可吸附蜂毒肽的水凝膠納米顆粒的制備方法及其親和性的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥材料制備領(lǐng)域，具體涉及一種可吸附蜂毒肽的水凝膠納米顆粒的制備方法及其與蜂毒肽之間親和性的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水凝膠納米顆粒(nanoparticles hydrogels，NPs)含水量高，類似于生物組織，有良好的生物相容性。納米水凝膠內(nèi)部可以負(fù)載具有生物活性的組分，并且對(duì)外界刺激如溫度、pH值、光等產(chǎn)生響應(yīng)會(huì)發(fā)生體積、折光系數(shù)、凝膠網(wǎng)絡(luò)通透性等變化。人們致力于制備各種各樣的NPs，其與生物分子如多肽、蛋白質(zhì)親和吸附作用制成穩(wěn)定性好、可靠且可大規(guī)模生產(chǎn)的、達(dá)到取代抗體的目的的研究，并且這種NPs廉價(jià)易得，在生物納米技術(shù)領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注。
[0003]生物大分子間(如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì))的相互作用有靜電作用、親水/疏水作用以及在三維立體結(jié)構(gòu)界面上互補(bǔ)的范德華力。而一般這種NPs的構(gòu)建則也可具備多種官能團(tuán)，通過靜電作用、氫鍵作用、三維立體結(jié)構(gòu)界面上互補(bǔ)的范德華力，或者親水/疏水作用識(shí)別復(fù)雜如蛋白質(zhì)、多肽或碳水化合物等生物靶標(biāo)?？梢酝ㄟ^調(diào)控和優(yōu)化共聚反應(yīng)的單體組成和比例，從而達(dá)到這種納米顆粒的構(gòu)建。
[0004]特別地，這種NPs可以捕獲毒素分子，并且可以在活體中進(jìn)行毒素中和，有“塑料抗體(plastic antibody)”之稱。與小分子解毒劑相比，這種由NPs制成的“塑料抗體”通過多位點(diǎn)相互作用，與目標(biāo)物生物大分子表面接觸的區(qū)域更大，從而更有效地中和目標(biāo)毒素的毒性。并且，NPs尺寸足夠小，幾乎能達(dá)到體內(nèi)的各個(gè)地方，比如毛細(xì)血管、器官，甚至體內(nèi)細(xì)胞。
[0005]蜂毒肽(蜂毒肽)又稱溶血肽，是一種典型的陽離子多肽，由26個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為2840，是蜂毒中最主要的活性成分，約占蜂毒干重的50%。蜂毒肽能夠在各種腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、增長抑制、凋亡和壞死。它對(duì)人類肝細(xì)胞瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系產(chǎn)生明顯的生長抑制和細(xì)胞毒性。它具有兩性分子屬性，通過造成缺陷、破壞或氣孔形成，擾亂細(xì)胞膜雙分子層的完整性。由此產(chǎn)生脂質(zhì)雙分子層的開放將導(dǎo)致跨膜電化學(xué)梯度的崩潰。所以這個(gè)特性決定蜂毒肽既可以溶于水中，又可以與膜自然結(jié)合，進(jìn)而可溶解細(xì)胞，具有強(qiáng)溶血作用或肥大細(xì)胞的脫顆粒作用，它的溶血性能是一個(gè)有效的定量評(píng)價(jià)手段。
[0006]加州大學(xué)的Shea課題組[YuH,Lee S H,Kanazawa H，et al.Proceedings of theNat1nal Academy of Sciences，2012，109( 1):33-38.]基于N_叔丁基丙稀酰胺、N_異丙基丙烯酰胺和丙烯酸三種單體合成的NPs人工合成了蜂毒肽的抗體，并且將其運(yùn)用于老鼠的活體試驗(yàn)中，獲得良好的效果。但目前本發(fā)明中涉及到的一種可吸附蜂毒肽的水凝膠納米顆粒的制備及親和性檢測(cè)方法尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的問題是提供一種可吸附蜂毒肽的水凝膠納米顆粒的制備及親和性檢測(cè)方法。
[0008]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種可吸附蜂毒肽的水凝膠納米顆粒的制備方法，其特征在于，將N，N-二乙基丙烯酰胺(DEA)和丙烯酸(AAc)單體、交聯(lián)劑及乳化劑按比例用去離子水溶解于容器中，并在室溫下鼓入氮?dú)獬?，磁力攪拌，反?yīng)溫度升至60-80°C，保溫20min-60min并且保持氮?dú)鈿夥?，加入引發(fā)劑引發(fā)聚合反應(yīng)3_6h，透析，即得水凝膠納米顆粒溶液。
[0009]優(yōu)選地，所述交聯(lián)劑為N，N’_亞甲基雙丙烯酰胺;其添加量為單體質(zhì)量總和的1%-15%。
[0010]優(yōu)選地，所述乳化劑為十二烷基硫酸鈉;其添加量為單體質(zhì)量總和的1%-7%。
[0011 ]優(yōu)選地，所述引發(fā)劑為過硫酸銨;其添加量為單體質(zhì)量總和的0.1 。
[0012]優(yōu)選地，所述透析步驟具體為:采用去離子水浸泡3-7天，每天換一次水。
[0013]進(jìn)一步地，所用透析袋的截留分子量為8000-14000。
[0014]本發(fā)明提供了上述可吸附蜂毒肽的水凝膠納米顆粒親和性的檢測(cè)方法，其特征在于，配制4 % -10 %的血紅細(xì)胞溶液，取1 OOyL將其與70yL的水凝膠納米顆粒、1 OyL的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)及20yL的蜂毒肽溶液在離心管中混合，于37°C下保溫30min;然后，將其在37°C離心5min，將100yL上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，用UV-Vis表征上清液吸光度的變化;測(cè)定紅細(xì)胞100%溶血和紅細(xì)胞在緩沖液中自發(fā)溶血的兩組吸光度值，中和溶血百分?jǐn)?shù)即可直觀地反應(yīng)蜂毒肽對(duì)紅細(xì)胞的溶血作用，從而判斷納米顆粒對(duì)蜂毒肽的吸附作用。若納米顆粒對(duì)蜂毒肽有吸附效果，則保護(hù)了紅細(xì)胞阻止其發(fā)生溶血。
[0015]其中，中和溶血百分?jǐn)?shù)=(樣品吸光度-陰性對(duì)照組吸光度)/(陽性對(duì)照組吸光度-陽性對(duì)照組吸光度)X 100%。
[0016]優(yōu)選地，所述血紅細(xì)胞為牛血紅細(xì)胞。
[0017]優(yōu)選地，所述磷酸鹽緩沖溶液濃度為0.01M-0.1M。
[0018]優(yōu)選地，所述蜂毒肽溶液濃度為5_50μΜ。
[0019]優(yōu)選地，所述離心時(shí)的離心力為1000-10000g。
[0020]本發(fā)明以N，N_二乙基丙烯酰胺(DEA)、丙烯酸(AAc)為單體共聚，合成溫敏性的聚合物納米顆粒對(duì)蜂毒肽進(jìn)行控制和釋放，采用溶血性試驗(yàn)檢測(cè)NPs與蜂毒肽之間的親和性。
[0021]本發(fā)明的有益效果在于:
[0022](1)本發(fā)明采用的合成均在水相中完成，使用的單體和助劑均為常見試劑，綠色環(huán)保且容易實(shí)現(xiàn)，使這種NPs具有廉價(jià)易得的優(yōu)點(diǎn)。
[0023](2)本發(fā)明的NPs對(duì)蜂毒肽有明顯的吸附效果，NPs與蜂毒肽之間有親和力。這種NPs穩(wěn)定性好、可靠且可大規(guī)模生產(chǎn)，有望達(dá)到取代抗體的目的。
【附圖說明】
[0024]圖1為不同單體比例的P(DEA/AAc)水凝膠納米顆粒對(duì)蜂毒肽的吸附效果(DEA:AAc,wt%:(a)90%/10%(b)80%/20%(c)70%/30%(d)60%/40%)
【具體實(shí)施方式】
[0025]為使本發(fā)明更明顯易懂，茲以優(yōu)選實(shí)施例，并配合附圖作詳細(xì)說明如下。
[0026]實(shí)施例1
[0027](1)水凝膠納米顆粒的制備:
[0028]取0.45gDEA、0.05gAAc、0.025g交聯(lián)劑N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺、0.025g乳化劑十二烷基硫酸鈉溶于50mL超純水中，并在室溫下鼓入氮?dú)獬?，磁力攪拌，反?yīng)溫度升至70°C，保溫30min并且保持氮?dú)鈿夥?，加?.0025g引發(fā)劑過硫酸銨，繼續(xù)反應(yīng)4h。然后把所得反應(yīng)物浸泡于超純水中透析7天，每天換一次水，去除殘留反應(yīng)原料及反應(yīng)體系中的電解質(zhì)，即得。
[0029](2)水凝膠納米顆粒吸附蜂毒肽的溶血性中和試驗(yàn):
[0030]配制6%的血紅細(xì)胞溶液，取100yL將其與70yL的NPs(其中NPs的濃度調(diào)為五組分別為5，10，50，100，500μg/mL，NPs的單體比例DEA:AAc為90%/10%，wt%)、10μL的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，0.1M)及20yL的蜂毒肽(18μΜ)溶液在離心管中混合。于37°C下保溫30min。在37°C離心(3，000g)5min，將100yL上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。用UV-Vis表征上清液吸光度的變化。
[0031]實(shí)施例2
[0032](1)水凝膠納米顆粒的制備:
[0033]取0.40gDEA、0.10gAAc、0.025g交聯(lián)劑N，N’-亞甲基雙丙烯酰