本發(fā)明屬于腫瘤免疫領(lǐng)域，涉及腫瘤疫苗，具體涉及組蛋白去乙酰化酶及其抑制劑在制備腫瘤全細胞抗原負載的DC腫瘤疫苗中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

免疫治療是手術(shù)、放療、化療之后的第四種腫瘤治療方式，在腫瘤的綜合治療模式中，免疫治療在提高腫瘤治愈率、改善患者生活質(zhì)量、延長生存期方面起重要作用。在腫瘤免疫中，T淋巴細胞識別的腫瘤抗原不是被腫瘤細胞提呈，而是被抗原提呈細胞提呈。樹突狀細胞(DC)是人體內(nèi)目前已知功能最強大、唯一能激活靜息狀態(tài)T細胞的抗原提呈細胞，具有強大的激活輔助和細胞毒T細胞的能力。樹突狀細胞腫瘤疫苗是腫瘤治療的第四模式之一，有望成為一種很有實用前景的抗腫瘤方法。腫瘤全細胞抗原負載的樹突狀細胞腫瘤疫苗是由樹突狀細胞經(jīng)腫瘤細胞裂解物或完整腫瘤細胞(兩種最常用的全細胞抗原)致敏形成，致敏樹突狀細胞能表達MHC-Ⅰ、Ⅱ類分子及共刺激分子，使疫苗的抗腫瘤作用明顯提高。

腫瘤細胞相關(guān)抗原的表達水平對DC疫苗的治療效果有重要影響。申請人2017年1月12日提交了名稱為“一種細胞裂解液、試劑盒及在制備腫瘤全細胞抗原負載DC腫瘤疫苗中的應(yīng)用”的申請，抗原結(jié)構(gòu)影響DC疫苗的預(yù)防和治療效果。申請人前期研究發(fā)現(xiàn)，SAHA處理后的腫瘤全細胞抗原可以顯著提高DC腫瘤疫苗對腫瘤的預(yù)防和治療效果，并進一步研究了SAHA作用靶標組蛋白去乙酰化酶與腫瘤全細胞抗原負載DC腫瘤疫苗療效的關(guān)系。

研究表明，腫瘤的發(fā)生與核小體核心組蛋白N-端的賴氨酸殘基的乙?；腿ヒ阴；氖Ш庥兄芮械年P(guān)系。組蛋白去乙?；?HDACs)抑制劑通過調(diào)節(jié)組蛋白N-端的賴氨酸殘基的乙?；腿ヒ阴；?，激活抑癌基因，抑制癌癥基因，從而抑制腫瘤細胞生長，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡(Apoptosis on hepatoma cells but not on primary hepatocytes by histone deacetylase inhibitors valproate and ITF2357.JHepatol,2005,42:210-217)?？涤|等2009年發(fā)表了一篇組蛋白去乙酰化酶抑制劑通過樹突細胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的研究綜述(康印東等，組蛋白去乙?；敢种苿┩ㄟ^樹突細胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用研究，中華移植雜志2009年第3卷第2期)。該綜述綜合闡述了組蛋白去乙?；敢种苿?HDACI)與DC和免疫調(diào)節(jié)之間的關(guān)系。HDACI在高濃度下顯示出強有力的抗腫瘤活性，在低濃度下顯示出多種免疫調(diào)節(jié)作用。HDACI直接作用于DC時，降低DC在成熟的過程中向趨化因子CCL19遷移的能力，從而限制DC到達輸入淋巴器官中發(fā)揮抗原呈遞功能；作為最主要的抗原呈遞細胞，DC對抗原特異性T淋巴細胞的活化至關(guān)重要，而HDACI影響了DC分化成熟和遷移，干擾其抗原呈遞過程?？傮w來說，HDACI直接作用于DC起到抑制免疫應(yīng)答的效果。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明首先發(fā)現(xiàn)SAHA處理后的腫瘤全細胞抗原可以顯著提高DC腫瘤疫苗對腫瘤的預(yù)防和治療效果，然后發(fā)現(xiàn)SAHA是通過其靶標組蛋白去乙?；竵碓鰪娔[瘤全細胞抗原對DC致敏效果的，最后以組蛋白去乙?；缸鳛榘袠撕Y選得到相關(guān)苯并噻唑類衍生物。

本發(fā)明通過如下技術(shù)方案得以實現(xiàn)：

組蛋白去乙?；缸鳛樾?yīng)靶標在制備腫瘤全細胞抗原負載DC腫瘤疫苗中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述腫瘤全細胞抗原為腫瘤細胞裂解物抗原；所述DC腫瘤疫苗為DC與腫瘤細胞裂解物共培養(yǎng)致敏形成。

上述組蛋白去乙?；傅囊种苿┰谥苽淠[瘤全細胞抗原負載DC腫瘤疫苗中的應(yīng)用。

一種化學試劑在制備腫瘤全細胞抗原負載DC腫瘤疫苗中的應(yīng)用，包括上述組蛋白去乙?；傅囊种苿?/p>

優(yōu)選地，所述組蛋白去乙酰化酶的抑制劑為SAHA。

優(yōu)選地，所述組蛋白去乙?；傅囊种苿槿缦陆Y(jié)構(gòu)的苯并噻唑類衍生物：

其中，取代基R為甲基、甲氧基、硝基、鹵素或氨基中的一種。

優(yōu)選地，所述苯并噻唑類衍生物中的取代基R為硝基。

優(yōu)選地，所述苯并噻唑類衍生物中的取代基R為甲氧基。

優(yōu)選地，所述苯并噻唑類衍生物中的取代基R為甲基。

上述DC腫瘤疫苗在預(yù)防、治療腫瘤方面的應(yīng)用。

本發(fā)明優(yōu)點：

本發(fā)明提供的組蛋白去乙?；敢种苿┛梢酝ㄟ^其靶標組蛋白去乙?；竵碓鰪娔[瘤全細胞抗原對DC致敏效果，從而顯著提高DC腫瘤疫苗對腫瘤的預(yù)防和治療效果。該靶標和抑制劑可以用于制備更高預(yù)防和治療價值的DC腫瘤疫苗。本發(fā)明具有重要的研究意義和產(chǎn)業(yè)開發(fā)前景。

附圖說明

圖1為SAHA對3LL中乙?；M蛋白H3和H4表達的影響(Hsp90為上樣對照)；

圖2為HDACI對3LL中乙酰化組蛋白H3和H4表達的影響(Hsp90為上樣對照)。

具體實施方式

為了更好地解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實施例進一步介紹。實施例中未特別強調(diào)的實驗材料均為常規(guī)實驗材料，屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員易于獲得的范疇。

實施例1：SAHA對組蛋白去乙?；富钚约癉C疫苗療效的影響

一、實驗材料

C57BL/6小鼠為8周齡雌性SPF級，購自南京大學動物中心；C57BL/6小鼠來源的肺癌細胞系3LL為本公司保存；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于Gibco公司。

其它所用試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

二、實驗方法

1、小鼠骨髓DC的分離制備和鑒定

脫頸處死C57BL/6小鼠，取雙后腿股骨、脛骨，除去上面附著的肌肉組織，除去骨兩端，暴露骨髓腔，用PBS沖洗骨髓腔數(shù)次，充分吹打制成單細胞懸液。用200目銅網(wǎng)過濾后，以PBS洗2次，重新懸浮細胞，配制成濃度1×l0⁵/ml細胞懸液，放置于含15％％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(含100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、1mM谷氨酰氨)中培養(yǎng)。在培養(yǎng)體系中加4ng/ml rhGM-CSF和10ng/ml rhIL-4，6天后培養(yǎng)體系中加入50ng/ml TNF-α繼續(xù)培養(yǎng)3天使之成熟。每3天半量換液，培養(yǎng)至第9天時收集疏松黏附的細胞。

DC表型鑒定：通過流式細胞儀測定上述方法獲得的DC表達MHCⅡ類分子、CD86水平。首先將以上制備的DC分別與FICT-抗MHCⅡ類分子、CD86單抗在PBS中反應(yīng)45分鐘，反應(yīng)結(jié)束后以PBS洗3次，上機分析。

2、肺癌細胞系3LL與SAHA孵育、裂解及組蛋白去乙?；富钚詼y試

實驗組：C57BL/6小鼠肺癌細胞系3LL于含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，選取處于對數(shù)生長期細胞，調(diào)整至1×10⁷/mL，在培養(yǎng)液中加入SAHA使其濃度為0.1μM，培養(yǎng)6小時后，更換為不含SAHA的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6小時，調(diào)整至5×10⁶/mL，加入裂解液(50mM pH 7.4Tris-HCl，150mM NaCl，1％Triton X-100，0.5mM EDTA，臨用前加入PMSF使終濃度為1mM)200μl，緩慢吹打約5min，收集裂解液于EP管中，4℃冰浴下于脫色搖床上振搖20min，4℃，12000×g離心15min，收集上清液，0.2μm的微孔濾膜過濾，-80℃保存。

對照組除不添加SAHA外，其余同實驗組。

組蛋白去乙酰化酶活性測試：組蛋白去乙?；?HDACs)包括多種亞型，如已知的HDAC1、HDAC2和HDAC3。已知乙?；M蛋白H3和H4是HDAC1、HDAC2和HDAC3的底物，通過Western blot法測定乙酰化組蛋白H3和H4的水平即可獲知組蛋白去乙酰化酶活性的變化。具體方法為：取細胞裂解液75μl，使用5μl測定樣品蛋白濃度，剩余70μl加等體積蛋白上樣緩沖液(2×上樣培養(yǎng)液65μl和3M的DTT儲備液5μl)置于沸水浴中煮沸5分鐘，分裝后在4℃冰箱中保存。之后12％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，據(jù)蛋白的條帶切膠，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，并以5％的封閉液封閉1小時。將聚偏二氟乙烯膜置于1:1000或1:2000稀釋的一抗中，4℃孵育過夜。取出膜，以TBST洗膜3次后加入1:2000稀釋的二抗室溫孵育2小時。之后將膜洗3遍，顯影。

3、DC與肺癌細胞系3LL裂解物共培養(yǎng)制備DC腫瘤疫苗

實驗組：按6:1的細胞比例將來自C57BL/6小鼠的DC與上述實驗組肺癌細胞裂解物共培養(yǎng)18小時，收集半貼壁的致敏DC細胞。

對照組：按6:1的細胞比例將來自C57BL/6小鼠的DC與上述對照組肺癌細胞裂解物共培養(yǎng)18小時，收集半貼壁的致敏DC細胞。

4、DC疫苗體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫預(yù)防作用

用DC疫苗對健康小鼠進行免疫：將實驗組、對照組DC疫苗懸浮于PBS中，小鼠雙側(cè)中腹部皮內(nèi)注射，每側(cè)100微升，2×10⁶/鼠；3天后對小鼠進行第二次免疫，劑量及方法同第一次免疫。兩次免疫小鼠7天后，以腫瘤細胞3LL攻擊小鼠，5×10⁴/鼠/200微升，溶于PBS中，雙側(cè)中側(cè)腹皮下接種，100微升/側(cè)。定期觀察腫瘤生長情況，測定腫瘤體積?？瞻捉M注射等劑量PBS，腫瘤細胞正常接種。

5、DC疫苗對荷瘤小鼠的免疫治療作用

將對數(shù)生長期的3LL(懸浮于PBS中)以5×10⁴/鼠/200微升雙側(cè)中側(cè)腹皮下接種攻擊小鼠，隨機分組。7天后，皮下注射經(jīng)放射線滅活的實驗組、對照組DC疫苗，在第10天進行第二次免疫，免疫劑量和方法同上。記錄腫瘤生長狀況，定期測量腫瘤體積，并記錄各組小鼠180天存活率(％)?？瞻捉M注射等劑量PBS，腫瘤細胞正常接種。每組20只。

三、實驗結(jié)果

1、小鼠骨髓DC的分離鑒定結(jié)果

小鼠骨髓來源的DC倒置顯微鏡下觀察，具有典型DC的形態(tài)，細胞體積大，外形不規(guī)則，胞漿豐富，胞膜向外伸出毛刺狀或樹枝狀突起，有明顯的貼壁集簇生長現(xiàn)象。DC表型鑒定證明上述方法獲得的DC高表達MHCⅡ類分子和CD86。

2、肺癌細胞系3LL與SAHA共孵育后組蛋白去乙酰化酶活性變化

由圖1可見，與對照組相比，實驗組乙?；M蛋白H3和H4的表達水平明顯升高，證明肺癌細胞系3LL與SAHA孵育后組蛋白去乙?；富钚允艿揭种?。

3、DC疫苗體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫預(yù)防作用

腫瘤體積測定結(jié)果如下表：

4、DC疫苗對荷瘤小鼠的免疫治療作用

各組小鼠180天存活率(％)如下表：

上述實驗結(jié)果證明：組蛋白去乙?；讣捌湟种苿㏒AHA與腫瘤全細胞抗原負載DC腫瘤疫苗的預(yù)防、治療效果有關(guān)，SAHA通過抑制腫瘤細胞組蛋白去乙酰化酶的活性改變了腫瘤全細胞抗原的性質(zhì)，這種改變可以顯著提高腫瘤全細胞抗原負載DC疫苗的療效。

實施例2：組蛋白去乙?；敢种苿┑暮Y選

篩選模型：C57BL/6小鼠肺癌細胞系3LL于含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，選取處于對數(shù)生長期細胞，調(diào)整至1×10⁷/mL，分組，在培養(yǎng)液中分別加入下表中的苯并噻唑類衍生物，培養(yǎng)6小時后，更換為不含苯并噻唑類衍生物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6小時，調(diào)整至5×10⁶/mL，加入裂解液(50mM pH 7.4Tris-HCl，150mM NaCl，1％Triton X-100，0.5mM EDTA，臨用前加入PMSF使終濃度為1mM)200μl，緩慢吹打約5min，收集裂解液于EP管中，4℃冰浴下于脫色搖床上振搖20min，4℃，12000×g離心15min，收集上清液，0.2μm的微孔濾膜過濾，-80℃保存。對照組不添加苯并噻唑類衍生物，其他操作相同。

組蛋白去乙酰化酶活性測試：通過Western blot法測定乙?；M蛋白H3和H4的水平即可獲知組蛋白去乙?；富钚缘淖兓?。具體方法為：取細胞裂解液75μl，使用5μl測定樣品蛋白濃度，剩余70μl加等體積蛋白上樣緩沖液(2×上樣培養(yǎng)液65μl和3M的DTT儲備液5μl)置于沸水浴中煮沸5分鐘，分裝后在4℃冰箱中保存。之后12％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，據(jù)蛋白的條帶切膠，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，并以5％的封閉液封閉1小時。將聚偏二氟乙烯膜置于1:1000或1:2000稀釋的一抗中，4℃孵育過夜。取出膜，以TBST洗膜3次后加入1:2000稀釋的二抗室溫孵育2小時。之后將膜洗3遍，顯影。

苯并噻唑類衍生物及其濃度如下：

實驗結(jié)果：如圖2所示，苯并噻唑類衍生物1-5均能顯著抑制組蛋白去乙?；傅幕钚?。

實施例3：組蛋白去乙?；敢种苿C疫苗療效的影響

一、實驗材料

同實施例1。

二、實驗方法

1、小鼠骨髓DC的分離制備和鑒定

同實施例1。

2、肺癌細胞系3LL與HDACs抑制劑孵育、裂解

實驗組：C57BL/6小鼠肺癌細胞系3LL于含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，選取處于對數(shù)生長期細胞，調(diào)整至1×10⁷/mL，在培養(yǎng)液中加入實施例2中結(jié)構(gòu)和濃度的苯并噻唑類衍生物1-3(分別為實驗組1-3)，培養(yǎng)6小時后，更換為不含HDACs抑制劑的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6小時，調(diào)整至5×10⁶/mL，加入裂解液(50mM pH 7.4Tris-HCl，150mM NaCl，1％Triton X-100，0.5mM EDTA，臨用前加入PMSF使終濃度為1mM)200μl，緩慢吹打約5min，收集裂解液于EP管中，4℃冰浴下于脫色搖床上振搖20min，4℃，12000×g離心15min，收集上清液，0.2μm的微孔濾膜過濾，-80℃保存。

對照組除不添加苯并噻唑類衍生物外，其余同實驗組。

3、DC與肺癌細胞系3LL裂解物共培養(yǎng)制備DC腫瘤疫苗

實驗組1-3：按6:1的細胞比例將來自C57BL/6小鼠的DC與上述實驗組1-3肺癌細胞裂解物共培養(yǎng)18小時，收集半貼壁的致敏DC細胞。

對照組：按6:1的細胞比例將來自C57BL/6小鼠的DC與上述對照組肺癌細胞裂解物共培養(yǎng)18小時，收集半貼壁的致敏DC細胞。

4、DC疫苗體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫預(yù)防作用

用DC疫苗對健康小鼠進行免疫：將實驗組1-3、對照組DC疫苗懸浮于PBS中，小鼠雙側(cè)中腹部皮內(nèi)注射，每側(cè)100微升，2×10⁶/鼠；3天后對小鼠進行第二次免疫，劑量及方法同第一次免疫。兩次免疫小鼠7天后，以腫瘤細胞3LL攻擊小鼠，5×10⁴/鼠/200微升，溶于PBS中，雙側(cè)中側(cè)腹皮下接種，100微升/側(cè)。定期觀察腫瘤生長情況，測定腫瘤體積?？瞻捉M注射等劑量PBS，腫瘤細胞正常接種。

5、DC疫苗對荷瘤小鼠的免疫治療作用

將對數(shù)生長期的3LL(懸浮于PBS中)以5×10⁴/鼠/200微升雙側(cè)中側(cè)腹皮下接種攻擊小鼠，隨機分組。7天后，皮下注射經(jīng)放射線滅活的實驗組1-3、對照組DC疫苗，在第10天進行第二次免疫，免疫劑量和方法同上。記錄腫瘤生長狀況，定期測量腫瘤體積，并記錄各組小鼠180天存活率(％)?？瞻捉M注射等劑量PBS，腫瘤細胞正常接種。每組20只。

三、實驗結(jié)果

1、小鼠骨髓DC的分離鑒定結(jié)果

小鼠骨髓來源的DC倒置顯微鏡下觀察，具有典型DC的形態(tài)，細胞體積大，外形不規(guī)則，胞漿豐富，胞膜向外伸出毛刺狀或樹枝狀突起，有明顯的貼壁集簇生長現(xiàn)象。DC表型鑒定證明上述方法獲得的DC高表達MHCⅡ類分子和CD86。

2、DC疫苗體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫預(yù)防作用

腫瘤體積測定結(jié)果如下表：

3、DC疫苗對荷瘤小鼠的免疫治療作用

各組小鼠180天存活率(％)如下表：

上述實驗結(jié)果證明：苯并噻唑類衍生物1-3通過抑制腫瘤細胞組蛋白去乙?；傅幕钚愿淖兞四[瘤全細胞抗原的性質(zhì)，這種改變可以顯著提高腫瘤全細胞抗原負載DC疫苗的療效。

本發(fā)明提供的組蛋白去乙酰化酶抑制劑可以通過其靶標組蛋白去乙酰化酶來增強腫瘤全細胞抗原對DC致敏效果，從而顯著提高DC腫瘤疫苗對腫瘤的預(yù)防和治療效果。該靶標和抑制劑可以用于制備具有更高預(yù)防和治療價值的DC腫瘤疫苗。

上述實施例僅用于進一步解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當明白，任何簡單替換或修改均不脫離本發(fā)明，本發(fā)明的保護范圍并不受限于上述具體實施例。