專利名稱：蜂毒肽的提純方法
技術領域：
本發(fā)明涉及蜂毒肽的分離提取工藝，特別是用粗蜂毒分離提取蜂毒肽的方法。
背景技術：
在蜂毒的眾多成份中，以蜂毒肽(melittin)的含量最高，生物活性最強， 具有最為廣闊的臨床前景。國內外雖有其分離提純方法的報道，但工藝復雜， 條件苛刻，難以大量生產；且生產周期較長， 一般至少需3天；產品損失嚴重， 蜂毒肽收率僅30%左右，提取純化成本高。已經公開的專利號92114271.4 "從 蜂毒中快速分離蜂肽的方法"，是將粗蜂毒溶解在水中后，使用超濾膜和透析 袋使蜂肽分離出來，超濾膜的截流分子量為5000以上，透析袋截流分子量為 1000,該方法目的是分離出大分子量可引起過敏反應的非蛋白物質，如釆用該 方法，蜂毒肽四聚體(分子量為11360 )在分離初期就被截流掉，而蜂毒肽四聚 體在蜂毒中約占10 20%,所以使得蜂毒肽的提取率比理論提取率低20 30%;
該方法為分離方法，蜂毒肽純度達不到電泳級純度，因此應用領域大大受到限 制。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術存在的缺陷，對現(xiàn)有層析分離法進行改進， 提供一種工藝步驟相對少，在提取純化過程中蜂毒肽損失少，即收率高，生產 周期短，提純后的蜂毒肽純度達電泳級的蜂毒肽分離提純方法。
本發(fā)明方法是將粗蜂毒用水浸洗，溶媒萃取、凝膠過濾柱層析的方法，從 蜂毒中提取蜂毒肽，其特征是1) 將粗蜂毒加水浸洗，去除不溶物雜質，濾液用乙醇沉淀，去除乙醇水液， 沉淀物1加入氫氧化銨與正丁醇溶液萃取，棄除沉淀，蒸餾回收正丁醇，濃縮
物加丙酮沉淀得沉淀物2;
2) 將沉淀物2溶解于脲的醋酸鹽緩沖液A中，在離子交換凝膠 CM-Sephrose.FF柱上，用緩沖液A梯度洗脫層析；
3) 在離子交換凝膠柱下收集溶血活性最強的吸收峰V時的層析餾份進行濃 縮，濃縮液通過葡聚糖凝膠G-10柱脫鹽，脫鹽濃縮物用丙酮沉淀得到沉淀物3;
4) 將沉淀物3溶于鹽酸胍、亞硫酸鈉和對氯汞苯甲酸混合溶液中，再將溶 液濃縮，再通過葡聚糖凝膠柱脫鹽，用丙酮沉淀得沉淀物4;
5) 將沉淀物4溶解于醋酸鹽緩沖液B中，在葡聚糖凝膠G-25柱上，用緩 沖液B梯度洗脫層析，在柱下收集溶血活性最強的吸收峰II時的層析餾份進行 濃縮，于葡聚糖凝膠柱G-10上脫鹽、冷凍干燥即得到蜂毒肽。
在離子交換凝膠柱及葡聚糖凝膠柱上進行層析時使用的緩沖液A和緩沖液B 的PH為4. 2-5.0，使用梯度混合儀進行梯度洗脫。鹽酸胍、亞硫酸鈉和對氯汞 苯甲酸混合溶液用0. 15M的氫氧化銨調整PH值達7. 0，鹽酸胍、亞硫酸鈉和對 氯汞苯甲酸的濃度分別為3M、 0. 055M和0. 0023M。在浸洗粗蜂毒時的濾液用20 倍的無水乙醇沉淀；中間過程中的脫鹽、沉淀，釆用3倍量的丙酮進行沉淀。
采用本方法生產的蜂毒肽純度可達電泳級純度，滿足了更多領域特別是臨 床應用的技術要求；蜂毒肽的提取率比現(xiàn)有方法均高出7~8%，工藝步驟減化， 提純生產周期比原來減少1.5~2天，提純成本比原來降低約30%。
下面結合實施例對本發(fā)明作詳細描述。
取粗蜂毒20g加入100ml蒸餾水分三次浸洗，用中性濾紙過濾，蜜蜂蟄針 等不溶物雜質棄除。濾液用20倍無水乙醇沉淀，去除乙醇水液，沉淀物1溶于1200ml 0. 15M的氫氧化銨中，再加入800ml正丁醇振搖2hr。用分液漏斗分離， 沉淀物棄除，蒸餾回收萃取液中正丁醇，濃縮物用三倍的丙酮沉淀；沉淀物2 溶解于1000 mL含有4mol/L脲的醋酸鹽緩沖液中，PH為4.75，此為緩沖液 A,上離子交換凝膠CM-Sephrose. FF柱，用緩沖液A+0. 5mol/L氯化鈉進行梯 度洗脫。洗脫液以溶血試驗進行蜂毒肽的生物活性跟蹤，在離子凝膠柱下收集 溶血活性作用最強的吸收峰V時的層析餾份共1000ml,蒸發(fā)濃縮至100mi。濃 縮液通過葡聚糖凝膠G-IO柱脫鹽，脫鹽濃縮物用三倍的丙酮沉淀。沉淀物3溶 解于2000 mL的含有3 mol/L鹽酸胍、55咖ol/L亞硫酸鈉和2. 3咖ol/L對氯 汞苯甲酸的溶液中，整個溶液用NH, OH調到pH 7.0，在37 土2。C下保溫2hr， 蒸發(fā)濃縮溶液至200ml,再通過葡聚糖凝膠柱G—10脫鹽，用3倍的丙酮沉淀。 沉淀物4溶解于500 mL醋酸銨緩沖液(O. 05 mol /L ， pH 4. 75,此為緩沖液B) 中，上葡聚糖凝膠G-25柱，用緩沖液B進行梯度洗脫(用梯度混合器)，洗脫 液以溶血試驗進行蜂毒肽的活性跟蹤，柱下收集溶血活性作用最強的吸收峰II 時的層析餾份共800ml，濃縮至100ml，用葡聚糖凝膠G-10柱脫鹽，冷凍干燥, 最后得到凍干物蜂毒肽9.4g。產物蜂毒肽的收率為47% 。
權利要求
1、蜂毒肽的提純方法，是將粗蜂毒用水浸洗，溶媒萃取、凝膠過濾柱層析的方法，從蜂毒中提取蜂毒肽，其特征是1)將粗蜂毒加水浸洗，去除不溶物雜質，濾液用乙醇沉淀，去除乙醇水液，沉淀物1加入氫氧化銨與正丁醇溶液萃取，棄除沉淀，蒸餾回收正丁醇，濃縮物加丙酮沉淀得沉淀物2；2)將沉淀物2溶解于脲的醋酸鹽緩沖液A中，在離子交換凝膠CM-Sephrose.FF柱上，用緩沖液A梯度洗脫層析；3)在離子交換凝膠柱下收集溶血活性最強的吸收峰V時的層析餾份進行濃縮，濃縮液通過葡聚糖凝膠G-10柱脫鹽，脫鹽濃縮物用丙酮沉淀得到沉淀物3；4)將沉淀物3溶于鹽酸胍、亞硫酸鈉和對氯汞苯甲酸混合溶液中，再將溶液濃縮，通過葡聚糖凝膠柱脫鹽，用丙酮沉淀得沉淀物4；5)將沉淀物4溶解于醋酸鹽緩沖液B中，在葡聚糖凝膠G-25柱上，用緩沖液B梯度洗脫層析，在柱下收集溶血活性最強的吸收峰II時的層析餾份進行濃縮，于葡聚糖凝膠柱G-10上脫鹽、冷凍干燥即得到蜂毒肽。
2、 按照權利要求1所述的方法，其特征是緩沖液A和緩沖液B的 PH=4.2 5. 0,鹽酸胍、亞硫酸鈉和對氯汞苯甲酸混合溶液用0. 15M氫氧化銨調 整PH達7. 0。
3、 按照權利要求1所述的方法，其特征是浸洗粗蜂毒濾液用20倍無水乙 醇沉淀，中間過程中脫鹽、沉淀釆用3倍量的丙酮進行沉淀。
全文摘要
一種蜂毒肽的分離提純方法，是將粗蜂毒用水浸洗，濾液用乙醇沉淀，沉淀物用氫氧化銨和正丁醇萃取，萃取液以丙酮沉淀，使沉淀物溶于脲的醋酸鹽緩沖液A中，在離子交換柱上作洗脫層析，柱下收集溶血活性最強吸收蜂V的層析餾份濃縮，濃縮液經葡聚糖凝膠G-10柱脫鹽，丙酮沉淀，再溶解、脫鹽沉淀處理，沉淀物溶于醋酸鹽緩沖液B中，在葡聚糖凝膠G-25柱上以緩沖B液作梯度洗脫，柱下收集吸收蜂II時層析餾份濃縮、脫鹽冷凍干燥即得到電泳級蜂毒肽。本發(fā)明工藝減化后生產周期縮短1.5～2天，蜂毒肽收率比現(xiàn)有方法提高7～8％，提純成本降低約30％，實現(xiàn)了蜂毒肽的工業(yè)化生產。
文檔編號A23L1/076GK101455287SQ200710158989
公開日2009年6月17日 申請日期2007年12月12日 優(yōu)先權日2007年12月12日
發(fā)明者張文禮 申請人:張文禮