智能化納米水凝膠拓撲結(jié)構(gòu)抗菌接骨板及其制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于外科醫(yī)療用材料及其制造方法，具體的說，智能化納米水凝膠拓撲結(jié)構(gòu)抗菌接骨板。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)國際內(nèi)固定研宄協(xié)會AO (Arbeit sgem ein schaft fur Osteosynthesesfragen) /ASIF (Associat1n for the Study of Internal Fixat1n)報道，開放性骨折中感染率高達約3?40%，如使用內(nèi)固定則感染率增加30%以上。每年在美國約200萬例院內(nèi)感染病例中，約50%與內(nèi)植物有關(guān)，不僅消耗高達240億美元的巨大社會財富，還導(dǎo)致包括細菌耐藥、截肢甚至每年10萬患者死亡等嚴(yán)重后果。宄其原因，細菌與植入物材料粘附以形成完整的生物膜是“內(nèi)植物相關(guān)感染”的主要病理基礎(chǔ)?！皟?nèi)植物相關(guān)感染”(Orthopedic Device Related Infect1ns, 0DRI)始終是困擾骨科臨床的最常見而嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。針對0DRI，一般傳統(tǒng)的治療方法是:在取出內(nèi)植物的基礎(chǔ)上，徹底清創(chuàng)去除感染壞死骨與軟組織及大部分細菌；使用外固定支架臨時固定骨折斷端；全身或局部應(yīng)用大劑量抗生素消滅殘留細菌；應(yīng)用皮瓣等技術(shù)關(guān)閉傷口。確實無感染后再行植骨、骨搬移或延長及膜成骨技術(shù)恢復(fù)骨結(jié)構(gòu)。
[0003]針對ODRI的傳統(tǒng)治療技術(shù)，周期長、花費大，多使用外固定支架固定骨骼，維持其穩(wěn)定性。而較少使用內(nèi)固定器械，與在開放性骨折和火器傷中鋼板螺絲釘?shù)葍?nèi)植物則被視為禁忌癥的原因相同，僅約數(shù)量為103CFU/ml的細菌即可與內(nèi)植物粘附以及并形成完整的生物膜導(dǎo)致ODRI的發(fā)生、發(fā)展與持續(xù)迀延不愈是基礎(chǔ)。而沒有內(nèi)植物的情況下，即使開放性骨折局部有106CFU/ml細菌，也未必導(dǎo)致肌體感染。但是外固定具有針道感染率高(5.9%?19% )、在干骺端骨折中不易固定、鋼針?biāo)蓜雍蛧?yán)重影響患者生活、不便于護理等缺點。而在干骺端骨折中，接骨板是不可替代的固定骨折斷端的方式。因此，在ODRI的預(yù)防與治療中，傳統(tǒng)抗生素使用方法:全身或局部用藥。前者，往往由于局部損傷和血循破壞導(dǎo)致全身血中抗生素難以在損傷局部達到有效抗菌濃度；后者，雖然能夠在局部初始產(chǎn)生高濃度的抗生素，但隨后快速下降，不能維持有效治療濃度。因此，均難以對ODRI與創(chuàng)傷性骨髓炎的形成與發(fā)展產(chǎn)生有效的抗感染作用。目前針對細菌生物膜，通過抑制其多糖基質(zhì)合成及促進其分解、干擾密度感應(yīng)系統(tǒng)、加用單抗和改進植入物的表面理化特性以降低細菌與材料的粘附及抗菌素涂層等方法，證實在一定程度上可以降低ODRI發(fā)生率，但均不能徹底地解決生物膜的形成和由此導(dǎo)致的持續(xù)感染。為此，尋找新的改變固定物材料表面特性的方法或物質(zhì)已成為目前臨床工作的迫切需要，是國內(nèi)外微生物、材料、臨床醫(yī)學(xué)等多領(lǐng)域研宄焦點之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一在于提供一種強力抗感染和抑制細菌生物膜形成的智能化納米水凝膠拓撲結(jié)構(gòu)抗菌接骨板，該接骨板制備PEG-C0-AA微膠粒為核的智能化電荷梯度徑向分布凝膠顆粒、PH敏感型PMMA微凝膠層為控釋殼的復(fù)合微膠粒。該微膠粒不僅能夠充分負載hBD-3等抗菌肽，并且由于微膠粒核內(nèi)hBD-3等抗菌肽呈現(xiàn)正電荷梯度徑向分布，使hBD-3等抗菌肽具有“智能化”由高電勢向低電勢自動地遞補、發(fā)揮“接觸性殺菌”效應(yīng)和拓撲抗菌結(jié)構(gòu)的三重“智能化”特征的納米水凝膠涂層，以克服傳統(tǒng)交聯(lián)方法的困境及涂層易水解、負載抗菌肽量少和半衰期短的缺陷，從而突破hBD-3等抗菌肽在體內(nèi)防治ODRI的應(yīng)用“瓶頸”。
[0005]本發(fā)明的目的之二在于提供一種智能化納米水凝膠拓撲結(jié)構(gòu)抗菌接骨板的制造方法。
[0006]一種智能化納米水凝膠拓撲結(jié)構(gòu)抗菌接骨板，包括鈦金屬或鈦合金接骨板(I)，其關(guān)鍵在于:所述鈦金屬或鈦合金接骨板拓撲抗菌結(jié)構(gòu)表面復(fù)合微膠粒負載β —防御素一I?3、乳鐵蛋白1-11、LL-37、富組蛋白類似體(histatin analogue DHVAR-5)、內(nèi)源性抗微生物多肽-1 (Protegrins-1)及人工合成的陽離子抗菌肽單位面積濃度約0.025?lmg/mL。所述鈦金屬或鈦合金接骨板表面覆蓋由聚乙二醇-Co-丙稀酸(Poly (ethyleneglycol)-co-acrylic acid, PEG_co_AA)微凝膠核為內(nèi)核，外層控釋殼為pH敏感型聚甲基丙稀酸(poly (methacrylic acid, PMAA)微凝膠層的智能化電荷梯度徑向分布復(fù)合微膠粒，該復(fù)合微膠粒涂層在不銹鋼、鈦金屬或鈦合金接骨板形成拓撲抗菌結(jié)構(gòu)表面復(fù)合微膠粒負載β 一防御素一 I?3、乳鐵蛋白l-ll、LL-37、富組蛋白類似體(histatin analogueDHVAR-5)、內(nèi)源性抗微生物多肽-1 (Protegrins-1)及人工合成的陽離子抗菌肽。所述復(fù)合微膠粒直徑約100?400 μm、高度范圍0.6?8 μπι。PEG-co-AA微凝膠核電勢范圍約負6?40mv，核內(nèi)徑約I?100nm ;PMAA微凝膠層電勢范圍約負6?Omv，層數(shù)約5?30層。該復(fù)合微膠粒具備電荷自高電勢向低電勢自動轉(zhuǎn)移的特性。所述不銹鋼、鈦金屬或鈦合金接骨板拓撲抗菌結(jié)構(gòu)表面復(fù)合微膠粒(3)間距范圍約0.5?4 μπι。
[0007]一種智能化納米水凝膠拓撲結(jié)構(gòu)抗菌接骨板的制造方法，其關(guān)鍵在于，按如下步驟進行:
[0008]步驟1，鈦金屬或鈦合金接骨板(I)表面預(yù)處理和鈦表面帶電處理。鈦金屬或鈦合金接骨板(I)依次以蒸餾水、丙酮、75%乙醇、蒸餾水超聲清洗、等離子plasma進行親水處理各10?20分鐘，置入0.2mg/mL，平均分子量為30?50k，pH9的多聚L賴氨酸(poly-l-lysine,PLL)2?3小時，在鈦合金基體形成帶正電高分子層，進行初始底層沉積，取出后用去離子水洗凈，在室溫下干燥待用。
[0009]步驟2，制備PEGDA/AA乳液(2)。分別取平均分子量500?600的聚乙二醇丙烯酸醋(Polyethylene Glycol Diacrylate, PEGDA) 200 μ 1，丙稀酸單體(acrylic acid, AA)在50°C蒸餾后留取0?20 μ 1，以及光引發(fā)劑(Darocur 1173，Ciba) 10 μ 1，共同溶解在二氯甲燒(dichloromethane，DCM) Iml中形成油相。I?10%聚乙稀醇(PVA) I?3ml作為乳化劑，被溶解在1ml去離子水中形成水相。在高速磁子(100rpm)的攪拌10?20分鐘，油相被分散到連續(xù)的水相中形成乳液。通過調(diào)整PVA的含量，油相/水相的比例，以及磁子攪拌的時間，控制乳液直徑大小約1.0?1.5 μπι。
[0010]步驟3，合成PEG-co-AA微凝膠核(2)。制成的乳液被置于10w的紫外燈下20分鐘。紫外光激發(fā)光引發(fā)劑產(chǎn)生自由基，在自由基聚合的原理下，油滴中的PEGDA以及AA的雙鍵被打開，導(dǎo)致鏈增長和鏈之間交聯(lián)反應(yīng)。因此，油滴中的PEGDA和AA形成了微凝膠核，以70%乙醇懸浮一離心的方法反復(fù)三次進行純化，用去離子水懸浮一離心的方法去除酒精。通過控制PEGDA與AA的比例10:0.1?I，控制微凝膠核的電荷密度，形成電勢約范圍約負6?40mv。制成的微膠粒核通過16000?50000r/min高速離心收集，用不同孔徑的濾膜可以選擇性的得到所需的粒徑大小I?lOOOnm，最后收集到的微膠粒核被分散在1mlPBS磷酸鹽緩沖液中。
[0011 ] 步驟4，PEG-co-AA微凝膠核表面修飾PMAA高電荷密度殼層⑵。純化后的微凝膠核首先被分散到聚乙稀卩比略燒酮(poly(N-vinylpyrrolidone)，PVP0N)的PBS溶液中(0.2mg/mL，pH 2,0.0lM PBS)，15分鐘后，將微凝膠粒通過過濾，離心的方式洗凈。隨后，將PVPON處理過的膠粒分散在聚甲基丙烯酸PMAA的PBS溶液中(0.2mg/mL，pH 2,0.0lM PBS)，15分鐘后，用上述方法洗凈。重復(fù)以上方法5?30次，形成有氫鍵交聯(lián)的5?30層PVPON/PMAA凝膠層。
[0012]步驟5，交聯(lián)穩(wěn)定PMAA凝膠殼層(2)。微凝膠顆粒被分散在1_乙基_ (3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽5mg/mL和羥基硫代琥珀酰亞胺5mg/mL的0.0lM PBS溶液(PH5)中1.5小時；之后，將膠粒從溶液中分離，并且浸泡到10mg/mL的乙二胺(ethylenediamine,EDA)溶液(ρΗ5.8)中14小時進行PMAA層之間的共價交聯(lián)；最后，為了去除PVPON和未反應(yīng)的其他試劑，PEG-co-AA/PMAA復(fù)合微凝膠粒被浸泡在ρΗ7.5的0.0lMPBS中2小時，離心一過濾之后復(fù)合微凝膠粒被懸浮在PBS中(pH7.4,0.1Μ)。應(yīng)用動態(tài)光散射和Zeta電勢測定方法在不同ρΗ4?9及離子強度的情況下復(fù)合微凝膠的大