專利名稱：大腸桿菌檢測試劑盒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測試劑，具體涉及一種大腸桿菌檢測試劑盒及其使用方法。
背景技術(shù)：
H7大腸桿菌是數(shù)百種大腸桿菌中的一個亞型。雖然生長在健康人類和動物的腸道 內(nèi)的絕大多數(shù)菌種都是無害的，但這一菌種卻會產(chǎn)生強烈的毒素，并引發(fā)嚴重的疾病。因此 準確、快速地檢測H7大腸桿菌具有十分重要的意義。傳統(tǒng)大腸桿菌檢測方法，由于其檢測周期長、程序復(fù)雜、所需試劑繁多等缺點已遠 遠不能滿足現(xiàn)代檢測要求。以聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)為代表的病原核酸檢測技術(shù)在 實際應(yīng)用中存在一些問題，如普通聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)需要專門的儀器，而且存在 容易交叉污染和操作過程煩瑣的缺點。而熒光實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(real time PCR) 技術(shù)雖然較好地解決了交叉污染的問題，并簡化了操作過程，但卻需要更復(fù)雜的定量測定 儀器，因此不適用于現(xiàn)場快速檢測。而且實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)PCR技術(shù)中熒光探針的 成本較高，加大了推廣應(yīng)用的難度。免疫學(xué)檢測技術(shù)快速簡便成本低廉，但要求高質(zhì)量高穩(wěn) 定性的單克隆抗體，否則因準確性不夠，目前只能是輔助檢測手段。所以及時運用生物技 術(shù)發(fā)展的最新成果對滿足病原微生物檢測要求的不斷提高具有重要意義。其中恒溫擴增 (Isothermal Amplification)核酸快速檢測技術(shù)是病原核酸檢測技術(shù)上的長足進步，現(xiàn)已 建立起來的環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)(LAMP)具有很多的優(yōu)越性。目前，中國200610035691. 4號發(fā)明專利申請也是涉及采用環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù) 檢測0157大腸桿菌。但在環(huán)境中，帶有0157抗原，而非0157 H7的大腸桿菌占有一定比例， 因此容易出現(xiàn)假陽性，特異性不高。因此，需要一種檢測效果更全面、特異性高、漏檢率低的大腸桿菌檢測試劑盒及其 使用方法以解決上述問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種檢測效果更全面、特異性 高、漏檢率低的大腸桿菌檢測試劑盒。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)措施實現(xiàn)一種大腸桿菌檢測試劑盒，所述的大 腸桿菌檢測試劑盒包括以大腸桿菌的fliC基因為靶基因、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)設(shè)計 的兩對引物內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3。大腸桿菌有兩個重要抗原H抗原與0抗原。本專利檢測的是f IiC基因。該flic 基因為大腸桿菌鞭毛抗原H7型的編碼基因，相比起傳統(tǒng)PCR方法中檢測0157抗原形成基 因rfbE，具有更高特異性。因為在環(huán)境中，帶有0157抗原，而非0157 :H7的大腸桿菌占有一 定比例，所以檢測H7基因的大腸桿菌具有重要意義。與NCBI網(wǎng)站nt數(shù)據(jù)庫的BLAST比對結(jié)果顯示，除大腸桿菌H7外，無其它菌帶有 該基因。
作為本發(fā)明大腸桿菌檢測試劑盒的優(yōu)選實施方式，所述的兩對引物為外引物F3(l) :(SEQ ID NO 1)CAGGAGTTGCTTTTGCGA外引物B3(l) (SEQ ID NO 2)AAACGGATTCAGCAGGTA內(nèi)引物 FIP(I) (SEQ ID NO 3)GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGttttTGTGCCATTGAATGTCAGA內(nèi)引物 BIP(I) (SEQ ID NO 4)CTGCGCTACCAGCGTTGTTAttttATATCACCATCGGTGGAAG或外引物F3(2) (SEQ ID NO 5)CTTTGAGCAGCGCTTTCA外引物B3(2) (SEQ ID NO 6)GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT內(nèi)引物 FIP (2) (SEQ ID NO 7)GCATACGTAGACGATGCAGGCttttCAGCTTTAGCTGCGCTAC內(nèi)引物 BIP (2) (SEQ ID NO 8)GGCTTCCACCGATGGTGATAttttACACCACAAAAGATGGTACTG或外引物F3(3) (SEQ ID NO 1)CAGGAGTTGCTTTTGCGA外引物B3(3) (SEQ ID NO 2)AAACGGATTCAGCAGGTA內(nèi)引物 FIP (3) (SEQ ID NO 9)GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGTGTGCCATTGAATGTCAGA內(nèi)引物 BIP (3) (SEQ ID NO 10)CTGCGCTACCAGCGTTGTTAATATCACCATCGGTGGAAG或外引物F3(4) (SEQ ID NO 5)CTTTGAGCAGCGCTTTCA外引物B3(4) (SEQ ID NO 6)GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT內(nèi)引物 FIP (4) (SEQ ID NO 11)GCATACGTAGACGATGCAGGCCAGCTTTAGCTGCGCTAC內(nèi)引物 BIP (4) (SEQ ID NO 12)GGCTTCCACCGATGGTGATAACACCACAAAAGATGGTACTG。作為本發(fā)明大腸桿菌檢測試劑盒的優(yōu)選實施方式，所述的大腸桿菌檢測試劑盒還 包括BstDNA聚合酶、反應(yīng)液、穩(wěn)定液、樣品預(yù)處理液、顯色液和陽性對照液。作為本發(fā)明大腸桿菌檢測試劑盒的更優(yōu)選實施方式，
所述的Bst DNA聚合酶酶濃度4-10U/ μ L ；所述的反應(yīng)液含1·6 2mmol/L dNTP、20 25mmol/L Tris-HCl、10 12. 5mmol/ L KClUO ~ 12. 5mmol/L(NH4)2S04、8 10mmol/L MgS04、0. 1 0· 125 體積 ％ TritonX-100、 0.8 lmol/L甜菜堿；所述的樣品預(yù)處理液含10 20mmol/L pH 8. 0 的 Tris-HCl、1 2mmol/LEDTA和 1 1. 2 體積％ Triton X-100 ；所述的顯色液為SYBR Green I 或 Eva Green ；所述穩(wěn)定液為石蠟油；所述的陽性對照為大腸桿菌基因組DNA ；所述的內(nèi)引物FIP/BIP各為0. 2 0. 25 μ mol/L，外引物F3/B3的濃度各為1. 2 2. 0 μ mol/L。作為本發(fā)明大腸桿菌檢測試劑盒的最優(yōu)選實施方式，所述的Bst DNA聚合酶酶濃度8U/ μ L ；所述的反應(yīng)液含2mmol/LdNTP、25mmol/L Tris-HCl,12. 5mmol/L KCl, 12. 5mmol/L (NH4) 2S04, lOmmol/L MgS04、0. 125 體積％ TritonX-100、lmol/L 甜菜堿；所述的樣品預(yù)處理液含20mmol/LpH 8. 0 的 Tris-HCl、2mmol/L EDTA 禾口 1. 2 體 積％ Triton X-100 ；所述的顯色液為SYBR Green I ；所述的內(nèi)引物FIP/BIP的濃度為0. 2 μ mol/L ；所述的外引物F3/B3的濃度為1. 6 μ mol/L。作為本發(fā)明大腸桿菌檢測試劑盒的優(yōu)選實施方式，所述的大腸桿菌檢測試劑盒還 包括反應(yīng)管，所述的反應(yīng)管由管體和管蓋兩部分組成，管體內(nèi)腔的下部設(shè)有將其分隔成A、B 兩個空腔的縱向延伸的隔板。作為本發(fā)明大腸桿菌檢測試劑盒的更優(yōu)選實施方式，所述的A、B兩個空腔中分別 裝有工作液或顯色液，兩個空腔中的液體上層均由穩(wěn)定液封存，所述工作液為反應(yīng)液和Bst DNA聚合酶的混合而成。本發(fā)明還提供一種大腸桿菌檢測試劑盒的使用方法，該方法包括如下步驟(1)將待測樣品離心，去上清，得到沉淀；(2)將步驟(1)的沉淀加入樣品預(yù)處理液，混合均勻，沸水浴滅活后冰上冷卻，高 速離心，上清即為樣品模板DNA ；(3)在反應(yīng)容器中加入Bst DNA聚合酶0. 9 1. 8體積份數(shù)、反應(yīng)液38 40體 積份數(shù)、穩(wěn)定液52 54. 5體積份數(shù)、樣品模板DNA 4. 5 9體積份數(shù)、內(nèi)引物FIP/BIP各 2體積份數(shù)、外引物F3/B3各4體積份數(shù)，恒溫反應(yīng)；(4)在上述反應(yīng)容器和陽性對照中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相 同則為陽性，否則為陰性；所述步驟(3)中的內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3為以大腸桿菌的fliC基因為 靶基因、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)設(shè)計的兩對引物。作為本發(fā)明使用大腸桿菌檢測試劑盒的方法的優(yōu)選實施方式，所述的兩對引物為外引物F3(l) :(SEQ ID NO 1)CAGGAGTTGCTTTTGCGA 外引物 B3(l) :(SEQ ID NO 2) AAACGGATTCAGCAGGTA 內(nèi)引物 FIP(I) :(SEQ ID NO 3) GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGttttTGTGCCATTGAATGTCAGA 內(nèi)引物 BIP(I) :(SEQ ID NO 4) CTGCGCTACCAGCGTTGTTAttttATATCACCATCGGTGGAAG 或
外引物 F3(2) :(SEQ ID NO 5) CTTTGAGCAGCGCTTTCA 外引物 B3(2) :(SEQ ID NO 6) GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT 內(nèi)引物 FIP (2) :(SEQ ID NO 7) GCATACGTAGACGATGCAGGCttttCAGCTTTAGCTGCGCTAC 內(nèi)引物 BIP (2) :(SEQ ID NO 8) GGCTTCCACCGATGGTGATAttttACACCACAAAAGATGGTACTG 或
外引物 F3(3) :(SEQ ID NO 1) CAGGAGTTGCTTTTGCGA 外引物 B3(3) :(SEQ ID NO 2) AAACGGATTCAGCAGGTA 內(nèi)引物 FIP (3) :(SEQ ID NO 9) GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGTGTGCCATTGAATGTCAGA 內(nèi)引物 BIP (3) :(SEQ ID NO 10) CTGCGCTACCAGCGTTGTTAATATCACCATCGGTGGAAG 或
外引物 F3(4) :(SEQ ID NO 5) CTTTGAGCAGCGCTTTCA 外引物 B3(4) :(SEQ ID NO 6) GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT 內(nèi)引物 FIP (4) :(SEQ ID NO 11) GCATACGTAGACGATGCAGGCCAGCTTTAGCTGCGCTAC 內(nèi)引物 BIP (4) :(SEQ ID NO 12) GGCTTCCACCGATGGTGATAACACCACAAAAGATGGTACTG。
作為本發(fā)明使用大腸桿菌檢測試劑盒的方法的優(yōu)選實施方式，步驟(3)中，恒溫 反應(yīng)的反應(yīng)條件為溫度63 65°C，反應(yīng)時間45 90min。 本發(fā)明所說的基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplication of DNA，簡稱LAMP)快速檢測大腸桿菌的方法，是利用Bst DNA聚合酶和根據(jù) 靶基因序列設(shè)計的兩對特殊的內(nèi)、外引物(即內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特異性識別靶序列上的六個獨立區(qū)域，啟動循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在靶標DNA區(qū)啟動互補鏈合成，結(jié)果在同 一鏈上互補序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖_環(huán)DNA混合物。LAMP反應(yīng)過 程中，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂乳 白色沉淀，即可通過肉眼觀察判定結(jié)果。LAMP反應(yīng)是在恒溫(63 65°C )條件下45 90 分鐘內(nèi)完成。這種比較溫和的溫度條件以及沒有溫度循環(huán)使所需儀器簡單化，克服了傳統(tǒng) PCR固有的檢測時間長、容易污染及檢測成本高等缺點。此外，這種檢測方法對檢測人員的 技術(shù)素質(zhì)要求較低，實際操作極為簡便，不需要特殊的試劑和儀器設(shè)備，有利于建立成本低 廉的快速篩選體系。LAMP法是一種簡便、快速、高度特異性的基因擴增法。將恒溫基因擴增 技術(shù)與PCR技術(shù)(包括熒光實時定量PCR技術(shù))進行比較，可以發(fā)現(xiàn)該技術(shù)在靈敏度、特異 性和檢測范圍等方法學(xué)指標上相當于或優(yōu)于PCR技術(shù)，且不依賴任何專門的儀器設(shè)備即可 實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，而且檢測成本遠低于熒光定量PCR技術(shù)。目前國家標準中以微 生物分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定為主、結(jié)合生化分析和血清學(xué)分型鑒定的通行方法，初步鑒定 需2 3天，完成鑒定報告需10 15天；采用本發(fā)明的檢測試劑盒僅需2小時。并且，本 發(fā)明的反應(yīng)體系中加入了顯色液，鑒定結(jié)果更為直觀清晰。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明的檢測試劑盒只需一個恒 定溫度就能擴增反應(yīng)，不需要特殊試劑與設(shè)備，檢測成本低；2.本發(fā)明的基因快速診斷試 劑盒應(yīng)用六個區(qū)段，四條引物，根據(jù)是否擴增就能判斷靶標物質(zhì)的存在與否，因此具有高 特異性；3.本發(fā)明的檢測試劑盒擴增快速且高效，在不到1小時即可完成擴增，且產(chǎn)率高； 4.本發(fā)明的檢測試劑盒靈敏度高，擴增模板僅需10拷貝或更少；5.本發(fā)明的基因快速診斷 試劑盒鑒定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物—— 焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液后，陰陽性結(jié)果顯色差異顯著，驗證 率高，更加明顯可靠；6.由于選擇了高保守性的fliC基因作為靶基因設(shè)計引物，使得本發(fā) 明的檢測試劑盒檢測大腸桿菌的準確率更高；7.在本發(fā)明檢測試劑盒中采用特制的反應(yīng) 管，減少了氣溶膠污染的可能性，同時方便操作。
具體實施方式
為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進一步闡述本發(fā)明的具體實施例。
下列縮略語適用于本發(fā)明
LAMP loop-mediated isothermal amplification,環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增
dNTP :deoxyribonucleoside triphosphate,脫氧核苷三憐酸
Bst 酶Bst DNA polymerase (large fragment), Bst DNA 聚合酶(大片段)
EDTA :ethylenediamine tetraacetic acid,乙:二胺四乙酸
DNA deoxyribonucleic acid，脫氧核糖核酸
Betaine 舌甘菜堿
Triton X-100 聚乙二醇辛基苯基醚
fliC 大腸桿菌鞭毛抗原H7型的編碼基因
實施例1試劑盒的制備
(1)按以下序列經(jīng)DNA合成儀合成寡聚脫氧核藤Bl物
外引物 F3(l) :(SEQ ID NO 1)
CAGGAGTTGCTTTTGCGA外引物B3(l) (SEQ ID NO 2)AAACGGATTCAGCAGGTA內(nèi)引物 FIP(I) (SEQ ID NO 3)GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGttttTGTGCCATTGAATGTCAGA內(nèi)引物 BIP(I) :(SEQ ID NO 4)CTGCGCTACCAGCGTTGTTAttttATATCACCATCGGTGGAAG。(2)購置DNA聚合酶Bst DNA聚合酶置于容器；(3)配制反應(yīng)液和引物反應(yīng)液含有 2mmol/LdNTP、25mmol/L Tris-Cl、12. 5mmol/ L KCl、12. 5mmol/L (NH4) 2S04、10mmol/L MgS04、0. 125 體積 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜堿、 內(nèi)引物FIP/BIP各0. 2 μ mol/L和外引物F3/B3各2. 0 μ mol/L,置于容器；(4)配制樣品預(yù)處理液樣品預(yù)處理液含有20mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)、2mmol/ L EDTA和 1. 2 體積 ％ Triton X-100，置于容器；(5)購置穩(wěn)定液石蠟油，置于容器；(6)購置顯色液SYBR Green I，置于容器；(7)提取陽性對照提取大腸桿菌基因組DNA，置于容器；(8)將上述7個容器裝成試劑盒，封裝。制備工藝簡述如下1、將內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制，濃度檢測，抽樣質(zhì) 檢；2、將上述(2) (4)步驟配制的液體無菌分裝，并按照實驗用進行濃度確定，抽樣 質(zhì)檢；3、將穩(wěn)定液分裝，抽樣質(zhì)檢；4、將陽性對照標本制備，分裝，抽樣質(zhì)檢；5、組裝試劑盒。在本發(fā)明大腸桿菌檢測試劑盒的其他實施例中，所采用的引物還可以是外引物 F3(3)CAGGAGTTGCTTTTGCGA外引物B3(3)AAACGGATTCAGCAGGTA內(nèi)引物FIP (3)GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGTGTGCCATTGAATGTCAGA內(nèi)引物BIP (3)CTGCGCTACCAGCGTTGTTAATATCACCATCGGTGGAAG。實施例2試劑盒的制備(1)按以下序列經(jīng)DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物外引物F3 (2) (SEQ ID NO 5)CTTTGAGCAGCGCTTTCA外引物B3(2) (SEQ ID NO 6)
GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT內(nèi)引物 FIP (2) (SEQ ID NO 7)GCATACGTAGACGATGCAGGCttttCAGCTTTAGCTGCGCTAC內(nèi)引物 BIP (2) (SEQ ID NO 8)GGCTTCCACCGATGGTGATAttttACACCACAAAAGATGGTACTG。(2)購置DNA聚合酶Bst DNA聚合酶置于容器；(3)配制反應(yīng)液和引物反應(yīng)液含有 1. 6mmol/LdNTP、20mmol/L Tris-ClUOmmol/ L KCl、10mmol/L(NH4)2S04、8mmol/L MgS04、0. 1 體積％ TritonX_100、0· 8mol/L甜菜堿、內(nèi)引 物FIP/BIP各0· 25 μ mol/L和外引物F3/B3各1· 2 μ mol/L,置于容器；(4)配制樣品預(yù)處理液樣品預(yù)處理液含有10mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0) Ummol/ L EDTA 和 1. O 體積 ％ Triton X-100，置于容器；(5)購置穩(wěn)定液石蠟油，置于容器；(6)購置顯色液EVA Green I，置于容器；(7)提取陽性對照提取大腸桿菌基因組DNA，置于容器；(8)將上述7個容器裝成試劑盒，封裝。其他同實施例1。在本發(fā)明大腸桿菌檢測試劑盒的其他實施例中，所采用的引物還可以是外引物 F3(4)CTTTGAGCAGCGCTTTCA外引物B3(4)GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT內(nèi)引物FIP (4)GCATACGTAGACGATGCAGGCCAGCTTTAGCTGCGCTAC內(nèi)引物BIP (4)GGCTTCCACCGATGGTGATAACACCACAAAAGATGGTACTG。實施例3大腸桿菌檢測試劑盒的應(yīng)用1材料與方法1.1 材料1. 1. 1 菌株本發(fā)明采用菌株有28株，主要來源于心廣州出入境檢驗檢疫局、臨床分離菌株和 環(huán)境分離菌株。詳見表1。表1菌株名稱及來源
菌株來源菌株及編號廣州CIQ大腸桿菌(H7B)臨床分離株來源于檢測樣品中的大腸桿菌H716株；
1權(quán)利要求
一種大腸桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述的大腸桿菌檢測試劑盒包括以大腸桿菌的fliC基因為靶基因、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)設(shè)計的兩對引物內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述的兩對引物為 外引物F3⑴CAGGAGTTGCTTTTGCGA 外引物B3⑴ AAACGGATTCAGCAGGTA 內(nèi)引物FIP(I)GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGttttTGTGCCATTGAATGTCAGA 內(nèi)引物BIP(I)CTGCGCTACCAGCGTTGTTAttttATATCACCATCGGTGGAAG 或外引物F3⑵ CTTTGAGCAGCGCTTTCA 外引物B3⑵ GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT 內(nèi)引物FIP (2)GCATACGTAGACGATGCAGGCttttCAGCTTTAGCTGCGCTAC 內(nèi)引物BIP (2)GGCTTCCACCGATGGTGATAttttACACCACAAAAGATGGTACTG 或外引物F3(3) CAGGAGTTGCTTTTGCGA 外引物B3(3) AAACGGATTCAGCAGGTA 內(nèi)引物FIP (3)GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGTGTGCCATTGAATGTCAGA 內(nèi)引物BIP (3)CTGCGCTACCAGCGTTGTTAATATCACCATCGGTGGAAG 或外引物F3(4) CTTTGAGCAGCGCTTTCA 外引物B3(4) GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT 內(nèi)引物FIP (4)GCATACGTAGACGATGCAGGCCAGCTTTAGCTGCGCTAC 內(nèi)引物BIP (4)GGCTTCCACCGATGGTGATAACACCACAAAAGATGGTACTG。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述的大腸桿菌檢測試 劑盒還包括Bst DNA聚合酶、反應(yīng)液、穩(wěn)定液、樣品預(yù)處理液、顯色液和陽性對照液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的大腸桿菌檢測試劑盒，其特征在于， 所述的Bst DNA聚合酶酶濃度4-10U/ μ L ；所述的反應(yīng)液含1. 6 2mmol/L dNTP、20 25mmol/L Tris-HCl、10 12. 5mmol/L KClUO ~ 12. 5mmol/L (NH4)2SO4,8 ~ 10mmol/L MgS04、0. 1 0· 125 體積 ％ TritonX-100、0.8.lmol/L甜菜堿；所述的樣品預(yù)處理液含10 20mmol/L pH 8. 0的Tris_HCl、l 2mmol/LEDTA禾口 1 1.2 體積％ Triton X-100 ；所述的顯色液為SYBR Green I或Eva Green ；所述穩(wěn)定液為石蠟油；所述的陽性對照為大腸桿菌基因組DNA ；所述的內(nèi)引物FIP/BIP各為0. 2 0. 25 μ mol/L,外引物F3/B3的濃度各為1. 2 2.0 μ mol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的大腸桿菌檢測試劑盒，其特征在于， 所述的Bst DNA聚合酶酶濃度8U/ μ L ；所述的反應(yīng)液含2mmol/L dNTP、25mmol/L Tris-HCl、12. 5mmol/L KC1、12. 5mmol/ L(NH4)2S04、10mmol/L MgS04、0. 125 體積％ TritonX-100、lmol/L 甜菜堿；所述的樣品預(yù)處理液含20mmol/L pH 8. 0的Tris-HCl、2mmol/L EDTA和1. 2體積％ Triton X-100 ；所述的顯色液為SYBR Green I ；所述的內(nèi)引物FIP/BIP的濃度為0. 2 μ mol/L ；所述的外引物F3/B3的濃度為1. 6 μ mol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求3、4或5所述的大腸桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述的大腸桿菌檢 測試劑盒還包括反應(yīng)管，所述的反應(yīng)管由管體和管蓋兩部分組成，管體內(nèi)腔的下部設(shè)有將 其分隔成A、B兩個空腔的縱向延伸的隔板。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的大腸桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述的A、B兩個空腔中 分別裝有工作液或顯色液，兩個空腔中的液體上層均由穩(wěn)定液封存，所述工作液為反應(yīng)液 和Bst DNA聚合酶的混合而成。
8.一種使用如權(quán)利要求3所述的大腸桿菌檢測試劑盒的方法，其特征在于，該方法包 括如下步驟(1)將待測樣品離心，去上清，得到沉淀；(2)將步驟(1)的沉淀加入樣品預(yù)處理液，混合均勻，沸水浴滅活后冰上冷卻，高速離 心，上清即為樣品模板DNA;(3)在反應(yīng)容器中加入BstDNA聚合酶0. 9 1. 8體積份數(shù)、反應(yīng)液38 40體積份 數(shù)、穩(wěn)定液52 54. 5體積份數(shù)、樣品模板DNA 4. 5 9體積份數(shù)、內(nèi)引物FIP/BIP各2體 積份數(shù)、外引物F3/B3各4體積份數(shù)，恒溫反應(yīng)；(4)在上述反應(yīng)容器和陽性對照中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相同則 為陽性，否則為陰性；所述步驟(3)中的內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3為以大腸桿菌的fliC基因為靶基 因、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)設(shè)計的兩對引物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的使用大腸桿菌檢測試劑盒的方法，其特征在于，所述的兩對 引物為外引物F3⑴ CAGGAGTTGCTTTTGCGA 外引物B3⑴ AAACGGATTCAGCAGGTA 內(nèi)引物FIP(I)GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGttttTGTGCCATTGAATGTCAGA 內(nèi)引物BIP(I)CTGCGCTACCAGCGTTGTTAttttATATCACCATCGGTGGAAG 或外引物F3⑵ CTTTGAGCAGCGCTTTCA 外引物B3⑵ GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT 內(nèi)引物FIP (2)GCATACGTAGACGATGCAGGCttttCAGCTTTAGCTGCGCTAC 內(nèi)引物BIP (2)GGCTTCCACCGATGGTGATAttttACACCACAAAAGATGGTACTG 或外引物F3(3) CAGGAGTTGCTTTTGCGA 外引物B3(3) AAACGGATTCAGCAGGTA 內(nèi)引物FIP (3)GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGTGTGCCATTGAATGTCAGA 內(nèi)引物BIP (3)CTGCGCTACCAGCGTTGTTAATATCACCATCGGTGGAAG 或外引物F3(4) CTTTGAGCAGCGCTTTCA 外引物B3(4) GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT 內(nèi)引物FIP (4)GCATACGTAGACGATGCAGGCCAGCTTTAGCTGCGCTAC 內(nèi)引物BIP (4)GGCTTCCACCGATGGTGATAACACCACAAAAGATGGTACTG。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的使用大腸桿菌檢測試劑盒的方法，其特征在于， 步驟(3)中，恒溫反應(yīng)的反應(yīng)條件為溫度63 65°C，反應(yīng)時間45 90min。
全文摘要
本發(fā)明提供一種大腸桿菌檢測試劑盒，所述的大腸桿菌檢測試劑盒包括以大腸桿菌的fliC基因為靶基因、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)設(shè)計的兩對引物內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本發(fā)明的大腸桿菌檢測試劑盒檢測效果更全面、漏檢率低。
文檔編號C12Q1/68GK101942508SQ20101018109
公開日2011年1月12日 申請日期2010年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月18日
發(fā)明者馮雪梅, 尹斌, 曹以誠, 杜正平, 柯佳佳, 譚慧媚, 陳洵 申請人:廣州華峰生物科技有限公司