專利名稱：抗菌素ge2270因子的酰胺類化合物衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有如下通式Ⅰ的抗菌素GE2270的新的酰胺類衍生物及其藥用的加成鹽
其中R代表氫、羥甲基或甲氧基甲基;
R1代表氫或甲基;
Y代表下式基團，
其中R2代表氫、(C1-C4)烷基、氨基(C2-C4)烷基、(C1-C4)烷基氨基-(C1-C4)烷基或二-(C1-C4)烷基氨基-(C1-C4烷基);
R3代表氫;帶有1-3個取代基的直鏈或支鏈(C1-C14)烷基，該取代基系選自羧基、磺基、膦?；?可任意被低級烷氧羰基或芐氧羰基保護的氨基;(C1-C4)烷基氨基(其中烷基可任意被一羧基取代);二-(C1-C4)烷基氨基;羥基;鹵素;(C1-C4)烷氧基(其中烷基部分可任意被一羧基取代);(C1-C4)烷氧羰基;巰基;(C1-C4)烷硫基(其中烷基部分可任意被一羧基取代);可被1-3個選自羧基、磺基、羥基、鹵素和巰基取代基任意取代的苯基;氨基甲?；?(C1-C6)烷基氨基甲?；财渲型榛糠挚杀贿x自羧基、氨基、(C1-C4)烷基氨基和二-(C1-C4)烷基氨基的1-2個取代基任意取代〕;二-(C1-C4)烷基氨基甲酰基(其中烷基部分與其相鄰的氮原子一起也可代表一飽和的五～七元雜環(huán)，該雜環(huán)的一個環(huán)碳原子可被羧基或氨基甲酰基任意取代，而且該雜環(huán)還可另外含有任意選自O(shè)、S和N的雜原子);苯甲酰氨基(其中苯基可被1-3個羥基取代);不飽和、部分飽和或完全飽和的含氮五～六元雜環(huán)，并且該雜環(huán)還可含有1-3個選自N、S和O的另外的雜原子(其中環(huán)碳原子之一可任意地帶有羧基、磺基、羧基(C1-C4)烷基和磺基(C1-C4)烷基，且該環(huán)氮原子可被(C1-C4)烷基、羧基(C1-C4)烷基、磺基(C1-C4)烷基和芐基任意取代〕;(C3-C6)鏈烯基(可被羧基或磺基任意取代);1-脫氧-1-山梨糖基;2-脫氧-2-葡糖基;全飽和的五～七元含氮雜環(huán)〔其中氮原子可被(C1-C4)烷基或芐基任意取代，且環(huán)骨架的1個或2個碳原子可帶有選自(C1-C4)烷基、羧基和磺基的取代基〕;
或R2和R3與相鄰的氮原子一起共同代表一完全飽和的五～七元雜環(huán)，該雜環(huán)可任意含有選自O(shè)、S和N的另外的雜原子，且在環(huán)碳原子上可任意地帶有選自(C1-C4)烷基、芐基、羧基、磺基、羧基(C1-C4)烷基和磺基(C1-C4)烷基的1個或2個取代基;
R4代表氫、甲基或羥甲基;
條件是當R4為氫為羥甲基時，則R同時為甲氧基甲基，且R1為甲基。
本發(fā)明也包括由相應(yīng)的式(Ⅱ)起始化合物制備本發(fā)明化合物的方法，
抗菌素GE2270是通過培養(yǎng)玫瑰游動雙孢菌ATCC53773或其變異株或突變株，并從菌絲體和/或發(fā)酵液中分離所需的抗菌素物質(zhì)而制得。玫瑰游動雙孢菌ATCC53773由土壤樣品分離得到，并且于1988年6月14日保藏在布達佩斯條約所規(guī)定的美國典型培養(yǎng)物收集中心(ATCC)(12301ParklawnDrive，Rockville，MD20852MarylandU.S.A.)。
記錄該菌株的登記號為ATCC53773。
抗菌素GE2270因子A是抗菌素GE2270復合物中的主要成分。
歐洲專利申請公開號359062對抗菌素GE2270因子A以及玫瑰游動雙孢菌ATCC53773已有敘述。
最近的研究表明，抗菌素GE2270因子A可用以下通式(Ⅲ)表示，
當在選擇性水解條件下處理抗菌素GE2270因子A時，得到一些稱作抗菌素GE2270因子A1、A2和A3的衍生物。所說的因子A1、A2和A3以及制備它們的水解方法已在歐洲專利申請公開號406745以及美國專利申請?zhí)?47，647中公開。
以上所提到的水解條件通常包括使用緩沖的或未緩沖的酸性水介質(zhì)和極性有機溶劑的混合液。反應(yīng)溫度隨所使用的酸的強度和濃度等因素的變化而變化，且一般在-10℃至90℃之間。反應(yīng)時間還顯著地取決于溫度、酸強度及其濃度等參數(shù)，一般為幾分鐘至幾小時。
一般來說，當使用較溫和的水解條件時(如較短的反應(yīng)時間和較低的溫度或較低的酸強度或濃度)，通常得到抗菌素GE2270因子A1，而使用較強的水解條件則得到抗菌素GE2270因子A2，為了獲得抗菌素GE2270因子A3，則必需使用更劇烈的水解條件。
雖然抗菌素GE2270因子A2和A3可被直接用作生產(chǎn)本發(fā)明化合物的起始物質(zhì)，而抗菌素GE2270因子A1不適于用作直接生產(chǎn)本發(fā)明化合物的起始物質(zhì)，但抗菌素GE2270因子A1如同下面將要進一步解釋的那樣可被用作上述起始物質(zhì)的前體。
抗菌素GE2270因子A2和A3的特征在于，在分子的上部分別具有酯基和羧基官能團。具體地說，已發(fā)現(xiàn)抗菌素GE2270因子A2和因子A3可由上面所定義的式Ⅱ表示，其中W代表COOH(抗菌素GE2270因子A3)或酯基(抗菌素GE2270因子A2)
R為甲氧基甲基，R1為甲基，R4為甲基。
抗菌素GE2270因子A2和因子A3(及其混合物)都可用作制備本發(fā)明化合物的合適起始物，但優(yōu)選其中的因子A3。因子A2可以作為活性酯直接加以使用，或者通過上面所述的劇烈酸水解或用稀釋的堿進行堿水解(見歐洲專利申請公開號406745和美國專利申請?zhí)?47，647)而被轉(zhuǎn)化為因子A3。
最近已發(fā)現(xiàn)(歐洲專利申請公開號451486和美國專利申請665，612)，可從玫瑰游動雙孢菌ATCC53773或其產(chǎn)生抗菌素GE2270的變異株或突變株的菌種中分離出其它較少的成分。具體地說，這些成分已在菌絲體以及所培養(yǎng)的微生物發(fā)酵液中被發(fā)現(xiàn)。
從菌絲體中回收所說的抗菌素GE2270的較少的成分的優(yōu)選方法包括用可與水溶混的有機溶劑萃取過濾或離心的菌絲體、濃縮萃取液并通過沉淀(有選擇地加入沉淀劑)、用不可與水混溶的有機溶劑萃取水溶性殘渣、或在吸附層析后從吸附基質(zhì)中洗脫所需產(chǎn)物等方法回收粗的抗菌素物質(zhì)。
最近發(fā)現(xiàn)(歐洲專利申請?zhí)?1114667.8)，從上面所述的玫瑰游動雙孢菌ATCC53773的相同培養(yǎng)物中可分離出其他較少的成分(因子C2a)。
抗菌素GE2270C2a的理化性質(zhì)如下A)用PerkinElmer320型光譜儀所記錄的紫外吸收光譜顯示出如下的最大吸收溶劑UVmax(nm)0.1MHCl245-250(肩峰)300-3150.1MKOH245-250(肩峰)300-315
磷酸鹽緩沖液(PH7.38)245-250(肩峰)300-315甲醇245-250(肩峰)300-315B)抗菌素GE2270因子C2a的1H-NMR光譜是用250MHIBruker光譜儀記錄的。以TMS作為內(nèi)標(0.00ppm)，在DMSO-d6中抗菌素的光譜顯示出如下信號〔δ，ppm，m〕(s＝單峰，d＝雙峰，t＝三峰，m＝多重峰，Py＝吡啶，TI＝噻唑)9.03，d，(NH);8.70，d，(2NH′s);8.60，s，8.54，s，8.29，s，和7.38，s，(TZCH′s);8.48，m，(甘氨酸NH);8.43，d，和8.27，d，(Py CH′s);7.35-7.20，m，(芳香族CH′s和伯酰胺NH);6.98，s(伯酰胺NH);6.04，d，(OH);5.80，t(OH);5.35-5.15，m，(αCH′s);5.04，m，(苯基絲氨酸βCH);4.98，s〔CH2(OCH3)〕;4.87，d，〔CH2(OH)〕;4.81，m和4.56，m，(噁唑啉CH2);4.35-3.75，m，(甘氨酸的CH2和脯氨酰胺CH′s);3.39，s，(OCH3);2.71，m，和1.30，m，(天冬酰胺的CH2);2.48，d，(N-甲基天冬酰胺的NCH3);2.22-1.80，m，(異丙基CH和脯氨酰胺CH′s);0.88和0.84，d，(纈氨酸CH3′s)
C)當用下列反相HPLC系統(tǒng)進行分析時，相對于抗菌素GE2270因子A(Rt16.6)的保留時間0.76min，抗菌素GE2270因子C2a的保留時間為12.6min柱子Bakerbond C8(5μm)4.6×250mm(Bakerbond 是反相辛基甲硅烷基硅膠HPLC柱的商品名，由J.T.Baker Research Product，Phillisburg，New Jersey 08865 USA提供)流速1.8ml/minA相CH3CN∶四氫呋喃∶40mM HCOONH4＝40∶40∶20B相CH3CN∶四氫呋喃∶40mM HCOONH4＝10∶10∶80洗脫在20min內(nèi)用20%-30%A相進行線性梯度洗脫檢測UV254nmD)抗菌素GE2270因子C2a的主要FAB-MS峰為1306道爾頓。它最可能對應(yīng)于質(zhì)子化了的分子離子的最低同位素。分析是在Kratos MS-50雙聚集質(zhì)譜儀上進行，使用了8kV的加速電壓和具有Xe氣體的鞍形場原子槍(在離子源壓力計上顯示的壓力為2×10-5乇)，其電壓為6kV，電流為1mA。用于FAB-MS分析的抗菌素是與含有0.1M乙酸的硫甘油基質(zhì)混合在一起。
所說的抗菌素GE2270的某些較少的成分(即因子B1、B2、C1、C2、C2a、D1、D2和E)可用上面所提到的通式Ⅱ代表，其中W代表下列基團
R分別代表氫(GE2270因子C1和D1)、甲基(因子B2)、羥甲基(因子D2和E)和甲氧基甲基(因子B1、C2和C2a);
R1代表氫(GE2270因子B1、D1和E)和甲基(GE2270因子B2、C1、C2、C2a和D2);
R4代表氫(GE2270因子C2)、甲基(GE2270因子B1、B2、C1、D1、D2和E)或羥甲基(因子C2a)。
當按照上面由抗菌素GE2270因子A制備抗菌素GE227因子A2和A3所述相同的水解方法(及歐洲專利申請公布號406745和美國專利申請?zhí)?47，647)處理抗菌素GE2270因子D1、D2和E或其混合物時，上述共同的基團W被水解成羧基，而取代基R、R1和R4則未變。
因此，其中W為羧基或活性酯官能團，R為氫、羥甲基或甲氧基甲基，R1為氫或甲基且R4為氫、甲基或羥甲基的式Ⅱ衍生物可用作本發(fā)明的起始物，條件是當R4為氫或羥甲基時R為甲氧基甲基且R1為甲基。應(yīng)當清楚的是，如同其它微生物一樣，產(chǎn)生GE2270菌株的特征在于需經(jīng)變異。例如，通過用各種已知的誘變因子(如紫外線、X-射線、高頻波、放射線、化學藥品，如亞硝酸、N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基-胍以及許多的其它因素)進行處理，可獲得該菌株的人工變異株和突變體。在本發(fā)明中，所有屬于游動雙孢菌屬且產(chǎn)生抗菌素GE2270的天然和人工變異株和突變體均被看作與菌株玫瑰游動雙孢菌ATCC53773等同。
這里所用的術(shù)語“烷基”，不論是單獨存在還是與其它取代基相結(jié)合，都包括直鏈和支鏈的烴基;更具體地說，“(C1-C14)烷基”代表具有1-14個碳原子的直鏈或支鏈的脂肪烴，如甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基、丁基、1-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、1-己基、2-己基、3-己基、3，3-二甲基-1-丁基、4-甲基-1-戊基和3-甲基-1-戊基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基和十四烷基。同樣，“(C1-C4)烷基”代表具有1-4個碳原子的直鏈或支鏈的烴，如前面所列舉的1-4個碳原子的烷基。
如前所述，“(C1-C14)烷基”可帶有1-3個取代基。
術(shù)語“鹵素”代表選自氟、氯、溴和碘的鹵原子。
這里所用的術(shù)語“(C3-C6)鏈烯基”指具有3-6個碳原子和雙鍵的鏈烯基;它包括丙烯基、3-丁烯基、2-丁烯基、2-甲基丙烯基、2-戊烯基、3-己烯基等，它們可被羧基或磺基任意取代。
本發(fā)明所表述的“可含有1-3個選自N、S和O的其它雜原子的含氮五～六元雜環(huán)”包括未飽和、部分飽和和完全飽和的環(huán)系統(tǒng)，如吡啶、嘧啶、吡嗪、吡咯烷、哌啶、哌嗪、噁唑、噁唑啉、噁唑烷、吡唑啉、吡唑烷、噻唑烷、嗎啉、硫代嗎啉、吡咯、吡咯啉、咪唑、咪唑烷、噻二唑、噁二唑和四唑等。
在所說的“含氮五～六元雜環(huán)”中1-3個環(huán)碳原子可任意地帶有羧基、磺基、羧基(C1-C4)烷基和磺基(C1-C4)烷基，且環(huán)氮原子可任意地被(C1-C4)烷基、羧基(C1-C4)烷基、磺基(C1-C4)烷基和芐基取代。
“其中氮原子可被(C1-C4)烷基或芐基任意取代的全飽和的五～七元含氮雜環(huán)”這一表述是指含有1個可被(C1-C4)烷基或芐基任意取代的氮原子，并且碳骨架可任意地帶有1或2個選自(C1～C4)烷基、羧基和磺基取代基的全飽和五～七元雜環(huán)。該雜環(huán)是通過下式的氮原子和雜環(huán)架的碳原子之間的鍵與該氮原子相連，
該基團的例子有1-甲基-4-吡咯烷基、3-哌啶基、1-乙基-4-哌啶基、1-芐基-2，6-二甲基-4-哌啶基和4-羧基-1-甲基-2-哌啶基。
當R2和R3與相鄰的氮原子一起共同代表“可任意地含有選自O(shè)、S和N的其它雜原子的全飽和五～七元雜環(huán)”時，該表述包括例如下面的雜環(huán)基團吡咯烷子基、嗎啉代、哌啶子基、哌嗪子基、硫代嗎啉代、吡唑烷子基、1，3-噁唑烷子基、1，3-噻唑烷子基和六氫氮雜
子基。當其它雜原子為N時，它可任意地帶有選自(C1-C4)烷基、芐基、羧基、羧基(C1-C4)烷基、磺基和磺基(C1-C4)烷基的取代基。
術(shù)語“1-脫氧-1-山梨糖基”指其中Y為來自葡糖胺的式(Ⅰ)化合物，即Y為1-氨基-1-脫氧-山梨糖醇。術(shù)語“2-脫氧-2-葡糖基”指其中Y為來自葡糖胺的式(Ⅰ)化合物，即Y為2-氨基-2-脫氧葡萄糖。
優(yōu)選的一組本發(fā)明化合物為其中R代表甲氧基甲基、R1和R4代表甲基和其它取代基的定義同前的式Ⅰ化合物。
更優(yōu)選的一組本發(fā)明化合物是其中R代表甲氧基甲基、R1和R4代表甲基以及Y代表下式基團的式Ⅰ化合物，
其中R2為氫，R3的定義同上。
另一組更優(yōu)選的本發(fā)明化合物為下述式Ⅰ化合物，其中R為甲氧基甲基，R1和R4代表甲基，并且Y代表氨基，該氨基來源于例如甘氨酸、鳥氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、賴氨酸等天然氨基酸，或來源于例如甘氨酰賴氨酸、絲氨酰脯氨酸、甘氨酰脯氨酰胺、酪氨酰脯氨酰胺、氨酰脯氨酰胺、亮氨酰脯氨酰胺等合成的二肽。
另一組更優(yōu)選的化合物包括如下式Ⅰ化合物，其中R為甲氧基甲基，R1和R4為甲基，Y為NR2R3基團(其中R2為氫，R3為被選自COOH、SO3H和PO3H2基團取代的具有3-12個碳原子，優(yōu)選3-7個碳原子的線性烷基鏈。
最優(yōu)選的化合物為其中R為甲氧基甲基、R1和R4為甲基和Y為NR2R3基團(其中R2為氫。R3為CH2CH2CH2CH2CH2-COOH)的式Ⅰ化合物。
另一組更優(yōu)選的本發(fā)明化合物是如下式Ⅰ化合物，其中R代表氫、羥甲基和甲氧基甲基，R1代表氫或甲基，Y代表下式基團，
其中R2為氫，R3和R4的定義同上。
另一組更優(yōu)選的本發(fā)明化合物是如下式Ⅰ化合物，其中R為氫、羥甲基或甲氧基甲基，R1代表氫或甲基，R4為氫、甲基或羥甲基(條件是當R4為氫或羥甲基時R為甲氧基甲基，R1為甲基)，且Y為氨基，該氨基來源于例如甘氨酸、鳥氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、賴氨酸等天然氨基酸，或來源于例如甘氨酰賴氨酸、絲氨酰脯氨酸、甘氨酰脯氨酰胺、酪氨酰脯氨酰胺、蘇氨酰脯氨酰胺、亮氨酰脯氨酰胺等合成的二肽。
另一組優(yōu)選的化合物包括如下式Ⅰ化合物，其中R為氫、羥甲基或甲氧基甲基，R1為氫或甲基，R4為氫、甲基或羥甲基(條件是當R4為氫或羥甲基時R為甲氧基甲基，R1為甲基)，且Y為NR2R3基團，其中R2為氫，R3為被COOH、SO3H和PO3H2基團取代的優(yōu)選具有3-12個碳原子(更優(yōu)選具有3-7個碳原子)的線性烷基鏈。
最后一組優(yōu)選的化合物是如下式Ⅰ化合物，其中R為氫、羥甲基或甲氧基甲基，R1為氫或甲基，R4的定義同上，且Y為NR2R3基團(其中R2為氫，R3為CH2CH2CH2CH2CH2-COOH)。
本發(fā)明化合物的代表性實例包括其中R、R1、R4和Y的定義如上，
代表如下基團的式Ⅰ化合物
-NH2-NHC4H9-NH(CH2)4-PO3H2-NHCH2COOH-NH-CH2CONH2-NH-CH2-CON(C2H5)2
其中n為2，3或4-NH-(CH2)n-NH2-NH-(CH2)n-NHCH3-NH-(CH2)n-N(CH3)2-NH-(CH2)n-N(C2H5)2-NH-(CH2)n-N(CH3)(C2H5)其中n為2，3，4，5，6，7或8
-NH-(CH2)n-NH-(CH2)m-COOH-NH-(CH2)n-NH-(CH2)m-SO3H-NH-(CH2)n-O-(CH2)m-COOH-NH-(CH2)n-O-(CH2)m-SO3H-NH-(CH2)n-S-(CH2)m-COOH-NH-(CH2)n-S-(CH2)m-SO3H其中n為2，3，4或5，m為1，2，3或4
-NH-(CH2)n-CH＝CH-(CH2)m-COOH-NH-(CH2)n-CH＝CH-(CH2)m-SO3H其中n為1，2或3，m為0.1或2
本發(fā)明的化合物可按照常規(guī)方法形成鹽。
具體地，其中-NR2R3基團含有另外的胺官能團的式Ⅰ化合物可以形成酸加成鹽。
另外，在-NR2R3基團中含有酸官能團的本發(fā)明化合物還可以形成堿加成鹽。
一般來說，含有酸和堿官能團的本發(fā)明化合物可形成內(nèi)鹽。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，“內(nèi)鹽”包括在“非鹽”形式的定義中。
優(yōu)選的本發(fā)明化合物的加成鹽是可藥用的酸和/或堿加成鹽。
術(shù)語“可藥用的酸和/或堿加成鹽”意指與酸和/或堿形成的鹽，從生物學、制藥和配方的角度看這些在制藥實踐以及用于促進動物生長方面均是適用的。
式Ⅰ化合物的代表性和適宜的酸加成鹽包括通過常規(guī)反應(yīng)與有機和無機酸形成的鹽，這些有機和無機酸的例子有鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸、琥珀酸、檸檬酸、抗壞血酸、乳酸、馬來酸、富馬酸、棕櫚酸、膽酸、雙羥萘酸、粘酸、谷氨酸、樟腦酸、戊二酸、羥基乙酸、鄰苯二甲酸、酒石酸、月桂酸、硬脂酸、水楊酸、甲磺酸、十二烷基磺酸(estolicacid)、苯磺酸、山梨酸、苦味酸、苯甲酸、肉桂酸以及類似的酸。
上述堿的代表性實例有堿金屬或堿土金屬氫氧化物，如氫氧化鈉、氫氧化鉀和氫氧化鈣;氨和有機脂族、脂環(huán)族或芳族胺，如甲胺、二甲胺、三甲胺、2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇(TRIS)、甲基吡啶;以及堿性氨基酸，如賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸和組氨酸。
將本發(fā)明的游離氨基或非鹽化合物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的加成鹽，以及反過來將本發(fā)明化合物的加成鹽轉(zhuǎn)化成非鹽或游離氨基形式都屬于常規(guī)技術(shù)并包括在本發(fā)明中。
例如，通過將非鹽形式的化合物溶于水溶性溶劑中并加入稍微過量摩爾的選擇的酸或堿，可將式Ⅰ化合物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的酸或堿加成鹽。然后將產(chǎn)生的溶液或懸浮液冷凍干燥就可得到所需的鹽。在某些情況下，不通過冷凍干燥而是用有機溶劑萃取、將分離出的有機相濃縮至小體積并加入非溶劑沉淀，也可能得到最終所需的鹽。
在最終的鹽不溶于有機溶劑而非鹽形式可溶的情況下，可在加入化學計算量稍微過量摩爾的選擇酸或堿之后，通過過濾非鹽形式的有機溶液的方法可以得到最終的鹽。
非鹽形式可通過下面方法制備將相應(yīng)的酸或堿鹽溶于水溶性溶劑，然后進行中和，游離出非鹽形式。再通過用有機溶劑萃取回收，或者通過加入選擇酸或堿并按上述方法操作而轉(zhuǎn)化成另一種堿或酸加成鹽。
當需要進行下面的中和脫鹽時，可使用普通的脫鹽方法。
例如，可方便地使用在控制的微孔葡聚糖樹脂(如SephadexLH20)或硅烷化的硅膠上進行柱層析。用水溶液洗去不需要的鹽后，用水與極性或非極性有機溶劑的混合液(如從50∶50乙腈/水至100%乙腈)進行線性梯度或階梯度洗脫，可洗脫出所需產(chǎn)物。
正如現(xiàn)有技術(shù)所已知的，與可藥用的酸(堿)或非藥用的酸(堿)成鹽可以用作為常規(guī)純化技術(shù)。在成鹽和分離之后，可以將式Ⅰ化合物的鹽形式轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的非鹽或轉(zhuǎn)化為可藥用的鹽。
在某些情況下，式Ⅰ化合物的酸加成鹽更易溶于水和親水溶劑，且其化學穩(wěn)定性得到提高。
但是，鑒于式Ⅰ化合物和它們的鹽性質(zhì)上的相似性，本申請中論及的式Ⅰ化合物的生物活性同樣適用于其可藥用的鹽，反之亦然。
鑒于本發(fā)明化合物的特性，在制備用于治療人體或動物的藥品中本發(fā)明化合物可以用作為有效成分。
具體地說，式Ⅰ所示的抗菌素GE2270化合物的酰胺類衍生物主要可用作抗革蘭氏陽性細菌以及抗革蘭氏陽性和抗陰性厭氧菌的抗菌劑。
制備本發(fā)明化合物的一般方法是將合適的抗菌素GE2270化合物式(Ⅱ)與所選擇的式HNR2R3的胺(其中R2和R3的定義同上)在惰性有機溶劑中反應(yīng)(酰胺化)，
其中W代表羧基或活性酯官能團;
R代表氫、羥甲基或甲氧基甲基;
R1代表氫或甲基;
R4代表氫、甲基或羥甲基;
條件是當R4代表氫或羥甲基時，R同時為甲氧基甲基，R1為甲基;并且當W為羧基時，在縮合劑存在下進行反應(yīng)。
在進行酰胺化制備本發(fā)明化合物時，有時需要將反應(yīng)物上不參與酰胺化反應(yīng)但對反應(yīng)條件敏感或?qū)Ψ磻?yīng)進程產(chǎn)生不利影響(如產(chǎn)生不需要的副產(chǎn)物)的官能團進行保護。
此外，當氨基酸含有其它可能影響酰胺化反應(yīng)進程的活性官能團(如氨基、羧基或巰基)時，可用本身已知方法將它們保護起來，這些方法在E.GrossandJ.Meienholer“ThePeptides”Vol.3，AcademicPress，NewYork，1981和M.BodanszkyandA.Bodanszky“ThePracticeofPeptideSynthesis”，Springer-Verlag，BerlinHeidelberg，1984等參考書中已有敘述。這些保護基在進行酰胺反應(yīng)的條件下必須是很穩(wěn)定的，并且能夠在反應(yīng)結(jié)束時很容易地脫去而不影響新形成的酰胺鍵或分子的任何其它部分。
能夠較好地用在本發(fā)明的方法中保護氨基官能團的N-保護基的代表性實例有形成氨基甲酸酯的試劑，其特征在于具有以下的氧羰基1，1-二甲基丙炔基-氧羰基、叔丁基氧羰基、乙烯基氧羰基、芳基氧羰基、肉桂酰氧基羰基、芐基氧羰基、對-硝基芐基氧羰基-3，4-二甲氧基-6-硝基芐基氧羰基、2，4-二氯芐基氧羰基、5-苯并異噁唑基甲氧羰基、9-蒽基甲氧羰基、二苯基甲氧羰基、異煙酰氧羰基、S-芐基氧羰基等。
對活性羧酸官能團的適當保護方法是通過例如形成酯官能團。
根據(jù)本申請的公開內(nèi)容，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠決定哪些胺HNR2R3官能團需要保護、怎樣保護以及為了得到所需最終化合物如何適當?shù)娜ケＷo反應(yīng)。
熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員均知道，根據(jù)所需要的具體酰胺衍生物的特性，最終選擇具體的保護基。事實上，終產(chǎn)物的酰胺官能團在脫去保護基的條件下必須是穩(wěn)定的。
由于除去不同保護基的條件是已知的，因此熟練的技術(shù)人員能夠選擇出適當?shù)谋Ｗo基。
用于縮合反應(yīng)的惰性有機溶劑是那些不會對反應(yīng)進程產(chǎn)生不利影響并且能夠至少部分溶解抗菌素起始物的溶劑。
所述惰性溶劑的例子有有機酰胺、二元醇和多元醇的醚、磷酰胺、亞砜。優(yōu)選的惰性溶劑的例子有二甲基甲酰胺、二甲氧基乙烷、六甲基磷酰胺、二甲基亞砜、二噁烷及其混合液。
對反應(yīng)條件，有時水是合適的。
當W為羧基時本發(fā)明方法中所使用的縮合劑是那些適于在有機化合物尤其是在肽合成中形成酰胺鍵的試劑。
代表性的和優(yōu)選的縮合劑的例子有(C1-C4)烷基、苯基或雜環(huán)基磷酰疊氮酯，如磷酰疊氮二苯酯(DPPA)、磷酰疊氮二乙酯、磷酰疊氮二(4-硝基苯基)酯、磷酰疊氮二嗎啉基酯和磷酰氯二苯酯或苯并三唑-1-基-氧代-三吡咯烷并磷鎓六氟磷酸酯(PyBOP)。優(yōu)選的縮合劑是磷酰疊氮二苯酯(DPPA)。
在本發(fā)明方法中，通常應(yīng)用稍微過量摩爾的胺反應(yīng)物HNR2R3。
一般應(yīng)用1-2倍摩爾過量，優(yōu)選1.2-1.5倍摩爾過量。
為了進行酰胺化反應(yīng)，胺HNR2R3必須能夠與抗菌素起始物的羧基官能團形成鹽。當在所選定的反應(yīng)介質(zhì)中胺HNR2R3不足以成鹽時，必須向反應(yīng)混合物中按與抗菌素起始物等摩爾的量加入形成鹽的堿。
這類形成鹽的堿其例子有有機脂族或脂環(huán)族叔胺(如三甲胺、三乙胺、N-甲基吡咯烷)和雜環(huán)堿(如甲基吡啶)等。
通常應(yīng)用稍微過量摩爾(如1.1-1.5)，優(yōu)選為抗菌素GE2270起始物1.2倍的縮合劑。
另外，也可將胺HNR2R3以其相應(yīng)的酸加成鹽如鹽酸鹽的形式很便利地加至反應(yīng)介質(zhì)中在此情況下，必須使用能夠從其鹽中游離出HNR2R3胺的至少2倍(優(yōu)選2-3倍)。同樣，在這種情況下，合適的堿是如同上面所列舉的有機脂族或脂環(huán)族叔胺。事實上，至少在某些情況下，最好使用胺HNR2R3的鹽，然后用上述堿將其游離出來，特別是當該鹽比相應(yīng)的游離胺更穩(wěn)定時尤其如此。
反應(yīng)溫度將明顯地取決于特定的起始物和反應(yīng)條件。一般來說，在0-20℃之間進行該反應(yīng)較好。
同樣，反應(yīng)時間也明顯地取決于其它反應(yīng)參數(shù)。一般來說，縮合反應(yīng)在約5-24h內(nèi)完成。
在任何情況下，均按照現(xiàn)有技術(shù)中的已知方法通過TCC(優(yōu)選HPLC)監(jiān)測反應(yīng)進程。
根據(jù)測定的結(jié)果，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)Ψ磻?yīng)進程進行評估以及決定何時終止反應(yīng)，并使用已知方法處理反應(yīng)物質(zhì)。這些方法包括用溶劑萃取、加入非溶劑沉淀以及通過柱層析進一步分離和純化。
如前所述，當需要對反應(yīng)物HNR2R3進行保護時，被保護的最終產(chǎn)物可通過已知方法脫去保護，所用的具體方法主要取決于所用的保護基。
當活性酯用作為GE2270起始物時，該酯是其中酯化的醇具有一離去基團的酯，而該離去基團在對分子的其它部分不發(fā)生改變的反應(yīng)條件下能夠很容易地被HNR2R3胺所置換或取代。在上面所提到的溶劑中，應(yīng)用的胺反應(yīng)物其摩爾數(shù)通常超過活性酯和低級烷醇的量。反應(yīng)溫度一般為0℃-100℃。活性酯的例子包括其中低級烷基部分被氰基和硝基任意取代的低級烷基酯、被鹵素和硝基取代的苯基酯以及GE2270因子A2中含有的酯基部分。
很顯然，在很多情況下可以多種方式制備本發(fā)明化合物，并且可以利用本身已知反應(yīng)將本發(fā)明的一種化合物轉(zhuǎn)化成另一種化合物。
例如，當HNR2R3胺含有可被進一步轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的酰胺衍生物的羧基或酯官能團時，可通過如下方法制備所需的式Ⅰ化合物首先將上述的胺與所選擇的GE2270起始物縮合，然后通過與合適的胺反應(yīng)將羧基或酯基轉(zhuǎn)化成酰胺。
以下各表列出了本發(fā)明某些代表性化合物的結(jié)構(gòu)式(表Ⅰ)及其制備方法(在實驗部分有詳細敘述)、起始物和反應(yīng)產(chǎn)率(表Ⅱ)。
HPLC分析下表(表Ⅲ)報道了具有代表性的本發(fā)明化合物的Rt值。
分析是在裝有10μl小孔注射器的Varian5000LC型泵和Varian2050可變?yōu)V長檢測器上于254nm處進行的。
柱子在LiChroCart-LiChrosorbRP-8(5μm)前置柱后面接著一個LiChroCart125-4LiChrospher100RP-8(5μm)柱。
洗脫劑A 0.05M HCOONH4水溶液B CH3CNCTHF方法A成分恒定的洗脫劑，44%B在A中的溶液流速0.7ml/min方法B成分恒定的洗脫劑，40%B在A中的溶液流速0.7ml/min方法C成分恒定的洗脫劑，38%B在A中的溶液流速0.5ml/min方法D成分恒定的洗脫劑，30%B在A中的溶液流速0.7ml/min方法E成分恒定的洗脫劑，38%B在A中的溶液流速0.7ml/min方法F按照以下方案在11min內(nèi)用38%-55%B在A中的溶液進行梯度洗脫時間(min)A中B的百分數(shù)03863874510451155流速0.7ml/min方法G按照以下方案在25min內(nèi)用38%～55%B在A中的溶液進行梯度洗脫時間(min)A中B的百分數(shù)038638104415452555流速0.7ml/min方法H成分恒定的洗脫劑，55%B在A中的溶液流速0.7ml/min方法Ⅰ成分恒定的洗脫劑，60%B在A中的溶液流速0.7ml/min方法L成分恒定的洗脫劑，48%B在A中的溶液流速0.7ml/min方法M按照以下方案進行梯度洗脫時間(min)%A%B%C074101620621919流速0.7ml/min
表Ⅲ(續(xù))
K＝相對保留時間K＝相對保留時間＝Rt酰胺/RtGE2270合適起始物(即其中W為COOH的式Ⅱ化合物)
實驗部分表Ⅳ-N.M.R1H-NMR譜是用TMS作為內(nèi)標(0.00ppm)，用DMSO-d6為溶劑，在250MHz和/或500MHz的Bruker譜分析儀上進行記錄的(s＝單峰，br s＝寬單峰，d＝雙峰，dd＝雙雙峰，t＝三重峰，m＝多重峰)。
表Ⅴ-I.R.
紅外光譜(IR)是在石蠟糊中用PerkinElmer580型分光光度計記錄的。
表Ⅵ-U.V.
紫外吸收光譜是用PerkinElmer320型分光計記錄的。
熟練的技術(shù)人員都知道，下面的表Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ中的數(shù)據(jù)并不代表所獲得的所有峰值，而僅代表單個物質(zhì)特征的峰值。
本發(fā)明化合物的抗菌活性可通過一系列的體外標準試驗加以證實。
通過瓊脂稀釋法測定對瘡皰丙酸桿菌和對脆弱擬桿菌的MIC(接種物104/105CFU/斑)。對其它細菌的MIC是用微量肉湯稀釋法測定(接種物104-105CFU/ml)。除流感嗜血菌、瘡皰丙酸桿菌和脆弱擬桿菌的培養(yǎng)時間為48h外，其它細菌的培養(yǎng)時間均為18-24h。所有細菌均于37℃培養(yǎng)。流感嗜血菌于5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，厭氧菌于厭氧氣體混合物中培養(yǎng)。所用的培養(yǎng)基為Iso-Sensitest肉湯(Oxoid)(葡萄球菌、糞鏈球菌、大腸桿菌、普通變形菌);腦心浸出肉湯(Difco)+1%補體C(Difco)(流感嗜血菌)。
下面表Ⅶ中報道了對一些細菌的最小抑制濃度(MIC，μg/ml)。
鑒于其性質(zhì)，本發(fā)明化合物可用作制備治療人體或動物的藥品的有效成分。
具體地說，抗菌素GE2270化合物的酰胺衍生物(式Ⅰ)主要對革蘭氏陽性細菌以及革蘭氏陽性和陰性厭氧菌具有抗菌作用。
本發(fā)明抗菌物質(zhì)主要的治療作用表現(xiàn)在可用它們處理對其敏感的細菌所引起的感染。
術(shù)語“處理”意指預(yù)防、治療和治愈。
接受治療的患者可以是任何動物，包括靈長類動物(尤其是人)和其它哺乳動物(如馬、牛、豬和羊);以及普通的家畜和家養(yǎng)動物。
本發(fā)明的化合物可以單獨服用，或者與可藥用的載體混合后服用，也可與其它的抗菌劑聯(lián)合服用。聯(lián)合療法包括依次、同時和單獨服用各有效成分，其方式是在第一次服用的治療作用還未完全消失時服用下一成分。
一種優(yōu)選的藥用制劑是適于在無損傷或損傷的皮膚或粘膜上進行局部給藥的制劑。這類制劑的例子有粉劑、軟膏、乳膏和洗液。這類制劑中賦形劑是普通的可藥用載體，如油脂性軟膏基質(zhì)(如十六烷基酯蠟、油酸、橄欖油、石蠟、鯨蠟、甘油淀粉);吸收性軟膏基質(zhì)(如無水羊毛脂、親水性礦脂);乳化軟膏基質(zhì)(如十六烷醇、單硬脂酸甘油酯、羊毛蠟、硬脂酸);水溶性軟膏基質(zhì)〔如乙二醇醚及其衍生物，包括聚乙二醇、聚(氧-1，2-乙烷二基)-α-氫-ω-羥基-十八酸酯、聚山梨酸酯和聚乙二醇單硬酸酯〕。
這些制劑中可含有其它已知賦形劑，如防腐劑，并且可以按照現(xiàn)有技術(shù)中已知方法和Remington′sPharmaceuticalSciences，Seventeenthedition，1985，MackPublishingCo.等參考書中所報道的方法進行制備。
也可按照現(xiàn)有技術(shù)中所已知的方法將本發(fā)明的化合物配制成適用于非經(jīng)胃腸道給藥的制劑。例如，可以將本發(fā)明化合物與用聚丙二醇或二甲基乙酰胺以及聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯或聚乙氧化的蓖麻油等表面活性劑一起配制。
優(yōu)選的非經(jīng)胃腸道給藥制劑包括以下賦形劑Cremophor
EL(聚烴氧基35蓖麻油USP/NF)20%，丙二醇5-10%。
在治療對本發(fā)明抗菌素敏感的細菌引起的任何感染時，優(yōu)選上述用于靜脈給藥的制劑。
適用于靜脈給藥的配方其一個例子是化合物19100mg丙二醇1ml注射用水(足量)5ml磷酸鹽緩沖液(PH8-8.5)在治療由于胃腸道中存在厭氧菌而引起的假膜結(jié)腸炎或其它疾病時，可將本發(fā)明化合物的有效劑量以合適的藥用形式(如膠囊或水懸浮液)口服給藥。
有效成分的劑量取決于許多因素，其中包括患者的類型、年齡和狀況、特定的有效成分、所選擇的給藥制劑以及給藥方式等。
一般來說，是按每單個單位劑量形式使用抗菌有效的劑量。一般用這些劑量形式進行重復給藥(如每天2-6次)較好。有效劑量一般為0.5-50mg/kg體重/天。
一優(yōu)選的局部制劑是含有1-10%本發(fā)明化合物的軟膏。
無論如何，有處方權(quán)的醫(yī)師能夠為具體情況下的某一患者確定最佳劑量。
本發(fā)明化合物除了可用作人和獸醫(yī)治療的藥物外，還可被用作動物生長促進劑。
為此，可將本發(fā)明的化合物加到合適的飼料中進行口服給藥。所使用的具體濃度是當正常量的飼料被消耗時產(chǎn)生促進生長作用所需有效成分的濃度。
向動物飼料中加入本發(fā)明的有效化合物，最好是制備含有有效量本發(fā)明的化合物的合適飼料預(yù)混合物，并將該預(yù)混合物加至全部的定量物中。
或者可將含有有效成分的中間物精飼料或飼料添加劑與飼料混和。上述飼料預(yù)混合物和全部定量物的制備和服用的方式在參考書中有所記載(如“AppliedAnimalNutrition”，W.H.FreedmanandCO.，S.Francisco，USA，1969或“LivestockFeedsandFeeding”O(jiān)andBbooks，Corvallis，Oregon，USA，1977)。
以下的實施例進一步說明了本發(fā)明，但無論如何不應(yīng)將其理解為是對本發(fā)明的限定。
方法A-起始物GE2270因子A3與所選擇的胺的反應(yīng)。
實施例1制備化合物15、29、30、32、33于0℃，在攪拌下向1mmol GE 2270因子A3(按歐洲專利申請公開號406745中所述的方法制備)的10ml二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入1.2mmol所選擇的胺、1.4mmol三乙胺(TEA)和1.2mmol磷酰疊氮二苯酯(DPPA)(如果使用所選擇胺的鹽(鹽酸鹽、對-甲苯磺酸鹽等)，則必須使用兩倍數(shù)量的TEA)。讓溫度升至室溫，并繼續(xù)攪拌約4h。然后用1N鹽酸水溶液將反應(yīng)混合物酸化至約pH3，并用水稀釋至產(chǎn)物完全析出。濕固體風干后經(jīng)硅膠60(230-400目 ASTM-Merck)快速層析純化，用3-5%甲醇的氯仿溶液洗脫。將含有標題化合物的部分合并，并蒸發(fā)溶劑。該固體與乙醚一起研磨后得到細粉狀的標題化合物。
方法A1-起始物GE 2270因子A3與所選擇的含有其它活性官能團(均被保護)的胺反應(yīng)，隨后脫去保護基。
實施例2制備化合物34、36基本按照實施例1所述的方法進行反應(yīng)。當反應(yīng)產(chǎn)物通過快速層析純化后，用7ml冷的三氟乙酸(TFA)處理1mmol所得的固體。將懸浮液攪拌幾分鐘，直至得到一種溶液，并且在冷卻下“真空”蒸發(fā)TFA。仍含有微量TFA的膠狀產(chǎn)物用乙醚處理，得到三氟乙酸鹽形式的標題化合物，為細粉狀物。
實施例3制備化合物1，3-10，18-21，39基本按照實施例1所述的方法進行反應(yīng)。當反應(yīng)產(chǎn)物通過快速層析純化后，將1mmol所得固體溶于20ml二噁烷，并于室溫和攪拌下加入1.2ml1NNaOH水溶液。5h后用1N鹽酸水溶液酸化該溶液至pH2，并用水稀釋至標題化合物完全析出。再經(jīng)過濾和風干，得到細粉狀的標題化合物。
實施例4制備化合物2按照實施例3所述的方法進行反應(yīng)。當完成酯官能團的水解以及產(chǎn)物風干后，將1mmol所得固體溶于20mlTFA，并按照Y.Kiso等(Chem.Pharm.Bull.28，673，1980)所述的方法，于室溫和攪拌下加入50mmol苯硫基甲烷。3.5h后，在冷卻下“真空”蒸發(fā)TFA，并將殘余物溶于最小量的1%甲醇的氯仿溶液中。加入乙醚使標題化合物沉淀，再經(jīng)過濾、用較多的乙醚洗滌和“真空”干燥得到標題化合物的三氟乙酸鹽，為細粉狀物。
實施例4-2制備化合物37基本按照實施例1所述的方法進行反應(yīng)。當起始物從反應(yīng)混合物中消失后，加水并過濾出所得的沉淀物，再用水洗滌并風干。然后將粗品溶于3mlTHF，在10%鹽酸水溶液存在下于室溫攪拌過夜用水稀釋，使產(chǎn)物完全沉淀，并且過濾和風干。然后固體經(jīng)硅膠60(230-400目ASTM-Merck)快速層析，用2-4%甲醇的氯仿溶液洗脫。將含有標題化合物的部分合并，并蒸發(fā)溶劑，得到淺黃色粉末。
方法B一起始物GE2270因子A3與所選擇的含有未被保護的酸殘基的胺反應(yīng)。
實施例5制備化合物19，22-28，40，41于0℃在攪拌下將1.1mmolDPPA加至1mmolGE2270因子和1.5mmolTEA的10mlDMF溶液中。讓溫度升至室溫，并繼續(xù)攪拌4.5小時。然后于室溫下向溶液中加入1.5mmol所選擇的胺和2mmolTEA，并在同一溫度下繼續(xù)攪拌5h(如果選擇的胺含有一個以上的酸性官能團，則調(diào)整TEA的量以便游離出氨基)。然后用1N鹽酸水溶液將反應(yīng)混合物酸化至約pH2，用水稀釋至產(chǎn)物完全析出。將濕固體風干，并通過硅膠60(230-400目ASTM-Merck)進行快速層析純化，用5-10%甲醇的氯仿溶液洗脫。合并含有標題化合物的部分，并且蒸發(fā)溶劑。固體與乙醚一起研磨后得到細粉狀標題化合物。
方法B1-起始物GE2270因子A3與所選擇的含有活性官能團(除了未被保護的酸性基團外，其它所有官能團均通過各種方式加以保護)的胺反應(yīng)，隨后脫去保護基。
實施例6制備化合物11，12基本上按照實施例5所述的方法進行反應(yīng)。當反應(yīng)產(chǎn)物通過快速層析純化后，將1mmol所得的固體溶于20mlTEA，并于室溫和攪拌下加入50mmol苯硫基甲烷。3.5小時后，在冷卻下“真空”蒸發(fā)TFA，并將殘余物溶于最小量的1%甲醇的氯仿溶液中。加入乙醚以使標題化合物沉淀，再經(jīng)過濾、用較多的乙醚洗滌和“真空”干燥，得到標題化合物的三氟乙酸鹽，為細粉狀物。
方法C-選擇作為起始物的GE2270因子A3的酰胺衍生物與所選擇的試劑反應(yīng)實施例7由化合物1、5、10、6分別制備化合物14、15、16、17
于0℃和攪拌下將1.2mmol所選擇的胺、1.4mmol TEA和1.2mmol DPPA加至1mmol GE2270因子A3的合適酰胺衍生物(按前面實施例中所述的方法制備)的10ml DMF溶液中〔如果使用所選擇的胺的鹽(鹽酸鹽、對-甲苯磺酸鹽等)，則必須用兩倍數(shù)量的TEA〕。讓溫度升至室溫，并繼續(xù)攪拌約4h。然后用1N鹽酸水溶液將反應(yīng)混合物酸化至約pH3，并用水稀釋至產(chǎn)物完全析出。濕固體風干后經(jīng)硅膠60(230-400目ASTM-Merk)快速層析純化，用3-5%甲醇的氯仿溶液洗脫。合并含有標題化合物的部分并蒸發(fā)溶劑。固體與乙醚一起研磨后得到細粉狀標題化合物。
方法C1-選擇作為起始物的GE2270因子A3的酰胺衍生物與所選擇的含有其它活性官能團(均被保護)的試劑反應(yīng)，隨后脫去保護基。
實施例8由化合物3制備化合物13按照實施例7所述的方法進行反應(yīng)。當反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)快速層析純化后，將1mmol所得固體溶于20ml二噁烷，并于室溫和攪拌下加入1.2ml1NNaOH水溶液。5h后用1N鹽酸水溶液將溶液酸化至pH2，并用水稀釋至標題化合物完全析出。再經(jīng)過濾和風干后得到細粉狀標題化合物。
實施例9-1由化合物36制備化合物31于室溫和攪拌下將1.2mmol TEA和1.1mmol所選擇的試劑(見表)加至1mmol GE2270因子A3的合適酰胺衍生物(按照前面實施例所述的方法制備)的10ml 10%甲醇的氯仿溶液中。20min后“真空”蒸發(fā)溶劑，并用5%Na2CO3水溶液處理殘余物。所得固體經(jīng)過濾、再用5%Na2CO3和水洗滌，再溶于10ml甲醇中。向該溶液中加入0.5ml水和0.1mmol對-甲苯磺酸，并將反應(yīng)混合物于室溫下攪拌過夜。真空濃縮溶液至少體積(約2ml)并加水沉淀標題化合物，風干后得到細粉狀標題化合物。
實施例9-2由化合物37制備化合物38于室溫和攪拌下，將9.2mmol乙酸、9.2mmol乙酸鈉和0.506mmol所選擇的試劑(見表Ⅱ)加至0.23mmol GE2270因子A3的合適酰胺衍生物(按前面實施例所述方法制備)的40ml乙醇溶液中。2h后加入0.46mmol NaBH4(Fluka)并于同一溫度下攪拌過夜。蒸發(fā)溶劑，得到粗產(chǎn)物，并用10ml 1N Hcl洗滌，過濾和風干。然后固體經(jīng)硅膠60(230-400目ASTM-Merck)快速層析純化，用0-10%甲醇的二氯甲烷溶液洗脫。合并含有標題化合物的甲基酯(中間產(chǎn)物)的部分。蒸發(fā)溶劑，將產(chǎn)生的固體再溶于2ml二噁烷中，并于室溫下用1.2mol過量的1N NaOH處理過夜。蒸發(fā)溶劑，將得到的固體與1∶1的乙酸乙酯和甲醇的混合液一起研磨而進一步純化，得到細粉狀的標題化合物。
方法D一起始物GE2270因子A2與所選擇的胺反應(yīng)實施例10制備化合物35
將1mmol GE2270因子A2(按照歐洲專利申請公開號406745所述的方法制備)溶于10ml氨飽和的甲醇溶液中。該溶液于室溫下放置3天后，“真空”蒸發(fā)溶劑。殘余物溶于2ml甲醇中，并用水沉淀標題化合物。過濾并風干。與乙醚一起研磨后得到細粉狀標題化合物。
方法E-制備本發(fā)明化合物的鹽實施例11制備化合物19的精氨酸鹽在攪拌下將423mgL-精氨酸(2.42mmol)的120ml水溶液加至3g化合物19(2.42mmol)的180ml二噁烷的懸浮液中，并冷凍干燥渾濁溶液以得到所需的鹽。
方法F-起始物GE2270成分C2a(即其中R為甲氧基甲基、R1為甲基、R4為羥甲基并且W為COOH的式Ⅱ化合物)與所選擇的含有其它活性官能團(均被保護)的胺反應(yīng)，隨后脫去保護基團。
實施例12制備化合物42按照實施例3所述的方法并且用起始物GE2270成分C2a代替因子A3進行反應(yīng)。
方法G-方法F中所述的起始物GE2270成分C2a與所選擇的含有未被保護的酸殘基的胺反應(yīng)實施例13制備化合物42按照實施例5所述方法用起始物GE2270成分C2a代替因子A3進行反應(yīng)。
方法H-起始物GE2270成分D1(即其中R和R1為氫、R4為甲基并且W為COOH的式Ⅱ化合物)與所選擇的含有其它活性官能團(均被保護)的胺反應(yīng)，隨后脫去保護基團。
實施例14制備化合物43按照實施例3所述方法并且用起始物GE2270成分D1代替因子A3進行反應(yīng)。
方法Ⅰ-方法H中所述的起始物GE2270成分D1與所選擇的含有未被保護的酸殘基的胺反應(yīng)實施例15制備化合物43按照實施例5所述的方法并且用起始物GE2270成分D1代替因子A3進行反應(yīng)。
方法J-起始物GE2270成分D2(即其中R為羥甲基、R1和R4為甲基、W為COOH的式Ⅱ化合物)與所選擇的含有其它活性官能團(均被保護)的胺反應(yīng)，隨后脫去保護基團。
實施例16制備化合物44按照實施例3所述的方法并且用起始物GE2270成分D2代替因子A3進行反應(yīng)。
方法K-方法J中所述的起始物GE2270成分D2與所選擇的含有未被保護的酸殘基的胺反應(yīng)。
實施例17制備化合物44按照實施例5所述的方法并且用起始物GE2270成分D2代替因子A3進行反應(yīng)。
方法L-抗菌素GE2270的較少成分(C2a、D1、D2和E)的混合物(起始物)與所選擇的含有其它活性官能團(均被保護)的胺反應(yīng)，隨后脫去保護基團。
實施例18按照實施例3所述的方法并且用抗菌素GE2270的較少成分(C2a、D、D2和E)的混合物(起始物)代替因子A3和6-氨基己酸甲酯鹽酸鹽(Fluka)進行反應(yīng)。Rt(min)參見HPLC分析部分所述的HPLC方法M。
當Y＝-NHCH2CH2CH2CH2CH2COOCH3時，GE2270因子C2a、D1、D2和E的Rt(min)分別為43.43、39.42、42.29和37.41。
當Y＝-NHCH2CH2CH2CH2CH2COOH時，GE2270因子C2a、D1、D2和E的Rt(min)分別為17.23、15.76、16.64和15.13。
方法M-所選擇的抗菌素GE2270的較少成分(C2a、D1、D2和E)的混合物(起始物)與所選擇的含有未被保護的胺反應(yīng)實施例19按照實施例5所述的方法，并且用所選擇的抗菌素GE2270的較少成分(C2a、D1、D2和E)的混合物(起始物)代替因子A3和6-氨基己酸(Fluka)進行反應(yīng)Rt(min)參見HPLC分析部分所述的方法M.GE2270因子C2a、D1、D2和E的Rt(分)分別為17.23、15.76、16.64和15.13。
制備起始物1.以下起始物購自Fluka(Fluka，Chemika-Biochemika，Buchs，Switzerland)甘氨酸乙酯鹽酸鹽，L-蘇氨酸甲酯鹽酸鹽，L-酪氨酸甲酯鹽酸鹽，L-亮氨酸甲酯鹽酸鹽，L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽，L-甲硫氨酸甲酯鹽酸鹽，L-脯氨酸甲酯鹽酸鹽，Na-Cbz-L-賴氨酸，4-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽，6-氨基己酸甲酯鹽酸鹽，6-氨基己酸，4-(甲基氨基)苯甲酸，哌啶-4-羧酸，N-甲基-D-葡糖胺，D(+)-葡糖胺鹽酸鹽，2-二甲基氨基乙胺，氨基乙醛縮二甲醇，
β-丙氨酸乙酯鹽酸鹽。
2.以下起始物購自Sigma(Sigma，BiochemicalsOrganicCompounds，St.LouisU.S.A.)Nδ-Cbz-L-鳥氨酸，L-天冬氨酸二甲酯鹽酸鹽。
3.以下起始物購自Aldrich(Aldrich，CatalogoProdottidiChimicaFine，Milano，Itanly)L-脯氨酰胺，?；撬幔?-氨基-1-丙烷磺酸，3-氨基丙基膦酸，4-氨基-1-芐基哌啶。
4.為制備抗菌素GE2270因子A、B1、B2、C1、C2、C2a、D1、D2和E而生產(chǎn)抗菌素GE2270。
將玫瑰游動雙孢菌ATCC53773的培養(yǎng)物在燕麥粉瓊脂斜面上于28-30℃培養(yǎng)兩周。然后用于接種500ml燒瓶內(nèi)含100ml具有如下組成的種子培養(yǎng)基淀粉20g/l聚胨5g/l酵母浸膏3g/l牛浸膏2g/l大豆粉2g/l碳酸鈣1g/l蒸餾水(定容)100ml
(滅菌前調(diào)節(jié)pH至7.0)將燒瓶在旋轉(zhuǎn)振蕩器(200rpm)上于28-30℃培養(yǎng)92h。然后用所得的培養(yǎng)物接種4l發(fā)酵罐內(nèi)含有的培養(yǎng)基，并于攪拌(約900rpm)和通氣(約1標準升/容積/分的空氣)下將培養(yǎng)物于28-30℃培養(yǎng)48h。
將所得的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至含有50l下列培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中淀粉20g/l胨2.5g/l水解的酪蛋白2.5g/l酵母浸膏3g/l牛浸膏2g/l大豆粉2g/l碳酸鈣1g/l蒸餾水適量(滅菌前將pH調(diào)至7.0)并于28-30℃培養(yǎng)約72h。
利用生長于Davis基本培養(yǎng)基上的枯草芽孢桿菌ATCC6633。通過紙盤瓊脂檢測法監(jiān)測產(chǎn)生的抗菌素。于35℃培養(yǎng)過夜后對抑制區(qū)進行評估。
4a)制備抗菌素GE2270粗品收集上面所獲得的發(fā)酵物質(zhì)(50l)并用過濾器(Clarcell)過濾。
盡管也可從濾液中得到一定數(shù)量的抗菌素GE2270，但它主要存在于菌絲體中。
調(diào)節(jié)濾液的pH至約7.0，并用乙酸乙酯(50l)萃取。離心分離出有機相，并將其減壓濃縮至小體積。然后用石油醚處理所得的油狀殘余物以析出抗菌素GE2270粗品。再經(jīng)過濾收集和干燥后得到415mg抗菌素GE2270粗品。
用20l甲醇萃取菌絲體兩次，所收集的萃取液經(jīng)減壓濃縮后得到水溶性殘余物，用乙酸乙酯將其萃取兩次。加入石油醚，從濃縮的有機相中析出抗菌素GE2270粗品(6.06g)。
4b-1分離抗菌素GE2270因子A將按照上面所述的方法從菌絲體獲得的粗品(3g)溶于四氫呋喃，并在硅膠(230-400目)存在下減壓濃縮。收集所得的固體殘余物，并加到由300g硅膠(230-400目)和二氯甲烷(CH2Cl2)裝填的層柱上。該柱子首先用二氯甲烷(2l)展層，接著用1.5l具有如下比例的二氯甲烷與甲醇的混合液展層98/2;96/4，94/6，92/8，90/10和88/12(V/V)。
收集各個部分，通過TLC、HPLC或?qū)莶菅挎邨U菌的抗菌作用等進行分析，并按其抗菌素含量進行收集。
減壓濃縮所收集的含有抗菌素GE2270因子A的部分，得到油狀殘渣，然后用四氫呋喃將其溶解。
向該溶液中加入石油醚以析出抗菌素GE2270因子A(600mg)。
4b-2分離抗菌素GE2270較少成分的混合物通過與每種單個成分的分析樣品進行HPLC比較，確定一個尤其富含C2a、D1D2和E成分的代表性混合物。
Rt(min)參見HPLC分析部分所述的HPLC方法M，且GE2270因子C2a、D1、D2和E的Rt(min)分別為20.55、17.43、18.17和16.61。
該部分減壓濃縮物為一油狀殘余物，將其重新溶于四氫呋喃并用石油醚沉淀后得到白色粉末。
4c)分離和純化抗菌素GE2270因子B1、B2、C1、C2、D1、D2和E。
利用裝有Nucleosil C18(用十八烷基硅烷使硅膠活化)(5μm)的250×20mm柱進行制備性HPLC，并用A相(CH2CN∶四氫呋喃∶40mMHCOONH4＝10∶40∶20)和B相(CH2CN∶四氫呋喃∶40mM HCOONH4＝10∶10∶80)的混合液進行洗脫，從上面所得的粗混合物中分離和純化抗菌素GE2270因子D1、D2和E。將抗菌素混合物(6mg)溶于3mlB相和1mlA相，并注入HPLC柱中，用26∶74的A相與B相的混合液按14ml/min的流速洗脫。根據(jù)254nm處的UV吸收圖譜收集洗脫成分。合并在隨后層析時具有同一含量的部分，并減壓濃縮以除去CH3CN。紙盤檢測法表明殘余溶液具有抗金黃色葡萄糖球菌的作用。將這些溶液至少凍干三次，從HPLC相中完全除去HCOONH4緩沖液殘余物。
產(chǎn)量如下抗菌素GE2270因子E，11mg;抗菌素GE2270因子D1，12mg;抗菌素GE2270因子D2，10mg。
4d)含有抗菌素GE2270因子C2a與其它GE2270因子純化混合物的分離合并6次重復發(fā)酵制得的粗GE2270因子并溶于12l CH2Cl2∶甲醇(93∶7)。過濾除去不溶物，并將含有抗菌素復合物的溶液加至用CH2Cl2∶甲醇(93∶7)平衡過的13mg(230-400目)硅膠柱上。用CH2Cl2∶甲醇(93∶7)從柱子上洗脫出抗菌素GE2270因子C2a。合并含有本發(fā)明抗菌素的部分(HPLC分析)，減壓濃縮并干燥，得到23.5g抗菌素GE2270因子C2a及其它較少因子的混合物。
在用二氯甲烷(CH2Cl2)平衡過的含有400g硅膠(230-400目)的柱子上，將部分上述制品(5.5g)通過快速層析再次純化。首先用二氯甲烷(1l)展層，然后用以下比例的二氯甲烷/甲醇系統(tǒng)混合液展層96/4(3l);94/6(1l);92/8(2l);90/10(6l)和88/12(4l)。
收集并濃縮主要含GE2270因子C2a(HPLC分析)的部分。加入石油醚后沉淀出抗菌素制品(646mg)。
4e)分離純的抗菌素GE2270因子C2a從上述制品中通過制備性HPLC使主要含抗菌素GE2270因子C2a的純化混合物進一步純化。
將部分上述抗菌素制品(10mg)溶于1mlA相(CH3CN∶四氫呋喃∶40mM HCOONH4-40∶40∶20)和1mlB相(CH3CN∶四氫呋喃∶40mM HCOONH4-10∶10∶80)并注入HPLC250×20mm Hibar柱(E.Merck;Darmstadt F.R.Germany)，該柱子中填有用40%A相和60%B相的混合液平衡過的7μm Nucleosil C18(用十八烷基硅烷使硅膠活化)。按15ml/min的流速在22min內(nèi)用40-50%A相進行線性梯度洗脫。于254nm處進行UV檢測。隨后將經(jīng)過10次層析的含有本發(fā)明純抗菌素的部分合并，并通過減壓濃縮除去CH3CN。用水沉淀出抗菌素GE2270因子C2a。離心收集沉淀物，再經(jīng)蒸餾水洗滌兩次和真空干燥后得到66mg純抗菌素。
5.制備抗菌素GE2270因子A2將抗菌素GE2270因子A(按上述方法制備)(86mg)溶于17ml95%乙醇和1.7ml乙酸。于60℃保溫24小時后，所產(chǎn)生的溶液用0.1M磷酸鈉調(diào)節(jié)至pH7.5。通過減壓蒸發(fā)除去乙醇，水溶性殘余物用乙酸乙酯(100ml)萃取兩次。減壓濃縮有機相，得到一固體殘余物，將其用四氫呋喃溶解后，再加入石油醚使其沉淀。得到含有少量抗菌素GE2270因子A和A1的抗菌素GE2270因子A2(62mg)。通過下面的HPLC可獲得純的抗菌素GE2270因子A2。
將10mg上述粗產(chǎn)物溶于四氫呋喃中，用水稀釋至溶解度的限度后注入HPLC系統(tǒng)，該系統(tǒng)含有填充了NucleosilRC18(5μm)逆相硅膠(Stacroma
)的柱子，以約15ml/min的流速用64%-93%B相在A相中的溶液進行線性梯度洗脫(20min)。該系統(tǒng)中，A相為18mM磷酸鈉(pH7.2)和乙腈的混合液(90∶10(V/V))，B相為18mM磷酸鈉(pH7.2)和乙腈的混合液(40∶60(V/V))。收集5次連續(xù)層析的部分，于330nm處進行UV監(jiān)測。合并含有大量抗菌素GE2270因子A2的部分(對應(yīng)于洗脫液UV圖譜中的主峰)，減壓濃縮得到水相，并用乙酸乙酯萃取兩次。然后用蒸餾水洗滌該有機相以除去殘余的無機鹽，濃縮后以便析出固體殘余物，再將其溶于四氫呋喃并用石油醚再次沉淀，得到純的抗菌素GE2270因子A2(45mg)。
歐洲專利申請公開號406745敘述了制備抗菌素GE2270因子A主要反應(yīng)產(chǎn)物的抗菌素GE2270因子A2的其它替代方法。
6.制備抗菌素GE2270因子A3于室溫下將抗菌素GE2270因子A2在0.5M碳酸鈉中保溫1小時。然后用冷水稀釋反應(yīng)混合物，并用鹽酸調(diào)至pH6.5。中和溶液含有作為主要反應(yīng)產(chǎn)物的抗菌素GE2270因子A3。用乙酸乙酯從水相中萃取該抗菌素，然后通過加入石油醚從濃縮的有機相中沉淀出該抗菌素。
通過如下所述的柱層析得到純的抗菌素GE2270因子A3。
將1.5g粗品GE2270A3溶于60ml甲醇與二氯甲烷混合液(1/1(V/V))中，并減壓蒸發(fā)溶劑使粗品GE2270A吸附在硅膠(75-230目)上。然后將固體殘余物加到經(jīng)二氯甲烷平衡過的硅膠(75-230目)柱(柱高40cm)的頂端。按照如下順序用甲醇在二氯甲烷中的混合液洗柱1)2%甲醇(450ml);2)5%甲醇(500ml);3)10%甲醇(600ml);4)15%甲醇(500ml);5)20%甲醇(500ml);6)30%甲醇(250ml)。
收集各部分并通過TLC和對枯草芽孢桿菌ATCC6633的細菌學檢測法進行監(jiān)測?？咕谿E2270因子A3通常存在于含有約15-20%甲醇的洗脫液中。
合并含有所需產(chǎn)物的部分并減壓濃縮。向殘余物中加入石油醚后沉淀出抗菌素GE2270因子A3(854mg純產(chǎn)物)。
7.由抗菌素因子D1、D2和C2a制備合適的起始物基本按照上面5和6中所述的方法，但用抗菌素GE2270的單個因子(C2a、D1、D2和E)為起始物代替因子A，可獲得合適的式Ⅲ起始物，其中W為COOH或活性酯，R為氫或CH2OH，R1為CH3或氫，R4為羥甲基或甲基。
7a)由抗菌素GE2270的較少成分(C2a、D1、D2和E)的混合物制備合適的起始物基本按照上面5和6所述的方法，但用較少成分(C2a，D1、D2和E)的混合物為起始物代替單個因子A，可獲得合適的式Ⅲ起始物，其中W為COOH或活性劑，R、R1和R4對于C2a分別為甲氧基甲基、甲基和羥甲基，對于D1分別為氫、氫和甲基，對于D2分別為羥甲基、甲基和甲基，對于E分別為羥甲基、氫和甲基。
Rt(min)參見HPLC分析部分中所述的HPLC方法M。
當W為活性酯時，GE2270因子C2a、D1、D2和E的Rt(min)分別為22.51、19.80、20.41、20.41和18.9。
當W為COOH時，GE2270因子C2a、D1、D2和E的Rt(min)分別為12.99、10.38、11.08和9.03。
8.制備甘氨酰-Nε-Cbz-L-賴氨酸三氟乙酸酯于0℃將4.8mlDPPA(22mmol)加至充分攪拌的3.5gBOC-甘氨酸(Fluka)(20mmol)和7.28gNε-Cbz-L-賴氨酸甲酯鹽酸鹽(Fluka)(22mmol)的50ml無水DMF溶液中。于0℃在10-15min內(nèi)將5.8ml TEA(42mmol)的50ml無水DMF溶液加至上述溶液中。于0℃繼續(xù)攪拌2h，然后于室溫攪拌過夜。用250ml甲苯和500ml乙酸乙酯稀釋反應(yīng)混合物，并用1N鹽酸(x3)、水、NaHCO3飽和溶液和鹽水洗滌。經(jīng)Na2SO4干燥蒸發(fā)溶劑后得到9.7g稠油狀物，用任何方法都不能使其結(jié)晶。該油狀物的NMR與BOC-甘氨酸-Nε-Cbz-L-賴氨酸甲酯的結(jié)構(gòu)非常一致。
將該油狀物溶于200ml丙酮/二噁烷(1∶1)，并于0℃在30min內(nèi)于攪拌下將22ml 1N NaOH加至其中。該反應(yīng)物于室溫下攪拌45分鐘，用300ml冷水稀釋，用25ml 1N鹽酸酸化并用氯仿(x3)和乙酸乙酯(x3)萃取。經(jīng)Na2SO4干燥和蒸發(fā)溶劑后得到9.4g樹膠狀物，用任何方法均不能使其結(jié)晶。該樹膠狀物的NMR與BOC-甘氨酰-Nε-Cbz-L-賴氨酸的結(jié)構(gòu)完全一致。
用20ml冷三氟乙酸(TFA)處理該樹膠狀化合物。于室溫下該反應(yīng)混合物，直至所有成分均成為溶液。冷卻和真空下使溶液減至小體積，然后加入乙醚以使標題化合物沉淀。得到9.6g甘氨酸-Nε-Cbz-L-賴氨酸三氟乙酸酯，為白色粉末。NMR與其結(jié)構(gòu)完全一致。
9.制備L-酪氨酰-L-脯氨酰胺于0℃將0.48mlDPPA(2mmol)加至充分攪拌的538mgBOC-L-酪氨酸(Fluka)(2mmol)，228.3mgL-脯氨酰胺(Aldrich)(2mmol)和168mgNaHCO3的5ml無水DMF溶液中。于室溫下攪拌反應(yīng)24h，然后用50ml水稀釋并用氯仿(x3)萃取。用水洗滌有機相，經(jīng)Na2SO4干燥，蒸發(fā)溶劑后得到-油狀物。通過硅膠60(230-400目ASTM-Merck)快速層析進行純化，并用己烷/丙酮(2∶3)洗脫。得到420mgBOC-L-酪氨酰-L-脯氨酰胺，為白色固體。NMR與其結(jié)構(gòu)一致。
將所得固體溶于6ml乙酸乙酯，并在4ml3N鹽酸存在下于室溫攪拌48h。然后將反應(yīng)混合物真空蒸發(fā)干燥，并將殘余物再溶于乙醇中，用乙醚沉淀，得到302mgL-酪氨酰-L-脯氨酰胺的白色粉末。NMR與結(jié)構(gòu)完全一致。
10.制備8-氨基辛酸甲酯和11-氨基十一烷酸甲酯對-甲苯磺酸鹽將40mmol所選擇的氨基酸(Fluka)和15.2g對-甲苯磺酸-水合物(Fluka)(80mmol)的200ml甲醇溶液回流過夜。然后真空蒸發(fā)溶劑并將殘余物再溶于乙醚。一段時間之后標題化合物定量地結(jié)晶出來。這兩個化合物的NMR與其結(jié)構(gòu)一致。
11.制備5-氨基戊基膦酸將3.48g5-氨基-1-戊醇(Fluka)(33.7mmol)和5.0g鄰苯二酐(Fluka)(33.7mmol)一起于180℃熔融。一直維持該溫度90min，直至無水產(chǎn)生為止。然后將反應(yīng)冷卻至室溫，油狀混合物在硅膠60(230-400目ASTM-Merck)上層析，用2%甲醇的氯仿溶液洗脫，得到5.9g純油狀物。NMR與其結(jié)構(gòu)一致。
向5.9g油狀中間產(chǎn)物(25mmol)中分批加進1.6mlpBr3(17mmol)，以控制放熱反應(yīng)。將反應(yīng)混合物于100℃加熱1.5h后倒入碎冰塊中，過濾所分離的固體物質(zhì)并讓其風干過夜。得到6.6g純的溴代中間物。其質(zhì)譜數(shù)據(jù)與計算的分子量一致。
將500mg純的溴代中間物(1.69mmol)和140mg亞磷酸三乙酯(Fluka)(0.84mmol)一起于150℃加熱約1h，然后在同樣溫度下按照30min的間隔將另外三份140mg的亞磷酸三乙酯分批加入。當所有起始物消失后，蒸餾掉過量的亞磷酸三乙酯。將粗產(chǎn)物在硅膠60(230-400目ASTM-Merch)上快速層析純化，并用2%甲醇的二氯甲烷溶液洗脫。得到468mg所需亞磷酸二乙酯，為粘稠狀物。NMR確證其結(jié)構(gòu)。
于室溫下將3ml 0.2M肼的甲醇溶液與468mg亞磷酸二乙酯中間物反應(yīng)過夜。過濾除去析出的鄰苯二甲酰肼，并將殘余的溶液真空蒸發(fā)干燥。殘余物溶于1N鹽酸中，溶液用乙酸乙酯洗滌、NaOH堿化并用正丁醇萃取數(shù)次。再經(jīng)Na2SO4干燥丁醇相并蒸發(fā)干燥后，得到175mg粘稠的油狀物，其NMR與所需產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)一致。
將175mg5-氨基戊基膦酸二乙酯在0.6ml濃鹽酸中回流20h。然后在正丁醇存在下通過共沸蒸餾將酸性溶液蒸發(fā)至干燥。經(jīng)NMR確證，玻璃狀油為5-氨基戊基膦酸。
12.制備5-(5-氨基戊基)四唑于0℃及攪拌條件下，將12.48ml氯甲酸芐酯(Fluka)(88mmol)滴加至10ml6-氨基己腈(Fluka)(80mmol)和13.3mlTEA(96mmol)的80ml四氫呋喃溶液中。繼續(xù)于室溫下攪拌2h，并真空蒸發(fā)溶劑。殘余物溶于乙酸乙酯中，并用1N鹽酸和水洗滌，再經(jīng)Na2SO4干燥和蒸發(fā)溶劑后得到19.6g漿狀物，其NMR與結(jié)構(gòu)一致。
在793mg疊氮化鈉(12.2mmol)和834mg三乙胺鹽酸鹽(6.1mmol)存在下，將1g被保護的6-氨基己腈(4.06mmol)的40ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液在氬氣中于150℃加熱。4h后，用120ml水稀釋反應(yīng)混合物。并用10%鹽酸小心酸化至pH1(注意形成azotidricacid)。用乙酸乙酯萃取溶液，再用10%NaOH水溶液(x2)萃取有機相，所得的堿性溶液用乙醚洗滌、用濃鹽酸酸化并用乙酸乙酯萃取(x3)。干燥并蒸發(fā)有機相后得到一漿狀物。用甲醇/水結(jié)晶后得到260mg細粉。NMR和質(zhì)譜確證了其結(jié)構(gòu)。
于室溫下將250mgN-保護的氨基四唑(0.86mmol)用5ml苯硫基甲烷(43.25mmol)和17.5ml三氟乙酸處理3小時。在冷卻下真空濃縮三氟乙酸，并加入乙醚以析出標題化合物，它為三氟乙酸鹽。NMR和質(zhì)譜確證了它的結(jié)構(gòu)。
13.制圖N-〔3，4-二-(O-四氫吡喃)苯甲?！?噻唑烷-2-硫酮在0.325ml濃H2SO4存在下，將4.62g，3，4-二羥基苯甲酸(Fluka)(30mmol)的40ml甲醇溶液回流24小時。冷卻溶液至室溫后，加入一定量的固體NaHCO3，并真空蒸發(fā)溶劑。殘余物溶于乙酸乙酯中，用水洗滌，再經(jīng)Na2SO4干燥蒸發(fā)溶劑后得到漿狀物，用乙酸乙酯/己烷將其結(jié)晶，得到3.53g白色結(jié)晶。
于室溫和攪拌下，將9.1ml二氫吡喃(Fluka)(0.1mol)和250mg對-甲苯磺酸吡啶鎓(1mmol)加至1.68g3，4-二羥基苯甲酸甲酯(10mmol)的4ml乙酸乙酯和25ml二氯甲烷溶液中。4天后，反應(yīng)混合物用NaHCO3飽和溶液洗滌，用Na2SO4干燥，再經(jīng)蒸發(fā)干燥后得到3.36g油狀物，未經(jīng)進一步純化它可直接用于下一步驟中。
將上面反應(yīng)中所得的粗產(chǎn)物溶于40ml丙酮，并向該攪拌溶液中加入20ml水、2.76gK2CO3(20mmol)和10ml 1N NaOH水溶液(10mmol)，于室溫下繼續(xù)攪拌7天。真空蒸發(fā)丙酮并用乙酸乙酯洗滌殘余的水相。然后將水相轉(zhuǎn)移至含有等體積氯仿的錐形瓶中，冷卻至0℃，并在激烈攪拌下用50ml 1N鹽酸小心酸化。然后再用氯仿萃取水相三次，合并后的有機層經(jīng)0.2%甲酸銨洗滌、Na2SO4干燥和蒸發(fā)干后得到漿狀物，加入己烷結(jié)晶后，得到2.34g白色固體，NMR與其結(jié)構(gòu)相符。
于0℃向644mg苯甲酸中間產(chǎn)物(2mmol)的14ml乙酸乙酯/二氯甲烷(5∶2)攪拌溶液中依次加入333mg2-噻唑啉-2-硫醇(Fluka)(2.8mmol)、577mgN，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(Fluka)(2.8mmol)和35mg4-二甲基氨基吡啶。繼續(xù)于室溫下攪拌過夜，過濾除去析出的二環(huán)己基脲并真空蒸發(fā)黃色溶液后得到一黃色油狀物，在硅膠60(230-400目ASTM-Merck)快速層析(用25%丙酮的己烷溶液洗脫)純化該油狀物。用丙酮/己烷結(jié)晶得到700mg黃色結(jié)晶。NMR和IR確證該化合物就是標題化合物。
14.制備N1-N8-二-叔-丁氧羰基亞精胺在攪拌下將5.8g亞精胺(Aldrich)(40mmol)和40ml脫氣THF溶液冷卻至0℃，然后在氬氣下將19.72gBOC-ON(Aldrich)(80mmol)的60ml脫氣THF溶液在1h內(nèi)滴加至其中。然后將反應(yīng)于室溫下攪拌過夜，接著蒸發(fā)至干燥。殘余物溶于乙醚中，用1N NaOH(×4)和水(×4)洗滌，Na2SO4干燥，并將溶劑真空濃縮至小體積。加入乙醚后，析出11g白色粉末，通過NMR確證它就是標題化合物。
15.制備N-叔-丁氧羰基亞丙基二胺于室溫和攪拌下，向溶于10ml二噁烷、10ml水和3.3ml三乙胺混合液的2g3-氨基丙腈富馬酸鹽(Aldrich)(15.6mmol)溶液中加入4.2gBOC-ON(Aldrich)(17.2mmol)，3小時后，再用水稀釋反應(yīng)混合物，并用二氯甲烷(×3)萃取。合并有機層，用1N NaOH水溶液(×3)和水(×3)洗滌，Na2SO4干燥并蒸干。殘余的油狀物溶于乙醚中并用己烷沉淀后得到2.2g白色粉末。
將1gN-BOC-保護的中間產(chǎn)物(5.9mmol)的7ml 1N乙醇NaOH溶液在130mg阮內(nèi)鎳(50%的水漿，pH＞9)(Aldrich)于40psi氫化40h。過濾除去阮內(nèi)鎳，并蒸發(fā)溶劑至干燥。殘余物溶于乙酸乙酯中，再經(jīng)1N NaOH水溶液洗滌、Na2SO4干燥和真空除去溶劑，得到950mg無色油狀物，它在放置后固化。經(jīng)NMR確證它就是標題化合物。
16.制備3-(2-氨基乙硫基)丙酸甲酯三氟乙酸鹽于室溫及攪拌條件下，將1.4g二-叔丁基二碳酸酯
(Aldrich)(6.48mmol)的5ml CH2Cl2溶液加至0.5g半胱胺(Fluka)(6.48mmol)的5ml CH2Cl2溶液中。30min后，蒸發(fā)有機溶劑，并將粗品溶于5ml無水乙醇中。然后依次向該乙醇溶液中加入2.7ml TEA(19.1mmol)和1.07ml3-溴丙酸甲酯(Fluka)(9.57mmol)。反應(yīng)在約30min內(nèi)完成。真空除去乙醇，并用15ml氯仿代替。再經(jīng)水洗滌有機相、Na2SO4干燥和蒸發(fā)溶劑后，得到一油狀物。最后于0℃將其用1ml三氟乙酸處理5min。蒸干后得到270mg淺黃色油狀物。NMR和IR確證它就是標題化合物。
17.制備6-氨基-2(E)-己烯酸于室溫和攪拌下，將1.5ml苯甲酰氯(Fluka)(12.9mmol)的5mlCH2Cl2溶液在30min內(nèi)加至2ml4-氨基-丁醛縮二乙醇(Fluka)(11.6mmol)和3.6ml TEA(25.6mmol)的5mlCH2Cl2溶液中。1h后，用10ml以上的CH2Cl2稀釋反應(yīng)物，用水洗滌，用Na2SO4干燥有機相，并將體調(diào)至20ml。然后在1.6ml TEA(11.5mmol)、10.2g二-叔丁基二碳酸酯(Aldrich)(46.8mmol)和1.4g4-二甲基氨基吡啶(Fluka)(11.5mmol)存在下，于室溫和氬氣中將所得溶液反應(yīng)3天。除去溶劑后得到棕色油狀物，在硅膠60(230-400目ASTM-Merck)上快速層析純化(用20%乙酸乙酯的正己烷溶液洗脫)，得到1.6gN，N-去保護的4-氨基丁醛縮二乙醇，為無色油狀物。NMR確證了它的結(jié)構(gòu)。
然后將所得的油狀物溶于5mlTHF中，并在室溫下用5ml 1N HCl處理3h。真空除去THF，殘余溶液用氯仿洗滌(2ml×3)，然后用NaHCO3溶液和水洗滌有機相，經(jīng)Na2SO4干燥，蒸干后得到一油狀物，未經(jīng)進一步純化將其直接用于下一步驟。
于0℃和氬氣條件下向160mg60%NaH(4mmol)的5ml無水THF懸浮液中加入0.837ml三乙基膦?；宜狨?Fluka)(4.3mmol)。30min后，加入上面所得的醛(1.17g)(4.02mmol)的無水THF(2ml)溶液，并將溫度升至室溫。將反應(yīng)攪拌過夜，然后于0℃加入50mg以上的60%NaH。在室溫下再經(jīng)過2h后，用稀鹽酸(10ml)處理反應(yīng)混合物，并用乙酸乙酯(5ml×3)萃取。合并有機相，用水洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥，并蒸干。粗品經(jīng)硅膠60(230-400目ASTM-Merck)快速層析并用15%乙酸乙酯的正己烷溶液洗脫，得到765mg漿狀物。NMR確證它就是所需的產(chǎn)物，其E構(gòu)型中具有雙鍵(J＝16Hz)。
在室溫及攪拌條件下，將6.15ml 1N LiOH(6.15mmol)加至739mg前面所獲得的不飽和酯(2.05mmol)的10mlTHF溶液中。當起始物消失后，將反應(yīng)混合物于30℃(浴溫)下真空濃縮。用1NHCl酸化水溶液至pH2，然后用乙酸乙酯萃取。合并后的有機相用Na2SO4干燥，再經(jīng)過濾和蒸發(fā)溶劑后得到一油狀物，它在真空下靜置后固化。NMR和MS確證它就是6-N-BOC-氨基-2(E)-己烯酸。
于0℃在純?nèi)宜嶂忻撊-BOC保護得到標題化合物，接著與合適的GE2270起始物偶聯(lián)。
18.制備3-(2-氨基乙氧基)丙酸三氟乙酸鹽在-18℃、攪拌和氬氣下，將3.88ml1.6M丁基鋰(Fluka)(6.22mmol)溶液加至1gN-BOC-乙醇胺(6.22mmol)〔按照標準方法由乙醇胺(Fluka)制備〕的10ml無水THF溶液中。30min后，加入1.3g3-溴丙酸叔丁酯〔按照標準方法由B-溴丙酸(Fluka)制得〕(6.22mmol)，將溫度升至室溫，并在該溫度下攪拌所產(chǎn)生的混合物20h。用水稀釋后，用正己烷(5ml×2)萃取反應(yīng)混合物，除去溶劑后得到粗品。再經(jīng)硅膠60(230-400目ASTM-Merch)快速層析純化(用20%乙酸乙酯的正己烷溶液洗脫)，得到1.43g油狀物。NMR確證它就是偶聯(lián)化合物。
將偶聯(lián)化合物完全去保護后，緊接著在攪拌和室溫下將其加至合適的GE2270起始物的三氟乙酸中，并攪拌約5min，真空除去三氟乙酸后得到標題化合物。
權(quán)利要求
1.具有如下通式Ⅰ的抗菌素GE2270的酰胺衍生物以及藥用的加成鹽
其中R代表氫、羥甲基或甲氧基甲基；R1代表氫或甲基；Y代表下式基團，
其中R2代表氫、(C1-C4)烷基、氨基(C2-C4)烷基、(C1-C4)烷基氨基-(C1-C4)烷基或二-(C1-C4)烷基；R3代表氫；帶有1～3個以下取代基的線性或帶支鏈的(C1-C4)烷基；羧基；磺基；膦酰基；可被低級烷氧羰基或芐氧羰基任意保護的氨基；(C1-C4)烷氧氨基(其中烷氧基部分可被羧基任意取代)；二-(C1-C4)烷基氨基、羥基、鹵素、(C1-C4)烷氧基(其中烷基部分可被羧基任意取代)；(C1-C4)烷氧羰基、巰基、(C1-C4)烷硫基(其中烷基部分可被羧基任意取代)；可被1-3個選自羧基、磺基、羥基鹵素和巰基的取代基任意取代的苯基、氨基甲酰基、(C1-C6)烷基氨基甲?；?其中烷基部分可被1-2個選自羧基、氨基、(C1-C4)烷基氨基和二-(C1-C4)烷基氨基的取代基任意取代)；二-(C1-C4)烷基氨基甲酰基(其中烷基可與相鄰的氮原子一起代表-五-七元雜環(huán)，在該雜環(huán)的一個環(huán)碳原子上可被羧基或氨基甲?；我馊〈?，而且該雜環(huán)還可任意含有選自O(shè)、S和N的另外的雜原子)；苯甲酰氨基(其中苯基可被1-3個羥基取代)；不飽和、部分飽和或完全飽和的含氮五-六元雜環(huán)，并且該雜環(huán)還可含有1-3個選自N、S和O的雜原子(其中環(huán)碳原子之一可任意地帶有羧基、磺基、羧基(C1-C4)烷基和磺基(C1-C4)烷基，且該環(huán)氮原子可被(C1-C4)烷基、羧基(C1-C4)烷基、磺基(C1-C4)烷基和芐基任意取代]；C3-C6)鏈烯基(可被羧基或磺基任意取代)；1-脫氧-1-山梨糖基；2-脫氧-2-葡糖基；完全飽和的五～七元含氮雜環(huán)[其中氮原子可被(C1-C4)烷基或芐基任意取代，且環(huán)骨架的1個或2個碳原子可帶有選自(C1-C4)烷基，羧基和磺基的取代基]；或R2和R3與相鄰的氮原子一起共同代表一完全飽和的五～七元雜環(huán)，該雜環(huán)可任意含有選自O(shè)、S和N的另外的雜原子，且在環(huán)碳原子上可任意地帶有選自(C1-C4)烷基、芐基、羧基、磺基、羧基(C1-C4)烷基和磺基(C1-C4)烷基的1個或2個取代基；R4代表氫、甲基或羥甲基；條件是，當R4為氫或羥甲基時，則R同時為甲氧基甲基，且R1為甲基。
2.按照權(quán)利要求1所述的化合物，其中R代表甲氧基甲基，且其它取代基的定義同權(quán)利要求1。
3.按照權(quán)利要求1所述的化合物，其中R代表甲氧基甲基，R1和R4代表甲基，Y代表下式基團，
其中R2為氫，R3的定義同權(quán)利要求1。
4.按照權(quán)利要求1的所述的化合物，其中R為甲氧基甲基，R1和R4代表甲基，Y為氨基，該氨基來自例如甘氨酸、鳥氨基、絲氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、賴氨酸等天然氨基酸，或來自例如甘氨酰賴氨酸、絲氨酰脯氨酸、甘氨酰脯氨酰胺、酪氨酰脯氨酰胺、蘇氨酰脯氨酰胺或亮氨酰脯氨酰胺等合成的二肽。
5.按照權(quán)利要求1所述的化合物，其中R為甲氧基甲基，R1和R4為甲基，Y為NR2R3〔其中R2為氫，R3為被選自COOH、SO3H和PO3H2的基團所取代的直鏈烷基，其碳原子數(shù)為3-12個較好，為3-7個更好〕。
6.按照權(quán)利要求1所述的化合物，其中R為甲氧基甲基，R1和R4為甲基，Y為NR2R3基團(其中R2為氫，R3為CH2CH2CH2CH2CH2-COOH)。
7.按照權(quán)利要求1所述的化合物，其中R代表氫、羥甲基或甲氧基甲基，R1代表氫或甲基，R4代表氫、甲基或羥甲基，Y代表下式基團，
(其中R2為氫，R3的定義同權(quán)利要求1)。
8.按照權(quán)利要求7所述的化合物，其中Y為氨基，該氨基來自例如甘氨酸、烏氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、賴氨酸等天然氨基酸或來自例如甘氨酰賴氨酸、絲氨酰脯氨酸、甘氨酰脯氨酰胺、酪氨酰脯氨酰胺、蘇氨酰脯氨酰胺、亮氨酰脯氨酰胺等合成的二肽。
9.按照權(quán)利要求1所述的化合物，其中R為氫、羥甲基或甲氧基甲基，R1為氫或甲基，R4為氫、甲基或羥甲基，Y為NR2R3基團(其中R2為氫，R3為被選自COOH、SO3H和PO3H2的基團取代的直鏈烷基，其碳原子數(shù)為3-12個較好，為3-7個更好)。
10.按照權(quán)利要求1所述的化合物，其中R為氫、羥甲基或甲氧基甲基，R1為氫或甲基，R4為氫、甲基或羥甲基，Y為NR2R3基團(其中R2為氫，R3為CH2CH2CH2CH2CH2-COOH)。
11.一種制備權(quán)利要求1所述化合物的方法，它包括在惰性有機溶劑中將抗菌素GE2270化合物(式Ⅱ)與所選擇的式HNR2R3胺(其中R2和R3的定義同權(quán)利要求1)反應(yīng)，
其中W代表羧基或活性酯官能團;R代表氫、羥甲基或甲氧基甲基;R1代表氫或甲基;R4代表氫、甲基或羥甲基;條件是當R4為氫或羥甲基時，R同時為甲氧基甲基，R1為甲基，并且當W為羧基時在縮合劑存在下進行。
12.按照權(quán)利要求11所述的方法，其中縮合劑系選自(C1-C4)烷基、苯基或雜環(huán)基磷酰疊氮酯，如磷酰疊氮二苯酯(DPPA)、磷酰疊氮二乙酯、磷酰疊氮二(4-硝基苯基)酯，磷酰疊氮二嗎啉基酯和磷酰氯二苯酯。
13.按照權(quán)利要求11和12所述的方法，其中相對于抗菌素起始物胺反應(yīng)物HNR2R3應(yīng)用1-2倍過量的摩爾，且反應(yīng)溫度為0-20℃。
14.應(yīng)用權(quán)利要求1-10中任一項所述的化合物作為藥物。
15.含有權(quán)利要求1-10中任一項化合物作為有效成分以及可藥用載體組成的混合物的藥用組合物。
16.應(yīng)用權(quán)利要求1-10中任一項的化合物制備用作為抗菌素藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗菌素GE2270化合物的新的酰胺類衍生物及其制備方法。該酰胺類衍生物是作用于革蘭氏陽性和陰性細菌有效的抗菌劑。
文檔編號A61P31/04GK1063110SQ92100038
公開日1992年7月29日 申請日期1992年1月3日 優(yōu)先權(quán)日1991年1月3日
發(fā)明者P·塔韋恰瓦, S·洛西爾, R·查泊蒂, E·塞爾瓦 申請人:格魯波萊佩蒂特公司