一種谷胱甘肽/pH雙重刺激響應(yīng)離子交聯(lián)型聚合物納米水凝膠及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種納米水凝膠及其制備方法和應(yīng)用。具體的說是一種具有谷胱甘肽/PH雙重刺激響應(yīng)性的離子交聯(lián)納米水凝膠及其制備方法和作為藥物載體的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]根據(jù)大量研宄表明，阿霉素是一種有效的抗癌藥物，可抑制RNA和DNA的合成，對RNA的抑制作用最強(qiáng)，抗瘤譜較廣，對各種生長周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用。但是直接注射后通過體液循環(huán)到達(dá)腫瘤組織的劑量很低，而且會給人體帶來嚴(yán)重的副反應(yīng)。世界上已經(jīng)有很多研宄來發(fā)展目標(biāo)革E向藥物傳輸體系(drug delivery systems, DDS)來增強(qiáng)藥效和降低副反應(yīng)，這些藥物載體包括各種形態(tài)的納米粒子、膠束、微膠囊、納米水凝膠等。
[0003]在各種藥物載體中，聚合物納米水凝膠是一種理想的藥物載體。作為一種通過物理或者化學(xué)交聯(lián)的三維高親水性的聚合物網(wǎng)絡(luò)，水凝膠是最接近于人體各種組織細(xì)胞的形態(tài)，從某種意義上說，人體各種組織都是不同水含量的凝膠。其中，化學(xué)交聯(lián)的納米水凝膠的高度親水性和膠體穩(wěn)定性使得它是一種理想的藥物傳輸載體。
[0004]對于目標(biāo)藥物載體，智能型的納米水凝膠尤其重要，因?yàn)樗梢赃x擇性的在目標(biāo)區(qū)域釋放藥物，而在別的區(qū)域保持穩(wěn)定，一般體現(xiàn)為對于PH值、溫度、離子濃度、谷胱甘肽或者它們之間的組合的刺激響應(yīng)性。其中，最重要的是pH和谷胱甘肽的刺激響應(yīng)性，因?yàn)槟[瘤組織(pH弱酸性)和正常細(xì)胞(pH中性)間，以及細(xì)胞外液(pH中性)和細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)涵體和溶酶體(pH酸性)之間存在著明顯的差異，而由腫瘤細(xì)胞內(nèi)液和外液不同濃度的谷胱甘肽濃度產(chǎn)生的環(huán)境差異則使得谷胱甘肽刺激響應(yīng)性也非常重要。針對這些不同組織部位的不同谷胱甘肽/pH設(shè)計(jì)多重刺激敏感性的藥物載體，可以智能化的控制釋藥和對于腫瘤細(xì)胞具有靶向殺傷性。
[0005]對于腫瘤組織，一般為了增強(qiáng)藥效，保持藥物在目標(biāo)組織增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)(EPR，Enhanced enhanced permeability and retent1n effect)，需要藥物載體為穩(wěn)定的高分子量聚合物；但是同時為了在釋藥結(jié)束后可以順利通過腎臟代謝排出體外，減小藥物載體對人體的副作用，一般又要求聚合物分子量小于初次代謝閾值(45 - 50kDa)，為了同時滿足這兩個矛盾的需求，制備生物可降解的藥物載體顯得尤為重要。
[0006]基于以上信息，設(shè)計(jì)制備一種具有可逆交聯(lián)的、良好的膠體穩(wěn)定性的、谷胱甘肽/PH雙重刺激響應(yīng)性的、可生物降解的納米水凝膠藥物載體將會是對于藥物傳遞領(lǐng)域的一次很好探索。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種離子交聯(lián)的具有谷胱甘肽/pH雙重刺激響應(yīng)性的可生物降解的納米水凝膠及其制備方法；同時，提供一種基于上述納米水凝膠在制備藥物載體中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明所提供的具有谷胱甘肽/pH雙重刺激響應(yīng)性的納米水凝膠的制備方法，具體步驟如下:
在單一的乙醇、乙腈、水、四氫呋喃、甲基異丁基酮或甲苯溶劑中，或者為乙腈一乙醇、乙腈一四氫呋喃、乙腈一水、乙腈一甲苯、乙醇一甲苯或甲基異丁基酮一乙腈的混合溶劑中，加入甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酸(AA)、甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)、烯酰胺(AM)、N_異丙基丙烯酰胺(NIPAM)或N-2-羥丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)單體；
以二甲基丙烯酸鋅(ZDMA)或二甲基丙烯酸鈣(CDMA)作為交聯(lián)劑；在引發(fā)劑AIBN或BPO的存在下，進(jìn)行反應(yīng)；
加熱，反應(yīng)溫度為75~120°C ;用蒸餾沉淀法除去一半溶劑，回流溶劑反應(yīng)時間為
0.2~4h ;再用離心法除去剩下溶劑和未反應(yīng)單體，用乙醇和去離子水反復(fù)洗滌3~5次；然后在真空烘箱內(nèi)30~55°C干燥5~24h，即得到納米水凝膠粒子。
[0009]本發(fā)明中，所述混合溶劑的濃度為0.5wt%~20.0wt%。
[0010]本發(fā)明中，所述單體在體系中所占質(zhì)量比為1:20~20:1。
[0011]本發(fā)明中，所用的引發(fā)劑為偶氮二異丁腈(AIBN)或過氧化二苯甲酰(BPO)。
[0012]上述制備的納米水凝膠，可以進(jìn)一步與氨基化的聚乙二醇-葉酸分子反應(yīng)，得到葉酸靶向、聚乙二醇修飾的納米水凝膠粒子，具體操作如下:
將上述制得的納米水凝膠粒子，加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，先在溶劑中進(jìn)行活化反應(yīng)，再和氨基化的聚乙二醇-葉酸分子反應(yīng)，即得到葉酸靶向、聚乙二醇修飾的納米水凝膠。
[0013]所述1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)的摩爾比分別為1:1.5和1:1.75。
[0014]本發(fā)明所制備的上述納米水凝膠大小為50~950nm，多分散度為0.04-0.16。
[0015]本發(fā)明制得的上述納米水凝膠可用作藥物載體，所載藥物可為抗癌藥物阿霉素。
[0016]本發(fā)明中，降解的測試條件為:在25mL的單口燒瓶里加入5mg的納米水凝膠粒子，分別加入10 mL的三種緩沖溶液中(磷酸鹽緩沖溶液pH=7.4,6.0，醋酸鹽緩沖溶液pH=5.0，然后加入10 mM的谷胱甘肽，放入恒溫?fù)u床(200rpm搖速，37.5°C)勻速振蕩。
[0017]載藥的條件為:10mg的納米水凝膠和6mg鹽酸阿霉素，超聲分散在20 mL的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)中，磁力攪拌24h，然后離心移去上清液，用磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)洗滌3次除去表面吸附的阿霉素，即得物理負(fù)載阿霉素的納米水凝膠。
[0018]釋藥的條件為:將10 mg載藥納米水凝膠粒子分散在10 mL的兩種緩沖溶液中(磷酸鹽緩沖溶液，PH=7.4 ;醋酸鹽緩沖溶液，pH=5.0)，超聲分散均勻，然后分為5份，每份2mL,將一份凝膠溶液移入透析袋中(透析分子量Mn=14000)，再放入80 mL的含不同濃度的谷胱甘肽的緩沖溶液中，即刻開始計(jì)時釋藥。在預(yù)訂時間，從瓶內(nèi)取出3 mL釋藥的緩沖溶液進(jìn)行紫外測量，再補(bǔ)充3 mL純的緩沖溶液保持體積恒定。
[0019]所制備的納米水凝膠在還原劑降解后，分子量小于2000且分子量分布均勻(Mn=1200,PDI<l.1)，遠(yuǎn)小于代謝閾值(45 — 50 kDa)，預(yù)計(jì)可以很好的代謝排出體外。
[0020]本發(fā)明中，所述的納米水凝膠藥物載體，用于裝載抗癌藥物阿霉素。裝載阿霉素藥物分子，其包封率和載藥率可以方便地用納米凝膠和阿霉素的不同比例加以控制。在上述方案的基礎(chǔ)上，所屬抗癌藥物阿霉素的載藥率的重量百分比最高可為45.4 %。
[0021]阿霉素的釋放過程可以通過調(diào)節(jié)環(huán)境的谷胱甘肽濃度和pH值加以控制，在高谷胱甘肽濃度和較低PH值條件下(模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境)展現(xiàn)出較快的釋放速度，而在低谷胱甘肽濃度和中性的pH值條件下(模擬細(xì)胞外環(huán)境)保持穩(wěn)定，釋放量小于20%。
[0022]本發(fā)明中，通過將載有藥物的上述納米藥物載體和子宮頸瘤細(xì)胞一起培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，納米水凝膠藥物載體體現(xiàn)出了很好的釋藥行為。通過熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)5h后載藥納米水凝膠粒子已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞，24h后阿霉素藥物對于細(xì)胞的殺傷作用已經(jīng)非常明顯，細(xì)胞存活率大幅降低，剩余的少量細(xì)胞也處于皺縮狀態(tài)，說明所制備的納米水凝膠是一種較好的藥物載體。
[0023]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于制備工藝清晰簡潔，得到的納米水凝膠藥物載體具有谷胱甘肽/pH雙重刺激響應(yīng)性，谷胱甘肽響應(yīng)性可以使得納米水凝膠在腫瘤細(xì)胞外低谷胱甘肽濃度的環(huán)境中保持穩(wěn)定，長時間循環(huán)，很少泄露藥物，而在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高