專利名稱：檢測酒精代謝相關基因突變的方法及其引物與TaqMan-MGB探針的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用分子生物學方法對突變堿基進行定性、定量檢測的引物和探針。特別是涉及用實時熒光定量PCR (real-time fluorescent quantificationPCR)技術對酒精代謝相關基因突變進行定性、定量檢測的引物和TaqMan-MGB探針。
背景技術：
飲酒會導致多種疾病，包括慢性胃炎，中毒性肝炎，心肌肥大，尿路結(jié)石，不可逆轉(zhuǎn)的腦損害以及酒精中毒，精神障礙和人格改變等。飲酒的健康危害主要由酒精(乙醇)及其中間代謝產(chǎn)物乙醛引起，兩者在體內(nèi)的有效劑量水平和作用時間長短除與酒精攝入量， 飲酒頻率相關外，還與體內(nèi)的代謝酶活性相關。一般情況下，乙醇在人體代謝過程中主要受肝臟中的乙醇脫氫酶(ADH)、乙醛脫氫酶(ALDH)和細胞色素P450(CYP2E1)所制約。乙醇在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)化成乙醛，乙醛再氧化為乙酸，分解成二氧化碳和水排出體外。人群中發(fā)現(xiàn)有7種多態(tài)性的ADH(ADH1-ADH7)，其中ADHlB和ADHlC在乙醇代謝過
程中有很重要的作用。ADHlB由ADHlB基因編碼產(chǎn)生，不同的基因型影響ADHlB的活性，從而對體內(nèi)乙醛濃度產(chǎn)生影響。ADHlB基因存在A/G多態(tài)性。G等位基因是野生型，攜帶這一等位基因的人群體內(nèi)ADHlB的活性相對于攜帶A等位基因的人群來說較低。A等位基因使ADHlB具有較高的活性，攜帶這一等位基因的人能迅速將吸收的乙醇催化反應形成乙醛。AA基因型的個體酶活很高，屬于快代謝型，能夠?qū)⒁掖己芸斓剞D(zhuǎn)化成乙醛。ADHlC基因編碼一種醇脫氫酶ADH的、亞基。乙醇隨血液循環(huán)到達肝細胞，分解代謝被激活。ADHlC基因存在一個A/G多態(tài)性，此多態(tài)性可導致其編碼的二聚體ADH具有不同的活性，進而導致不同個體對酒精代謝的速度不同。其中A型等位基因的ADHlC酶活性約為G型等位基因的2. 5倍。AA基因型其ADHlC酶具有很高的催化活性，屬于快代謝型，能夠加速體內(nèi)酒精的代謝。人體器官和組織中至少有12種不同基因編碼的ALDH，常見的有ALDH1-ALDH4四種，是人體肝臟內(nèi)的主要同工酶。在12種ALDH中只有ALDH2表現(xiàn)出遺傳多態(tài)性。ALDH2位于線粒體內(nèi)，而ALDH1，ALDH3，ALDH4位于胞液內(nèi)。ALDH2催化酒精代謝過程中從乙醛到乙酸的代謝過程。ALDH2基因型與飲酒者對乙醇的敏感性、耐受性、酒后反應、飲酒行為、以及引發(fā)疾病密切相關。該多態(tài)性位點形成G/A多態(tài)性，可造成ALDH2氨基酸序列中的一個谷氨酸轉(zhuǎn)化為賴氨酸，導致ALDH2酶活性的改變。ALDH2是四聚化合物酶，突變影響了四聚體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，進而會影響酶的活性，進而對乙醇代謝過程的效率造成不同的影響。A等位基因造成ALDH2酶活性的急劇下降，G等位基因則保持其正?；钚约毎豍450家族成員CYP2E1，與藥物代謝和脂類合成等功能相關。它對一些內(nèi)源和外源的化學物質(zhì)具有代謝功能，例如酒精、丙酮等等。CYP2E1是乙醇代謝中起主要作用的關鍵酶之一，它受乙醇誘導并參與乙醇的代謝。這一基因存在一個C/G多態(tài)性，該多態(tài)性位于CYP2E1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域，C等位基因可能直接影響下游外顯子的表達，從而影響 CYP2E1酶的活性，使個體對酒精等物質(zhì)的代謝能力發(fā)生改變。它與肝損傷、肝硬化及多種腫瘤等疾病的易感性具有關聯(lián)。通過檢測ADH1B、ADH1C、ALDH2和CYP2E1這4個基因的多態(tài)性特點，可以得知相應酶代謝活性高低，判斷個體酒精代謝能力和特點，從而為篩選高位敏感個體和采取預防措施以減少乙醇相關性疾病的發(fā)生提供理論基礎。目前，已報道的用于酒精代謝相關基因突變的方法主要包括PCR直接測序和定性 PCR等，這些方法普遍存在靈敏度低，特異性不高，費時費力且易污染等缺點，使應用受到一定限制。實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入一對引物的同時加入一個特異性熒光探針，探針只與模板特異結(jié)合，其結(jié)合位點位于兩條引物之間，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR過程。目前常用的TaqMan熒光探針為寡核苷酸，其5’端標記有報告熒光基團，如FAM，VIC等，3’端標記有淬滅熒光基團，如TAMRA等。探針完整時，報告基團發(fā)出的熒光信號被淬滅基團吸收，故檢測不到熒光，當探針與靶序列配對時，PCR延伸反應聚合酶的5’ 一 3’外切酶活性將探針酶切降解，是報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光檢測系統(tǒng)可以接收到熒光信號。每經(jīng)過一個PCR循環(huán)，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數(shù)增長的過程，每個循環(huán)結(jié)束后檢測一次熒光強度，整個反應結(jié)束后，便可得到一條擴增曲線，由已知濃度標準樣品的擴增曲線可以得到一條標準曲線，根據(jù)該標準曲線以及未知模板的擴增曲線可對未知模板進行定量分析。但是，實際上，探針較長使得兩端基團距離較遠，會導致熒光淬滅不徹底，而且，熒光基團也會產(chǎn)生不同波長的熒光，都會使得本底偏高。針對TaqMan探針熒光淬滅不徹底的問題，2000年美國ABI公司推出了一種新 TaqMan-MGB (TaqMan Minor Groove Binder Probe, TaqMan-MGB ), TaqMa-MGB ^ 針是帶有一個小溝結(jié)合物基團的寡核昔酸探針，工作原理與TaqMan探針相同，報告熒光基團連接在探針的5’端(如FAM、VIC等)，3’端標記有淬滅基團，不同的是淬滅基團為不發(fā)光的淬滅基團(Non-FluorescentQuenohenNFQ)，淬滅基團吸收報告基團的能量后并不發(fā)光， 大大降低了本底信號的干擾。此外，MGB探針的3’端還連接了一個二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindole tripetide，DPI3)，DPI3 可折疊進由探針末端 5_6bp 核營酸形成的小溝內(nèi)。DPI3呈新月行，與B型DNA螺旋的淺深小溝一樣螺旋，主要通過范德華力穩(wěn)定。TaqMan-MGB探針顯示了更強的序列特異性。可以大大穩(wěn)定探針與模板的雜交，升高探針Tm值，使較短的探針同樣能達到較高的Tm值一而短探針的熒光報告基團和淬滅基團的距離更近，淬滅效果更好，熒光背景更低，使得信噪比更高?？傊?，與傳統(tǒng)的TaqMan探針比較，TaqMan-MGB探針有以下優(yōu)勢MGB增加了探針熔點溫度(Tm)，這樣可使探針較短，尤其適合富含A/T的序列，并且提高配對與非配對模板間的Tm值差異，可進行更多重的PCR ；提高信噪比，由于在探針的3 ‘端的淬滅基團為不發(fā)光的熒光基團，并且與報告基團在空間的位置更接近，實驗的結(jié)果更精確，分辨率更高；且實驗步驟簡單，雜交的穩(wěn)定性大大提高，重復性大大提高。目前尚沒有專門用于檢測乙醇代謝相關基因突變的實時熒光定量PCR檢測技術。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供針對皮膚老化相關基因突變進行定性、定量檢測的引物。為解決上述技術問題，本發(fā)明采取以下技術方案用于檢測ADHlB突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2組成的引物對。用于檢測ADHlC突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4組成的引物對。用于檢測ALDH2突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6組成的引物對。用于檢測CYP2E1突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO :7和SEQ ID N0:8組成的引物對。本發(fā)明還提供了針對皮膚健康相關基因突變進行定性、定量檢測的TaqMan-MGB 探針。為解決上述技術問題，本發(fā)明采取以下技術方案用于檢測突變的ADHlB TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO 9和SEQID NO 10的DNA序列。用于檢測突變的ADHlC TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:11和SEQID NO: 12的DNA序列。用于檢測突變的ALDH2 TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:13和SEQID NO: 14的DNA序列。用于檢測突變的CYP2E1 TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO: 15禾口 SEQ ID NO 16 的 DNA 序歹Ij。
具體實施例方式本發(fā)明結(jié)合具體實施例做進一步說明。應理解，這些實施例僅用于說明目的，而不用限制本發(fā)明范圍。實施例1、用于酒精代謝相關基因突變檢測的引物和TaqMan-MGB探針的設計根據(jù)基因序列的突變位點，用Primer Express Software 2. 0軟件設計PCR引物，同時根據(jù)野生型基因及突變型基因的反向互補序列設計2條TaqMan-MGB探針，將2條 TaqMan-MGB探針的5’端分別標記報告熒光基因FAM(紅色熒光)和VIC(綠色熒光)，3’端標記不發(fā)光淬滅基團，并連接DIP3。引物及TaqMan-MGB探針序列為檢測ADHlB突變的引物5' -agagtgttggagaaggggtgacta-3‘5， -aaatgtatttgagggttttgctac-3，檢測ADHlB 突變的 iTaciMan-MGB 探針5， -VIC-gtcatctgtgtgacagattcc-MGB-3，5， -FAM-gtcatctgtgcgacagattcc-MGB-3，檢測ADHlC突變的引物
5' -aaagtttagaaaaagtgctgcatt-3‘5' -tagcagagaatgaaaaggtggaag-3‘檢測ADHlC 突變的 iTaciMan-MGB 探針5， -VIC-aaaaggtaaaacatttgttatt-MGB-3，5， -FAM-aaaaggtaaaatatttgttatt-MGB-3，檢測ALDH2突變的引物5， -ctgctggtggctcggagcctgctg-3，5' -aaagacgttagagcaaagtttaat-3‘檢測ALDH2 突變的 iTaciMan-MGB 探針5， -VIC-gttttcactttagtgtatgcc-MGB-3，5， -FAM-gttttcacttcagtgtatgcc-MGB-3，檢測CYP2E1突變的引物5' -agtgatttggctggattgtaaatg-3‘5， -ctgccgcctcctcctctctttcct-3，檢測CYP2E1 突變的 iTaciMan-MGB 探針5' -VIC-ttcaggagaggtgcagtgtta-MGB-3'5' -FAM-ttcaggagagctgcagtgtta-MGB-3'實施例2、酒精代謝相關基因突變的檢測1)樣本基因組DNA的獲取用細胞裂解法提取口腔粘膜脫落細胞中的DNA，懸浮于Iml生理鹽水中，2000Xg 離心IOmin ；棄上清，每管加Iml生理鹽水重復洗滌一次，再2000 X g離心IOmin ；棄上清，每管加 400 μ 1 細胞裂解緩沖液(10mmol/L Tris-HCl, PH 8. 0 ；0. Imol EDTA, PH 8. 0 ；0. 5% SDS)，放在50°C水浴中溫育30分鐘；然后冷卻至室溫，加等體積的酚一氯仿一異戊醇(體積比25 24 1)，混勻，5000Xg離心IOmin ；轉(zhuǎn)移上層水相到另一 Eppendorf管中，重復抽提一次；再轉(zhuǎn)移上層水相到另一 Eppendorf管中，加1/10體積的3M NaAc (pH5. 2)，混勻； 加入2. 5倍體積的95%冷乙醇，混勻，-20°C沉淀DNA 30分鐘；10000 Xg離心15分鐘，棄上清；加lml70%冷乙醇清洗沉淀，IOOOOXg離心分鐘，棄上清；37°C溫箱30分鐘烘干；將DNA 沉淀溶于20 μ 1 TE緩沖液中，加1 μ 1 RNA酶，37°C 30分鐘，置于_20°C保存。2) PCR 擴增以步驟1)提取的DNA為模板，在實施例1所述引物及TaqMan-MGB探針的引導下， 用ABI 7900實時熒光定量PCR儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)進行PCR擴增，并按等位基因鑒別實驗操作步驟完成并分析，即依次進行讀取等位基因鑒別實驗PCR擴增前信號、執(zhí)行擴增程序及讀取、分析擴增后信號。其中，PCR反應體系為2XTaqMan通用PCR擴增預混試劑 (購自美國應用生物系統(tǒng)公司)，引物各900nM，熒光標記的2條I1aqMan-MGB探針各200nM， 150ng DNA。PCR反應條件為先95°C 10分鐘；然后95°C 15秒，60°C 1分鐘，共40個循環(huán)。3)得出結(jié)果用SDS軟件(美國應用生物系統(tǒng)公司)分析實驗結(jié)果。本次實驗共取3名受試者
樣本進行實驗，最終的基因型分布見下表。
6快代謝型快代謝型快代謝型慢代謝型慢代謝型慢代謝型
■試ADHlB ADHlC CYP2E1 ALDH2乙醇-乙_謝盒乙酸⑶乙酸
ADHlB ADHlC CYP2E1 ALDH2
銷謂 鎮(zhèn)代代代快型慢型慢型
謝謝 謝代代代 5型則型斷型
權(quán)利要求
1.用于檢測ADHlB突變的引物，是由序列表中SEQID NO :1和SEQ ID NO :2組成的引物對。
2.用于檢測ADHlC突變的引物，是由序列表中SEQIDNO :3和SEQ ID NO :4組成的引物對。
3.用于檢測ALDH2突變的引物，是由序列表中SEQID NO :5和SEQ ID NO :6組成的引物對。
4.用于檢測CYP2E1突變的引物，是由序列表中SEQID NO :7和SEQ IDNO :8組成的引物對。
5.用于檢測突變的ADHlBTaciMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO :9禾口 SEQID NO 10 的DNA序列。
6.用于檢測突變的ADHlCTaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:11和SEQ ID NO: 12的DNA序列。
7.用于檢測突變的ALDH2TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14的DNA序列。
8.用于檢測突變的CYP2EITaqMan-MGB探針，是序列表中SEQIDNO 15和SEQ ID NO 16的DNA序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8所述的DNA序列，其特征在于5’端標記有發(fā)光顏色不同的報告熒光基團，3’端不僅標記有不發(fā)光的淬滅集團，還連接有二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求5-8所述的TaqMan-MGB探針，其特征在于所述報告熒光基團為FAM 或VIC，不發(fā)光的淬滅基團為NFQ。
11.一種檢測酒精代謝相關基因突變的試劑盒，包括權(quán)利要求1-4所述的引物以及權(quán)利要求5-8所述的TaqMan探針。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于檢測酒精代謝相關基因突變的方法及其引物與TaqMan-MGB探針。用于檢測酒精代謝相關基因突變的引物，是由序列表中SEQID1～SEQ ID8共8條DNA序列組成。該TaqMan-MGB探針是序列表中SEQ ID9～SEQ ID16共8條DNA序列所述DNA序列5’端標記有發(fā)光顏色不同的報告熒光基團，3’端不僅標記有不發(fā)光的淬滅集團，還連接有二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽。本發(fā)明為酒精代謝的檢測、測試、分析、評估提供了一條快速、可靠、準確的新途徑，從而為篩選高位敏感個體和采取預防措施以減少酒精相關性疾病的發(fā)生提供理論基礎。
文檔編號C12Q1/68GK102251023SQ201010180530
公開日2011年11月23日 申請日期2010年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月20日
發(fā)明者毛裕民 申請人:聯(lián)合基因生物技術(上海)有限公司