測定海因酶的酶活性將ImL發(fā)酵液以4800r/min離心 30min,棄上清液并將所得細胞重懸于生理鹽水中，使總體積達到lmL，不提取酶而直接向該 細胞懸液中加入9mL含2. 2% (w/w)對羥基苯海因的磷酸緩沖溶液(pH8. 0)，于38°C下緩 慢震蕩反應30min，然后加入0. ImL 6N鹽酸混勻終止反應，然后離心30min。取上清液，用 HPLC測定其中D-N-氨甲酰對羥基苯甘氨酸的濃度。1個海因酶的酶活單位(U)被定義為 每Imin內(nèi)每ImL發(fā)酵液所含細胞能產(chǎn)生的D-N-氨甲酰對羥基苯甘氨酸的量。根據(jù)三次發(fā) 酵結(jié)果，海因酶活性分別為0. 37U、0. 42U和0. 39U，表明用該方法可以直接穩(wěn)定活化出高酶 活性的細胞。2、氨甲酰水解酶制劑的制備在IOL發(fā)酵罐中，分別加入360g玉米漿、220g葡萄糖、90g蛋白胨、25g氯化鈉、 1. Sg硫酸錳、7. 2g磷酸氫二銨、14g阿拉伯糖以及水至體積8L，并用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為 6.8。于0. 1 0. 12Mpa壓力、12. 125°C條件下消毒滅菌0. 5h，降溫至30. 5°C，將預先在 250mL搖瓶中培養(yǎng)好的放射形土壤桿菌3255 (購自石家莊中天生物技術(shù)有限責任公司)接 種于發(fā)酵罐中。隨后在壓力為0. 2Mpa、空氣流量為18 22L/h的前提下，控制反應釜壓力 0.05Mpa、溫度為35°C，攪拌發(fā)酵17h。然后，將發(fā)酵液用(w/w)殼聚糖400g絮凝，從而 沉淀出細胞，減壓過濾得濕的氨甲酰水解酶制劑，即為活化的放射形土壤桿菌3255細胞同時，另外取ImL發(fā)酵液測定氨甲酰水解酶的酶活性將ImL發(fā)酵液以4800r/min 離心30min，棄上清液并將所得細胞重懸于生理鹽水中，使總體積達到lmL，不提取酶而直 接向該細胞懸液中加入9mL含2. 2% (WZV)D-N-氨甲酰對羥基苯甘氨酸的磷酸緩沖溶液 (pH8. 0)，于38°C下緩慢震蕩反應30min，然后加入0. ImL 6N鹽酸混勻終止反應，然后離心 30min。取上清液，用HPLC測定其中D-對羥基苯甘氨酸的濃度。1個氨甲酰水解酶的酶活
8單位(U)被定義為每Imin內(nèi)每ImL發(fā)酵液所含細胞能產(chǎn)生的D-對羥基苯甘氨酸的量。根 據(jù)三次發(fā)酵結(jié)果，氨甲酰水解酶的酶活性分別為10. 1UU1.7U和10. 6U，表明用該方法可以 直接穩(wěn)定活化出高酶活性的細胞。3，生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑取以上制備的濕的海因酶制劑和濕的氨甲酰水解酶制劑混合均勻，即得雙酶制 劑一生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑。實施例二，生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑的應用一催化反應實例1、D-對苯甘氨酸的制備在50L的酶催化反應罐中，先加入30kg水，然后投入5_苯基海因2. 8kg，加鹽酸 或硫酸調(diào)整PH為6. 8，在攪拌的條件下再加入由實施例一步驟1中制備的濕的海因酶制劑 1.5kg和實施例一步驟2中制備的濕的氨甲酰水解酶酶制劑1.5kg，混合均勻，控制溫度為 38°C，攪拌反應。當反應進行到4h左右時，則有D-苯甘氨酸晶體析出，其間抽樣并用高效液相色譜 檢測反應，反應液中D-苯甘氨酸的濃度基本恒定在1.6%左右。待液相色譜幾乎檢不出底 物5-苯基海因，且中間體N-氨甲酰苯甘氨酸含量低于0. 25%時，停止反應。苯海因的轉(zhuǎn)化 率在99. 6%以上。對該50L酶催化反應罐中的物質(zhì)過200目篩，以實現(xiàn)固體產(chǎn)物與微小的菌體細胞 和溶液之間的分離，得到D-苯甘氨酸的粗晶體。以水為溶劑，通過酸堿轉(zhuǎn)化重結(jié)晶便可獲 得D-苯甘氨酸1.48kg，此為第一部分產(chǎn)品；篩分分離得到的液體部分進一步提取首先將 液體通過截留5000分子量超濾膜進行過濾，濾液經(jīng)減壓蒸發(fā)濃縮，期間有D-苯甘氨酸結(jié)晶 析出。過濾收集D-苯甘氨酸結(jié)晶，再采用第一部分產(chǎn)品相同的重結(jié)晶方法，便可獲得第二 部分產(chǎn)品0. 51kg。合并兩部分D-苯甘氨酸，共得純度為99. 8%以上、質(zhì)量為1. 99kg的產(chǎn) 品，總收率83%。2，D-苯甘氨酸衍生物的制備采用與上述ID-對苯甘氨酸的制備相同的制備方法和參數(shù)，其中以5-對羥基苯 海因4. 5kg代替5-苯海因2. 8kg，最終得到純度為99. 7%以上的D-對羥基苯甘氨酸晶體 3. Ikg0采用與上述ID-對苯甘氨酸的制備相同的制備方法和參數(shù)，其中以5-對甲氧基苯 海因3. 2kg代替5-苯海因2. 8kg，最終得到純度為99. 8%以上的D-對甲氧基苯甘氨酸晶 體 2. 3kg。采用與上述ID-對苯甘氨酸的制備相同的制備方法和參數(shù)，其中以5-對氟苯海因 3. 8kg代替5-苯海因2. 8kg，最終得到純度為99. 8%以上的D-對氟苯甘氨酸晶體2. 6kg。采用與上述ID-對苯甘氨酸的制備相同的制備方法和參數(shù)，其中以5-對氯苯海因 3. 5kg代替5-苯海因2. 8kg，最終得到純度為99. 8%以上的D-對氯苯甘氨酸晶體2. 4kg。采用與上述ID-對苯甘氨酸的制備相同的制備方法和參數(shù)，其中以5-對溴苯海 因4. Ikg代替5-苯海因2. 8kg，最終得到純度為99. 8 %以上的晶體D-對溴苯甘氨酸晶體 2. 9kg。采用與實例二中1相同的制備方法和參數(shù)，其中以5-對碘苯海因2. 8kg代替5-苯
9海因2. 8kg，最終得到純度為99. 7%以上的D-對碘苯甘氨酸晶體2. 1kg。3、D-3-吡啶甘氨酸的制備在50L的酶催化反應罐中，先加入32kg水，在攪拌的條件下投入5_(3_吡啶基) 海因3. 8kg，加鹽酸或硫酸調(diào)整pH為6. 3，再加入由實施例一中1制備的濕的海因酶制劑 1. 8kg和實施例一中2制備的濕的氨甲酰水解酶酶制劑3. 0kg，混合均勻，于33°C下攪拌反 應。當反應進行到6h左右時，則有D-3-吡啶甘氨酸晶體開始析出，然后定期取樣并用 高效液相色譜檢測反應，待液相色譜幾乎檢不出底物5-(3_吡啶基)海因，且中間體N-氨 甲酰-3-吡啶甘氨酸含量低于0.20% (w/w)時，停止反應。5-(3_吡啶基)海因的轉(zhuǎn)化率 在99. 6%以上。反應混合物經(jīng)200目篩以實現(xiàn)固體產(chǎn)物與菌體和溶液之間的分離，得到D-3-吡 啶甘氨酸的粗晶體，以水為溶劑，通過酸堿轉(zhuǎn)化重結(jié)晶便可獲得D-3-吡啶甘氨酸1. 87kg， 此為第一部分產(chǎn)品；將透過篩的得到的液體進一步提取首先將液體通過截留1萬分子 量的超濾膜進行過濾，濾液經(jīng)減壓蒸發(fā)濃縮，期間有D-3-吡啶甘氨酸結(jié)晶析出。過濾收 集D-3-吡啶甘氨酸結(jié)晶，再采用第一部分產(chǎn)品相同的重結(jié)晶方法，便可獲得第二部分產(chǎn)品 0. 81kg。合并兩部分D-3-吡啶甘氨酸，共得純度為99. 2%以上、質(zhì)量為2. 68kg的產(chǎn)品，總 收率82%。4、D-2_萘甘氨酸的制備在50L的酶催化反應罐中，先加入37kg水，在攪拌的條件下投入5_(2_萘基)海 因3. 8kg，加鹽酸或硫酸調(diào)整pH為7. 1，再加入由實施例一/1制備的濕的海因酶制劑1. 5kg 和實施例一中2制備的濕的氨甲酰水解酶酶制劑2. 3kg，混合均勻，于38°C下攪拌反應。當反應進行到7h左右時，則有D-2-萘甘氨酸晶體開始析出，然后定期取樣并用高 效液相色譜檢測反應，待液相色譜幾乎檢不出底物5- (2-萘基)海因及對應中間體時，停止 反應。5-(2-萘基)海因的轉(zhuǎn)化率在99.0%左右。反應混合物過200目篩以實現(xiàn)固體產(chǎn)物與菌體細胞和溶液之間的分離，得到 D-2-萘甘氨酸的粗晶體，以水為溶劑，通過酸堿轉(zhuǎn)化重結(jié)晶得D-2-萘甘氨酸1. 90kg，此為 第一部分產(chǎn)品；將透過篩得到的部分液體進一步提取首先將液體通過截留1萬分子量的 超濾膜進行過濾，濾液經(jīng)減壓蒸發(fā)濃縮，期間有D-2-萘甘氨酸結(jié)晶析出。過濾收集D-2-萘 甘氨酸結(jié)晶，再采用第一部分產(chǎn)品相同的重結(jié)晶方法，便可獲得第二部分產(chǎn)品0. 63kg。合并 兩部分D-2-萘甘氨酸，共得純度為98. 8%以上、質(zhì)量為2. 53kg的產(chǎn)品，總收率75%。5、D-2-喹啉甘氨酸的制備在50L的酶催化反應罐中，先加入36kg水，在攪拌的條件下投入5_(2_喹啉基) 海因4. 2kg，調(diào)整pH為6. 5，然后加入由實施例一中1制備的濕的海因酶制劑1. 5kg和實施 例一中2制備的濕的氨甲酰水解酶酶制劑3. 2kg，混合均勻，于37°C下攪拌反應。當反應進行到6h左右時，則有D-2-喹啉甘氨酸晶體開始析出，然后定期取樣并 用高效液相色譜檢測反應，待液相色譜幾乎檢不出底物5-(2_喹啉基)海因，且其中間體 N-氨甲酰-D-喹啉甘氨酸在反應液中的含量低于0.3% (w/w)時，停止反應。5-(2-喹啉 基)海因的轉(zhuǎn)化率在99. 5%左右。反應混合物過200目篩以實現(xiàn)固體產(chǎn)物與菌體細胞和溶液之間的分離，得到D-2-喹啉甘氨酸的粗晶體。以水為溶劑，通過酸堿轉(zhuǎn)化重結(jié)晶得D-2-喹啉甘氨酸2. 55kg， 此為第一部分產(chǎn)品；將透過篩得到的液體進一步提取首先將液體通過截留2萬分子量的 超濾膜過濾，濾液經(jīng)減壓蒸發(fā)濃縮，期間有D-2-喹啉甘氨酸結(jié)晶析出，過濾、收集D-2-喹啉 甘氨酸結(jié)晶。再采用第一部分產(chǎn)品相同的重結(jié)晶方法，便可獲得第二部分產(chǎn)品0. 63kg，經(jīng)檢 測合格后，合并兩部分D-2-喹啉甘氨酸，共得純度為98. 5 %以上、質(zhì)量為3. 18kg的產(chǎn)品，總 收率85%。
權(quán)利要求
生物催化合成D 芳基甘氨酸的酶制劑，其特征是，它由產(chǎn)海因酶的黃金節(jié)桿菌的活化細胞和產(chǎn)氨甲酰水解酶的放射形土壤桿菌的活化細胞組成。
2.如權(quán)利要求1所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑，其特征是，所述黃金節(jié) 桿菌產(chǎn)生的海因酶的初始酶活性為大于0. 32U，所述放射形土壤桿菌產(chǎn)生的氨甲酰水解酶 的初始的活性大于10U。
3.如權(quán)利要求1所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑，其特征是，所述黃金節(jié) 桿菌的初始海因酶活性為0. 32U 0. 45U。
4.如權(quán)利要求1所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑，其特征是，所述黃金節(jié) 桿菌為黃金節(jié)桿菌3256活化細胞，所述放射形土壤桿菌為放射形土壤桿菌3255活化細胞。
5.如權(quán)利要求1 4所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑的制備方法，其特征 是它包括以下步驟a.將產(chǎn)海因酶的黃金節(jié)桿菌接種于含玉米漿、糖蜜、氫氧化鈉水溶液、氯化鈉、2-硫尿 嘧啶、硫酸鎂、硫酸錳和磷酸氫二銨的液體培養(yǎng)基中，于30 34°C攪拌活化培養(yǎng)，其中，攪 拌速度為60rpm ；活化時間為12 18h，優(yōu)選14 16h ；空氣壓力為0. 18 0. 23Mpa，優(yōu)選 為0. 2Mpa ；空氣流量為20 26L/h ；反應釜壓力為0. 04 0. 06Mpa，優(yōu)選為0. 05Mpa ；然后 將該培養(yǎng)液用水溶性殼聚糖絮凝，過濾收獲固形酶制劑1 ；所述液體培養(yǎng)基含玉米漿360 460重量份、糖蜜380 480重量份、濃度為25 35% (w/w)的氫氧化鈉水溶液15 25重量份、氯化鈉40 60重量份、2-硫尿嘧啶27 37重 量份硫酸鎂8 10重量份、硫酸錳1. 2 1. 8重量份、和磷酸氫二銨3 4重量份，并加水 定容至8000重量份；b.將產(chǎn)氨甲酰水解酶的放射形土壤桿菌接種于含玉米漿、葡萄糖、蛋白胨、氯化鈉、硫 酸錳、磷酸氫二銨和阿拉伯糖的液體培養(yǎng)基中，于32 38°C攪拌活化培養(yǎng)，其中攪拌速度 為60rpm ；活化時間為15 22h，優(yōu)選16 18h，最優(yōu)選為17h ；空氣壓力為0. 18 0. 23Mpa， 優(yōu)選為0. 2Mpa ；空氣流量為18 22L/h ；反應釜壓力為0. 04 0. 06Mpa，優(yōu)選為0. 05Mpa ； 在所述培養(yǎng)基中添加氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH為6. 5 7. 8，優(yōu)選為6. 8 7. 3，最優(yōu)選為7. 0，然后 將該培養(yǎng)液用水溶性殼聚糖絮凝，過濾收獲固形酶制劑2 ；所述液體培養(yǎng)基含玉米漿200 400重量份、葡萄糖180 260重量份、蛋白胨80 100重量份、25g氯化鈉20 30重量份、硫酸錳1. 6 2. 0重量份、磷酸氫二銨6. 8 7. 6 重量份、和阿拉伯糖12 16重量份；并將所述液體培養(yǎng)基加水定容至8000重量份；c.將步驟a制得的固形酶制劑1和步驟b制得的固形酶制劑2混合，制得生物催化合 成D-芳基甘氨酸的酶制劑，其中所述固形酶制劑1和所述固形酶制劑2的重量配比為1 5 1 50，優(yōu)選比例為1 5 1 20，更優(yōu)選比例為1 2 1 5。
6.如權(quán)利要求1所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑，其特征是，它用于酶催 化非均相水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法中。
7.如權(quán)利要求6所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑，其特征是，所述的酶催 化非均相水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法包括以下步驟①在酶催化反應罐中，加入水和5-芳基海因，并調(diào)整pH值為6.5 7. 8，5-芳基海因 的加入量占水和5-芳基海因總重量的5 21% (w/w)，得混合溶液；②在攪拌的條件下向酶催化反應罐中加入權(quán)利要求1 5任一所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑，在25 40°C下攪拌反應，直至無法檢測出5-芳基海因，制得D-芳 基甘氨酸；其中所述生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑占步驟①中的混合溶液的總重量的 1 10%，優(yōu)選為為2-8% ；反應時間8 66小時；③通過200目篩分離沉淀出D-芳基甘氨酸固體，經(jīng)過重結(jié)晶，獲得D-芳基甘氨酸晶體；④通過超濾膜過濾和蒸發(fā)濃縮來提取酶催化反應罐中的液體中溶解的D-芳基甘氨 酸，再經(jīng)過重結(jié)晶，得D-芳基甘氨酸晶體。
8.如權(quán)利要求7所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑，其特征是，所述的酶催 化非均相水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法步驟④還可以為以下步驟先通過超濾膜過濾酶催化反應罐中的溶液，然后蒸發(fā)濃縮透析液部分來提取酶催化反 應罐中的液體中溶解的D-芳基甘氨酸，再經(jīng)過重結(jié)晶，得D-芳基甘氨酸晶體。
9.如權(quán)利要求7所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑，其特征是，所述酶催化 非均相水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法中的D-芳基甘氨酸為D-苯甘氨酸、D-對羥基苯 甘氨酸、D-氟苯甘氨酸、D-氯苯甘氨酸、D-溴苯甘氨酸、D-碘苯甘氨酸、D-甲氧苯甘氨酸、 D-吡啶系列甘氨酸、D-萘系列甘氨酸、D-喹啉系列甘氨酸D-嘧啶甘氨酸、D-吡嗪甘氨酸、 D-噠嗪甘氨酸、D-吲哚甘氨酸、D-噻吩甘氨酸、D-呋喃甘氨酸、D-吡咯甘氨酸、D-吡唑甘 氨酸、D-咪唑甘氨酸、D-噻唑甘氨酸、D-噁唑甘氨酸和D-異噁唑甘氨酸中的一種。
10.如權(quán)利要求8所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑，其特征是，所述制備 非均相酶催化水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法中的D-芳基甘氨酸為D-苯甘氨酸；所述 D-苯甘氨酸的制備方法為①在酶催化反應罐中，加入水30kg和5-苯基海因2.8kg，并調(diào)整pH值為6. 8 ；②在攪拌的條件下向酶催化反應罐加入權(quán)利要求1-5之任一所述的生物催化合成 D-芳基甘氨酸的酶制劑2. 8kg，在38°C下攪拌反應，直至無法檢測出5-苯基海因，并且中間 產(chǎn)物N-氨甲酰苯甘氨酸含量小于等于0. 25% (w/w)，制得D-苯基甘氨酸；③分離沉淀出D-苯基甘氨酸固體，經(jīng)過重結(jié)晶，獲得D-苯基甘氨酸晶體；④通過超濾膜過濾和蒸發(fā)濃縮來提取酶催化反應罐中溶液部分溶解的D-苯基甘氨 酸，得D-苯基甘氨酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑，由產(chǎn)海因酶的黃金節(jié)桿菌的活化細胞和產(chǎn)氨甲酰水解酶的放射形土壤桿菌的活化細胞組成，本發(fā)明還涉及該生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制劑的制備方法和用途，它可用于催化非均相水解海因合成D-芳基甘氨酸或其衍生物，使用本發(fā)明可大大降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)品收率。
文檔編號C12N9/78GK101906408SQ20101018138
公開日2010年12月8日 申請日期2010年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月25日
發(fā)明者劉守信, 明常鑫, 李軍章, 甄小麗, 田霞 申請人:河北科技大學