本發(fā)明屬于納米藥物領(lǐng)域，尤其涉及一種負載雙藥的雜合前藥納米組合物及其制備方法。

背景技術(shù)：

近幾十年來，納米科學(xué)得到了飛速的發(fā)展，在生物醫(yī)藥等領(lǐng)域掀起了巨大的變革。納米藥物的迅猛發(fā)展，對傳統(tǒng)小分子藥物在體內(nèi)的傳輸產(chǎn)生了深遠的影響。廣義的說，納米藥物是指利用納米技術(shù)，將藥物活性成分裝載到納米材料中，制備出尺度為納米級的藥物，這些納米藥物可以輸送藥物活性成分至體內(nèi)靶點位置，進而釋放藥物發(fā)揮其活性作用。相對小分子藥物來說，納米藥物既提高了藥物療效，又降低了藥物的毒副作用。

化療藥物聯(lián)合治療能提高單一藥物的治療效果,是目前臨床腫瘤治療的主要模式,但由于化療藥物特異性差、不良反應(yīng)較大,限制了其臨床應(yīng)用。納米給藥系統(tǒng)共遞送化療藥物能夠聯(lián)合多種治療藥物同時作用于靶點,發(fā)揮藥物間的協(xié)同作用,提高療效并對抗腫瘤細胞的耐藥性。納米給藥系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)藥物對腫瘤細胞的靶向傳遞,大大提高治療效果并有效減輕不良反應(yīng),改善患者預(yù)后，具有廣闊的前景。但在設(shè)計、制備以及控制同步釋放等問題上仍面臨著諸多挑戰(zhàn)。

納米藥物載體在腫瘤中的分布直接影響其負載藥物的治療效果，納米藥物在血液循環(huán)中容易被免疫系統(tǒng)所識別進而排除體外，只有在血液循環(huán)中穩(wěn)定存在的納米顆粒才有可能通過滲透滯留效應(yīng)靶向到腫瘤部位。聚乙二醇(polyethyleneglycol,peg)是一種安全,無毒,水溶性較高的，廣泛用于生物醫(yī)藥高分子化合物,其重復(fù)單元為氧乙烯基,呈線性或支化鏈狀結(jié)構(gòu).聚乙二醇聚合物是迄今為止已知聚合物中蛋白和細胞吸收水平最低的聚合物,能夠避免免疫系統(tǒng)的識別。并且，腫瘤獨特的生理病理學(xué)特點限制了納米材料在腫瘤中的深入滲透，限制納米藥物載體向內(nèi)部的滲透，阻礙其均勻分布。在眾多的納米顆粒中，小粒徑的納米粒子在滲透方面表現(xiàn)出更強的優(yōu)勢。因為其在腫瘤基質(zhì)中，有較弱的滲透阻礙，因而表現(xiàn)出較強的腫瘤穿透能力。以磷脂為疏水端的兩親性材料形成的納米膠束粒徑極小，并且具有較高的穩(wěn)定性。然而，在一個理想的給藥系統(tǒng)中，給藥系統(tǒng)通過對外界環(huán)境的細微刺激做出響應(yīng)，并產(chǎn)生相應(yīng)的物理結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)的變化來達到控釋目的。兩親性磷脂類聚合物所形成的膠束在使用中藥物控釋性不良，而且親水性與疏水性的藥物的共同遞送能力較差，因此其應(yīng)用被限制。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種負載雙藥的雜合前藥納米組合物及其制備方法與應(yīng)用。

本發(fā)明將親水藥物的結(jié)構(gòu)適當通過化學(xué)敏感鍵進行親脂化修飾，合成既親水又親脂的兩親性前藥，進而制備環(huán)境響應(yīng)的兩親性前藥的納米制劑，并且通過共組裝制備peg化的載雙藥的環(huán)境敏感型小粒徑納米藥物。

一方面，本發(fā)明提供一種負載雙藥的雜合前藥納米組合物，其包含：兩親性的二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇，親水性藥物與二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(dspe)共價結(jié)合(例如通過ph裂解的苯甲酰亞氨鍵)形成的兩親性前藥(簡稱前藥)，和包裹于由上述兩者即所述兩親性前藥與二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇形成的雜合的納米膠束核中的疏水藥物。

本發(fā)明所述親水性藥物與二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(dspe)共價結(jié)合(例如通過ph裂解的苯甲酰亞氨鍵)形成的兩親性(即親水性和親油性)的前藥，該前藥可在體內(nèi)環(huán)境(ph值5.0-6.8)中裂解苯甲酰亞氨鍵，從而釋放親水性藥物。

所述親水性藥物可選用帶有氨基且能與二硬脂?；字Ｒ掖及饭矁r結(jié)合(例如通過ph裂解的苯甲酰亞氨鍵連接)的親水藥物，例如抗癌藥物阿霉素(dox)、吉西他濱等。

當所述親水性藥物選用阿霉素時，阿霉素與二硬脂?；字Ｒ掖及饭矁r結(jié)合(通過ph裂解的苯甲酰亞氨鍵)形成二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-阿霉素，其結(jié)構(gòu)式如下所示：

本發(fā)明所述二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇的結(jié)構(gòu)式如下：

優(yōu)選地，所述二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇中聚乙二醇鏈段的重均分子量為2000da。

本發(fā)明所述疏水藥物可選用紫杉醇、粉防己堿(tet)等。

在本發(fā)明一個具體實施方式中，所述親水藥物為阿霉素，所述疏水藥物為粉防己堿；在本發(fā)明另一個具體實施方式中，所述親水藥物為吉西他濱，所述疏水藥物為粉防己堿；在本發(fā)明另一個具體實施方式中，所述親水藥物為吉西他濱，所述疏水藥物為紫杉醇。

本發(fā)明所述負載雙藥的雜合前藥納米組合物中所述兩親性前藥與二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇的摩爾比為1:0.5-1:2，例如1:0.6,1:0.8,1:1,1:1.2,1:1.6或1:1.8，優(yōu)選為1:1。

本發(fā)明所述負載雙藥的雜合前藥納米組合物中所述親水藥與疏水藥的質(zhì)量比為1:1-5:1，例如1:1,2:1,3:1或4:1，優(yōu)選為4:1。

在本發(fā)明所述負載雙藥的雜合前藥納米組合物中親水藥的包封率為70.00-95.00％，例如73.75％、74.60％、80.89％、83.00％、84.00％、87.92％、82.00％、84.17％、90.00％、92.00％或95.00％，優(yōu)選為85.43％。

在本發(fā)明所述負載雙藥的雜合前藥納米組合物中疏水藥的包封率為60.00-85.00％，例如63.75％、64.60％、60.89％、63.00％、64.00％、67.92％、72.00％、74.17％、80.00％、82.00％或85.00％，優(yōu)選為76.48％。

本發(fā)明所述包封率是指雜合的納米膠束中親水藥或疏水藥的含量占原始投藥量的比率。主要是指被雜合的納米膠束包進去的藥物含量與初始投藥量之比。

本發(fā)明所述負載雙藥的雜合前藥納米組合物(形成的納米粒子)的粒徑分布為15-40nm，平均粒徑為28nm。

另一方面，本發(fā)明提供了上述負載雙藥的雜合前藥納米組合物的制備方法，包括以下步驟：

1)將二硬脂?；字Ｒ掖及放c對苯二甲醛發(fā)生縮合反應(yīng)(縮合反應(yīng)后進行濃縮，沉淀，過濾，干燥等處理)，得到活化的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺；反應(yīng)歷程如下所示：

2)將所述活化的二硬脂?；字Ｒ掖及放c所述親水藥物反應(yīng)(所述親水藥物中的氨基與所述活化的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺中的醛基基團反應(yīng)生成苯甲酰亞氨鍵，反應(yīng)后進行透析，凍干等處理)，制成兩親性的前藥；

3)將所得兩親性的前藥、二硬脂?；字Ｒ掖及啡芤?聚乙二醇和疏水藥物溶于有機溶劑，旋膜，水化，即得負載雙藥的雜合前藥納米組合物。

上述制備方法步驟1)中，

優(yōu)選地，二硬脂?；字Ｒ掖及放c對苯二甲醛的摩爾比為1:5-1:50，進一步優(yōu)選為1:20；

優(yōu)選所述縮合反應(yīng)的溶劑為無水二氯甲烷；

優(yōu)選所述縮合反應(yīng)溫度為25-50℃，進一步優(yōu)選為40℃；

優(yōu)選所述縮合反應(yīng)時間為4-48小時，進一步優(yōu)選為24小時；

優(yōu)選采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮(所用儀器為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀)；

優(yōu)選所述沉淀使用乙醚為沉淀劑。

上述制備方法步驟2)中，

優(yōu)選地，所述活化的二硬脂?；字Ｒ掖及放c所述親水藥物(例如阿霉素)的摩爾比為1:1＝1:1.5，進一步優(yōu)選為1:1.2；

優(yōu)選所述反應(yīng)溫度為25-50℃，進一步優(yōu)選為40℃；

優(yōu)選所述反應(yīng)時間為4-48小時，進一步優(yōu)選為24小時；

優(yōu)選地，所述反應(yīng)溶劑為二甲基亞砜；

優(yōu)選地透析所用試劑首先為甲醇，然后改成中性去離子水。

所述活化的二硬脂?；字Ｒ掖及放c阿霉素反應(yīng)生成二硬脂?；字Ｒ掖及?阿霉素(dspe-dox)，其反應(yīng)歷程如下所示：

上述制備方法步驟3)中，

所述有機溶劑優(yōu)選為三氯甲烷和/或三氟乙醇，進一步優(yōu)選為三氯甲烷/三氟乙醇(v:v＝2:1)。

所述三氟乙醇即2,2,2-三氟乙基乙醇。

所述旋膜所用儀器為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；

所述水化溶劑為pbs緩沖液或去離子水。

優(yōu)選地，所述水化時間為10分鐘-2小時，進一步優(yōu)選為0.5小時。

所述兩親性的前藥與二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的摩爾比為1:0.5-1:2，例如1:0.6,1:0.8,1:1,1:1.2,1:1.6或1:1.8，優(yōu)選為1:1。

所述親水藥與包裹的疏水藥的質(zhì)量比為1:1-5:1，例如1:1,2:1,3:1或4:1，優(yōu)選為4:1。

本發(fā)明還包括上述負載雙藥的雜合前藥納米組合物在制備小尺寸的具有強組織滲透功能的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還包括含有上述負載雙藥的雜合前藥納米組合物的藥物。進一步地，所述藥物還包括藥學(xué)上可用的輔料、載體或助劑。

本發(fā)明所述負載雙藥的雜合前藥納米組合物能夠在血液循環(huán)中穩(wěn)定存在，延長血液循環(huán)時間，并且特異性聚集在腫瘤部位。到達腫瘤部位后在腫瘤軟組織之間有較好的滲透性，能滲透到腫瘤內(nèi)部。并且可以有效地聚集在耐藥腫瘤細胞內(nèi)部不被排出，可控地將所負載的藥物在腫瘤細胞內(nèi)釋放出來，從而增強藥物殺傷力，降低毒副作用。

本發(fā)明制備的負載雙藥的雜合前藥納米組合物具有較高的血液循環(huán)穩(wěn)定性，能夠完全實現(xiàn)對腫瘤的高度靶向，在腫瘤中的均勻擴散，以及腫瘤細胞高效攝取功能的統(tǒng)一，并能在靶向部位智能釋放所負載的藥物。使用不同類型藥物的共投遞，實現(xiàn)藥物治療的協(xié)同作用，進一步提高治療效果。

附圖說明

圖1為實施例1中負載雙藥的雜合前藥納米組合物粒子的透射電鏡圖；

圖2為實施例1中負載雙藥的雜合前藥納米組合物粒子的粒徑分布圖；

圖3為實施例1中活化的二硬脂?；字Ｒ掖及返暮舜殴舱駳渥V圖；

圖4為實施例1中活化的二硬脂?；字Ｒ掖及返募t外譜圖；

圖5為實施例1中二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-阿霉素的核磁共振氫譜圖；

圖6為實施例1中二硬脂?；字Ｒ掖及?阿霉素的紅外譜圖；

圖7為實施例1中負載雙藥的雜合前藥納米組合物粒子的穩(wěn)定性評價圖；

圖8為實施例1中負載雙藥的雜合前藥納米組合物粒子在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布圖；

圖9為實施例1中負載雙藥的雜合前藥納米組合物粒子的3d腫瘤球滲透圖；

圖10為實施例1中負載雙藥的雜合前藥納米組合物粒子的腫瘤組織間隙分布圖；

圖11為實施例1中負載雙藥的雜合前藥納米組合物粒子的細胞攝入效果圖；

圖12為實施例1中負載雙藥的雜合前藥納米組合物粒子的細胞外排作用圖；

圖13為實施例1中負載雙藥的雜合前藥納米組合物粒子中親水藥dox的釋放圖；

圖14為實施例1中負載雙藥的雜合前藥納米組合物粒子中疏水藥tet的釋放圖。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過正規(guī)渠道商購買得到的常規(guī)產(chǎn)品。

主要儀器及試劑:

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠，型號：re52cs-2；

透射電子顯微鏡：日本電子公司，型號為jem-200cx；

激光粒度儀：馬爾文儀器有限公司，zetasizernanozs，英國；

核磁共振氫譜儀：瑞士，布魯克公司，型號為av400；

紅外光譜儀：美國珀金-埃爾默公司，型號為spectrumone；

紫外分光光度計：美國熱電公司，heλiosβ；

液相色譜儀：美國沃特斯公司，2796；

激光共聚焦顯微鏡：美國蔡司公司，lsm510duoconfocalunit；

流式細胞儀：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，lifetechnologies。

二硬脂?；字Ｒ掖及?、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇購自上海前塵生物科技有限公司，其中聚乙二醇鏈段的重均分子量為2000da，阿霉素購自北京華奉聯(lián)博化學(xué)材料有限公司；吉西他濱購自北京百靈威科技有限公司，粉防己堿購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

本發(fā)明通過旋膜法制備負載雙藥的雜合前藥納米組合物納米粒，其中的疏水鏈段二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺由于疏水相互作用而聚集形成粒子的內(nèi)核，可以負載疏水藥物。

實施例1

將100mg的二硬脂?；字Ｒ掖及放c362mg的對苯二甲醛溶解于20ml無水二氯甲烷，在40℃條件下攪拌24小時。將所得溶液用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮。將濃縮后的溶液用乙醚進行分散，在0℃下結(jié)晶。對混合物進行過濾，烘干，得到活化的二硬脂?；字Ｒ掖及?。

稱取85mg活化的二硬脂?；字Ｒ掖及泛?5mg阿霉素溶于20ml無水二甲基亞砜，在40℃條件下攪拌24小時。將所得溶液在甲醇中透析12小時，然后再在ph中性的去離子水中透析24小時，用凍干機凍干，得到苯甲酰亞胺鍵連接的前藥(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-阿霉素，dspe-dox)。

利用核磁共振氫譜儀和紅外光譜儀表征所得到的前藥(dspe-dox)分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖3為實施例1中的活化的二硬脂?；字Ｒ掖及返暮舜殴舱駳渥V圖，圖4為實施例1中的活化的二硬脂?；字Ｒ掖及返募t外光譜圖，圖5為實施例1中的二硬脂?；字Ｒ掖及?阿霉素的核磁共振氫譜圖，圖6為實施例1中的二硬脂?；字Ｒ掖及?阿霉素的紅外光譜圖。

將1ml濃度為10mg/ml的二硬脂?；字Ｒ掖及?阿霉素的三氯甲烷/三氟乙醇溶液，0.4ml濃度為120mg/ml的二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇的三氯甲烷/三氟乙醇溶液與100ul濃度為12mg/ml的粉防己堿的三氯甲烷/三氟乙醇溶液混合，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋膜，然后加入5ml去離子水超聲乳化0.5小時。得到負載雙藥的雜合前藥納米組合物納米粒子。以上溶劑三氯甲烷/三氟乙醇(v:v＝2:1)。

對制備得到的負載雙藥的雜合前藥納米組合物納米粒子的性質(zhì)進行檢測：

通過標準曲線法分別用可見紫外分光光度計和液相色譜儀測定包入納米粒子的阿霉素和粉防己堿的濃度，根據(jù)公式ee％＝包入納米粒子的藥物總質(zhì)量/總藥物質(zhì)量×100％，考察載雙藥雜合前藥納米組合物納米粒的包封率。

利用透射電子顯微鏡觀察所得到的負載雙藥型雜合前藥納米粒子，初步確定納米粒徑的分布情況，如圖1所示。圖1表明制備的負載雙藥型雜合前藥納米粒子為球形粒子，這些粒子分散均勻，且無團聚現(xiàn)象。

利用激光粒度儀檢測所得到的負載雙藥型雜合前藥納米粒子，測定納米粒的粒徑分布，如圖2所示。圖2表明制備的負載雙藥型雜合前藥納米粒子的粒徑分布較窄，分散性好，平均粒徑為28.82nm。

將本實施例制備的負載雙藥型雜合前藥納米粒子放置7天，利用激光粒度儀每天監(jiān)測其納米粒徑，以確定所制備的負載雙藥型雜合前藥納米粒子的穩(wěn)定情況，結(jié)果如圖7所示，從結(jié)果可以得出，制備的負載雙藥型雜合前藥納米粒子具有較高的穩(wěn)定性。

通過小動物活體熒光成像儀觀察不同時間點本實施例制備的負載雙藥型雜合前藥納米粒子在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布，從而測定該納米粒子的腫瘤靶向效果。結(jié)果如圖8所示，從結(jié)果可以得出，隨著時間的推移，腫瘤部位(黑色虛線圈內(nèi))的熒光強度越強，而其他部位的熒光強度逐漸消失，說明制備的負載雙藥型雜合前藥納米粒子具有較高的腫瘤靶向性。

通過體外構(gòu)建3d腫瘤球模型來評價本實施例制備的負載雙藥型雜合前藥納米粒子的滲透能力。結(jié)果如圖9所示，通過使用激光共聚焦顯微鏡對腫瘤球進行層掃，發(fā)現(xiàn)50mm深的時候，腫瘤球內(nèi)部依然有較強的熒光信號，說明制備的負載雙藥型雜合前藥納米粒子具有較高的滲透性，能有效滲透到腫瘤球內(nèi)部。

通過免疫組化熒光染色對離體的腫瘤組織進行染色，分析本實施例制備的負載雙藥型雜合前藥納米粒子的在腫瘤組織間隙的分布。結(jié)果如圖10所示，從結(jié)果可以得出，制備的負載雙藥型雜合前藥納米粒子的熒光不僅分布在腫瘤血管中，而且還分布在腫瘤組織各個部位，說明了制備的負載雙藥型雜合前藥納米粒子能有效逸出血管滲透到腫瘤組織其他部位，具有較高的滲透性。。

通過流式細胞儀定量分析本實施例制備的負載雙藥型雜合前藥納米粒子的細胞內(nèi)吞效果。結(jié)果如圖11所示，從結(jié)果可以得出，制備的負載雙藥型雜合前藥納米粒子能有效地進入腫瘤細胞。

通過流式細胞儀定量分析本實施例制備的負載雙藥型雜合前藥納米粒子的細胞外排情況。結(jié)果如圖12所示，從結(jié)果可以得出，制備的負載雙藥型雜合前藥納米粒子能抑制耐藥腫瘤細胞的外排能力從而有效地聚集在腫瘤細胞內(nèi)部。

通過體外模擬生理條件(ph7.4，37℃)和細胞內(nèi)溶酶體的酸性條件(ph5.0，37℃)來評估本實施例制備的負載雙藥型雜合前藥納米粒子在體內(nèi)的阿霉素控制釋放性能。結(jié)果如圖13所示，從結(jié)果可以得出，制備的負載雙藥型雜合前藥納米粒子ph控制釋放特性。

通過體外模擬生理條件和細胞內(nèi)溶酶體的酸性條件來評估本實施例制備的負載雙藥型雜合前藥納米粒子在體內(nèi)的粉防己堿控制釋放性能。結(jié)果如圖14所示，從結(jié)果可以得出，制備的負載雙藥型雜合前藥納米粒子ph控制釋放特性。

實施例2

在本實施例中通過以下方法來制備兩親性前藥分子，該方法包括以下步驟：

將100mg的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺與400mg的對苯二甲醛溶解于20ml無水二氯甲烷，在40℃條件下攪拌24小時。將所得溶液用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮。將濃縮后的溶液用乙醚進行分散，在0℃下結(jié)晶。對混合物進行過濾，烘干，得到活化的二硬脂?；字Ｒ掖及贰?/p>

稱取85mg活化的二硬脂?；字Ｒ掖及泛?00mg吉西他濱溶于20ml無水二甲基亞砜，在40℃條件下攪拌24小時。將所得溶液在甲醇中透析12小時，然后再在ph中性的去離子水中透析24小時，用凍干機凍干，得到苯甲酰亞胺鍵連接的前藥(二硬脂?；字Ｒ掖及?吉西他濱)。

與實施例1的測試相同，利用核磁共振氫譜儀和紅外光譜儀表征所得到的前藥分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

在本實施例中通過以下方法來制備負載雙藥型雜合前藥納米粒子，該方法包括以下步驟：將1ml濃度為10mg/ml的二硬脂?；字Ｒ掖及?吉西他濱的三氯甲烷/三氟乙醇溶液，0.8ml濃度為120mg/ml的二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇的三氯甲烷/三氟乙醇溶液與100ul濃度為12mg/ml的粉防己堿的三氯甲烷/三氟乙醇溶液混合，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋膜，然后加入5ml去離子水超聲乳化0.5小時。得到負載雙藥的雜合前藥納米組合物納米粒子。。以上溶劑三氯甲烷/三氟乙醇(v:v＝2:1)。

通過與實施例1相同的測試可知，本實施例制備的負載雙藥型雜合前藥納米粒子具有規(guī)整的圓球形結(jié)構(gòu)，得到的納米粒子的平均粒徑為28.4nm。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。