本發(fā)明屬于納米水凝膠的制備領(lǐng)域，特別涉及一種負(fù)載聚苯胺的γ-PGA納米水凝膠的制備方法。

背景技術(shù)：

對(duì)于癌癥，目前治療的方法有手術(shù)治療，放射治療和化學(xué)藥物治療，這些傳統(tǒng)的治療方法仍然存在缺陷。光熱治療是治療腫瘤的一種新技術(shù)，具有精確性、可控性和高效性，通過(guò)近紅外光選擇性照射腫瘤組織，其區(qū)域產(chǎn)生熱量，溫度升高，導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。因此，新型高效光熱治療的生物醫(yī)學(xué)材料在腫瘤治療中具有重要意義。光熱的材料分為有機(jī)和無(wú)機(jī)材料，無(wú)機(jī)材料如金屬納米粒子的生物代謝差、長(zhǎng)期毒性，以及碳納米材料誘發(fā)的毒性反應(yīng)。而有機(jī)材料具有良好的生物相容性、光學(xué)穩(wěn)定性、較高的光熱轉(zhuǎn)化效率，使其脫穎而出成為新型光熱試劑。

聚苯胺是一類(lèi)用于研究細(xì)胞增殖的導(dǎo)電高分子，具有非常好的生物兼容性。其吸收峰容易受到摻雜劑(如強(qiáng)酸、路易士酸、過(guò)渡金屬以及堿粒子等)的影響而發(fā)生移動(dòng)，因?yàn)檫@些摻雜能在聚苯胺的價(jià)帶與導(dǎo)帶之間產(chǎn)生一個(gè)能帶，從而迫使電子發(fā)生移動(dòng)，降低了激發(fā)態(tài)能級(jí)，所以當(dāng)聚苯胺上的亞胺基團(tuán)轉(zhuǎn)變成亞胺鹽時(shí)，其吸收峰將紅移到近紅外區(qū)域。而這種具有近紅外吸收的聚苯胺的亞胺鹽就可以很好地用于光熱治療(J.Mater.Chem.B，2015，3，3767)。

在諸多納米顆粒的修飾方法中，納米水凝膠具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。相比于單個(gè)納米顆粒，納米凝膠具有良好的膠體穩(wěn)定性，生物相容性、高負(fù)載能力、易于合成、尺寸可控、易于多功能化等特點(diǎn)。γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一種天然多聚氨基酸，具有優(yōu)良的水溶性和生物相容性，是一種優(yōu)良的環(huán)保型高分子材料，目前已廣泛應(yīng)用于納米水凝膠的制備。根據(jù)之前報(bào)道的納米水凝膠具有更好的柔性和流動(dòng)性易被腫瘤細(xì)胞吞噬的特點(diǎn)，因此本發(fā)明以胱胺二鹽酸鹽為交聯(lián)劑合成γ-PGA納米水凝膠，構(gòu)建了負(fù)載聚苯胺的γ-PGA納米水凝膠用作光熱試劑。

檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前尚沒(méi)有關(guān)于以胱胺二鹽酸鹽為交聯(lián)劑制備γ-PGA水凝膠用于負(fù)載聚苯胺作為光熱試劑研究的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種負(fù)載聚苯胺的γ-PGA納米水凝膠的制備方法，該方法工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)溫和，易于操作分離，原料來(lái)源廣泛，成本低廉；制備的γ-PGA納米水凝膠能穩(wěn)定地分散于水溶液中，粒徑分布均勻，光聲成像效果顯著，具有良好的醫(yī)用前景。

本發(fā)明的一種負(fù)載聚苯胺的γ-PGA納米水凝膠的制備方法，包括：

(1)將EDC活化的γ-聚谷氨酸γ-PGA經(jīng)過(guò)雙乳化反應(yīng)，得到W/O/W聚合物乳液；

(2)將胱胺二鹽酸鹽Cys溶于超純水中，然后滴加到步驟(1)中的W/O/W聚合物乳液中，反應(yīng)2～3h，除去溶劑(過(guò)夜蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑)，透析純化，凍干，得到胱胺二鹽酸鹽交聯(lián)的γ-PGA納米水凝膠，即γ-PGA/Cys納米水凝膠；

(3)將步驟(2)中的γ-PGA/Cys納米水凝膠溶于pH至3.00超純水中，然后加入水溶性的苯胺鹽酸鹽，冰浴靜置45min～1h，再加入過(guò)硫酸銨反應(yīng)1.75h～2.25h，透析純化3天，得到負(fù)載聚苯胺的γ-PGA納米水凝膠，即γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠。

所述步驟(1)中雙乳化反應(yīng)為：將經(jīng)過(guò)EDC活化的γ-PGA中加入碳酸氫鈉NaHCO₃反應(yīng)30min～45min，然后滴加到磺基琥珀酸二辛酯鈉AOT的二氯甲烷DCM溶液中，攪拌10min，形成W/O乳液；將得到的W/O乳液滴加到聚乙烯醇PVA的超純水溶液中，攪拌15min，形成W/O/W聚合物乳液；其中，EDC活化γ-PGA的方法為：取γ-PGA溶于超純水中，加入EDC活化1-2h。

所述AOT的DCM溶液的濃度為33.5mg/mL；PVA的超純水溶液的濃度為20.4mg/mL。

所述γ-PGA的超純水溶液、AOT的DCM溶液和PVA水溶液的體積比為1：2：15。

所述步驟(2)中胱胺二鹽酸鹽與γ-PGA的質(zhì)量比為3：1。

所述步驟(2)中胱胺二鹽酸鹽Cys溶于超純水中得到的溶液的濃度為50mg/mL。

所述步驟(2)透析純化為：用截留分子量為10萬(wàn)的透析袋透析純化3天，步驟(3)透析純化為：用截留分子量為10萬(wàn)的透析袋透析純化3天，第一天中每隔25～30min透析一次。

所述步驟(3)中γ-PGA/Cys納米水凝膠溶于超純水中得到的溶液的濃度為0.8mg/mL。

所述步驟(3)中苯胺鹽酸鹽和γ-PGA/Cys納米水凝膠的質(zhì)量比為4.3：1。

所述步驟(3)中苯胺鹽酸鹽和過(guò)硫酸銨的質(zhì)量比為104：184。

所述步驟(3)中苯胺鹽酸鹽的水溶液濃度為104mg/mL；過(guò)硫酸銨的水溶液濃度為184mg/mL。

所述步驟(3)中γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠的尺寸為650～700nm。

本發(fā)明中γ-PGA的水溶液先經(jīng)EDC活化，然后經(jīng)過(guò)雙乳化的方法反應(yīng)形成W/O/W的聚合物乳液；將交聯(lián)劑胱胺二鹽酸鹽(Cys)加入到的聚合物乳液中發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，除去有機(jī)溶劑和表面活性劑后，即得到交聯(lián)的γ-PGA/Cys的納米水凝膠(γ-PGA/Cys NGs)；γ-PGA/Cys NGs與苯胺單體(aniline)混合，合成原位聚合PANI摻雜的γ-PGA NGs(γ-PGA/Cys@PANI)。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，易于操作分離，原料來(lái)源廣泛，成本低廉；制備的γ-PGA水凝膠粒徑分布均勻，具有良好的水溶性、膠體穩(wěn)定性、生物相容性，對(duì)生物體無(wú)不良影響，在光熱治療領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明所制備的負(fù)載聚苯胺的γ-PGA納米水凝膠是由γ-PGA與胱胺二鹽酸鹽化學(xué)交聯(lián)，并且苯胺單體在過(guò)硫酸銨的催化下發(fā)生原位聚合而成。本發(fā)明將胱胺二鹽酸鹽加入到經(jīng)EDC活化和雙乳化的γ-PGA溶液中，再加入苯胺單體和催化劑過(guò)硫酸銨發(fā)生氧化聚合反應(yīng)形成負(fù)載聚苯胺的γ-PGA納米水凝膠。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)溫和，原料來(lái)源廣泛。制備的γ-PGA納米水凝膠粒徑分布均勻，具有良好的水溶性、膠體穩(wěn)定性和細(xì)胞相容性，易于被腫瘤細(xì)胞吞噬。腫瘤光聲成像、光熱成像和光熱治療結(jié)果顯示，本發(fā)明制備的負(fù)載聚苯胺的γ-PGA納米水凝膠能有效作為光熱試劑用于腫瘤的光聲成像、光熱成像和光熱治療。

本發(fā)明使用Zeta電勢(shì)及動(dòng)態(tài)光散射分析(DLS)、紫外吸收光譜分析(UV-Vis)、透射電子顯微鏡(TEM)、熱重分析(TGA)、掃描電子顯微鏡(SEM)等手段表征制備的負(fù)載聚苯胺的γ-PGA納米水凝膠。然后利用CCK8細(xì)胞活力測(cè)試法來(lái)評(píng)價(jià)納米水凝膠的細(xì)胞毒性，隨后評(píng)價(jià)了腫瘤細(xì)胞對(duì)該納米水凝膠的吞噬能力。最后進(jìn)行體外細(xì)胞、裸鼠體內(nèi)腫瘤模型的光聲成像及光熱成像實(shí)驗(yàn)，考察γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠的體外、體內(nèi)光熱治療效果。

有益效果

本發(fā)明采用胱胺二鹽酸鹽作為交聯(lián)劑，負(fù)載聚苯胺的γ-PGA納米水凝膠粒徑分布均勻，具有良好的水溶性、膠體穩(wěn)定性和細(xì)胞相容性，同時(shí)工藝簡(jiǎn)單、反應(yīng)溫和、原料來(lái)源廣泛價(jià)廉、生物可降解，具有良好的應(yīng)用前景。另外，本發(fā)明得到的納米水凝膠表面擁有大量的活性基團(tuán)為其進(jìn)一步的修飾和深入開(kāi)發(fā)提供了良好的條件。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例2中γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠在不同溶液中不同儲(chǔ)存時(shí)間的水動(dòng)力直徑變化；

圖2為實(shí)施例3中γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠的UV-Vis圖譜；

圖3為實(shí)施例3中γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠經(jīng)過(guò)785nm激光照射不同時(shí)間后吸收值的變化；

圖4為實(shí)施例3中γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠的TEM圖片；

圖5為實(shí)施例3中γ-PGA/Cys，γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠的熱重分析圖片；

圖6為實(shí)施例4中γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠的細(xì)胞吞噬變化圖；

圖7為實(shí)施例5中CCK8法測(cè)試的4T1細(xì)胞0.9％NaCl(對(duì)照)和γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠(濃度范圍在0.1-5mg/mL)處理24小時(shí)后的細(xì)胞活力；

圖8為實(shí)施例6中γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠在不同濃度下經(jīng)過(guò)785nm激光照射后的PA成像圖(a)和PA值隨γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠濃度變化的線(xiàn)性關(guān)系圖(b)；

圖9為實(shí)施例7中γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠在不同濃度下(0-4mg/mL)經(jīng)過(guò)785nm激光照射后的升溫曲線(xiàn)圖；

圖10為實(shí)施例7中在γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠相同濃度下(1mg/mL)經(jīng)過(guò)不同功率的激光照射后升溫曲線(xiàn)圖；

圖11為實(shí)施例8中CCK8法測(cè)試的4T1細(xì)胞在與γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠(濃度0-4mg/mL)共培養(yǎng)6小時(shí)后，不經(jīng)過(guò)和經(jīng)過(guò)的激光照射后細(xì)胞的存活率；

圖12為實(shí)施例9中瘤內(nèi)注射制備的γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠(4mg/mL，100μL)到裸鼠腫瘤部位前后經(jīng)785nm激光照射后的PA成像(a)和PA信號(hào)值(b)的變化；

圖13為實(shí)施例10中瘤內(nèi)注射制備的γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠(4mg/mL，100μL)(Bx1)和PBS(0.1mL)(Bx2)到裸鼠腫瘤部位后的腫瘤部位的溫度變化曲線(xiàn)；

圖14為實(shí)施例11中經(jīng)過(guò)不同方式處理后裸鼠腫瘤的體積變化；荷瘤鼠分為四組：不做任何處理；瘤內(nèi)注射0.9％NaCl(0.1mL)且經(jīng)過(guò)激光照射；瘤內(nèi)注射制備的γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠(4mg/mL，100μL)但不經(jīng)過(guò)激光照射；瘤內(nèi)注射制備的γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠(4mg/mL，100μL)且經(jīng)過(guò)激光照射；

圖15為實(shí)施例11中經(jīng)過(guò)不同方式處理后裸鼠的生存率變化。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。

實(shí)施例1

(1)取20mgγ-PGA溶于1mL超純水中，加入30mg EDC活化1-2h，再加入26mg NaHCO₃繼續(xù)反應(yīng)0.5h；然后將上述溶液逐滴加入到溶有134mg AOT的DCM溶液中(4mL)，攪拌10min，形成W/O乳液；然后將該W/O乳液逐滴加入到30mL含有612mg PVA(醇解度87-89％，Mw＝85-124kDa)的超純水溶液中，攪拌15min，形成W/O/W的聚合物乳液；(2)將60mg胱胺二鹽酸鹽溶于1.2mL超純水中，并逐滴加入到上述步驟制備的W/O/W的聚合物乳液中，攪拌12h，過(guò)夜蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，然后用截留分子量為10萬(wàn)的透析袋透析純化3天，并且凍干，即得到胱胺二鹽酸鹽交聯(lián)的γ-PGA/Cys納米水凝膠。(3)取γ-PGA/Cys納米水凝膠48mg溶于60mL的pH＝3.0的超純水中，攪拌至完全溶解，加入苯胺鹽酸鹽208mg，冰浴靜置45min至1h，加入過(guò)硫酸銨368mg，反應(yīng)2h，用截留分子量為10萬(wàn)的透析袋純化，第一天中每隔30min透析一次，透析3天即可得到γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠。

實(shí)施例2

取實(shí)施例1中制備的γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠，將其用超純水稀釋至適當(dāng)濃度后，用于測(cè)表面電勢(shì)和水動(dòng)力直徑。Zeta電勢(shì)測(cè)定結(jié)果表明γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠的表面電勢(shì)為-4.32±0.16mV。γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠水動(dòng)力學(xué)直徑為669.03±14.99nm，粒徑分布均一，且水動(dòng)力直徑能長(zhǎng)時(shí)間保持幾乎不變，并且在不同溶劑中均能穩(wěn)定保存一定時(shí)間(參見(jiàn)圖1)，從而說(shuō)明實(shí)施例1制備的γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠具有良好的膠體穩(wěn)定性。

圖1為將γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠分散于水、0.9％NaCl、PBS和細(xì)胞培養(yǎng)基中，存放不同時(shí)間后測(cè)水動(dòng)力粒徑，發(fā)現(xiàn)其在水中的粒徑保持在660nm左右，在0.9％NaCl、PBS和細(xì)胞培養(yǎng)基中的粒徑保持在900nm左右(圖1)。說(shuō)明合成的γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠具有良好的穩(wěn)定性。

實(shí)施例3

取實(shí)施例1中得到的γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠測(cè)紫外吸收(見(jiàn)圖2：γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠在400到1100nm的紫外吸收?qǐng)D譜)。從圖2中可以看出，所制備的水凝膠在700nm處出現(xiàn)明顯的吸收峰，在785nm處有一個(gè)很強(qiáng)的紫外吸收值，從而為近紅外的成像和光熱治療提供了可行性。此外，在785nm激光(1.5W/cm²)分別照射不同時(shí)間后，該納米凝膠在785nm處的吸收值沒(méi)有明顯的變化，表明制備的納米顆粒具有較好的光熱穩(wěn)定性，能夠長(zhǎng)期暴露于激光下進(jìn)行疾病的光熱治療(圖3)。通過(guò)TEM觀(guān)察實(shí)施例1中制備γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠的形貌(參見(jiàn)圖4)，結(jié)果表明所形成的γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠的形貌呈球形，尺寸較均勻，凝膠直徑大小約為71.9±15.8nm(隨機(jī)測(cè)量300個(gè)納米顆粒的直徑)，沒(méi)有明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象。之后對(duì)γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠進(jìn)行了TGA分析(參見(jiàn)圖5)，在溫度升至900℃時(shí)，γ-PGA/Cys納米水凝膠重量為19.20％，γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠重量為73.70％，經(jīng)過(guò)計(jì)算，聚苯胺負(fù)載量為54.50％(圖5)，由此表明γ-PGA/Cys納米水凝膠已成功負(fù)載了聚苯胺。

實(shí)施例4

通過(guò)高壓細(xì)胞破碎測(cè)定實(shí)施例1制備的γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠是否被4T1細(xì)胞吞噬。配制γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠濃度為0.74mg/mL，用六孔板培養(yǎng)4T1細(xì)胞，每孔10萬(wàn)。每孔加入培養(yǎng)基溶解的γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠2mL。分別培養(yǎng)0min，30min，60min，120min，240min，480min。通過(guò)胰酶消化離心后用0.9％的NaCl溶解，在高壓細(xì)胞破碎儀破碎之后用紫外測(cè)出在700nm下的紫外吸收值(見(jiàn)圖6)?？梢园l(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的增加，吸收值也逐漸增加，說(shuō)明γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠在細(xì)胞中的吞噬量隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，同時(shí)說(shuō)明γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠能被細(xì)胞吞噬。

實(shí)施例5

通過(guò)CCK8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)測(cè)定4T1細(xì)胞的活力來(lái)評(píng)價(jià)實(shí)施例1制備的γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠的細(xì)胞相容性。配制不同濃度的實(shí)施例1制備的γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠的0.9％NaCl溶液。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期4T1細(xì)胞，按照10000細(xì)胞每孔的密度接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，加入200μL DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO₂濃度為5％和溫度為37℃的環(huán)境中培養(yǎng)24h。棄掉培養(yǎng)基后，每孔更換180μL DMEM培養(yǎng)基，并分別添加20μL不同濃度的γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠(濃度為0.1、0.2、0.5、1、2、3、4和5mg/mL)和純0.9％NaCl(對(duì)照組)，每種濃度設(shè)定6個(gè)平行樣。將細(xì)胞培養(yǎng)板繼續(xù)放置在5％CO₂，37℃繼續(xù)孵育24h。倒掉原有培養(yǎng)基并用無(wú)菌0.9％NaCl清洗3遍，每孔加入20μL CCK8溶液，避光環(huán)境下37℃恒溫培養(yǎng)4h。按順序每孔吸取上層培養(yǎng)液100μL于96孔板中，在MK3型酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔在激發(fā)波長(zhǎng)490nm處的吸收值，吸收值的大小可以反映活細(xì)胞的數(shù)量(參見(jiàn)圖7)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠在實(shí)驗(yàn)濃度為0到4mg/mL范圍內(nèi)對(duì)4T1細(xì)胞的存活率的影響沒(méi)有顯著性差異，細(xì)胞存活率均在90％以上，即使實(shí)驗(yàn)濃度高達(dá)5mg/mL，細(xì)胞存活率也在80％以上。這充分說(shuō)明γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠具有良好的細(xì)胞相容性。

實(shí)施例6

由于γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠(實(shí)施例3)在700nm左右有明顯的近紅外吸收峰，據(jù)此可一步探究γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠的PA成像效應(yīng)，測(cè)量了該γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠的785nm激光照射下的光聲信號(hào)增強(qiáng)特性(如圖8所示)。配制成γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠濃度依次為0、0.1、0.25、0.5和1.0mg/mL，各取20μL進(jìn)行PA值的測(cè)定，利用光聲成像系統(tǒng)在785nm波長(zhǎng)激光下測(cè)定γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠光聲效應(yīng)(見(jiàn)圖8a)。結(jié)果表明，隨著濃度的增加(0-1mg/mL)，γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠的PA信號(hào)強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。而且，復(fù)合納米顆粒的PA值隨著γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠濃度的變化具有很好的線(xiàn)性關(guān)系(見(jiàn)圖8b)。說(shuō)明了γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠有望用作PA成像的造影劑。

實(shí)施例7

在EP管中用超純水配制γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠(實(shí)施例1中制備)濃度依次為0.5、1、2、4mg/mL的水溶液100μL，以等體積的水做對(duì)照，用785nm激光照射(輸出功率1.5W/cm²，照射5分鐘)，觀(guān)察溫度變化情況(見(jiàn)圖9)。結(jié)果表明，水在照射5分鐘后，溫度僅稍微的升高。而對(duì)于γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠，隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，納米顆粒水溶液的溫度明顯升高。而且隨著濃度的增加，溫度的升高更加明顯。在相同濃度下(1mg/mL)，分別用輸出功率為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5W/cm²的785nm的激光照射，觀(guān)察溫度變化情況(見(jiàn)圖10)。結(jié)果表明，隨著對(duì)γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠水溶液照射時(shí)間的延長(zhǎng)，水溶液的溫度明顯升高；而且隨著輸出功率的增加，溫度的升高更加明顯。

實(shí)施例8

以4T1細(xì)胞為模型細(xì)胞，在785nm激光照射下評(píng)價(jià)γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠(實(shí)施例1)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。用無(wú)菌0.9％NaCl配置不同濃度的γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠，并用紫外照射殺菌過(guò)夜。將4T1細(xì)胞種植于96孔板(1×10⁴細(xì)胞/孔)，在37℃和5％CO₂條件下過(guò)夜培養(yǎng)，貼壁后棄去培養(yǎng)基，再用200μL含γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠(實(shí)施例1)(濃度為0、0.2、0.5、1、2和4mg/mL)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時(shí)，用0.9％NaCl洗滌3次，用785nm激光器照射(輸出功率1.5W/cm²，照射5分鐘)，未照射的細(xì)胞用作對(duì)照組。然后，向培養(yǎng)板孔中加入20μL CCK8，繼續(xù)在37℃下培養(yǎng)4小時(shí)后，在MK3型酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔在激發(fā)波長(zhǎng)490nm處的吸收值，吸收值的大小可以反映活細(xì)胞的數(shù)量(見(jiàn)圖11)。結(jié)果表明隨著濃度的增加，未照射的細(xì)胞仍然保持很高的細(xì)胞存活率；而經(jīng)過(guò)激光照射5分鐘，細(xì)胞表現(xiàn)出死亡趨勢(shì)，并且隨著濃度的增加，細(xì)胞的存活率越低，在濃度為4mg/mL時(shí)，僅有29.2％的細(xì)胞存活。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠在近紅外激光照射下能引起腫瘤細(xì)胞的死亡。

實(shí)施例9

為了探索γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠(實(shí)施例1)用作PA成像造影劑的潛力，將4T1荷瘤裸鼠麻醉后，瘤內(nèi)注射γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠NaCl溶液(濃度為4mg/mL，100μL)，然后用光聲成像系統(tǒng)在785nm波長(zhǎng)激光下觀(guān)察γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠注射后腫瘤的光聲效果(見(jiàn)圖12a)。結(jié)果表明，注射γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠30min后，裸鼠腫瘤較注射前(0min)PA信號(hào)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。對(duì)信號(hào)強(qiáng)度定量測(cè)量可知，腫瘤部位的PA值從注射前的496.47升高到5707.69(見(jiàn)圖12b)。結(jié)果說(shuō)明，γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠具有良好的PA成像性能。

實(shí)施例10

為了探索γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠(實(shí)施例1)在體內(nèi)光熱升溫能力，將4T1荷瘤裸鼠麻醉后，直接瘤內(nèi)注射γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠0.9％NaCl溶液(4mg/mL,0.1mL)。接著，使用785nm激光照射(輸出功率1.5W/cm²，照射5分鐘)，并通過(guò)紅外攝像機(jī)來(lái)評(píng)價(jià)體內(nèi)腫瘤部位的熱成像效果，同時(shí)以注射相同體積NaCl的裸鼠作為對(duì)照(見(jiàn)圖13)。結(jié)果表明，注射后2.5分鐘，注射γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠的裸鼠腫瘤部位(Bx2)的溫度明顯升高，達(dá)到了57.2℃，而此時(shí)注射0.9％NaCl的裸鼠的腫瘤部位(Bx1)的溫度僅僅達(dá)到39.3℃。在隨后的一段時(shí)間內(nèi)，注射γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠的裸鼠腫瘤部位的溫度一直保持在50℃以上。注射5min后，注射γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠的裸鼠腫瘤部位溫度高達(dá)58.1℃，而對(duì)照裸鼠腫瘤部位的溫度僅僅達(dá)到在40.5℃左右。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明制備的γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠能使腫瘤部位的溫度升高，從而達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的作用。

實(shí)施例11

將負(fù)荷腫瘤的裸鼠分為四組，分別經(jīng)過(guò)不同方式處理：不經(jīng)過(guò)任何處理；瘤內(nèi)注射0.9％NaCl(0.1mL)且經(jīng)過(guò)785nm激光照射(輸出功率1.5W/cm²，照射5分鐘)；瘤內(nèi)注射γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠(實(shí)施例1)0.9％NaCl溶液(4mg/mL，0.1mL)但不經(jīng)過(guò)激光照射；瘤內(nèi)注射γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠(實(shí)施例1)0.9％NaCl溶液(4mg/mL，0.1mL)且經(jīng)過(guò)785nm激光照射(輸出功率1.5W/cm²，照射5分鐘)。各組荷瘤裸鼠均在第0，2和4天各處理一次。結(jié)果表明，只有瘤內(nèi)注射γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠(實(shí)施例1)NaCl溶液(4mg/mL，0.1mL)且經(jīng)過(guò)激光照射的裸鼠腫瘤才完全消失(處理后第9天)，其余三組裸鼠腫瘤均繼續(xù)快速生長(zhǎng)(見(jiàn)圖14)。而且，只有瘤內(nèi)注射納米凝膠且經(jīng)過(guò)激光照射的裸鼠未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，其余三組在45天內(nèi)均完全死亡(見(jiàn)圖15)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明制備的γ-PGA/Cys@PANI納米水凝膠在近紅外激光的照射下能引起腫瘤的消融，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。