本發(fā)明涉及利用病毒載體生產(chǎn)狂犬病活載體疫苗的方法及其產(chǎn)品和用途，特別是一種利用腺病毒載體表達狂犬病病毒G蛋白和細菌鞭毛蛋白制備狂犬病活載體疫苗的方法及其產(chǎn)品和用途。

背景技術(shù)：

狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒(rabies virus，RV)感染引起的人獸共患急性接觸性病傳染病，一旦發(fā)病，則100％死亡。全球每年約有55000人死于該病，我國近5年每年死亡約3000人左右，僅次于印度，主要由犬咬傷引起。因此，預(yù)防狂犬病的主要措施是對犬、貓和野生動物進行狂犬病疫苗的免疫接種。目前我國獸用的狂犬病疫苗主要有滅活苗和弱毒苗。盡管傳統(tǒng)疫苗在狂犬病預(yù)防控制中仍占主導(dǎo)地位，但由于生產(chǎn)成本昂貴，以及滅活不徹底而造成散毒的潛在危險等因素的存在，限制了其的廣泛使用。因此，研制安全、高效的新型狂犬病分子疫苗仍顯得非常必要。

活載體疫苗是近年來研究的熱點之一，被認為是一種很有開發(fā)前景的疫苗。制苗時往活載體中插入外源保護性目的基因，由于外源基因已經(jīng)成為作為載體的病毒或細菌的自身結(jié)構(gòu)的一部分，故所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答水平通常不低于完整病毒或細菌相應(yīng)成分所引起的免疫強度。重組痘病毒載體和重組腺病毒載體具有宿主范圍廣，對外界有一定的抵抗力，被認為是基因工程疫苗的優(yōu)良載體。雖然對重組痘病毒載體的研究起步最早，但由于痘苗病毒能在哺乳動物體內(nèi)復(fù)制，人們對它的生物安全性存在某種疑問，擔心與天花病毒類似的痘苗病毒在動物上應(yīng)用會進化出對人類有致病性的新病毒。而復(fù)制缺陷型腺病毒常缺失對于病毒復(fù)制所必需的病毒早期基因E1區(qū)，使其在動物體內(nèi)不能復(fù)制，因此研制重組復(fù)制缺陷型腺病毒狂犬病疫苗更為安全和有效。

狂犬病毒有5種結(jié)構(gòu)蛋白，其中糖蛋白G與病毒的感染和免疫有密切關(guān)系。研究表明G是唯一誘導(dǎo)中和抗體的蛋白，也能刺激細胞免疫應(yīng)答，可抵抗狂犬病毒外周和腦內(nèi)途徑的攻擊。近年來研制的狂犬病基因工程重組疫苗，大都以糖蛋白cDNA 作為目的基因。這些重組疫苗雖然可以刺激特異性抗體的產(chǎn)生，并產(chǎn)生一定水平的保護力，但是，單一的糖蛋白G其總體誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平并不高，有待于提高其水平。

細菌的鞭毛蛋白是鞭毛絲狀部的主要成分，在細菌性病原體的毒力和細菌的運動中起著重要作用。在大多數(shù)沙門氏菌株中，有兩個基因(fljB和fliC)可以編碼鞭毛抗原。fliC編碼一相鞭毛蛋白FliC，fljB編碼二相鞭毛蛋白FljB。鞭毛蛋白也是一種病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，可以與哺乳動物細胞上的TLR5結(jié)合介導(dǎo)信號的傳導(dǎo)。先天性免疫系統(tǒng)能夠通過TLRs識別細菌上保守的PAMPs，如脂多糖和鞭毛蛋白。這些結(jié)構(gòu)能夠誘導(dǎo)強烈的炎癥反應(yīng)，并最終激活獲得性免疫反應(yīng)。

活載體疫苗具有安全、高效、生產(chǎn)費用低廉等優(yōu)點，但目前尚未有狂犬病活載體疫苗疫苗上市。綜合狂犬病分子疫苗的研究現(xiàn)狀，我們認為以腺病毒為表達載體的基因工程重組狂犬病疫苗(或稱活載體疫苗)將具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種利用腺病毒載體表達狂犬病病毒G蛋白和細菌鞭毛蛋白制備狂犬病活載體疫苗的方法，從而獲得安全、高效的狂犬病疫苗。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明的一種利用腺病毒載體表達狂犬病病毒G蛋白和細菌鞭毛蛋白制備狂犬病活載體疫苗的方法，包括如下步驟：

(1)制備目的基因：

設(shè)計引物，通過PCR的方法擴增出狂犬病病毒(Rabies Virus，RV)的抗原蛋白G基因與細菌鞭毛蛋白FIjB或FIiC基因；

(2)構(gòu)建重組復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體：

將步驟(1)擴增的到的抗原蛋白G基因與細菌鞭毛蛋白FIjB或FIiC基因一同插入到復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體特異性啟動子和終止子之間，檢測抗原蛋白G基因以及FIjB或FIiC基因是否已經(jīng)整合到腺病毒穿梭載體中，構(gòu)建得到含有G-FIjB或G-FIiC的重組復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體，命名為PAdTrack-CMV/G-FIjB或PAdTrack-CMV/G-FIiC；

(3)獲得復(fù)制缺陷型腺病毒質(zhì)粒：

將獲得的重組復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體PAdTrack-CMV/G-FIjB或 PAdTrack-CMV/G-FIiC與腺病毒骨架載體PAdEasy-1通過在大腸桿菌中進行質(zhì)粒間同源重組從而得到重組腺病毒質(zhì)粒；

(4)用重組腺病毒質(zhì)粒產(chǎn)生基因組結(jié)構(gòu)均一的重組腺病毒，包括以下操作：

1)用Pac I酶切步驟(3)得到的重組腺病毒質(zhì)粒，

2)轉(zhuǎn)染293細胞，

3)接種293細胞，

4)獲得基因組結(jié)構(gòu)均一的重組腺病毒，收集病毒感染的病變細胞，連同上清凍存，即得。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(1)中用于擴增抗原蛋白基因G和細菌鞭毛蛋白FIjB和FIiC基因的擴增引物為：

GF：5’GCAGATCTGCCACCATGGTTCCTCAAGCTCTTTTG3’(含有Bgl Ⅱ酶切位點)

GR：5’GCGTCGACTCACAGTCTGATCTCACC 3’(含有Sal Ⅰ酶切位點)

FIjBF：5’ATTGTCGACGCCACCATGGCACAAGTAATCAACACT 3’(含有Sal Ⅰ位點)

FIjBR：5’GCTCTAGATTAACGTAACAGAGACAGC 3’(含有Xba Ⅰ酶切位點)

FIiCF：5’ATTGTCGACGCCACCATGGCACAAGTCATTAATACA 3’(含有Sal Ⅰ位點)

FIiCR：5’GCAAGCTTTTAACGCAGTAAAGAGAG 3’(含有HindⅢ酶切位點)

其中，ATG為起始密碼子；狂犬病病毒G基因以狂犬病毒aG毒株為模板使用引物對GF/GR進行擴增；細菌鞭毛蛋白FIjB或FIiC基因分別以鼠傷寒沙門氏菌的鞭毛蛋白基因為模板使用引物對FIjBF/FIjBR或FIiCF/FIiCR進行擴增。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，在步驟(2)中，所述的腺病毒載體啟動子為CMV；終止子為PolyA；所述的重組復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體的構(gòu)建包括以下操作：

1)將擴增得到的目的基因G經(jīng)Bgl Ⅱ、Sal Ⅰ雙酶切，形成帶有粘性末端的目的基因片段；

2)同時，將腺病毒穿梭載體PAdTrack-CMV經(jīng)Bgl Ⅱ、Sal Ⅰ雙酶切，得到線性化的載體；

3)使用T4DNA連接酶對上述產(chǎn)物進行粘端連接；

4)按常規(guī)方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌，在含卡那抗性的瓊脂平板上篩選， 挑選克隆后，提取質(zhì)粒；

5)采用酶切、PCR擴增方法鑒定，得到陽性重組質(zhì)粒，命名為PAdTrack-CMV/G；

6)將回收得到的目的基因FIjB經(jīng)Sal Ⅰ、Xba Ⅰ雙酶切，目的基因FIiC經(jīng)Sal Ⅰ、HindⅢ雙酶切，形成帶有粘性末端的目的基因片段；

7)同時，將陽性重組質(zhì)粒PAdTrack-CMV/G經(jīng)Sal Ⅰ、Xba Ⅰ雙酶切或Sal Ⅰ、HindⅢ雙酶切，得到線性化的載體；

8)使用T4DNA連接酶對步驟(6)和(7)的產(chǎn)物進行粘端連接；按常規(guī)方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌JM109，在含卡那抗性的瓊脂平板上篩選，挑選克隆后，提取質(zhì)粒；采用酶切、PCR擴增方法鑒定，得到陽性重組質(zhì)粒，命名為PAdTrack-CMV/G-FIjB或PAdTrack-CMV/G-FIiC。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，在步驟(3)中，獲得復(fù)制缺陷型腺病毒質(zhì)粒的過程包括以下操作：

1)將重組復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體PAdTrack-CMV/G-FIjB或PAdTrack-CMV/G-FIiC用Pme I單酶切以線性化；

2)取PAdEasy-1與步驟1)得到的線性化后的重組復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體混合，高壓電轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183；

3)電轉(zhuǎn)后將細胞在培養(yǎng)液中復(fù)蘇，取細胞涂入含卡那霉素的培養(yǎng)板中，培養(yǎng)；

4)挑選卡那霉素抗性克隆，小量提取質(zhì)粒DNA，用0.8％瓊脂糖凝膠進行電泳遷移率分析，并進行限制性內(nèi)切酶圖譜分析；

5)將所得的重組腺病毒質(zhì)粒高壓電轉(zhuǎn)化入宿主菌，在此宿主菌中可獲得大量高質(zhì)量的質(zhì)粒，挑取目的克隆。其中，優(yōu)選的，所述的宿主菌為DH10B。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，在步驟(4)中，用重組腺病毒質(zhì)粒產(chǎn)生基因組結(jié)構(gòu)均一的重組腺病毒的各操作的具體做法為：

1)取步驟(3)得到的重組腺病毒質(zhì)粒，用Pac I酶切，完全消化以切去包括Ori和Kan抗性基因在內(nèi)的質(zhì)粒構(gòu)件，并暴露其反轉(zhuǎn)末端重復(fù)序列(ITR)；

2)脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，在組織培養(yǎng)皿中接種293細胞進行轉(zhuǎn)染；

3)取病毒上清接種293細胞，以含2％小牛血清的完全DMEM培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細胞病變，到293細胞完全病變；

4)收集病毒感染的病變細胞，檢測抗原蛋白G-FIjB和G-FIiC基因是否獲得表達，最后連同上清液凍存。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟2)中，所述的脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染包括以下操作步 驟：

①稀釋Pac I酶切線性化的重組腺病毒質(zhì)粒至DMEM培養(yǎng)液中；

②然后將脂質(zhì)體懸液加至DMEM培養(yǎng)液中，充分將二者混勻，室溫下溫育；

③在此期間吸棄細胞原培養(yǎng)液，用DMEM培養(yǎng)液洗細胞一次；

④往每平皿中加DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，在5％CO2培養(yǎng)箱中溫育后吸棄含DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)液，

⑤補加含10％小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后收集細胞，反復(fù)凍融。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟4)中通過觀測綠色熒光蛋白表達的辦法，包括利用倒置顯微鏡觀測細胞病變和熒光顯微鏡觀測報告基因綠色熒光蛋白的表達來確定抗原蛋白G-FIjB和G-FIiC基因是否獲得表達。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(2)中通過采用PCR和限制性內(nèi)切酶鑒定，進行瓊脂糖凝膠電泳分析檢測的方法來確定抗原蛋白G基因以及FIjB或FIiC基因是否已經(jīng)整合到腺病毒載體中。

進一步的，本發(fā)明還提出了由以上任一項所述的方法制備得到的狂犬病活載體疫苗以及所述的狂犬病活載體疫苗在制備預(yù)防或治療狂犬病的藥物中的用途。

本發(fā)明將狂犬病毒G蛋白基因分別與細菌鞭毛蛋白FIjB或FIiC基因通過IRES序列連接，構(gòu)建得到含有狂犬病毒G基因和鞭毛蛋白FIjB以及G基因和鞭毛蛋白FIiC的重組腺病毒質(zhì)粒，進而得到基因組結(jié)構(gòu)均一的重組腺病毒。本發(fā)明方法制備得到的狂犬病活載體疫苗，其以狂犬病毒糖蛋白G為基礎(chǔ)，同時在鞭毛蛋白的參與下，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生更為全面的免疫應(yīng)答，獲得更好的免疫效果。

構(gòu)建重組腺病毒工作中的限速步驟是將目的基因整合入腺病毒基因組，目前這一關(guān)鍵過程中大都是以哺乳動物細胞中同源重組方式實現(xiàn)的，有一定的難度。同時，因重組效率不高，所得的重組病毒常常需要空斑純化，故實驗周期較長，而且也不能保證重組腺病毒基因組結(jié)構(gòu)的均一性。本發(fā)明利用生長周期快，操作簡便的大腸桿菌細菌實現(xiàn)質(zhì)粒間同源，從而很快的獲得均一的重組腺病毒載體。

綜上所述，本發(fā)明得到的重組復(fù)制缺陷型腺病毒狂犬病疫苗較之現(xiàn)有狂犬病疫苗更為安全和有效，且制作周期較短。

附圖說明

圖1為重組穿梭載體PAdTrack-CMV/G-FIjB和PAdTrack-CMV/G-FIiC酶切及PCR鑒定圖；

圖2為重組腺病毒質(zhì)粒鑒定圖；

圖3為利用倒置顯微鏡觀測細胞病變圖和利用熒光顯微鏡觀測綠色熒光蛋白的表達圖；

圖4為表達重組腺病毒穿梭載體的構(gòu)建圖；

圖5為中和抗體檢測結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

實施例1狂犬病活載體疫苗的制備

用本實施例方法可以制備得到用于直接接種動物的復(fù)制缺陷型腺病毒狂犬病活載體疫苗。包括以下過程，參照圖4：

一、制備目的基因

設(shè)計引物，通過PCR的方法擴增出狂犬病病毒(Rabies Virus，RV)抗原蛋白G基因與細菌鞭毛蛋白FIjB基因或FIiC基因；所設(shè)計的抗原蛋白基因G和細菌鞭毛蛋白FIjB基因或FIiC基因的擴增引物為：

GF：5’GCAGATCTGCCACCATGGTTCCTCAAGCTCTTTTG3’(含有Bgl Ⅱ酶切位點)

GR：5’GCGTCGACTCACAGTCTGATCTCACC 3’(含有Sal Ⅰ酶切位點)

FIjBF：5’ATTGTCGACGCCACCATGGCACAAGTAATCAACACT 3’(含有Sal Ⅰ位點)

FIjBR：5’GCTCTAGATTAACGTAACAGAGACAGC 3’(含有Xba Ⅰ酶切位點)

FIiCF：5’ATTGTCGACGCCACCATGGCACAAGTCATTAATACA 3’(含有Sal Ⅰ位點)

FIiCR：5’GCAAGCTTTTAACGCAGTAAAGAGAG 3’(含有HindⅢ酶切位點)

其中，ATG為起始密碼子；狂犬病病毒G基因以狂犬病毒aG毒株為模板使用引物對GF/GR進行擴增；細菌鞭毛蛋白FIjB或FIiC基因分別以鼠傷寒沙門氏菌的鞭毛蛋白基因為模板使用引物對FIjBF/FIjBR或FIiCF/FIiCR進行擴增。

GF位于狂犬病毒aG株全序列3318處；GR位于狂犬病毒aG株全序列4893處；

FIjBF位于鞭毛蛋白FIjB基因的1處；FIjBR位于鞭毛蛋白FIjB基因的1521處；

FIiCF位于鞭毛蛋白FIiC基因的1處；FIjBR位于鞭毛蛋白FIiC基因的1488處。

二、構(gòu)建重組復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體

將擴增得到的狂犬病毒G基因與細菌鞭毛蛋白FIjB或FIiC基因分別插入到復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體特異性啟動子CMV和終止子之間PolyA，構(gòu)建成含有基因G-FIjB或G-FIiC的重組復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體，命名為

PAdTrack-CMV/G-FIjB或PAdTrack-CMV/G-FIiC；

具體包括以下操作步驟：

1)將回收得到的目的基因G經(jīng)Bgl Ⅱ、Sal Ⅰ雙酶切，形成帶有粘性末端的目的基因；

2)同時，將腺病毒穿梭載體PAdTrack-CMV經(jīng)Bgl Ⅱ、Sal Ⅰ雙酶切，得到線性化的載體；

3)使用T4DNA連接酶對上述產(chǎn)物進行粘端連接；

4)按常規(guī)方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌JM109，在含卡那抗性的瓊脂平板上篩選，挑選克隆后，提取質(zhì)粒；

5)采用酶切、PCR擴增方法鑒定，得到陽性重組質(zhì)粒PAdTrack-CMV/G。

6)將回收得到的目的基因FIjB經(jīng)Sal Ⅰ、Xba Ⅰ雙酶切，目的基因FIiC經(jīng)Sal Ⅰ、HindⅢ雙酶切，形成帶有粘性末端的目的基因。

7)同時，將陽性重組質(zhì)粒PAdTrack-CMV/G經(jīng)Sal Ⅰ、Xba Ⅰ雙酶切或Sal Ⅰ、HindⅢ雙酶切，得到線性化的載體。

8)使用T4DNA連接酶對上述產(chǎn)物進行粘端連接；按常規(guī)方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌JM109，在含卡那抗性的瓊脂平板上篩選，挑選克隆后，提取質(zhì)粒；采用酶切、PCR擴增方法鑒定，得到陽性重組質(zhì)粒PAdTrack-CMV/G-FIjB或 PAdTrack-CMV/G-FIiC。

所述的檢測G-FIjB或G-FIiC基因已經(jīng)整合到腺病毒載體中，采用PCR和限制性內(nèi)切酶鑒定，進行瓊脂糖凝膠電泳分析。將所獲得的含有目的基因G-FIjB的重組穿梭載體PAdTrack-CMV/G-FIjB經(jīng)Bgl Ⅱ、Xba I雙酶切鑒定可切出約3.0KB的目的片段，同時PCR鑒定也可擴增出大小相符的G基因和FIjB基因目的片段(圖1左)；將所獲得的含有目的基因G-FIiC的重組穿梭載體PAdTrack-CMV/G-FIiC經(jīng)Bgl Ⅱ、HindⅢ雙酶切鑒定可切出約3.0KB的目的片段，同時PCR鑒定也可擴增出大小相符的G基因和FIiC基因目的片段(圖1右)，通過與標準分子量對比可判斷。

三、獲得復(fù)制缺陷型腺病毒質(zhì)粒

將獲得的重組復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體PAdTrack-CMV/G-FIjB或PAdTrack-CMV/G-FIiC與腺病毒骨架載體PAdEasy-1通過在大腸桿菌中質(zhì)粒間同源重組從而得到重組腺病毒質(zhì)粒，具體包括以下操作步驟：

1)將重組穿梭載體分別用Pme I單酶切以線性化；

2)取0.1mg PAdEasy-1與1.0mg線性化重組穿梭載體混合，高壓電轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183；

3)電轉(zhuǎn)后將細胞在LB培養(yǎng)液中于37℃復(fù)蘇30min，取細胞涂入含50mg/Ml卡那霉素的培養(yǎng)板中，于37℃培養(yǎng)16～20h；

4)挑選卡那霉素抗性克隆，小量提取質(zhì)粒DNA，用0.8％瓊脂糖凝膠進行電泳遷移率分析，并進行限制性內(nèi)切酶圖譜分析，結(jié)果如圖2所示，從圖2可以看到同源重組后檢測目的基因已經(jīng)整合入腺病毒載體，通過瓊脂糖凝膠電泳分析可見重組質(zhì)粒明顯落后于骨架載體，限制性內(nèi)切酶酶切后可見約4.5KB和33KB的條帶，其結(jié)果與預(yù)期相符；得到的陽性重組質(zhì)粒命名為PAdEasy-G+FIiC或PAdEasy-G+FIjB；

5)將所得的重組腺病毒質(zhì)粒以高壓電轉(zhuǎn)化入宿主菌DH10B(Rec A，End A)，在此宿主菌中可獲得大量高質(zhì)量的質(zhì)粒，挑取目的克隆。

四、用重組腺病毒質(zhì)粒產(chǎn)生基因組結(jié)構(gòu)均一的重組腺病毒，包括以下操作：

1)酶切，取從DH10B中提取的各重組腺病毒質(zhì)粒PAdEasy-G+FIiC或PAdEasy-G+FIjB 4μg，用Pac I酶切，完全消化以切去Ori和Kan抗性基因等質(zhì)粒構(gòu)件，并暴露其反轉(zhuǎn)末端重復(fù)序列ITR；

2)轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，在35mm組織培養(yǎng)皿中接種293細胞進行轉(zhuǎn)染，所述的脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染包括以下分操作：

①稀釋Pac I酶切線性化的重組腺病毒質(zhì)粒4μg至250ul DMEM培養(yǎng)液中；

②然后將脂質(zhì)體LipofectAMINE2000懸液10μl加至250ul DMEM培養(yǎng)液中，充分將二者混勻，室溫下溫育20min；

③在此期間吸棄細胞原培養(yǎng)液，用DMEM培養(yǎng)液洗細胞一次；

④往每平皿加500ul DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中溫育3～5h后吸棄含DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)液，

⑤補加3ml含10％小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)7天，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后，收集細胞，反復(fù)凍融3次。

3)接種，取病毒上清接種293細胞，以含2％小牛血清的完全DMEM培養(yǎng)液于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細胞病變CPE，至293細胞完全病變；

4)凍存，收集病毒感染的病變細胞，連同上清凍存于-20℃，構(gòu)建得到的含有抗原蛋白G基因與細菌鞭毛蛋白FIjB或FIiC基因的重組腺病毒，命名為Ad-RV-G-FljB或Ad-RV-G-FliC。

同時按照上述方法構(gòu)建了僅含有抗原蛋白G基因的重組腺病毒，命名為Ad-RV-G。

檢測G-FIjB或G-FIiC基因是否獲得表達，采用觀測綠色熒光蛋白表達的辦法包括利用倒置顯微鏡觀測細胞病變，可見對照細胞正常生長，而轉(zhuǎn)染細胞出現(xiàn)明顯的細胞病變。利用熒光顯微鏡可直接觀測到報告基因綠色熒光蛋白的表達。其結(jié)果圖3所示。

將經(jīng)檢測合格的重組腺病毒制成狂犬病活載體疫苗，直接注射動物進行免疫。

實施例2狂犬病活載體疫苗的免疫效力實驗動物試驗數(shù)據(jù)

用實施例1構(gòu)建的Ad-RV-G、Ad-RV-G-FljB、Ad-RV-G-FliC三種重組腺病毒活載體分別在0、14天免疫6-8周齡的Balb/c小白鼠，在免疫后7、14、21、28、35、42分別采血，用RFFIT法測定中和抗體，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示，3種重組腺病毒在2次免疫后，中和抗體均開始上升，其中重組腺病毒Ad-RV-G-FljB刺激產(chǎn)生的中和抗體水平最高，而重組腺病毒Ad-RV-G-FliC產(chǎn)生的中和抗體水平較低，但均高于Ad-RV-G。結(jié)果表明，將鞭毛蛋白FljB或FliC與狂犬病毒G蛋白共表達的重組腺病毒具有明顯的佐劑增強效應(yīng)，其免疫產(chǎn)生的中和抗體水平能夠抵抗狂犬病毒致死劑量的攻擊。

免疫42天用30LD50的狂犬病毒攻擊，觀察14天，結(jié)果所有免疫小鼠獲得 100％。以上結(jié)果說明本發(fā)明的一種基于重組腺病毒表達狂犬病毒G蛋白和鞭毛蛋白的狂犬病活載體疫苗具有良好的應(yīng)用前景。