本發(fā)明屬于醫(yī)藥，涉及膀胱癌治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和治療藥物的開(kāi)發(fā)，具體涉及環(huán)氧化酶-2及其抑制劑在膀胱癌中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤，以移行上皮細(xì)胞癌為多。據(jù)世界衛(wèi)生組織2002年統(tǒng)計(jì)，全球每年約有36萬(wàn)新發(fā)病例，發(fā)病率居惡性腫瘤第九位，男性患者約占75％～80％，平均發(fā)病年齡為70歲；每年約有15萬(wàn)人死于膀胱癌，在致命癌癥中排第12位，在非治療情況下，自然生存期約16至20個(gè)月。臨床上，間歇出現(xiàn)無(wú)痛性血尿是膀胱癌的最早癥狀，分化良好的乳頭狀腫瘤可有嚴(yán)重血尿，分化不良的浸潤(rùn)性癌卻反而血尿不嚴(yán)重，非上皮性腫瘤血尿也較輕。尿頻、尿急等膀胱刺激癥狀，提示膀胱原位癌的可能。但若非同時(shí)伴有感染或腫瘤位于膀胱三角區(qū)，其他早期膀胱癌較少出現(xiàn)尿路刺激癥狀。當(dāng)腫瘤較大或阻塞膀胱口時(shí)，可出現(xiàn)排尿困難或尿潴留。晚期甚至可累及下腹部浸潤(rùn)性腫瘤，或出現(xiàn)嚴(yán)重貧血和浮腫等。

環(huán)氧化酶(Cox)是花生四烯酸代謝過(guò)程中前列腺素合成的限速酶，有Cox-1和Cox-2兩種同工酶。Cox-1是一種結(jié)構(gòu)型酶，屬人體正常成分，可在大多數(shù)組織中均有表達(dá)；而Cox-2則是一種誘導(dǎo)型酶，其基因長(zhǎng)約8.8kb，含有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子，正常生理狀態(tài)時(shí)Cox-2在絕大多數(shù)組織都不表達(dá)，但在受到如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、促癌劑等刺激時(shí)則會(huì)迅速合成，激活炎癥反應(yīng)，而長(zhǎng)期的慢性炎癥可促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。在許多實(shí)體腫瘤如宮頸癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等中，均有Cox-2的表達(dá)上調(diào)，而應(yīng)用cox抑制劑可起到一定的抑制效果。cox抑制劑，又稱非甾體類抗炎藥，是全球使用最多的藥物之一，其主要通過(guò)抑制cox的表達(dá)，減少炎性介質(zhì)前列腺素的生成，產(chǎn)生抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱的作用。

2-胺基苯并惡唑及其衍生物是典型的雜環(huán)化合物，活性多樣，但目前尚未發(fā)現(xiàn)其對(duì)環(huán)氧化酶-2和膀胱癌的作用報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于環(huán)氧化酶-2及其抑制劑在膀胱癌中的應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：

環(huán)氧化酶-2及其抑制劑在制備治療膀胱癌的藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述抑制劑為2-胺基苯并惡唑衍生物。

優(yōu)選地，所述2-胺基苯并惡唑衍生物為如下衍生物1-4中的一種：

衍生物1

衍生物2

衍生物3

衍生物4

藥物組合物在制備治療膀胱癌的藥物中的應(yīng)用，所述藥物組合物含有上述抑制劑和藥學(xué)上可以接受的載體，制成藥學(xué)上可以接受的劑型。

優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可以接受的載體包括一種或多種固體、半固體或液體輔料；藥學(xué)上可以接受的劑型包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、注射劑、丸劑、散劑、膏劑、口服液體制劑。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)環(huán)氧化酶-2的選擇性抑制劑尼美舒利可以通過(guò)下調(diào)環(huán)氧化酶-2的表達(dá)抑制膀胱癌細(xì)胞T24的增殖；并用該模型篩選得到四個(gè)環(huán)氧化酶-2的抑制劑，這四個(gè)抑制劑化合物均為2-胺基苯并惡唑衍生物，均可以下調(diào)環(huán)氧化酶-2的表達(dá)，抑制T24的增殖。本發(fā)明證實(shí)環(huán)氧化酶-2可以作為藥物靶標(biāo)篩選抑制膀胱癌的藥物。

附圖說(shuō)明

圖1為四種2-胺基苯并惡唑衍生物1-4的化學(xué)結(jié)構(gòu)式；

圖2為不同濃度衍生物1-4作用于T24細(xì)胞48小時(shí)后對(duì)T24細(xì)胞的抑制率(2B)及T24細(xì)胞中COX-2蛋白Western Blot測(cè)定結(jié)果(2A)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容。

實(shí)施例1：尼美舒利對(duì)膀胱癌細(xì)胞環(huán)氧化酶-2表達(dá)和細(xì)胞增殖的影響

一、實(shí)驗(yàn)材料

膀胱癌細(xì)胞系T24為本公司長(zhǎng)期保存；甲基塞唑藍(lán)MTT、二甲基亞砜DMSO、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Sigma公司。其他為常規(guī)試劑。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1、細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組

膀胱癌細(xì)胞系T24按常規(guī)方法培養(yǎng)。含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5％CO₂及飽和濕度下培養(yǎng)，48h換液1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和尼美舒利組，對(duì)照組不添加環(huán)氧化酶-2抑制劑，尼美舒利組添加尼美舒利處理。具體如下：

將對(duì)數(shù)期的膀胱癌細(xì)胞系T24按照2×10⁴/孔細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h后，尼美舒利組T24細(xì)胞中加入終濃度為50、100和200μmol/L的尼美舒利，培養(yǎng)48h。

2、細(xì)胞中環(huán)氧化酶-2(COX-2)的表達(dá)測(cè)定(Western Blot法)

取尼美舒利作用48h的細(xì)胞，裂解細(xì)胞后提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，每組各取50μg蛋白上樣，SDS-PAGE蛋白電泳并將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。一抗為兔抗人COX-2多克隆抗體，稀釋度為1:1000，多克隆小鼠抗β-actin抗體，稀釋度為1:2000，4℃環(huán)境下孵育過(guò)夜。次日分別加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，稀釋度均為1:5000，室溫孵育1h。經(jīng)洗滌后，通過(guò)ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影，壓片曝光后將膠片進(jìn)行拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)測(cè)定各條帶的光密度值，以COX-2/β-actin的比值作為COX-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3、細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定

培養(yǎng)48h后，測(cè)定各孔的吸光度(A)，測(cè)定前每孔加5mg/ml的MTT 20μl，溫育4h，棄上清液后，加入DMSO 200μl/孔。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)560nm下檢測(cè)。用各組的平均A值計(jì)算出細(xì)胞增殖抑制率：增殖抑制率(％)＝(1-尼美舒利組A/對(duì)照組A)×100％。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、尼美舒利對(duì)膀胱癌細(xì)胞系T24形態(tài)學(xué)影響

與對(duì)照組相比，尼美舒利組細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)異常，胞體變圓和不規(guī)則、脫壁，細(xì)胞間接觸變松，胞漿中顆粒增多，增殖變慢。隨著時(shí)間增長(zhǎng)，部分細(xì)胞從培養(yǎng)板壁脫落。

2、尼美舒利對(duì)膀胱癌細(xì)胞系T24中環(huán)氧化酶-2表達(dá)的影響

Western Blot結(jié)果顯示，在內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度基本一致的情況下，與對(duì)照組相比，尼美舒利組COX-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1培養(yǎng)48h后各組COX-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量

3、尼美舒利對(duì)膀胱癌細(xì)胞系T24增殖抑制率的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示尼美舒利對(duì)T24細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，且抑制作用與藥物濃度呈明顯的依賴關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2培養(yǎng)48h后各組T24細(xì)胞的增殖抑制率

實(shí)施例1結(jié)果表明，環(huán)氧化酶-2可能是尼美舒利抑制T24細(xì)胞增殖的靶標(biāo)，尼美舒利通過(guò)抑制環(huán)氧化酶-2的表達(dá)發(fā)揮對(duì)膀胱癌細(xì)胞系T24的增殖抑制作用。

實(shí)施例2：環(huán)氧化酶-2抑制劑的篩選

一、實(shí)驗(yàn)材料

膀胱癌細(xì)胞系T24為本公司長(zhǎng)期保存；甲基塞唑藍(lán)MTT、二甲基亞砜DMSO、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Sigma公司。其他為常規(guī)試劑。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1、細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組

膀胱癌細(xì)胞系T24按常規(guī)方法培養(yǎng)。含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5％CO₂及飽和濕度下培養(yǎng)，48h換液1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和給藥組，對(duì)照組不添加環(huán)氧化酶-2抑制劑，給藥組添加不同待測(cè)化合物處理。具體如下：

將對(duì)數(shù)期的膀胱癌細(xì)胞系T24按照2×10⁴/孔細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h后，給藥組T24細(xì)胞中加入不同終濃度的待測(cè)化合物，培養(yǎng)48h。待測(cè)化合物結(jié)構(gòu)如表3和圖1。

表3待測(cè)化合物結(jié)構(gòu)

2、細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定，計(jì)算IC50(抑制率為50％時(shí)化合物濃度)

培養(yǎng)48h后，測(cè)定各孔的吸光度(A)，測(cè)定前每孔加5mg/ml的MTT 20μl，溫育4h，棄上清液后，加入DMSO 200μl/孔。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)560nm下檢測(cè)。用各組的平均A值計(jì)算出細(xì)胞增殖抑制率：增殖抑制率(％)＝(1-給藥組A/對(duì)照組A)×100％。

3、細(xì)胞中環(huán)氧化酶-2(COX-2)的表達(dá)測(cè)定(Western Blot法)

取待測(cè)化合物作用48h的細(xì)胞，裂解細(xì)胞后提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，每組各取50μg蛋白上樣，SDS-PAGE蛋白電泳并將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。一抗為兔抗人COX-2多克隆抗體，稀釋度為1:1000，多克隆小鼠抗β-actin抗體，稀釋度為1:2000，4℃環(huán)境下孵育過(guò)夜。次日分別加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，稀釋度均為1:5000，室溫孵育1h。經(jīng)洗滌后，通過(guò)ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影，壓片曝光后將膠片進(jìn)行拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)測(cè)定各條帶的光密度值，以COX-2/β-actin的比值作為COX-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、不同化合物對(duì)T24細(xì)胞的增殖抑制率和IC50值

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示各化合物對(duì)T24細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，且抑制作用與藥物濃度呈明顯的依賴關(guān)系，IC50值見(jiàn)表4。

表4 2-胺基苯并惡唑衍生物IC50值(μmol/L，作用時(shí)間為48h)

發(fā)明人還測(cè)試了衍生物1-4對(duì)人正常膀胱上皮細(xì)胞(SV-HUC-1細(xì)胞系，作用時(shí)間為24h)的毒性，衍生物1-3的細(xì)胞毒性相對(duì)較高，120μmol/L即出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒作用(與對(duì)照組相比抑制率≥20％，下同)，衍生物4在400μmol/L時(shí)抑制率仍＜10％。衍生物1-3可以開(kāi)發(fā)成膀胱癌靶向藥物，以降低對(duì)正常細(xì)胞的損傷。

2、不同化合物對(duì)T24細(xì)胞中環(huán)氧化酶-2表達(dá)的影響

Western Blot結(jié)果顯示，在內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度基本一致的情況下，與對(duì)照組相比，給藥組COX-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào)，且下調(diào)程度與給藥劑量呈依賴關(guān)系。不同濃度衍生物1-4(見(jiàn)表5)作用于T24細(xì)胞48小時(shí)后對(duì)T24細(xì)胞的抑制率及T24細(xì)胞中COX-2蛋白Western Blot測(cè)定結(jié)果如圖2所示。

表5衍生物1-4測(cè)試濃度水平(μmol/L)

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)環(huán)氧化酶-2的選擇性抑制劑尼美舒利可以通過(guò)下調(diào)環(huán)氧化酶-2的表達(dá)抑制膀胱癌細(xì)胞T24的增殖；并用該模型篩選得到四個(gè)環(huán)氧化酶-2的抑制劑，這四個(gè)抑制劑化合物均為2-胺基苯并惡唑衍生物，均可以下調(diào)環(huán)氧化酶-2的表達(dá)，抑制T24的增殖。本發(fā)明證實(shí)環(huán)氧化酶-2可以作為藥物靶標(biāo)篩選抑制膀胱癌的藥物。