本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
痛風(fēng)(gouty)，又稱痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(gouty arthritis)，是體內(nèi)嘌呤代謝紊亂所致的疾病，表現(xiàn)為血中尿酸過多，易于使尿酸鹽(MSU)在關(guān)節(jié)等組織析出結(jié)晶。痛風(fēng)的急性發(fā)作是由于沉積在關(guān)節(jié)的MSU引起中性粒細(xì)胞局部浸潤和炎性反應(yīng)。
西藥在痛風(fēng)急性發(fā)作期選用三種藥：秋水仙堿、非甾體抗炎藥和腎上腺皮質(zhì)激素。秋水仙堿的作用機(jī)制是與中性粒細(xì)胞的微管蛋白結(jié)合，從而妨礙粒細(xì)胞的活動，抑制粒細(xì)胞浸潤。非甾體抗炎藥如吲哚美辛，抑制環(huán)氧酶(COX)活性而發(fā)揮抗炎作用，以及選擇性COX2抑制藥。它們雖然消炎止痛作用快，但毒副作用也相當(dāng)明顯，如秋水仙堿的有效劑量與產(chǎn)生腹瀉等胃腸道癥狀的劑量相近，非甾體抗炎藥在有活動性消化性潰瘍、胃腸道出血情況下絕對禁用，而保泰松用藥短至3周也可致嚴(yán)重的粒細(xì)胞減少癥或再生障礙性貧血。
從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物最有重要價值。
本發(fā)明涉及的化合物I是一個2009年發(fā)表(Pei Tang et al.,2009.Atropurpuran,a novel diterpene with an unprecedented pentacyclic cage skeleton,from Aconitum hemsleyanum var.atropurpureum.Tetrahedron Letters 50(2009)460–462)的化合物，我們對化合物I進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物并對該組合物抗抗急性痛風(fēng)活性進(jìn)行了評價，其具有抗急性痛風(fēng)活性。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明公開了一個新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為15％和85％。
本發(fā)明公開的組合物可以制成藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明用尿酸鈉(MSU)致人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)損傷的急性痛風(fēng)模型評價顯示，本發(fā)明組合物對MSU致HUVEC損傷具有保護(hù)作用，并抑制ICAM-1表達(dá)，可用于制備治療急性痛風(fēng)炎癥藥物。本發(fā)明的目的在于提供本發(fā)明組合物在醫(yī)學(xué)中的新用途，具體地說是涉及本發(fā)明組合物在制備治療急性痛風(fēng)藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病理研究說明，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是MSU引起中性粒細(xì)胞局部浸潤和炎性反應(yīng)，急性痛風(fēng)產(chǎn)生的本質(zhì)是中性粒細(xì)胞(PMN)-血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)黏連增強(qiáng)(Terkeltaub R，et al.The murine homolog of the interleukin-8 receptorcxcr-2is essential for the occurrence of neutrophilic inflammation in air pouch model of acute urate crystal-induced gouty synovitis.Arthritis Rheum,1998,41(5):900-909.)，HUVEC損傷，其分子生物學(xué)基礎(chǔ)在于PMN與HUVEC表面黏附分子的相互作用(FujiwaraY,et al.Interleukin-8stimulates leukocyte migration across amonolayer of cultured rabbit NF-α,IL-1β,IL-8,and IL-1 rain Monosodium Urate Crystal induced rabbit arthritis.Labinvest,19998,78(5):559-569.)，其中細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)與粘附功能關(guān)系最密切，是急性痛風(fēng)炎癥的重要指標(biāo)之一(張春，唐怡，劉軍，等.痛風(fēng)靈方對尿酸鈉致大鼠模型關(guān)節(jié)軟組織ICAM-1表達(dá)的影響，重慶醫(yī)學(xué)，2002,31(12)：1211-1213.)。
因此，針對急性痛風(fēng)MSU致HUVEC損傷，ICAM-1表達(dá)增多的病理特征，本發(fā)明用MSU致HUVEC損傷的體外急性痛風(fēng)模型(楊妍華，尹蓮，王明艷，等.尿酸鈉誘導(dǎo)HUVEC損傷的急性痛風(fēng)模型研究，中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010,28(3)：592-594.)，評價本發(fā)明組合物抗急性痛風(fēng)炎癥活性。MSU致人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)損傷的急性痛風(fēng)模型評價顯示，本發(fā)明組合物對MSU致HUVEC損傷具有保護(hù)作用，并抑制ICAM-1表達(dá)。
有益效果
研究結(jié)果表明，用MSU致HUVEC損傷的急性痛風(fēng)模型評價顯示，本發(fā)明組合物可保護(hù)MSU致HUVEC損傷，減少細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞活性，抑制ICAM-1表達(dá)，具有抗急性痛風(fēng)炎癥的活性，本發(fā)明組合物可用于制備治療急性痛風(fēng)炎癥藥物。
以下通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。
具體實施方式
實施例1 化合物Atropurpuran的制備
化合物Atropurpuran(I)的制備方法參照Pei Tang等人發(fā)表的文獻(xiàn)(Pei Tang et al.,2009.Atropurpuran,a novel diterpene with an unprecedented pentacyclic cage skeleton,from Aconitum hemsleyanum var.atropurpureum.Tetrahedron Letters 50(2009)460–462)的方法。
實施例2 Atropurpuran的O-溴乙基衍生物(II)的合成
將化合物I(312mg，1.00mmol)溶于10mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨(TBAB)(0.08g)，1,2-二溴乙烷(3.760g，20.00mmol)和6mL的50％氫氧化鈉溶液?；旌衔镌?5攝氏度攪拌6h。6h之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機(jī)相溶液。然后對有機(jī)相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌3次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:1.0，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的黃色粉末(309mg，74％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.86(s,1H),5.23(s,1H),4.87(s,1H),4.83(s,1H),4.39(s,1H),4.00(s,2H),3.91(s,1H),3.58(s,2H),3.01(s,1H),2.27(s,1H),2.15(d,J＝6.3Hz,2H),2.09–2.00(m,5H),1.78(dd,J＝35.2,19.2Hz,2H),1.71–1.65(m,1H),1.41(s,2H),0.99(s,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.55(s),203.16(s),150.94(s),125.16(s),111.66(s),78.63(s),71.39(s),57.77(s),47.73(s),40.79(s),34.58(s),33.01(s),32.69(s),29.25(s),29.34(s),26.52(s),24.23(s),22.30(s),20.64(s).
HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcd for C22H28BrO3:419.1222；found 419.1226.
實施例3 Atropurpuran的O-(哌嗪基)乙基衍生物(III)的合成
將化合物II(209mg，0.5mmol)溶于16mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和無水哌嗪(6892mg，80mmol)，混合物加熱回流2h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:0.7，v/v)，收集棕色集中洗脫帶，濃縮即得到化合物III的棕色固體(163mg,77％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.69(s,1H),5.12(s,1H),4.65–4.55(m,3H),3.80(s,1H),3.53(s,2H),2.91(s,1H),2.61(s,4H),2.50(s,2H),2.28(s,4H),2.17(s,1H),2.05(s,1H),1.96(dd,J＝25.4,15.5Hz,4H),1.87–1.59(m,3H),1.47(d,J＝28.9Hz,4H),1.05(s,1H),0.90(s,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.52(s),203.24(s),150.91(s),125.24(s),111.63(s),78.71(s),67.07(s),57.85(s),54.25(s),53.94(s),47.70(s),45.04(s),40.87(s),34.55(s),32.66(s),29.33(s),29.09(s),26.49(s),24.31(s),22.27(s),20.72(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C26H37N2O3:425.2804；found:425.2801。
實施例4 Atropurpuran的O-(二羥乙胺)乙基衍生物的合成
將化合物II(209mg，0.5mmol)溶于15mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和二乙醇胺(1051mg，10mmol)，混合物加熱回流1h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入15mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:0.5，v/v)，收集淺棕色集中洗脫帶，濃縮即得到化合物III的黃色固體(159.5mg,72％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.74(s,1H),5.13(s,1H),4.61(d,J＝10.5Hz,2H),4.25(s,1H),3.75(s,1H),3.54(s,2H),3.36(s,4H),2.89(s,1H),2.62(s,2H),2.51(s,4H),2.32(s,2H),2.17(s,1H),2.05(s,1H),1.95(dd,J＝13.4,11.6Hz,4H),1.78(s,1H),1.76–1.69(m,4H),1.44(s,2H),0.89(s,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.46(s),203.18(s),150.85(s),125.18(s),111.57(s),78.65(s),67.01(s),58.86(s),57.79(s),56.41(s),53.21(s),47.64(s),40.81(s),34.49(s),32.60(s),29.27(s),29.03(s),26.43(s),24.25(s),22.21(s),20.66(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C26H38N1O5:444.2750；found:444.2744。
實施例5 組合物抗急性痛風(fēng)炎癥實驗
1、溶液配制
5g尿酸加1000ml蒸餾水煮沸，加5％NaOH溶液調(diào)PH 7.4，攪拌，冷卻析晶制成尿酸鈉結(jié)晶(MSU)。將制好的MSU 10mg高壓滅菌，加不含血清的DMEM培養(yǎng)液10ml，研磨配成1mg/ml的DMEM溶液。實驗時，此溶液再加DMEM培養(yǎng)液配成不同濃度DMEM的MSU溶液。
組合物的制備：將研磨之后過200目網(wǎng)的15mg化合物III的粉末和研磨之后過200目網(wǎng)的85mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物，使用時用水溶解這100mg的組合物即得到組合物的溶液。
組合物、化合物III或者化合物IV 2.5mg，用二甲基亞砜(DMSO)溶解，DMSO終濃度<0.02％，再加無血清的DMEM培養(yǎng)液，配制成濃度25ug/ml。
2、血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)
人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC株由南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供，細(xì)胞經(jīng)支原體檢測，無支原體污染，細(xì)胞經(jīng)0.25％胰蛋白酶消化，含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中和，離心(1000r/min×6min)，去上清液，加含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。
3、對MSU刺激HUVEC活力的影響
HUVEC在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待生長至70％～80％融合時，以0.25％胰蛋白酶消化、離心，10％小牛血清DMEM培養(yǎng)液洗滌3次，用10％小牛血清DMEM培養(yǎng)液調(diào)成4×104/ml細(xì)胞懸液，植入96孔板(每孔200ul)，培養(yǎng)24小時后輕吸出原培養(yǎng)液，進(jìn)行以下實驗，每組各8孔，具體分組及加液如下：對照組(200ul DMEM培養(yǎng)液)、模型組(100ug/ml MSU溶液)、干預(yù)組(100ug/ml MSU溶液+25ug/ml的組合物或者化合物)，加液后繼續(xù)放37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，收集上清液，剩余的HUVEC用于測定細(xì)胞活性，每孔再加5mg/ml MTT液20ul，繼續(xù)放37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時后，棄MTT液，加入二甲基亞砜200ul溶解，震蕩，于酶標(biāo)儀讀取吸光度值，波長490nm。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理，細(xì)胞活力(％)＝實驗組吸光度值/對照組吸光度值×100％，結(jié)果見表1。
與對照組相比，模型組細(xì)胞活力顯著減小(P<0.05)，組合物干預(yù)后細(xì)胞活力顯著提高(P<0.05)，并強(qiáng)于對照組，而化合物III和化合物IV無此活性。
表1 組合物對MSU刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響
注：與模型組相比，*P<0.05；與對照組相比，△P<0.05
4對ICAM-1表達(dá)影響
將處于對數(shù)生長期的HUVEC用0.25％的胰蛋白酶消化，輕輕吹打，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×109/L，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞長滿后(約24h)，棄去上清液，分為下列組：對照組、模型組(100ug/ml MSU溶液)、干預(yù)組(100ug/ml MSU溶液+25ug/ml組合物或者化合物)，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，PBS收集細(xì)胞，離心去上清，加入CD54單克隆抗體，30min后，PBS洗滌，重懸細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測其陽性細(xì)胞百分率(n＝10000)，重復(fù)3次，結(jié)果見表2。
表2 組合物對MSU刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)的影響
注：與模型組相比，*P<0.05；與對照組相比，△P<0.05
結(jié)果顯示，空白組HUVEC幾乎無ICAM-1表達(dá)，模型組ICAM-1的表達(dá)最高，與模型組相比，組合物對ICAM-1的表達(dá)有顯著的抑制作用，而化合物III和化合物IV無顯著的抑制作用。
結(jié)論：用MSU致HUVEC損傷的急性痛風(fēng)模型評價顯示，組合物可保護(hù)MSU致HUVEC損傷，減少細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞活性，抑制ICAM-1表達(dá)，具有抗急性痛風(fēng)炎癥的活性，組合物可用于制備治療急性痛風(fēng)炎癥藥物。而化合物III和化合物IV不能保護(hù)MSU致HUVEC損傷，不能減少細(xì)胞凋亡，不能提高細(xì)胞活性，不能抑制ICAM-1表達(dá)，不具有抗急性痛風(fēng)炎癥的活性，不能用于制備治療急性痛風(fēng)炎癥藥物。
實施例6 本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備
取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成100片。
實施例7 本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備
取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。