本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，具體涉及辣蓼提取物的用途及其制備方法和制劑。
背景技術：
辣蓼為蓼科蓼屬植物polygonumhydropiperl.的干燥全草，別名：柳草、蓼子草、蝙蝠草等。味辛、性溫，具有祛風利濕、散瘀止痛、解毒消腫、殺蟲止癢之功效。辣蓼在我國分布廣泛，植物資源豐富，主要化學成分有黃酮、揮發(fā)油、鞣質、三萜、糖苷等。
目前，辣蓼提取物主要應用于植物源農(nóng)藥，在植物源農(nóng)藥應用中，辣蓼對蚜蟲、粘蟲、小菜蛾、菜青蟲和稻飛虱等多種害蟲均具有拒食活性。如中國專利申請cn102210831a公開了一種復方辣蓼制劑及其用途，包括辣蓼提取物、白頭翁葉提取物、馬尾松針葉提取物和大蒜精油，該制劑對鰻弧菌、哈維氏弧菌、溶藻膠弧菌和嗜鹽弧菌具有抑菌作用，可開發(fā)相應制劑用于防治水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中發(fā)生的弧菌病。
目前對于辣蓼提取物的研究僅在于對痢疾桿菌、傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌等的抑制作用，而對于其在產(chǎn)腸毒素大腸桿菌方面的應用較少。
大腸埃希氏菌(e.coli)通常被稱為大腸桿菌，是escherich在1885年發(fā)現(xiàn)的。在相當長的一段時間內(nèi)，大腸桿菌一直被當作正常腸道菌群的組成部分，認為是非致病菌。直到20世紀中葉，才認識到一些特殊血清型的大腸桿菌對人和動物有病原性，尤其對嬰兒和幼畜(禽)，常引起嚴重腹瀉和敗血癥。根據(jù)不同的生物學特性，可以將致病性大腸桿菌分為6類:腸致病性大腸桿菌(epec)、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(etec)、腸侵襲性大腸桿菌(eiec)、腸出血性大腸桿菌(ehec)、腸黏附性大腸桿菌(eaec)和彌散粘附性大腸桿菌(daec)。
目前尚未發(fā)現(xiàn)辣蓼提取物在抑制產(chǎn)腸毒素大腸桿菌方面的應用。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在提供辣蓼提取物在抑制產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌方面的用途。
進一步地，所述產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌escherichiacolieteco78:k80，菌株編號為gim1.739。
進一步地，所述辣蓼提取物為醇提物。
進一步地，所述辣蓼提取物由以下步驟制得：
s1、脫色：取辣蓼干燥全草，粉碎，加入10～30倍量的石油醚-無水乙醇混合溶液(v/v＝15:1)回流提取15～60min，濾過，將藥渣烘干，備用；
s2、提?。簩⑸鲜鏊幵凑?:(10～50)的料液比加入60～80％乙醇，浸泡0.5～2h，回流提取1～2次，每次1～3h，合并提取液，減壓回收乙醇，靜置過夜，抽濾，減壓濃縮至浸膏狀，真空干燥，得到辣蓼干膏，研磨成細粉，即得。
本發(fā)明另一目的在于提供一種泡騰顆粒劑，含有有效量的上述的辣蓼提取物以及藥學上可接受的輔料。
進一步地，所述顆粒劑包含以下重量份數(shù)的組分：如權利要求1～4任一所述的辣蓼提取物303份、可溶性淀粉303份、乳糖151份、復合有機酸109份、碳酸氫鈉91份，聚乙二醇-600040份以及矯味劑3份。
進一步地，所述矯味劑為安賽蜜。
進一步地，所述復合有機酸由檸檬酸和富馬酸按1:1的重量比組成。
本發(fā)明另一目的在于提供一種制備上述的泡騰顆粒劑的方法，包括以下步驟：
a)辣蓼提取物的制備：
s1、脫色：取辣蓼干燥全草，粉碎，加入10～30倍量的石油醚-無水乙醇混合溶液(v/v＝15:1)回流提取15～60min，濾過，將藥渣烘干，備用；
s2、提?。簩⑸鲜鏊幵凑?:(10～50)的料液比加入60～80％乙醇，浸泡0.5～2h，回流提取1～2次，每次1～3h，合并提取液，減壓回收乙醇，靜置過夜，抽濾，減壓濃縮至浸膏狀，真空干燥，得到辣蓼干膏，研磨成細粉，即得；
b)稱取辣蓼提取物、可溶性淀粉以及乳糖，混合均勻，制成藥粉；往藥粉中加入配方量的復合有機酸、矯味劑、碳酸氫鈉以及聚乙二醇-6000，混合均勻，用適量的75％的乙醇潤濕，制粒，干燥，整粒，即得。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
1)本發(fā)明提供了一種辣蓼醇提物，其對產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌具有明顯的抑制作用，為臨床應用奠定了基礎。
2)本發(fā)明在現(xiàn)有的基礎上，對泡騰顆粒劑的制備工藝進一步改進，優(yōu)選了最佳的原料比、酸源、包和劑以及矯味劑種類，得到了一種外觀光潔、色澤均一的辣蓼泡騰顆粒劑，其制備簡單，易于臨床應用。
具體實施方式
以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下實施例。
可溶性淀粉cas號為9005-84-9；辣蓼采于湖南省衡陽市，經(jīng)廣東藥科大學楊全教授鑒定為蓼科植物水辣蓼polygonumhydropiperl.的干燥全草，標本保存于中藥學院標本館。
實施例1、一種泡騰顆粒劑
制備方法：
a)辣蓼提取物的制備：
s1、脫色：取辣蓼干燥全草，粉碎，加入20倍量的石油醚-無水乙醇混合溶液(v/v＝15:1)回流提取35min，濾過，將藥渣烘干，備用；
s2、提?。簩⑸鲜鏊幵凑?:25的料液比加入70％乙醇，浸泡1h，回流提取2次，每次2h，合并提取液，減壓回收乙醇，靜置過夜，抽濾，減壓濃縮至浸膏狀，真空干燥，得到辣蓼干膏，研磨成細粉，即得；
b)稱取辣蓼提取物、可溶性淀粉以及乳糖，混合均勻，制成藥粉；往藥粉中加入配方量的復合有機酸、矯味劑、碳酸氫鈉以及聚乙二醇-6000，混合均勻，用適量的75％的乙醇潤濕，制粒，干燥，整粒，即得。
實施例2、辣蓼對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的體外抑制作用
2.1菌液的制備
產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌菌株經(jīng)復蘇后以營養(yǎng)肉湯于搖床150rpm/h，37℃培養(yǎng)24h，以平板稀釋法配制終濃度為1.0×107cfu/ml的菌懸液。
2.2供試品藥液的制備
辣蓼按照1:35的料液比加入65％乙醇，超聲提取3次，每次40min；合并提取液，回收乙醇，濃縮至藥液濃度為0.75、1.00、1.25、1.50g(生藥)/ml，121℃高壓滅菌20min，制得無菌樣品，陽性對照藥：卡那霉素。
2.3抑菌實驗
吸取100μl菌懸液均勻涂布后，在平板上等距離放入4個經(jīng)滅菌處理的牛津杯，逐一加入100μl的供試品藥液，以5‰cmc-na作為空白對照，37℃恒溫培養(yǎng)24h。觀察抑菌情況，用游標卡尺測量抑菌圈直徑(mm)，每組重復3次，結果如表1所示。由表1數(shù)據(jù)可知，辣蓼藥液的抑菌活性與其濃度呈正相關。
表1不同濃度辣蓼醇提液的抑菌圈
注：卡那霉素濃度20μg/ml。
實施例3、辣蓼泡騰顆粒制劑的研制
3.1提取物的制備
3.1.2脫色素
辣蓼干燥全草粉碎后加入20倍量的石油醚-無水乙醇混合溶液(v/v＝15:1)回流提取30min，濾過，將藥渣烘干，備用。
3.1.3藥材浸膏制備
將脫色后的辣蓼按照1:35的料液比加入65％乙醇，浸泡藥材1h后，用微型提取機組回流提取2次，每次1h；合并兩次提取液，減壓回收乙醇，靜置過夜，抽濾，減壓濃縮至浸膏狀，真空干燥(60℃)，得到辣蓼干膏，研磨成細粉，備用。
3.1.4泡騰顆粒劑制備工藝流程
原輔料比是辣蓼浸膏：可溶性淀粉：乳糖＝2:2:1。在此基礎上，本實驗將浸膏、可溶性淀粉、乳糖研成細粉過100目篩后，按上述比例混合均勻，制成藥粉。將酸源、矯味劑、藥粉及被聚乙二醇6000(peg-6000)包裹的堿源分別粉碎，過100目篩，按照工藝設計將其混合均勻，用適量的75％乙醇潤濕、制粒，70℃干燥，整粒。
3.2物理常數(shù)測定
3.2.1泡騰時間測定
取定量辣蓼泡騰顆粒置于20倍量的蒸餾水(25℃)中，攪拌5s，待其完全溶解，記錄所需時間。
3.2.2ph測定
取定量辣蓼泡騰顆粒置于20倍量的蒸餾水(25℃)中，待其完全溶解，沒有氣泡出現(xiàn)后，用精密ph試紙測出ph值。
3.2.3發(fā)泡量測定
取定量辣蓼泡騰顆粒置于500ml量筒中，加入20倍量的蒸餾水(25℃)中，待液面到達最高水平，記錄此時的體積v1，用v1減去水的體積v2，即為發(fā)泡量v。
3.2.4堆密度測定
采用量筒法。稱取5g辣蓼泡騰顆粒，于2cm處沿漏斗壁均勻散落至100ml量筒內(nèi)，記錄落下的體積v，計算堆密度。堆密度(g/ml)＝m/v，式中m為辣蓼泡騰顆粒質量g，v為辣蓼泡騰顆粒散落至量筒內(nèi)體積ml。
3.2.5休止角測定
采用固定漏斗法測定，取漏斗固定于鐵架臺，將處于水平位置的坐標紙與最末漏斗底端相距1cm，將辣蓼泡騰顆粒沿最上面的漏斗壁緩慢倒入漏斗中，直到坐標紙上形成的顆粒圓錐體尖端剛好接觸到最末漏斗口為止，讀出圓錐底部的半徑r，計算休止角α。
3.2.6水分含量測定
用烘干法測定，取定量已研細的辣蓼泡騰顆粒平鋪于干燥至恒重的稱量瓶中，厚度不超過2mm，打開瓶蓋在105℃干燥5h后轉移至玻璃干燥器內(nèi)冷卻30min，稱重，繼續(xù)105℃干燥1h，冷卻30min，稱重，重復此步驟，至連續(xù)兩次稱重差異小于5mg時停止干燥。計算含水量。
3.3單因素試驗
3.3.1篩選酸源
對四種有機酸(檸檬酸、蘋果酸、富馬酸、酒石酸)進行篩選。分別稱取每種有機酸2.1g、碳酸氫鈉1.9g、辣蓼干膏4g、可溶性淀粉4g、乳糖2g，按3.1.4項下方法制粒。以泡騰顆粒溶化時間、發(fā)泡量、主觀口感、吸濕性為考察指標選擇最佳酸源。
由表2可知，單一酸源難以同時滿足口感和易于干燥的需求，故考慮采用混合酸源。因蘋果酸吸濕十分嚴重，故不做酸源考慮。進而從檸檬酸、富馬酸、酒石酸中進行兩兩組合，作為混合酸源進行篩選。預實驗發(fā)現(xiàn)，當檸檬酸：酒石酸＝1：2時，易干燥但口感差；比例為2：1時，口感較好但吸濕仍比較明顯，難干燥；而比例為1：1時，口感較好且易于干燥，初步確定混合酸比例為1：1。按3.1.4項下方法制粒，結果見表3。綜合考慮口感和干燥難易程度，酸源選定為檸檬酸：富馬酸＝1：1的混合酸。
表2單一酸源篩選結果表
表3混合酸源篩選結果表
3.3.2篩選酸堿比例
按表3稱取不同用量的酸源和堿源，按3.1.4項下方法制粒，以主觀口感評定、ph值為檢驗標準，選出適合的酸堿配比。綜合考慮口感、發(fā)泡速度及ph值，初步確定酸堿比為1.0：1.0、1.1：1.0和1.2：1.0時較適合。
表4酸堿比例篩選結果表
3.3.3篩選酸堿總量
按表5對泡騰顆粒劑中的酸堿總量進行篩選(酸源：堿源＝1：1)，按3.1.4項下工藝流程制粒，以發(fā)泡量、泡騰顆粒溶化時間、主觀口感為檢驗標準，選出適合的酸堿總量。綜合考慮泡騰時長、發(fā)泡量、口感，酸堿總量為20％、25％、30％較適合。
表5酸堿總量篩選結果表
3.3.4篩選包合劑用量
peg-6000用于包合碳酸氫鈉，可增加泡騰顆粒的穩(wěn)定性，而且在實際應用中peg-6000還有一定的矯味作用，可以明顯減弱藥物的苦澀味；故本實驗對peg-6000的用量進行了篩選。按表6稱取不同用量的peg-6000，包合碳酸氫鈉后，按3.1.4項下工藝流程制粒，以發(fā)泡量、主觀口感作為檢驗標準選出適合的peg-6000用量。綜合考慮發(fā)泡量和口感，peg-6000用量為4％、5％、6％較為適宜。
表6包合劑用量篩選結果表
3.3.5篩選矯味劑的種類及用量
選取四種矯味劑(阿斯巴甜、安賽蜜、甜菊糖甙、甜蜜素)，按表7稱取不同用量的矯味劑，分別加入已經(jīng)定量的顆粒藥液中，以主觀口感為檢驗指標選出適合的矯味劑種類及用量。安賽蜜和甜菊糖甙兩者甜味較純，0.4％的用量就有很好甜度，但甜菊糖甙的后味較安賽蜜的長，較甜膩。阿斯巴甜的甜味不純，口感不佳。甜蜜素甜味純正，但0.6％的用量才有比較好的甜味，用量較其他矯味劑大。綜合考慮口感及用量后，初步確定用安賽蜜作為矯味劑，用量為0.2％、0.3％、0.4％較合適。
表7矯味劑種類及用量配方表
3.4正交試驗設計
在單因素試驗的基礎上，選擇酸堿比、酸堿總量、peg-6000用量、安賽蜜用量作為影響因素，設計正交試驗。因素水平見表8，每個配方平行制取3份。以泡騰顆粒溶化時間為指標，正交試驗結果及方差分析見表9、表10。由實驗結果可知，各因素對泡騰時長的影響程度依次為：a>d>c>b，最佳工藝組合為a3b1c1d2，即酸堿比為1.2：1.0、酸堿總量為20％、peg-6000用量為4％、安賽蜜用量為0.3％。
表8正交試驗因素水平表
表9正交實驗結果表
表10方差分析表
r2＝0.971(調(diào)整r2＝0.945)
3.5辣蓼泡騰顆粒工藝驗證及理化指標檢測
根據(jù)最佳工藝制備辣蓼泡騰顆粒劑5份，按照3.2項下方法計算該制劑的各項理化指標。結果見表11。實驗結果偏差小、重復性好，說明a3b1c1d2即酸堿比1.2：1.0、酸堿用量20％、peg-6000用量4％、安賽蜜用量0.3％是辣蓼泡騰顆粒的最佳工藝參數(shù)。
表11工藝驗證及理化指標檢測結果
3.6感官指標檢測
辣蓼泡騰顆粒劑為味苦、微酸甜，有特殊香氣的棕褐色顆粒。外觀光潔、色澤均一。
上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應由本發(fā)明的權利要求所涵蓋。