本申請是申請日為2009年4月2日、國家申請?zhí)枮?00980120404.1、發(fā)明名稱為“用于維生素D缺乏癥和相關(guān)障礙的方法、組合物、用途和試劑盒”的發(fā)明專利申請的分案申請。

相關(guān)申請的交叉引用

本申請根據(jù)美國35USC§119(e)要求于2008年4月2日遞交的美國臨時專利申請第61/041,898號和2009年3月18日遞交的美國臨時專利申請第61/161,292號的權(quán)益，它們?nèi)績?nèi)容通過引用并入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本公開大體上涉及用于診斷和治療疾病和障礙的方法，以及其所用的相關(guān)組合物和試劑盒。更具體地，本公開涉及用于診斷和治療分解代謝相關(guān)的維生素D缺乏癥和其易感性的方法、相關(guān)的組合物和試劑盒，和用于預(yù)防和治療相關(guān)障礙的方法。

背景技術(shù)：

人類從飲食來源和7-去羥基膽固醇向維生素D₃的UV光依賴性轉(zhuǎn)化中獲得維生素D。維生素D₃(或膽鈣化甾醇)和維生素D₂(或麥角鈣化甾醇)統(tǒng)稱為“維生素D”，它們是活性維生素D激素的脂溶性前體。維生素D₃和維生素D₂的代謝主要發(fā)生在肝中，以分別產(chǎn)生25-羥基維生素D₃和25-羥基維生素D₂(文中統(tǒng)稱為“25-羥基維生素D”)，它們?yōu)楦髯曰钚跃S生素D激素的激素原。這些維生素D激素原的進一步代謝活化主要通過細胞色素P450酶(CYP27B)發(fā)生在腎中。CYP27B也在表達在許多腎外維生素D靶組織中，且可實現(xiàn)25-羥基維生素D的局部活化，以產(chǎn)生自分泌和/或旁分泌激素響應(yīng)。具體地，25-羥基維生素D₃代謝為活性激素1,25-二羥基維生素D₃(或骨化三醇)，且25-羥基維生素D₂代謝為活性激素1,25-二羥基維生素D₂(文中統(tǒng)稱為“1,25-二羥基維生素D”)。

維生素D激素經(jīng)由與維生素D受體(VDR)的相互作用調(diào)節(jié)多種細胞過程。特別地，維生素D激素通過小腸控制膳食鈣的吸收和通過腎控制鈣的再吸收來調(diào)節(jié)血液鈣水平。過量的激素水平可導(dǎo)致尿鈣(高鈣尿癥)、血液鈣(高鈣血癥)和血液磷(高磷血癥)的異常升高。另一方面，維生素D缺乏癥與繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進癥、甲狀旁腺增生、低鈣血癥、慢性腎病(CKD)和代謝性骨病如囊性纖維性骨炎、骨軟化、軟骨病、骨質(zhì)疏松和骨骼外鈣化有關(guān)。已報導(dǎo)維生素D激素對甲狀旁腺激素系統(tǒng)具有許多與其“經(jīng)典”作用不同的“非經(jīng)典”生物學(xué)作用。已報導(dǎo)此類作用與細胞增殖、包括腎素-血管緊張素系統(tǒng)的免疫系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)、血壓、細胞生長和分化、抗纖維化、血紅細胞形成、毛發(fā)生長和肌肉功能有關(guān)。

維生素D激素原、激素和類似物的分解代謝通過細胞色素P450酶的作用來完成。細胞色素P450酶CYP24催化各種維生素D化合物分解代謝中的第一步。特別地，例如CYP24進行25-羥基維生素D₃向24,25-二羥基維生素D₃的轉(zhuǎn)化和1,25-二羥基維生素D₃(骨化三醇)向1,24,25-三羥基維生素D₃的轉(zhuǎn)化，最終產(chǎn)生維生素D₃-23羧酸(calcitroic acid)。CYP24也可23位羥基化，導(dǎo)致最終代謝產(chǎn)物1,25-二羥基維生素D₃-26,23-內(nèi)酯的生成。由Ⅱ相分解代謝酶的進一步加工最終將維生素D化合物從身體中清除。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本公開一方面為診斷患者中分解代謝相關(guān)的維生素D缺乏癥的易感性的方法，包括如通過從患者中獲取組織、血液或細胞樣本和分析所述樣本的CYP24表達和/或活性或其指標(biāo)，來測定患者的CYP24表達和/或活性水平或其指標(biāo)水平，其中CYP24表達和/或活性的異常升高預(yù)示分解代謝相關(guān)的維生素D缺乏癥的易感性。在一個實施方式中，所述患者的維生素D充足，且所述方法進一步包括通過針對異常升高的CYP24表達和/或活性，對患者施用CYP24抑制劑來抑制和/或預(yù)防維生素D缺乏癥。在另一個實施方式中，所述患者缺乏維生素D，且所述方法進一步包括通過針對異常升高的CYP24表達和/或活性，對患者施用CYP24抑制劑來治療維生素D缺乏癥。

本公開另一方面為診斷患者中分解代謝相關(guān)的維生素D缺乏癥的易感性的方法，包括如通過從患者中獲取組織、血液或細胞樣本和分析所述樣本的FGF23濃度來測定患者的FGF23水平，其中FGF23濃度的異常升高預(yù)示分解代謝相關(guān)的維生素D缺乏癥的易感性。所述方法可進一步包括本文所述治療或預(yù)防方法的任意一種。

本公開另一方面為診斷和治療患者的方法，包括測定患者的CYP24表達和/或活性，或CYP24表達和/或活性的指標(biāo)，和對響應(yīng)CYP24表達和/或活性異常升高的患者施用CYP24抑制劑。所述方法可進一步包括從所述患者中獲取組織、血液或細胞樣本，和分析所述樣本的CYP24表達和/或活性或其指標(biāo)。

優(yōu)選地，在測定CYP24表達和/或活性或其指標(biāo)時，所述患者未在接受活性維生素D治療。

優(yōu)選地，所述患者未患有癌癥。

所述方法可進一步包括測定所述患者的25-羥基維生素D水平，和通過對維生素D缺乏患者施用所述CYP24抑制劑來治療維生素D缺乏癥。

所述方法可進一步包括對所述患者施用維生素D前激素、激素原和前述任一種的類似物中的一種或多種，優(yōu)選選自膽鈣化甾醇、麥角鈣化甾醇、25-羥基維生素D₂、25-羥基維生素D₃和它們的組合的化合物。例如，所述治療可包括施用25-羥基維生素D₃。優(yōu)選地，所述治療包括施用治療有效量的25-羥基維生素D₃，以將所述患者的25-羥基維生素D水平恢復(fù)到至少30ng/mL。

所述方法可進一步包括測定所述患者的25-羥基維生素D水平，和通過對維生素D充足的患者施用所述CYP24抑制劑來抑制和/或預(yù)防維生素D缺乏癥。

在一種類型的實施方式中，所述患者具有如選自1期和2期，或選自3期和4期的慢性腎病。

在一種類型的實施方式中，所述患者具有甲狀旁腺功能亢進。例如，所述患者的PTH水平高于患者CKD期的目標(biāo)范圍。

在一種類型的實施方式中，所述患者缺乏1,25-二羥基維生素D₃。

所述方法可進一步包括避免活性維生素D治療，或者，如果所述患者正在接受活性維生素D治療，則降低活性維生素D治療的水平，或停止活性維生素D治療。

所述方法可進一步包括對所述患者施用足以增加1,25-二羥基維生素D水平的量的25-羥基維生素D。

在一個實施方式中，所述CYP24抑制劑也是維生素D受體激動劑。

所述方法可包括測定所述患者中作為CYP24表達和/或活性水平指標(biāo)的FGF23的水平，其中FGF23水平大于正常范圍上限預(yù)示異常升高的CYP24表達。例如，F(xiàn)GF23水平為正常范圍上限的至少2倍、至少4倍、至少10倍或至少40倍預(yù)示異常升高的CYP24表達。

所述方法可包括測定血清或其它體液中CYP24的一種或多種分解代謝副產(chǎn)物的濃度，以作為CYP24活性指標(biāo)。

所述方法可進一步包括測定血清或其它體液中CYP24的一種或多種分解代謝副產(chǎn)物的一種或多種前體的濃度，并計算CYP24的一種或多種分解代謝副產(chǎn)物濃度與一種或多種對應(yīng)前體的血清濃度的比例，以作為CYP24活性指標(biāo)。

在一個實施方式中，CYP24的分解代謝副產(chǎn)物包括24,25-二羥基維生素D和/或1,24,25-三羥基維生素D。

在一個實施方式中，CYP24活性測定包括測定選自由24,25-二羥基維生素D與25-羥基維生素D的比例和1,24,25-三羥基維生素D與1,25-二羥基維生素D的比例組成的組中的一個或多個比例。

在一個實施方式中，CYP24的分解代謝副產(chǎn)物包括選自由帕立骨化醇、度骨化醇、22-奧沙骨化三醇、二氫速甾醇和26,26,26,27,27,27-六氟骨化三醇(氟骨三醇)組成的組中的一種或多種成員的24-羥基化和/或23-羥基化分解代謝副產(chǎn)物。

在一個實施方式中，CYP24表達和/或活性或其指標(biāo)的測定在短期或長期施用CYP24底物之后。在此實施方式中，如下所述，優(yōu)選該CYP24底物不為雙重作用抑制劑和VDR激動劑。

在一個實施方式中，一種或多種測定包括血清濃度。

在一個實施方式中，CYP24表達的測定包括測定組織、血漿或細胞中的CYP24mRNA。

在一個實施方式中，CYP24表達的測定包括測定組織、血漿或細胞中的CYP24蛋白質(zhì)。

在一個實施方式中，CYP24活性的測定包括測定組織、血漿或細胞中的CYP24的酶活性。

在一個實施方式中，所述組織或細胞選自由腎組織、肝組織、甲狀旁腺組織、外周血單核細胞和口部細胞組成的組中。

在一個實施方式中，異常升高的CYP24表達和/或活性是正常CYP24表達和/或活性的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少10倍或至少100倍。

本公開另一方面包括試劑盒，所述試劑盒包括用于測定一種或多種CYP24分解代謝副產(chǎn)物水平的試劑，和實施本文所述方法的說明書。所述試劑盒可進一步包括用于測定一種或多種對應(yīng)前體水平的試劑。

本公開另一方面包括試劑盒，所述試劑盒包括用于測定CYP24蛋白質(zhì)水平的試劑，和實施本文所述方法的說明書。所述試劑可包括固定的抗CYP24抗體和標(biāo)記的抗CYP24抗體。

本公開另一方面包括用于治療或預(yù)防維生素D缺乏癥的藥物制劑，所述藥物制劑包括有效量的CYP24抑制劑。所述制劑可進一步包括有效量的25-羥基維生素D₃。

本公開另一方面包括用于治療或預(yù)防甲狀旁腺功能亢進的藥物制劑，所述藥物制劑包括有效量的CYP24抑制劑。所述制劑可進一步包括有效量的25-羥基維生素D₃。所述藥物制劑可用于治療慢性腎病如3期或4期CKD繼發(fā)的甲狀旁腺功能亢進。

本公開另一方面包括用于治療或預(yù)防維生素D缺乏癥的CYP24抑制劑。

本公開另一方面包括用于治療或預(yù)防甲狀旁腺功能亢進，如慢性腎病如3期或4期CKD繼發(fā)的甲狀旁腺功能亢進的CYP24抑制劑。

本公開另一方面包括CYP24抑制劑在制備用于治療或預(yù)防維生素D缺乏癥的藥物中的應(yīng)用。

本公開另一方面包括CYP24抑制劑在制備用于治療或預(yù)防甲狀旁腺功能亢進，如慢性腎病如3期或4期CKD繼發(fā)的甲狀旁腺功能亢進的藥物中的應(yīng)用。

對于本文所述的組合物、方法、應(yīng)用和試劑盒，優(yōu)選特征如組分、其組成范圍、替代物、病癥(如患病群體的特征)和方法步驟可選自本文提供的各種實施例。

從以下詳細說明并結(jié)合附圖，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將明白其它方面和優(yōu)點。盡管本發(fā)明方法可有各種形式的實施方式，但是以下說明包括具體實施方式，應(yīng)理解本公開是說明性的，且并非意在將本發(fā)明限制為本文所述的具體實施方式。

附圖說明

為了進一步幫助理解本發(fā)明，附上九個附圖。

圖1顯示了在用富含腺嘌呤的食物或?qū)φ帐澄镂桂B(yǎng)的大鼠中，血清甲狀旁腺激素(PTH)水平在隨時間變化的圖。

圖2顯示了在用三種不同維生素D化合物處理1周的喂腺嘌呤的大鼠中，血清甲狀旁腺激素(PTH)水平的圖。

圖3顯示了在喂腺嘌呤的食物和用對照食物喂養(yǎng)的大鼠中，以及在用三種不同維生素D化合物處理的用腺嘌呤喂養(yǎng)的動物中，1,25-(OH)₂-D₃(骨化三醇)水平的圖。

圖4顯示了來自用腺嘌呤喂養(yǎng)和用對照食物喂養(yǎng)的大鼠、以及來自用三種不同維生素D化合物處理的用腺嘌呤喂養(yǎng)的動物的腎組織中CYP24表達的圖。RFI表示相對誘導(dǎo)倍數(shù)(relative fold induction)。

圖5顯示了來自用腺嘌呤喂養(yǎng)和用對照食物喂養(yǎng)的大鼠、以及來自用三種不同維生素D化合物處理的用腺嘌呤喂養(yǎng)的動物的甲狀旁腺組織中CYP24表達的圖。

圖6顯示了在用腺嘌呤喂養(yǎng)和用對照食物喂養(yǎng)的大鼠中，以及在用三種不同維生素D化合物處理的用腺嘌呤喂養(yǎng)的動物中，血清FGF23水平的圖。

圖7顯示了來自用腺嘌呤喂養(yǎng)和用對照食物喂養(yǎng)的大鼠的腎組織中FGF23水平和骨鈣蛋白水平的圖。

圖8顯示了在用維生素D(25-羥基維生素D₂和25-羥基維生素D₃)處理2周的大鼠中，相對CYP24誘導(dǎo)的圖。

圖9顯示了在響應(yīng)于安慰劑和(5Z,7E,16Z,23E)-(1S,3R)-25-降-25-叔丁基磺?；?9,10-斷(seco)-5,7,10(19),16,23-膽甾五烯(cholestapentaene)-1,3-二醇給藥的人中，25-OH-D水平的變化。

圖10顯示了在正常和腺嘌呤誘導(dǎo)的尿毒癥大鼠的腎組織中相對CYP24誘導(dǎo)的圖，此圖顯示了CYP24的基礎(chǔ)表達(載體)和1,25-二羥基維生素D₃(1α,25(OH)₂D₃)誘導(dǎo)的CYP24的表達。

圖11顯示了在正常和腺嘌呤誘導(dǎo)的尿毒癥大鼠的甲狀旁腺組織中相對CYP24誘導(dǎo)的圖，此圖顯示了CYP24的基礎(chǔ)表達(載體)和1,25-二羥基維生素D₃(1α,25(OH)₂D₃)誘導(dǎo)的CYP24的表達。

圖12顯示了在正常大鼠、腺嘌呤誘導(dǎo)的尿毒癥大鼠和伴隨產(chǎn)生了維生素D缺乏癥的惡化的用1,25-二羥基維生素D₃處理的腺嘌呤誘導(dǎo)的尿毒癥大鼠中CYP24和CYP27B1的相對表達。

圖13顯示了在正常大鼠和采用維生素D缺乏食譜的正常大鼠中，以及在食物正常和食物缺乏維生素D的腺嘌呤誘導(dǎo)的尿毒癥大鼠之間，CYP24和CYP27B1的相對表達。

圖14顯示了在用1,25-二羥基維生素D₃單獨孵育或用1,25-二羥基維生素D₃和CYP24抑制劑一起孵育的HEK細胞中，CYP24表達的相對誘導(dǎo)。

圖15顯示了在用不同濃度的1,25-二羥基維生素D₃單獨處理或用不同濃度的1,25-二羥基維生素D₃和CYP24抑制劑一起孵育的HEK細胞中，3H-胸腺嘧啶的摻入(％)。

圖16顯示了在用1,25-二羥基維生素D₃單獨處理或用1,25-二羥基維生素D₃和FGF23一起處理的HPK1a-ras細胞中，CYP24的相對表達。

圖17顯示了在正常大鼠、用缺乏維生素D的食物喂養(yǎng)的正常大鼠，和用缺乏維生素D的食物喂養(yǎng)且用不同濃度的1,25-二羥基維生素D₃處理的正常大鼠中，CYP24的相對誘導(dǎo)。

圖18顯示了在用添加有腺嘌呤(“腺嘌呤載體”)的正常食物喂養(yǎng)的大鼠、用添加有腺嘌呤的缺乏維生素D的食物喂養(yǎng)的大鼠，和用添加有腺嘌呤的缺乏維生素D的食物喂養(yǎng)且用不同濃度的25-羥基維生素D₃處理的大鼠中，CYP24的相對誘導(dǎo)。

圖19顯示了25-羥基維生素D₃對尿毒癥維生素D缺乏大鼠和正常維生素D缺乏大鼠中1,25-二羥基維生素D₃濃度的影響。

具體實施方式

通常將“維生素D缺乏癥”定義為人患者或其它哺乳動物中血清25-羥基維生素D水平低于30ng/mL的病癥(參見National Kidney Foundation guidelines,NKF,Am.J.Kidney Dis.42:S1-S202(2003)，其通過引用并入本文)?！熬S生素D缺乏癥”包括：“維生素D不足”，其定義為血清25-羥基維生素D至少為16ng/mL但小于30ng/mL，“輕微”維生素D缺乏癥，其定義為血清25-羥基維生素D為5-15ng/mL，和“嚴(yán)重”維生素D缺乏癥，其定義為血清25-羥基維生素D小于5ng/mL。

如本文所用，將術(shù)語“維生素D充足”定義為人患者或其它哺乳動物中血清25-羥基維生素D水平大于或等于30ng/mL的病癥。

本文所用術(shù)語“有風(fēng)險”通常是指具有維生素D缺乏癥相關(guān)特征或疾病的那些患病人群。具體實例包括但不限于具有1、2、3、4或5期慢性腎病的對象；未飲用維生素D強化奶的嬰兒、兒童和成人(如乳糖不耐癥對象、奶過敏的對象、不吃奶的素食者和母乳喂養(yǎng)的嬰兒)；患有軟骨病的對象；具有黑色皮膚的對象(例如，在美國，相比于4％的白種婦女，年齡在15和49歲間的42％的非洲裔美國婦女缺乏維生素D)；老年人(他們合成維生素D的能力降低且也更經(jīng)常待在室內(nèi))；患有慢性或急性和嚴(yán)重病的成人(他們更經(jīng)常待在室內(nèi)、醫(yī)院、重病特護區(qū)、特設(shè)的和輔助護理區(qū)，包括患有阿爾莫茨海默癥或精神病的對象)；將全部暴露皮膚遮蓋的對象(如某些宗教或文化的成員)；經(jīng)常使用遮光劑的對象(如使用防曬系數(shù)(SPF)為8的遮光劑會降低95％的維生素D產(chǎn)生，較高的SPF值可進一步降低維生素D)；患有脂肪吸收不良綜合癥的的對象(包括但不限于囊性纖維化病、膽汁郁積型肝病、其它肝病、膽囊疾病、胰酶缺乏癥、Crohn’s病、炎性腸病、口炎性腹瀉或乳糜瀉，或部分或全部胃和腸的手術(shù)切除)；患有炎性腸病的對象；患有Crohn’s病的對象；小腸被切除的對象；患有齒齦疾病的對象；服用包括苯妥英、磷苯妥英、苯巴比妥、卡馬西平和利福平等增加維生素D分解代謝的藥的對象；服用包括消膽胺、考來替泊、奧利司他、礦物油和脂肪替代物等降低維生素D吸收的藥的對象；服用包括酮康唑等抑制維生素D活化的藥的對象；服用包括皮質(zhì)類固醇等降低鈣吸收的藥的對象；患有肥胖、糖尿病、胰島素抵抗綜合癥、內(nèi)皮功能紊亂(沉積在身體脂肪儲存中的維生素D的生物利用率較低)的對象；患有骨質(zhì)疏松的對象；絕經(jīng)后的婦女；患有心血管病、動脈硬化和/或心力衰竭的個體；和/或危重病住院的對象。

在一個實施方式中，患者未患有癌癥?！鞍┌Y”是指存在具有癌癥引起的細胞典型特征的細胞，如不可控的增殖、永生、轉(zhuǎn)移潛力、快速生長和增殖速率以及某些特有的形態(tài)特征。通常，癌細胞為腫瘤形式，但這類細胞可在人或動物內(nèi)單獨存在，或可為致瘤的癌細胞，如白血病細胞。癌癥包括但不限于乳腺癌、肺癌、支氣管癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、腦或中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、周圍神經(jīng)系統(tǒng)癌、食管癌、宮頸癌、黑色素瘤、子宮或子宮內(nèi)膜癌、口腔或咽癌、肝癌、腎癌、睪丸癌、膽道癌、小腸或闌尾癌、唾液腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、骨肉瘤和軟骨肉瘤。

如本文所用，術(shù)語“甲狀旁腺功能亢進”是指原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進、繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進、慢性腎病(3、4或5期)繼發(fā)的甲狀旁腺功能亢進，和維生素D缺乏癥繼發(fā)的甲狀旁腺功能亢進。

本文所用術(shù)語“對象”和“患者”通常包括人、哺乳動物(如狗、貓、嚙齒類、綿羊、馬、母牛、山羊)、獸醫(yī)動物(veterinary animals)和動物園中的動物(zoo animals)，優(yōu)選人。

本文所用術(shù)語“CYP24表達和/或活性”通常包括轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生CYP24mRNA，翻譯產(chǎn)生CYP24蛋白質(zhì)，和轉(zhuǎn)錄和翻譯結(jié)合產(chǎn)生CYP24蛋白質(zhì)，以及直接得出的CYP24酶活性，或通過計算CYP24產(chǎn)物與CYP24底物的比例得出的CYP24酶活性。

如本文所用，術(shù)語“維生素D化合物”通常包括維生素D前激素(如膽鈣化甾醇和麥角鈣化甾醇)、維生素D激素原(如1α-羥基維生素D₃、1α-羥基維生素D₃、25-羥基維生素D₃和25-羥基維生素D₂)、活性維生素D激素、前述化合物的類似物，和前述化合物的任意組合。具體實例包括但不限于維生素D₃(膽鈣化甾醇)、維生素D₂(麥角鈣化甾醇)、25-羥基維生素D₃、25-羥基維生素D₂、1α,25-二羥基維生素D₃、1α,25-二羥基維生素D₂、1α,25-二羥基維生素D₄和維生素D類似物(包括全部羥基和二羥基形式)，包括1,25-二羥基-19-去甲-維生素D₂、22-氧雜骨化三醇、二氫速甾醇和26,26,26,27,27,27-六氟骨化三醇(氟骨三醇)。

如本文所用，術(shù)語“活性維生素D”和“活化的維生素D”是指至少在1α位置上被羥基化的維生素D化合物?；钚跃S生素D化合物包括骨化三醇、1,25-二羥基維生素D₂、阿法骨化醇、度骨化醇、22-氧雜骨化三醇和帕立骨化醇。

如本文所用，短語“治療有效量”是指治療或預(yù)防藥(如CYP24抑制劑或雙重作用CYP24抑制劑和VDR激動劑)這樣的量，所述量適用于本發(fā)明的實施方式，且當(dāng)根據(jù)所需治療方案施用時，將會引起所需的治療或預(yù)防作用或響應(yīng)。更具體地，“治療有效量”是指有效預(yù)防相關(guān)病癥如維生素D缺乏癥發(fā)展的量，去除、消除或延緩相關(guān)病癥如維生素D缺乏癥的進展的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力確定治療有效量，尤其是根據(jù)本文的詳細公開來確定。

“治療有效劑量”是指實現(xiàn)所需效果的活性成分的量。此活性成分的毒性和治療功效可在細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏型ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)制藥過程，如通過測定LD₅₀(50％群體的致死劑量)和ED₅₀(50％群體的治療有效劑量)來確定。毒性效果和治療效果之間的劑量比為治療指數(shù)，可用LD₅₀和ED₅₀間的比例表示。優(yōu)選高治療指數(shù)。所得數(shù)據(jù)可用于制定人用劑量的范圍?；钚猿煞值膭┝績?yōu)選在包括ED₅₀且毒性很小或無毒性的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。劑量可根據(jù)所用劑型和所用給藥途徑在此范圍內(nèi)變化。

如本文所用，術(shù)語“包括”是指除所詳述的那些外，還可能包括其它試劑、成分、步驟或特征。

本公開一方面提供了用于診斷分解代謝相關(guān)的維生素D缺乏癥的方法。此方法包括測定維生素D缺乏患者中CYP24表達和/或活性，和將CYP24表達和/或活性的異常升高與分解代謝相關(guān)的維生素D缺乏癥相關(guān)聯(lián)。針對CYP24表達和/或活性的異常升高，此方法可進一步包括對維生素D缺乏的患者施用CYP24抑制劑。

本公開一方面提供了用于診斷分解代謝相關(guān)的維生素D缺乏癥的易感性的方法。此方法包括測定患者中CYP24表達和/或活性，和將CYP24表達和/或活性的異常升高與分解代謝相關(guān)的維生素D缺乏癥的易感性相關(guān)聯(lián)。針對維生素D充足患者中CYP24表達和/或活性的異常升高，此方法可進一步包括對維生素D充足的患者施用CYP24抑制劑來抑制和/或預(yù)防維生素D缺乏癥。針對維生素D缺乏患者中CYP24表達和/或活性的異常升高，此方法可進一步包括對維生素D缺乏的患者施用CYP24抑制劑來治療維生素D缺乏癥。

本公開另一方面提供了用于治療或預(yù)防維生素D缺乏癥和/或甲狀旁腺功能亢進的方法。此方法包括測定患者中的CYP24表達和/或活性或其指標(biāo)，并針對CYP24表達和/或活性異常升高的患者施用CYP24抑制劑。此方法可包括通過對CYP24表達和/或活性異常升高的維生素D缺乏的患者施用CYP24抑制劑來治療維生素D缺乏癥。此方法可進一步包括通過對CYP24表達和/或活性異常升高的維生素D充足的患者施用CYP24抑制劑來抑制和/或預(yù)防維生素D缺乏癥。此方法可包括通過對CYP24表達和/或活性異常升高的患者施用CYP24抑制劑來抑制和/或預(yù)防甲狀旁腺功能亢進。此方法也可包括通過對CYP24表達和/或活性異常升高的患者施用CYP24抑制劑來抑制和/或預(yù)防1,25-二羥基維生素D缺乏。

本公開另一方面提供了用于治療或預(yù)防患者中維生素D缺乏癥的方法。此方法包括測定患者中的CYP24表達和/或活性，并針對CYP24表達和/或活性異常升高的患者施用CYP24抑制劑。此方法進一步包括針對CYP24表達和/或活性異常升高的患者，如通過外界影響，例如通過降低、避免(停止)或中止施用活性維生素D化合物來降低、避免(停止)或中止維生素D結(jié)合受體(VDR)的活化，以避免加劇CYP24水平的增加和維生素D缺乏癥。此方法可進一步包括對患者施用維生素D補充劑，例如通過對患者施用25-羥基維生素D(25-羥基維生素D₃)。此方法可進一步包括測定患者中完整甲狀旁腺激素(PTH)的水平和25-羥基維生素D水平。在一個實施方式中，患者具有異常升高的PTH水平和正常的25-羥基維生素D水平。在另一個實施方式中，患者具有異常升高的PTH水平和異常降低的25-羥基維生素D水平(如維生素D缺乏癥)。在一個實施方式中，患者具有正常的PTH水平和異常降低的25-羥基維生素D水平。此方法可進一步包括測定患者的腎小球濾過率(GFR)以確定慢性腎病的時期。在一個實施方式中，患者將具有選自1至5期的CKD。在另一個實施方式中，患者將具有選自1和2期的CKD。在另一個實施方式中，患者將具有選自3和4期的CKD。

本公開的一個實施方式提供了通過測定患者中成纖維細胞生長因子-23(FGF23)的水平來測定CYP24活性。另一個實施方式提供了通過測定CYP24的一種或多種分解代謝副產(chǎn)物(包括但不限于24,25-二羥基維生素D₃、25-羥基維生素D₃-26,23-內(nèi)酯、1,24,25-三羥基維生素D₃、24,25-二羥基維生素D₂或1,24,25-三羥基維生素D₂，或CYP24活性作用于包括維生素D₃-23羧酸或1,25-(OH)₂D₃-26,23-內(nèi)酯的維生素D3代謝物而產(chǎn)生的終產(chǎn)物)，來測定CYP24表達和/或活性。另一個實施方式提供了通過測定CYP24的一種或多種分解代謝副產(chǎn)物與一種或多種相應(yīng)前體的比例(如24,25-二羥基維生素D與25-羥基維生素D的比例，或1,24,25-三羥基維生素D與1,25-二羥基維生素D的比例)，來測定CYP24活性。另一個實施方式提供了通過測定患者中CYP24mRNA的水平、患者中CYP24蛋白質(zhì)的水平和/或患者中CYP24酶活性的水平來測定CYP24表達。另一個實施方式提供了通過測定其它CYP24底物的CYP24代謝物來測定CYP24活性，所述其它CYP24底物可被引入(如通過注射)、被CYP24代謝并隨后被測定。

本公開另一方面提供了用于診斷分解代謝相關(guān)的維生素D缺乏癥的試劑盒。在一個實施方式中，試劑盒包括用于測定CYP24mRNA、蛋白質(zhì)或酶促活性的試劑或其它設(shè)備，和例如根據(jù)本文公開方法使用的說明書。

除非另有說明，希望本文公開的診斷試劑盒和方法包括含下述(包括圖中所示的那些)其它可選成員、特征和步驟中任意一種或多種組合的多個實施方式。

也清楚地明白本文所用任何數(shù)值包括從下限值至上限值的全部值，即認為在所列舉的最低值和最高值之間全部可能的數(shù)值組合清楚地表述在本申請中。例如，如果稱濃度范圍或有益效果范圍為1％至50％，意思是諸如2％至40％、10％至30％或1％至3％等數(shù)值清楚地列舉在本申請中。這些僅是優(yōu)選的示例。

在一個方面，本公開提供了診斷分解代謝相關(guān)的維生素D缺乏癥的方法。此方法包括測定維生素D缺乏患者中CYP24表達和/或活性，和將CYP24表達和/或活性的異常升高與分解代謝相關(guān)的維生素D缺乏癥相關(guān)聯(lián)。針對CYP24表達和/或活性的異常升高，此方法可進一步包括對維生素D缺乏的患者施用CYP24抑制劑。

在另一個方面，本公開提供了診斷分解代謝相關(guān)的維生素D缺乏癥的易感性的方法。此方法包括測定患者中CYP24表達和/或活性，和將CYP24表達和/或活性的異常升高與分解代謝相關(guān)的維生素D缺乏癥的易感性相關(guān)聯(lián)。針對維生素D充足患者中CYP24表達和/或活性的異常升高，此方法可進一步包括對維生素D充足的患者施用CYP24抑制劑來抑制和/或預(yù)防維生素D缺乏癥。針對維生素D缺乏患者中CYP24表達和/或活性的異常升高，此方法可進一步包括對維生素D缺乏的患者施用CYP24抑制劑來治療維生素D缺乏癥。

另一方面，本公開提供了用于治療或預(yù)防維生素D缺乏癥和/或甲狀旁腺功能亢進的方法。此方法包括測定患者中的CYP24表達和/或活性或其指標(biāo)，并針對CYP24表達和/或活性異常升高的患者施用CYP24抑制劑。此方法可包括通過對CYP24表達和/或活性異常升高的維生素D缺乏的患者施用CYP24抑制劑來治療維生素D缺乏癥。此方法可包括通過對CYP24表達和/或活性異常升高的維生素D充足的患者施用CYP24抑制劑來抑制和/或預(yù)防維生素D缺乏癥。此方法可包括通過對CYP24表達和/或活性異常升高的患者施用CYP24抑制劑來抑制和/或預(yù)防甲狀旁腺功能亢進。此方法也可包括通過對CYP24表達和/或活性異常升高的患者施用CYP24抑制劑來抑制和/或預(yù)防1,25-二羥基維生素D缺乏。

維生素D缺乏癥與許多其它疾病和障礙有關(guān)，包括繼發(fā)甲狀旁腺功能亢進、甲狀旁腺增生、低鈣血癥、牛皮癬、慢性腎病(CKD)和代謝性骨病，如骨纖維發(fā)育不全、囊性纖維性骨炎、骨軟化癥、軟骨病、骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少、骨硬化、腎性骨營養(yǎng)不良癥和骨骼外鈣化。根據(jù)本公開的方法也可用于治療或預(yù)防與維生素D缺乏癥有關(guān)的疾病或障礙。

當(dāng)前護理CKD患者的標(biāo)準(zhǔn)認為應(yīng)測定患者的PTH和25-羥基維生素D水平。在3期和4期患者中，如果血漿完整甲狀旁腺(PTH)水平升高(如高于CKD時期的目標(biāo)范圍)且25-羥基維生素D降低(<30ng/ml)，隨后用維生素D₂補充劑(麥角鈣化甾醇)治療患者。參見慢性腎病中骨代謝和疾病的國家腎基金會K/DOQI臨床實踐標(biāo)準(zhǔn)“Guideline 7:Prevention And Treatment Of Vitamin D Insufficiency And Vitamin D Deficiency In People With CKD(Algorithm 1)”,Am J Kidney Dis 42:S1–S202,2003(Suppl 3)，其通過引用并入本文。對于CKD 3期(GFR范圍30-59ml/min/1.73m²)，目標(biāo)PTH水平為35-70pg/ml(3.85-7.7pmol/L)。對于CKD 4期(GFR范圍15-29ml/min/1.73m²)，目標(biāo)PTH水平為70-110pg/ml(7.7-12.1pmol/L)。

另一方面，如果PTH水平高于CKD時期的目標(biāo)范圍，且25-羥基維生素D的血清水平為>30ng/ml，隨后用活性維生素D激素(如骨化三醇、阿法骨化醇或度骨化醇)治療患者。參見慢性腎病中骨代謝和疾病的國家腎基金會K/DOQI臨床實踐指南“Guideline 8A:Active Vitamin D Therapy In Stages3And 4CKD(Algorithm 2)”,Am J Kidney Dis 42:S1–S202,2003(Suppl 3)，其通過引用并入本文。

不受任何特定理論束縛，圖12顯示了如果25-羥基維生素D的水平正常，按照指南用活性維生素D激素治療將增加CYP24的水平，因此盡管降低了PTH水平，但將加劇維生素D缺乏癥。在患有慢性腎病且PTH水平升高的患者中，CYP24活性過高應(yīng)通過(a)使用CYP24抑制劑和/或(b)避免進一步加劇CYP24水平的增加和維生素D缺乏癥來控制。

因此，本公開另一方面提供了用于治療或預(yù)防患者中慢性腎病(優(yōu)選3和4期)繼發(fā)的甲狀旁腺功能亢進的方法。此方法包括測定患者中的CYP24表達和/或活性，并針對CYP24表達和/或活性異常升高的患者施用CYP24抑制劑。此方法優(yōu)選進一步包括通過避免施用活性維生素D來避免CYP24水平增加和維生素D缺乏癥(如果有的話)的加劇。此方法可進一步包括對患者施用維生素D補充劑，優(yōu)選25-羥基維生素D(如25-羥基維生素D₃)。此方法可進一步包括測定患者中25-羥基維生素D水平。在一個實施方式中，患者具有異常升高的PTH水平和正常的25-羥基維生素D水平。在另一個實施方式中，患者具有異常升高的PTH水平和異常降低的25-羥基維生素D水平。在另一個實施方式中，患者具有正常的PTH水平和異常降低的25-羥基維生素D水平。此方法可進一步包括測定患者的腎小球濾過率(GFR)以確定慢性腎病的時期。

在一個實施方式中，不束縛于任何特定理論，將FGF23水平用作CYP24表達和/或活性的指標(biāo)。在另一個實施方式中，不束縛于任何特定理論，與任何特定原因無關(guān)(即無論是否通過CYP24的分解代謝)，升高的FGF23本身作為維生素D缺乏癥易感性的標(biāo)志。從患者獲得的生物樣本中FGF23的水平可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種技術(shù)來測定。例如，完整FGF-23(iFGF23)和中間C末端FGF-23(cFGF23)的濃度可使用購自IMMUTOPICS(San Clemente,CA,USA)的ELISA試劑盒測定。雖然濃度可在血漿、血清或其它體液(如唾液)或組織中測定，但前述物質(zhì)的測定結(jié)果優(yōu)選為血清濃度。對于健康的成人，正常iFGF23水平在0至90pg/mL的范圍內(nèi)(Fliser et al.J.Am.Soc.Nephrol.18:2601-2608(2007),Ibrahim et al.Int.Urol.Nephrol.41(1):163-169(2009))。對于健康的成人，正常cFGF23水平在0至85參考單位(RU)/mL的范圍內(nèi)(Tebbin et al.Mayo Clin.Proc.80(6):745-751(2005))。FGF23的水平大于正常范圍的上限值表示CYP24表達的異常升高。FGF23的水平距正常范圍的上端越遠，與CYP24表達異常升高的關(guān)聯(lián)度越大。根據(jù)本文所述的方法，升高的FGF23將至少為正常FGF23的2倍，如3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍或1000倍。

在另一個實施方式中，CYP24活性通過測定CYP24的一種或多種分解代謝副產(chǎn)物的水平來測定。從患者獲得的生物樣本中CYP24分解代謝副產(chǎn)物的水平可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種技術(shù)來測定。例如，CYP24分解代謝副產(chǎn)物可通過免疫分析，如酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫熒光分析等來測定。測定CYP24副產(chǎn)物如25-羥基維生素D₃-26,23-內(nèi)酯或1,25-二羥基維生素D₃-26,23-內(nèi)酯的另一種方法將利用它們與天然維生素D結(jié)合蛋白如維生素結(jié)合蛋白(DBP)或維生素D受體的高親和性。這類蛋白質(zhì)也可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來修飾，以對這類維生素D產(chǎn)物具有更高的親和性或選擇性。與目標(biāo)維生素D代謝物具有親和性的合成抗體或蛋白質(zhì)也可使用如噬菌體展示或酵母展示等技術(shù)來產(chǎn)生，且可加入試劑盒中以測定微生物D代謝物和CYP24分解代謝副產(chǎn)物的濃度。測定CYP24分解代謝副產(chǎn)物的其它技術(shù)包括高效液相色譜(HPLC)聯(lián)用紫外-可見光光譜、熒光光譜、質(zhì)譜等。CYP24活性也可通過測定CYP24的一種或多種分解代謝副產(chǎn)物與一種或多種相應(yīng)前體的比例來測定。CYP24分解代謝副產(chǎn)物包括24-羥基化的天然和合成維生素D化合物。天然CYP24分解代謝副產(chǎn)物的實例包括24,25-二羥基維生素D₃、1,24,25-三羥基維生素D₃、24,25-二羥基維生素D₂和1,24,25-三羥基維生素D₂。CYP24的其它產(chǎn)物也可被23-羥基化，如25-羥基維生素D₃-26,23-內(nèi)酯或1,25-二羥基維生素D₃-26,23-內(nèi)酯。CYP24分解代謝副產(chǎn)物的其它實例包括對合成的維生素D化合物進行24-羥基化獲得的產(chǎn)物。合成的維生素D化合物包括帕立骨化醇度骨化醇22-氧雜骨化三醇、阿法骨化醇和26,26,26,27,27,27-六氟骨化三醇(氟骨三醇)。雖然濃度可在血清或其它體液(如唾液)中測定，但前述物質(zhì)的測定優(yōu)選為測定血清濃度。測定可在短期或長期施用CYP24底物之后進行。

CYP24分解代謝副產(chǎn)物的對應(yīng)前體化合物包括如25-羥基維生素D₃、1,25-二羥基維生素D₃、25-羥基維生素D₂和1,25-二羥基維生素D₂。對應(yīng)前體化合物的水平可與CYP24催化分解副產(chǎn)物一起測定，且可通過CYP24的一種或多種分解代謝副產(chǎn)物與一種或多種相應(yīng)前體的比例來獲得CYP24活性的值。例如，可測定24,25-二羥基維生素D與25-羥基維生素D的比例，以及1,24,25-三羥基維生素D與1,25-二羥基維生素D的比例，且可使用這些比例來獲得CYP24活性。雖然濃度可在血清或其它體液(如唾液)中測定，但前述物質(zhì)的測定優(yōu)選為測定血清濃度。測定可在短期或長期施用CYP24底物之后進行。

在一個實施方式中，CYP24表達通過測定患者中CYP24mRNA的水平來確定。從患者獲取的生物樣本中mRNA的水平可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種技術(shù)測定。在Northern印跡中，例如，mRNA水平可通過將放射活性或熒光標(biāo)記的探針與mRNA樣本雜交，所述mRNA樣本經(jīng)電泳分離和/或結(jié)合到膜或其它固體支持物上。DNA微陣列技術(shù)提供了另一種定量mRNA水平的方法，其將熒光標(biāo)記的mRNA樣本與以預(yù)定模式固定在固體支持物上的數(shù)千DNA寡核苷酸中的數(shù)十個至數(shù)百個DNA寡核苷酸雜交。當(dāng)存在低水平的mRNA時，提供信號放大的技術(shù)特別有用。例如，實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)通過將靶mRNA轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的DNA分子，隨后通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增來將mRNA量化。通過使用熒光標(biāo)記的引物，在擴增過程中可實時檢測mRNA水平。

在一個實施方式中，CYP24表達通過測定患者中CYP24蛋白質(zhì)的水平來確定。從患者獲取的生物樣本中蛋白質(zhì)的水平可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種技術(shù)測定。在Western印跡中，例如，蛋白質(zhì)水平可通過檢測靶蛋白特異性抗體與蛋白質(zhì)樣本的結(jié)合來定量，所述蛋白質(zhì)樣本經(jīng)電泳分離和/或結(jié)合到膜或其它固體支持物上。依賴于特異性抗體與靶抗原(如CYP24)結(jié)合的分析可采用各種形式，除Western印跡(免疫印跡)外，這類分析的實例還包括酶聯(lián)免疫分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫熒光分析等。蛋白質(zhì)水平也可通過各種染色、分光光度法和光譜檢測技術(shù)，可選地結(jié)合各種分離技術(shù)來測定。檢測技術(shù)的實例包括考馬斯染色、銀染色、紫外可見光譜、熒光光譜、質(zhì)譜等。這些檢測技術(shù)可與以下分離技術(shù)聯(lián)用，如電泳、毛細管電泳、高效液相色譜(HPLC)、快速蛋白質(zhì)液相色譜(FPLC)、薄層層析(TLC)、用于基因定量的倍增技術(shù)等。

在一個實施方式中，CYP24活性通過測定患者中CYP24酶活性的水平來確定。從患者獲取的生物樣本中酶活性的水平可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種技術(shù)測定。對于CYP24，酶活性可通過測定25-羥基維生素D₃向?qū)?yīng)24-羥基化的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化來測定。例如，25-羥基維生素D₃向24,25-二羥基維生素D₃的轉(zhuǎn)化可通過將來自患者的生物樣本與放射活性標(biāo)記的25-羥基維生素D₃底物一起孵育、將反應(yīng)產(chǎn)物通過HPLC分離，和測定相比于總放射活性的24,25-二羥基維生素D₃峰的放射活性來分析。

一方面，CYP24表達和/或活性可在維生素D缺乏或維生素D充足的患者的一種或多種組織、血漿和細胞中測定。CYP24表達和/或活性可在通過活組織檢查獲得的組織中測定，且所述組織可包括，例如但不限于皮膚組織、腎組織、肝組織、甲狀旁腺組織等。在一個實施方式中，優(yōu)選腎組織。在另一個實施方式中，優(yōu)選甲狀旁腺組織。CYP24表達和/或活性可在細胞中測定，所述細胞包括獲得自血液的細胞，如外周血單核細胞，和從組織拭取獲得的細胞，如口腔細胞。在本文方法的一個實施方式中，相比于基于組織的過表達測定，CYP24表達和/或活性優(yōu)選通過可在腫瘤生長中出現(xiàn)的系統(tǒng)性指示物(如外周血單核細胞或血清)來測定。

一方面，CYP24表達和/或活性異常升高?；趤碜?0-100個“正常”供體的CYP24表達和/或活性的平均值，將測定的CYP24表達和/或活性的正常水平定義為1個相對單位(RU)，在“正?！惫w中，制備CYP24mRNA并將其用作對照。

CYP24的基準(zhǔn)水平可從收集自正常個體中的樣本(如腎、皮膚、血液、血清、血漿、唾液、口腔拭取物)建立，所述正常個體從基于如性別、種族和/或年齡的不同種群的正常個體中收集。CYP24RNA水平可通過實時PCR、倍增技術(shù)技術(shù)或其它技術(shù)從組織(如腎或皮膚活組織檢查)或細胞(如口腔拭取物)中建立。通過使用諸如倍增技術(shù)和Western印記等技術(shù)在這些組織中測定CYP24蛋白質(zhì)水平。將CYP24RNA水平或CYP24蛋白質(zhì)水平的平均值記為1RU。

24-羥基化的天然和合成維生素D化合物如24,25-二羥基維生素D₃、1,24,25-三羥基維生素D₃或內(nèi)酯絕對量的正常水平可基于標(biāo)準(zhǔn)曲線使用諸如HPLC、氣相色譜、質(zhì)譜和前述方法等技術(shù)從樣本(如血液、血漿、唾液)確立。醫(yī)生將24-羥基化的天然和合成維生素D化合物的絕對值作為正常水平。

如果患者中CYP24RNA的水平、CYP24蛋白質(zhì)的水平或24-羥基化的天然和合成維生素D化合物的絕對值落在“正常”范圍外，則患者具有異常升高的CYP24表達和/或活性。例如，CYP24表達和/或活性可為正常CYP24表達和/或活性的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍。預(yù)期異常升高的CYP24表達和/或活性可為正常CYP24表達和/或活性的數(shù)百倍或數(shù)千倍(如100x、500x、1000x、5000x等)。

在一個實施方式中，醫(yī)生通過收集來自患者的至少一種樣本(如血液、血漿、唾液、血清、口腔拭取物)并測定CYP24RNA水平、CYP24蛋白質(zhì)水平或24-羥基化天然或合成維生素D化合物的絕對值，將確定是否患者具有異常升高的CYP24表達和/或活性。如上所述，如果測得的一個或若干個參數(shù)落在“正常”范圍外，且優(yōu)選增加為至少2倍、3倍、4倍等，醫(yī)生將患者診斷為具有異常升高的CYP24活性和/或表達，且可開CYP24抑制劑的處方。

CYP24抑制劑可包括有機分子、單鏈或雙鏈核酸(如正義、反義或錯義寡核苷酸；適配子；正義、反義或錯義多核苷酸；正義、反義或錯義DNA；正義、反義或錯義RNA；和siRNA)、肽、碳水化合物和蛋白質(zhì)(如抗體、抗體片段、激素、激素類似物、糖蛋白和凝集素)。在一個實施方式中，CYP24抑制劑包括美國專利第6,380,408號(第6欄)中作為式IX(化合物1)公開的化合物，其為(5Z,7E,16Z,23E)-(1S,3R)-25-去甲-25-叔丁基磺?；?9,10-斷-5,7,10(19),16,23-膽甾五烯-1,3-二醇。在一個實施方式中，CYP24抑制劑包括氮雜茂化合物，如(R)-N-(2-(1H-咪唑-1-基)-2-苯乙基)-4′-氯聯(lián)苯-4-羧酰胺、酮康唑、甲硝唑、氯美噻唑、伊曲康唑和氟康唑。

CYP24的一類有機分子抑制劑包括維生素D化合物的類似物。具有CYP24抑制活性的1,25-二羥基維生素D₃類似物的實例公開在美國專利第6,380,408號、第7,101,865號、第7,166,585號和第6,982,258號以及美國專利申請第10/738,248號中(它們整體通過引用并入本文)，且包括23,23-二氟-24-砜維生素D₃化合物、25-砜維生素D₃化合物、24,24-二氟-25-砜維生素D₃化合物、24-亞砜亞胺維生素D₃化合物、16-烯-25-肟維生素D₃化合物和16-烯-25-肟醚維生素D₃化合物、24-砜維生素D₃化合物和24,24-二氟維生素D₃化合物。在方法的一個方面，分子可選自純CYP24抑制劑，如(5Z,7E)-(1S,3R)-24-(S)-苯基亞砜亞胺-25-去甲-9,10-斷-5,7,10(19)-膽甾三烯-1,3-二醇(參見美國專利第7,101,865號，化合物I(a))。在方法的另一個方面，分子可選自同時為CYP24抑制劑和維生素D激動劑的化合物，如(5Z,7E,16Z,23E)-25-去甲-25-叔丁基磺?；?9,10-斷-5,7,10(19),16,23-膽甾五烯-1,3β-二醇(參見美國專利第6,380,408號，式IX，化合物1)和(5Z,7E,16Z)-(1S,3R)-25-(O-烯丙基)-N-叔丁基肟-9,10-斷-5,7,10(19),16-膽甾五烯-1,3β-二醇(參見美國專利第6,982,258號，化合物I(g))。

CYP24抑制劑可選地與增加體內(nèi)維生素D水平的其它試劑聯(lián)合給藥。本領(lǐng)域已知的增加體內(nèi)維生素D水平的試劑包括在本公開范圍內(nèi)，且包括如維生素D₂、25-羥基維生素D₂、1,25-二羥基維生素D₂、維生素D₃、25-羥基維生素D₃和1,25-二羥基維生素D₃。優(yōu)選地，避免維生素D化合物，以有利于維生素D前激素、維生素D激素原和其類似物。

膽鈣化甾醇和麥角鈣化甾醇均通過主要位于人體內(nèi)肝中的酶代謝為激素原。膽鈣化甾醇代謝為激素原25-羥基維生素D₃，且麥角鈣化甾醇代謝為激素原25-羥基維生素D₂和24(S)-羥基維生素D₂。在某些細胞如腸上皮細胞中，膽鈣化甾醇和麥角鈣化甾醇也通過與肝中相同或類似的那些酶在肝外代謝為激素原。提高任一前體的濃度增加激素原的產(chǎn)生；類似地，降低前體的濃度降低激素的產(chǎn)生。膽鈣化甾醇和/或麥角鈣化甾醇(“膽鈣化甾醇/麥角鈣化甾醇”)血液水平的激增可暫時提高細胞內(nèi)維生素D濃度，加速激素原的產(chǎn)生，且升高細胞內(nèi)和血液的激素原濃度。

1,25-二羥基維生素D的血液水平由PTH參與的反饋機制來精確地調(diào)節(jié)。腎的1α-羥化酶(或CYP27B1)被PTH刺激且被1,25-二羥基維生素D抑制。當(dāng)1,25-二羥基維生素D的血液水平降低，甲狀旁腺通過細胞內(nèi)維生素D受體感知這種變化，并分泌PTH。分泌出的PTH刺激腎CYP27B1的表達，并以此增加維生素D激素的產(chǎn)生。隨著1,25-二羥基維生素D血液濃度的再次升高，甲狀旁腺進一步降低PTH分泌。隨著血液PTH水平降低，腎產(chǎn)生的維生素D激素下降。提高1,25-二羥基維生素D血液濃度也直接抑制CYP27B1進一步產(chǎn)生維生素D激素。

膽鈣化甾醇、麥角鈣化甾醇和25-羥基維生素D血液水平的顯著激增也可引起CYP24的上調(diào)響應(yīng)，以代謝分解暫時過量的維生素D底物。類似地，提高1,25-二羥基維生素D血液水平可引起CYP24活性的上調(diào)。

不想受任何具體的操作模式的限制，認為CYP24的過表達是至少一些維生素D缺乏類型的原因，其與物質(zhì)或陽光的缺乏無關(guān)，但可能由于物質(zhì)或陽光的缺乏而復(fù)雜化。

因此，在本文公開方法的一類實施方式中，將單獨施用CYP24抑制劑，或不施用維生素D化合物(如膽鈣化甾醇、麥角鈣化甾醇、維生素D激素原、維生素D激素或其類似物)，最優(yōu)選不施用活性維生素D激素或其類似物。在在本文公開方法的另一個實施方式中，將單獨施用CYP24抑制劑，或當(dāng)也施用維生素D化合物(如膽鈣化甾醇、麥角鈣化甾醇、維生素D激素原、維生素D激素或其類似物)時，將維生素D化合物以控釋制劑給藥以避免化合物(如緩釋或延長釋放制劑)的血液水平激增，或經(jīng)由慢推IV遞送方法給藥。

一方面，本公開提供了用于診斷分解代謝相關(guān)的維生素D缺乏癥的試劑盒。根據(jù)本公開的試劑盒提供了CYP24表達和/或活性的測定，且包括測定以下一種或多種性質(zhì)的試劑盒，所述性質(zhì)包括CYP24分解代謝副產(chǎn)物或此分解代謝副產(chǎn)物前體的水平、CYP24mRNA的水平、CYP24蛋白質(zhì)的水平和/或CYP24酶活性的水平。在一個實施方式中，試劑盒包括固定的抗CYP24抗體、標(biāo)記的抗CYP24抗體和用于使用如本文公開方法的說明書。涉及基于抗體檢測的其它試劑盒也在本公開預(yù)料內(nèi)。例如，用于測定CYP24表達的試劑盒可測定CYP24催化分解副產(chǎn)物的水平。試劑盒可包括用于測定催化分解副產(chǎn)物的一種或多種對應(yīng)前體水平的試劑。一種此類試劑盒可包括特異于CYP24分解代謝副產(chǎn)物的抗體(其功能性片段)，和特異于包括CYP24分解代謝副產(chǎn)物的維生素D化合物的抗體。預(yù)期對維生素D代謝物和CYP24分解代謝副產(chǎn)物具有高親和性的蛋白，如DBP或VDR或合成衍生的蛋白質(zhì)或大分子也可用于替代此類試劑盒中的抗體。預(yù)期將前述抗體之一固定在固體支持物上，且其它抗體具有檢測用的標(biāo)記。在另一個實例中，用于測定CYP24表達的試劑盒可包括固定的CYP24分解代謝副產(chǎn)物和抗CYP24抗體。使用上述試劑盒，通過測定CYP24分解代謝副產(chǎn)物與固定的CYP24分解代謝副產(chǎn)物競爭結(jié)合抗CYP24抗體的能力來測定CYP24活性。

另一方面，本公開包括用于治療或預(yù)防維生素D缺乏癥的藥物制劑，所述藥物制劑包括有效量的CYP24抑制劑。此制劑可進一步包括有效量的25-羥基維生素D₃。

另一方面，本公開包括用于治療或預(yù)防甲狀旁腺功能亢進的藥物制劑，所述藥物制劑包括有效量的CYP24抑制劑。此制劑可進一步包括有效量的25-羥基維生素D₃。此藥物制劑可用于治療慢性腎病如1期或2期CKD繼發(fā)的甲狀旁腺功能亢進。

每個醫(yī)生可根據(jù)患者的情況確定確切的制劑、給藥途徑和劑量。劑量和間隔可根據(jù)個人調(diào)整，以提供足以保持治療或預(yù)防效果的活性成分的水平。

此類制劑可為如顆粒、散劑、片劑、膠囊、糖漿、栓劑、注射劑、乳劑、酏劑、混懸劑或溶液的形式?？膳渲糜糜诟鞣N給藥途徑，如經(jīng)口服給藥、經(jīng)鼻給藥、經(jīng)直腸給藥、經(jīng)皮下注射、經(jīng)靜脈注射、經(jīng)肌肉注射或經(jīng)腹腔注射的制劑。以下劑型通過舉例給出，且不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。

對于口服、含服和舌下給藥，散劑、混懸劑、顆粒、片劑、丸劑、膠囊、軟膠囊和錠為可接受的固體劑型。這些劑型可通過將一種或多種CYP24抑制劑或雙功能CYP24抑制劑和本發(fā)明的VDR激動劑與至少一種添加劑如淀粉或其它添加劑混合來制備。適合的添加劑為蔗糖、乳糖、纖維素糖、甘露醇、麥芽糖醇、葡聚糖、淀粉、瓊脂、海藻酸、幾丁質(zhì)、殼聚糖、果膠、黃蓍膠、阿拉伯膠、明膠、膠原、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成的聚合物或甘油酯。可選地，口服劑型可包含輔助給藥的其它成分，如無活性的稀釋劑，或潤滑劑如硬脂酸鎂，或防腐劑如對羥基苯甲酸酯或山梨酸，或抗氧化劑如抗壞血酸、生育酚或半胱氨酸，崩解劑、粘結(jié)劑、增稠劑、緩沖劑、甜味劑、調(diào)味劑或加香劑。片劑和丸劑可進一步用本領(lǐng)域已知的適合包衣材料處理。

用于口服給藥的液體劑型可為藥學(xué)上可接受的乳劑、糖漿、酏劑、混懸劑和溶液形式，所述液體劑型可包含無活性的稀釋劑，如水。藥物制劑和藥劑可使用無菌液體，例如但不限于油、水、醇和它們的組合制備成懸浮液或溶液?？杉尤胨帉W(xué)上適合的表面活性劑、混懸劑、乳化劑以用于口服或腸胃外給藥。

如上所述，混懸劑可包括油。此類油包括但不限于花生油、芝麻油、棉籽油、玉米油和橄欖油?；鞈抑苿┛梢舶ㄖ舅岬孽?，如油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、脂肪酸甘油酯和乙?；闹舅岣视王ァ；鞈抑苿┛砂ù迹绲幌抻谝掖?、異丙醇、十六醇、甘油和丙二醇。醚例如但不限于聚乙二醇、石油烴如礦物油和石油，和水也可用在混懸制劑中。

對于經(jīng)鼻給藥，藥物制劑和藥劑可為噴霧劑或氣溶膠，所述噴霧劑或氣溶膠包含適合的溶劑和可選地其它化合物，例如但不限于穩(wěn)定劑、抗菌劑、抗氧化劑、pH調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、生物利用度調(diào)節(jié)劑(bioavailability modifiers)和它們的組合。用于氣溶膠制劑的推進劑可包括壓縮空氣、氮氣、二氧化碳或烴類低沸點溶劑。

可注射劑型通常包括可使用適合的分散劑或濕潤劑和懸浮劑制備的含水混懸劑或含油混懸劑?？勺⑸鋭┬涂蔀槭褂萌軇┗蛳♂寗┲苽涞娜芤合嗷蚧鞈覄┬问健？山邮艿娜軇┗蜉d體包括滅菌水、Ringer溶液或等滲壓的鹽水溶液。或者，無菌油可用作溶劑或懸浮劑。優(yōu)選地，油或脂肪酸為非揮發(fā)性的，包括天然或合成油、脂肪酸、甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯。

對于注射，藥物制劑和/或藥劑可為適于用上述適合溶液重建的散劑。這些散劑的實例包括但不限于凍干粉、旋轉(zhuǎn)干燥粉或噴霧干燥粉、無定形粉末、顆粒、沉淀物或微粒。對于注射，制劑可選地包含穩(wěn)定劑、pH調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、生物利用度調(diào)節(jié)劑和它們的組合。

對于直腸給藥，藥物制劑和藥劑可為用于在腸、乙狀結(jié)腸和/或直腸中釋放化合物的栓劑、軟膏劑、灌腸劑、片劑或乳膏劑。直腸栓劑可通過將本發(fā)明的一種或多種化合物或此化合物的藥學(xué)上可接受的鹽或互變異構(gòu)體與可接受的載體如可可脂或聚乙二醇混合來制備，所述直腸栓劑在正常存儲溫度下以固相存在，且在適用于體內(nèi)如直腸內(nèi)釋放藥物的那些溫度下以液相存在。油也可用于制備軟明膠型和栓劑制劑。水、鹽水、葡萄糖水溶液和相關(guān)糖溶液以及甘油可用于制備混懸制劑，所述混懸制劑也可包含懸浮劑，如果膠、卡波姆、甲基纖維素、羥丙基纖維素或羧甲基纖維素，以及緩沖劑和防腐劑。

可將本發(fā)明的制劑設(shè)計為下述的速效、速釋、長效和緩釋型。因此，也可配制用于控釋和慢釋的藥物制劑。

本發(fā)明組合物也可包括如膠束或脂質(zhì)體，或一些其它包裹的形式，或可以延遲釋放的形式給藥以提供更長的存儲和/或遞送效果。因此，可將藥物制劑和藥劑壓縮為小球或圓柱體，并經(jīng)肌肉或經(jīng)皮下作為積存注射劑(depot injections)植入或作為植入物如支架。此類植入物可采用已知的惰性材料，如硅酮和生物可降解性聚合物。

具體劑量可根據(jù)對象的病情、年齡、體重、一般健康情況、性別和飲食、服藥間隔、給藥途徑、排泄率和藥物的組合來調(diào)節(jié)。包含有效量的任何以上劑型都在常規(guī)實驗范圍內(nèi)，因此也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

除了上述那些代表性的劑型外，藥學(xué)上可接受的賦形劑和載體通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，因此也包含在本發(fā)明內(nèi)。這類賦形劑和載體描述在如"Remingtons Pharmaceutical Sciences"Mack Pub.Co.,New Jersey(1991)中，其通過引用并入本文。

維生素D化合物的適合的控釋制劑公開在申請PCT/US2008/061579中，此申請作為WIPO公開WO 2008/134512(2008年11月6日)公布，且其公開通過引用全部并入本文。預(yù)期此類制劑也可包括相容性CYP24抑制劑和雙功能CYP24抑制劑和VDR激動劑。

實施例

提供以下實施例是用于說明而非要限制本發(fā)明的范圍。

以下實施例支持以下結(jié)論。

在來自正常和尿毒癥大鼠的組織中，1,25-二羥基維生素D₃強力地誘導(dǎo)CYP24基因表達。

與其它組織相比，CYP24的組成型表達在健康腎中相對較高。然而，尿毒癥大鼠中，CYP24的基礎(chǔ)表達顯著升高。這提示與尿毒癥狀態(tài)有關(guān)的機理可能涉及CYP24表達的調(diào)節(jié)。

與正常動物的甲狀旁腺相比，在尿毒癥動物的甲狀旁腺中1,25-二羥基維生素D₃顯著地誘導(dǎo)CYP24，提示重復(fù)給藥可導(dǎo)致抗性增加。

尿毒癥大鼠中CYP27B1的表達與1,25-二羥基維生素D₃水平降低無關(guān)，這提示CYP24在降低尿毒癥維生素D水平中起更重要的作用。

在正常動物中，CYP24表達依賴于維生素D的狀況；維生素D缺乏癥顯著地降低CYP24表達水平。尿毒癥動物顯示出較高的CYP24表達基礎(chǔ)水平，此水平在維生素D缺乏癥狀態(tài)下不改變。這提示在尿毒癥中，獨立于維生素D的機理調(diào)節(jié)CYP24水平。這會對尿毒癥中維生素D狀態(tài)產(chǎn)生影響。

尿毒癥腎中CYP24基礎(chǔ)表達的升高可能是導(dǎo)致潛在25(OH)D₃和1,25-二羥基維生素D₃缺乏癥以及抵抗維生素D激素替補療法的主要機理。抑制CYP24的化合物可用于保持維生素D狀態(tài)和克服CYP24對治療的抗性。

FGF23與1,25-二羥基維生素D協(xié)同作用以誘導(dǎo)CYP24RNA產(chǎn)生。在尿毒癥的情況中，高水平的FGF23可能導(dǎo)致進一步升高CYP24，使得患者抵抗維生素D治療。

CYP24水平在維生素D缺乏的動物中降低，并在用25-羥基維生素D治療后增至正常或較高水平。

CYP24水平在尿毒癥維生素D缺乏的大鼠中不改變，且在用25-羥基維生素D治療后不增加，這提示尿毒癥大鼠中缺乏對維生素D的控制。

與維生素D缺乏的動物相比，在維生素D缺乏的尿毒癥大鼠中CYP24RNA水平增加。這可以解釋為何在施用25-羥基維生素D₃兩周后，與維生素D缺乏的動物相比，在維生素D缺乏的尿毒癥大鼠中1,25-二羥基維生素D₃的水平較低。

實施例1

維生素D缺乏癥的動物模型

為了獲得維生素D缺乏癥的動物模型，用富含腺嘌呤的食物喂養(yǎng)大鼠。在7天后，與用對照食物喂養(yǎng)的動物相比，通過完整PTH(iPTH)Elisa試劑盒在用腺嘌呤喂養(yǎng)的大鼠中觀察到甲狀旁腺激素(PTH)水平升高，且在29天后，繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進已出現(xiàn)在用腺嘌呤喂養(yǎng)的大鼠中，但未出現(xiàn)在用對照食物喂養(yǎng)的動物中(圖1)。通過用維生素D化合物治療用腺嘌呤喂養(yǎng)的動物，顯著降低iPTH水平。如圖2所示，通過用1,25-(OH)₂-D₃(骨化三醇或1,25-二羥基維生素D₃)、25-OH-D₃(骨化二醇或25-羥基維生素D₃)或1,25-(OH)₂-D₂(1,25-二羥基維生素D₂)治療用腺嘌呤喂養(yǎng)的動物，在用腺嘌呤喂養(yǎng)的動物中iPTH水平恢復(fù)至與用對照食物喂養(yǎng)的動物類似的水平。

通過用質(zhì)譜測定活性形式的維生素D，即1,25-(OH)₂-D₃(骨化三醇或1,25-二羥基維生素D₃)的水平來分析用腺嘌呤喂養(yǎng)的動物和對照動物的維生素D激素狀態(tài)。與用對照食物喂養(yǎng)的動物相比，用腺嘌呤喂養(yǎng)的動物顯示出維生素D激素狀態(tài)的降低(圖3)。通過用1,25-(OH)₂-D₃治療用腺嘌呤喂養(yǎng)的動物，用腺嘌呤喂養(yǎng)的動物中維生素D狀態(tài)恢復(fù)至用對照食物喂養(yǎng)的動物的水平。相反，用25-(OH)₂-D₃(骨化二醇或25-羥基維生素D₃)或1,25-(OH)₂-D₂(1,25-二羥基維生素D₂)治療用腺嘌呤喂養(yǎng)的動物未顯著影響這些動物的1,25-(OH)₂-D₃水平(圖3)。

實施例2

維生素D缺乏癥中的CYP24表達

為了確定維生素D缺乏癥和CYP24水平間的關(guān)系，在用腺嘌呤喂養(yǎng)的大鼠和用對照食物喂養(yǎng)的動物中通過qRT-PCR測定CYP24表達。與用對照食物喂養(yǎng)的動物的腎組織相比，在用腺嘌呤喂養(yǎng)的大鼠的腎組織中CYP24表達異常升高為約7倍。用維生素D化合物治療用腺嘌呤喂養(yǎng)的動物進一步誘導(dǎo)CYP24。如圖4所示，通過用1,25-(OH)₂-D₃(骨化三醇或1,25-二羥基維生素D₃)、25-OH-D₃(骨化二醇或25-羥基維生素D₃)或1,25-(OH)₂-D₂(1,25-二羥基維生素D₂)治療用腺嘌呤喂養(yǎng)的動物，使得CYP24表達活性升高為2倍至25倍。與用對照食物喂養(yǎng)的動物的甲狀旁腺相比，在用腺嘌呤喂養(yǎng)的動物的甲狀旁腺組織中CYP24表達活性異常升高為約3倍(圖5)。用維生素D化合物治療用腺嘌呤喂養(yǎng)的動物顯著誘導(dǎo)CYP24。如圖5所示，通過用1,25-(OH)₂-D₃(骨化三醇或1,25-二羥基維生素D₃)、25-OH-D₃(骨化二醇或25-羥基維生素D₃)或1,25-(OH)₂-D₂(1,25-二羥基維生素D₂)治療用腺嘌呤喂養(yǎng)的動物，使得CYP24表達活性升高為50倍至14,000倍。

實施例3

維生素D缺乏癥中的FGF23表達

為了確定維生素D缺乏癥和成纖維細胞生長因子-23(FGF23)水平間的關(guān)系，在用腺嘌呤喂養(yǎng)的大鼠和用對照食物喂養(yǎng)的動物中測定血清FGF23水平。與用對照食物喂養(yǎng)的動物相比，在用腺嘌呤喂養(yǎng)的動物中血清FGF23水平異常升高為至少53倍(圖6)。用維生素D化合物治療用腺嘌呤喂養(yǎng)的動物也顯示出FGF23水平升高。如圖6所示，與用對照食物喂養(yǎng)的動物相比，通過用1,25-(OH)₂-D₃(骨化三醇或1,25-二羥基維生素D₃)、25-OH-D₃(骨化二醇或25-羥基維生素D₃)或1,25-(OH)₂-D₂(1,25-二羥基維生素D₂)治療用腺嘌呤喂養(yǎng)的動物，使得FGF23水平升高為74倍。

在來自用腺嘌呤喂養(yǎng)的大鼠和用對照食物喂養(yǎng)的動物的腎組織中，測定骨形成生物標(biāo)志物，即FGF23和骨鈣蛋白的水平。與用對照食物喂養(yǎng)的動物相比，在用腺嘌呤喂養(yǎng)的動物中FGF23升高為約55倍且骨鈣蛋白升高為約1.5倍(圖7)。

實施例4

25-羥基維生素D治療中的CYP24表達

圖8顯示了在用維生素D(25-羥基維生素D₂和25-羥基維生素D₃)處理2周的大鼠中，相對CYP24誘導(dǎo)的圖。對正常大鼠經(jīng)靜脈施用16μg/kg 25-羥基維生素D₂、25-羥基維生素D₃和對照載體2周。采集血液并通過實時PCR測定CYP24表達。

實施例5

在人對象中分析(5Z,7E,16Z,23E)-(1S,3R)-25-去甲-25-叔丁基磺?；?9,10-斷-5,7,10(19),16,23-膽甾五烯-1,3-二醇對25-羥基維生素D水平的影響。對這些對象在第1、3、5、8和10天時施用安慰劑或此化合物。在此化合物最后施用24小時后，測定25-羥基維生素D水平。血清25-羥基維生素D的百分?jǐn)?shù)變化顯示在圖9中(對于90mcg和180mcg，p＝0.1)。

實施例6

每天用載體或0.5mcg/kg 1,25-二羥基維生素D₃經(jīng)靜脈治療SD大鼠，持續(xù)1周。在最后一次給藥后24小時采集器官。CYP24基因表達通過實時PCR測定。結(jié)果顯示在圖10中。

用標(biāo)準(zhǔn)食物(正常)或含0.75％腺嘌呤的誘導(dǎo)尿毒癥的食物(尿毒癥)喂養(yǎng)SD大鼠。隨后每天用載體或0.5mcg/kg 1,25-二羥基維生素D₃經(jīng)靜脈對動物給藥，持續(xù)7周。在最后一次給藥后24小時采集器官。CYP24基因表達通過實時PCR測定，并相對于GAPDH水平進行標(biāo)準(zhǔn)化。相對于載體治療組標(biāo)準(zhǔn)化相對表達值(相對表達＝1)。結(jié)果顯示在圖11中。

圖10和11顯示，與正常大鼠相比，在尿毒癥大鼠中CYP24的基礎(chǔ)表達在腎中顯著升高(圖10)，但在甲狀旁腺中未顯著升高(圖11)。然而，與正常動物相比，尿毒癥動物甲狀旁腺中1,25-二羥基維生素D₃(1α,25(OH)₂D₃)誘導(dǎo)的CYP24表達顯著增加?！?”是指在正常和尿毒癥大鼠中，載體和1,25-二羥基維生素D₃治療間CYP24表達有顯著差異。“**”是指載體治療的正常大鼠和尿毒癥大鼠之間有顯著差異。是指在用1,25-二羥基維生素D₃治療的正常大鼠和尿毒癥大鼠之間CYP24誘導(dǎo)水平之間有顯著差異。將p值<0.05設(shè)為顯著的界限。數(shù)據(jù)用平均值±SEM表示。每個柱上的數(shù)值代表相對于正常-載體的相對誘導(dǎo)倍數(shù)。

實施例7

使用與對應(yīng)于圖11的以上實施例6所述相同的方法測定CYP24和CYP27B1表達。25(OH)D₃和1,25-二羥基維生素D₃的血清水平通過LC-MS測定。血清PTH根據(jù)制造商的說明書通過ELISA IMMUTOPICS(San Clemente,CA,USA)測定。簡言之，將血清樣本用[26,27-²H₆]25(OH)D₃或[25,26-²H₆]1,25-二羥基維生素D₃加同位素，并溶解在乙腈以作為內(nèi)標(biāo)。使用Accubond II ODS-C18 100mg,1mL SPE濾柱(Agilent Technologies)從血清中提取1,25-二羥基維生素D₃或25(OH)D₃和內(nèi)標(biāo)。收集的餾分在穩(wěn)定的氮氣流下蒸發(fā)至干燥，將剩余物再溶解于50μL甲醇/H₂O(80/20；v/v)中并用LC-MS/MS(Waters Alliance HPLC-Waters Quattro Ultima mass spectrometer)分析。相對于載體治療組標(biāo)準(zhǔn)化相對表達值(相對表達＝1)。結(jié)果顯示在圖12中。

圖12顯示在CYP27B1不變的情況下，尿毒癥大鼠中CYP24基礎(chǔ)表達的增加可導(dǎo)致較低的1,25-二羥基維生素D₃水平。用1,25-二羥基維生素D₃治療引起血清25-(OH)D₃水平的降低。用1,25-二羥基維生素D₃治療引起PTH降低，但也顯著誘導(dǎo)CYP24表達。對于CYP27B1(*)和CYP24(**)，星號代表正常和尿毒癥組之間在統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異。在上面的表格中，(*)是指正常和尿毒癥大鼠之間維生素D水平有顯著差異。使用以p值<0.05為界限的student’s獨立t檢驗來檢驗其統(tǒng)計學(xué)顯著性。數(shù)據(jù)用平均值±SEM表示。

實施例8

通過用缺乏維生素D的食物喂養(yǎng)SD大鼠6周來誘導(dǎo)維生素D缺乏癥。用含維生素D的標(biāo)準(zhǔn)食物喂養(yǎng)正常大鼠。通過在最后2周持續(xù)口服給藥(管飼法)0.2％的腺嘌呤溶液來誘導(dǎo)尿毒癥。通過經(jīng)口管飼法對非尿毒癥的對照大鼠施用載體。在最后一次施用腺嘌呤后24小時采集血清和器官?；虮磉_通過實時PCR測定。實施例7詳述了25(OH)D₃和1,25-二羥基維生素D₃的血清水平的測定。結(jié)果顯示在圖13中。

圖13顯示CYP24基礎(chǔ)表達的增加不依賴于尿毒癥大鼠中維生素D代謝物的水平?！?”是指各個組與非尿毒癥的正常組之間有顯著差異?！?*”代表CYP27B1正常食物和CYP27B1維生素D缺乏(VD Def)食物之間有顯著差異。使用以p值<0.05為界限的student’s獨立t檢驗來檢驗其統(tǒng)計學(xué)顯著性。數(shù)據(jù)用平均值±SEM表示。不可檢測的水平表示為“ND”。

實施例9

將HEK細胞以每孔(24孔板)25,000個細胞接種，并用1,25-二羥基維生素D₃(10nM)單獨孵育，或用1,25-二羥基維生素D₃(10nM)與CYP24抑制劑((MK-24(S)-S(O)(NH)-Ph-1，參見美國專利第7,101,865號，化合物I(a))(10nM)一起孵育6、24、48和72小時。收集細胞，并使用試劑制備RNA。使用實時PCR定量CYP24。結(jié)果顯示在圖14中。

結(jié)果顯示，在CYP24抑制劑MK-24(S)-S(O)(NH)-Ph-1存在下，1,25-二羥基維生素D₃顯著延長了CYP24誘導(dǎo)。

實施例10

將HEK細胞以2000細胞/孔的密度轉(zhuǎn)移至96孔板中。在96孔板中生長2天后，將細胞用終濃度為10^-6-10^-11的1,25-二羥基維生素D₃和終濃度分別為0、1、10和50nM的MK-24(S)-S(O)(NH)-Ph-1化合物共同處理。在過夜處理后，持續(xù)16小時向細胞中加入[³H]-胸腺嘧啶，KGM培養(yǎng)基濃度為0.2mCi/孔。在加入25ml閃爍液體后，使用閃爍計數(shù)器來計算放射活性的加入。結(jié)果顯示在圖15中。數(shù)據(jù)表示取決于1,25-二羥基維生素D₃濃度的以cpm計的胸腺嘧啶加入。每個數(shù)據(jù)點代表至少4個獨立的試驗。

結(jié)果顯示抑制CYP24活性可將所培養(yǎng)HEK細胞中1,25-二羥基維生素D₃的抗增殖效果增加約3個數(shù)量級。

實施例11

將HPK1a-ras細胞用含或不含100ng/mL FGF23的0、1、10和100nM1,25-二羥基維生素D₃(骨化三醇)處理，并在8小時后測定CYP24RNA表達。結(jié)果顯示FGF23的存在可協(xié)同1,25-二羥基維生素D₃一起誘導(dǎo)CYP24RNA產(chǎn)生(圖16)。

實施例12

用標(biāo)準(zhǔn)食物或維生素D缺乏的食物喂養(yǎng)SD大鼠4周。隨后按圖17中每個軸的標(biāo)記，在2周內(nèi)持續(xù)每天對動物注射0.6、3或18mcg/kg 25-羥基維生素D₃或載體。在隨后一次注射后24小時采集腎，并通過實時PCR測定CYP24mRNA水平。結(jié)果顯示在圖17中。

實施例13

用標(biāo)準(zhǔn)食物(腺嘌呤載體組)或維生素D缺乏的食物(維生素D缺乏/腺嘌呤載體組)喂養(yǎng)SD大鼠4周。在此處理后，持續(xù)2周每天對動物口服給予100mg腺嘌呤。隨后按圖18中每個軸的標(biāo)記，在另外2周內(nèi)持續(xù)每天對動物注射0.6或18mcg/kg 25-羥基維生素D₃或載體。在隨后一次注射后24小時采集腎，并通過實時PCR測定CYP24mRNA水平。結(jié)果顯示在圖18中。

實施例14

圖19顯示與持續(xù)2周施用6或18mcg/kg 25-羥基維生素D的維生素D缺乏的大鼠相比，在維生素D缺乏的尿毒癥大鼠中1,25-二羥基維生素D₃的水平。

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在全文中，當(dāng)組合物被描述為包括組分或材料時，除非另有說明，預(yù)計組合物也可基本上由所述組分或材料的任意組合組成，或由所述組分或材料的任意組合組成。

本文公開方法的實施和其單獨步驟可手動和/或在電子裝置輔助下進行。雖然已參照具體實施方式描述了方法，但本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易明白可使用其它方式進行與方法相關(guān)的方案。例如，除非另有說明，可改變各步驟的順序而不背離所述方法的范圍或精神。此外，一些單獨的步驟可組合、省略或進一步細分為附加步驟。

在禁止對在人體上實施的方法授予專利權(quán)的司法權(quán)中，向人類對象“施用”組合物的含義應(yīng)被限制為將受控的物質(zhì)開處方，其中人類對象能夠通過任何技術(shù)(例如口服、吸入、局部施用、注射、插入等)自己施用所述物質(zhì)。希望有一種最寬泛的合理解釋，這種解釋符合限定可授予專利的主題的法律或法規(guī)。在不禁止對在人體上實施的方法授予專利權(quán)的司法權(quán)中，組合物的“施用(給藥)”既包括在人體上實施的方法也包括上述行為。

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